ДВУХФОТОННЫЙ СКАНИРУЮЩИЙ МИКРОСКОП С АВТОМАТИЧЕСКОЙ ТОЧНОЙ ФОКУСИРОВКОЙ ИЗОБРАЖЕНИЯ И СПОСОБ АВТОМАТИЧЕСКОЙ ТОЧНОЙ ФОКУСИРОВКИ ИЗОБРАЖЕНИЯ

Изобретение относится к области физических и химических исследований свойств материалов, микро- и наноструктур.

Фокусировка однофотонных (обычных) сканирующих микроскопов осуществляется перемещением фокусатора или образца вдоль оптической оси, при этом контроль за наилучшей фокусировкой может осуществляться либо визуально, либо при помощи электронной регистрации.

Физический принцип, лежащий в основе распознавания положения наилучшего фокуса - дифракция световой волны на апертуре фокусирующей линзы, описываемая функцией размытия точки [R.H.Webb, Rep.Prog. Phys. 59 (1996) 427-471]. При различных положениях линзы относительно образца распределение светового поля лазерного пучка на образце различно (описывается функцией (sin(х)/х)², где х является функцией координат р в плоскости образца и z вдоль оптической оси (фиг.1 из работы R.H.Webb Webb).

Для идентификации положения по оси z наилучшей фокусировки необходимо наличие в микроскопе отдельной (видео)регистрации, позволяющей зафиксировать пространственное распределение светового поля (сечения, изображенные на фиг.1). Для микроскопов с невысоким пространственным разрешением, если возможно выделение и детектирование только центральной области пятна Эйри, возможно построение функции Эйри при сканировании фокусатора относительно образца вдоль оптической оси (US 5672861). Используются также методики контроля за контрастом изображения (US 6128129, US 7109459), которые также предусматривают визуализацию изображения для фокусировки.

В случае однофотонного микроскопа функции фокусировки и собственно получения изображении совмещены, и такие методики работают достаточно эффективно.

В случае когда получение изображения пятна Эйри или выделение центральной зоны пятна Эйри не предусматривается, и все излучение, отраженное от (или прошедшее через) образца попадает в детектор, то сканирование фокусатора вдоль оптической оси не приводит к существенной зависимости интенсивности регистрируемого сигнала от положения фокусатора.

В случае двухфотонного микроскопа осуществляется именно описанная конфигурация: все излучение на длине волны второй гармоники, генерируемое в образце (в геометрии на просвет или в геометрии на отражение), попадает в детектор, то есть визуализация центральной части пятна Эйри невозможна (или требует существенного усложнения и удорожания микроскопа).

Двухфотонная микроскопия является частным случаем многофотонной микроскопии и находит широкое применение при изучении различных физических и биологических явлений и объектов, как правило, в конфокальной геометрии. Данный метод диагностики материалов включает в себя такие методики, как генерация второй оптической гармоники (ГВГ) и двухфотонная люминесценция (ДФЛ).

На сегодняшний день основное применение многофотонной конфокальной микроскопии - биология. Это связано с тем, что данная методика позволяет получать трехмерные изображения тканей за счет изменения фокусировки лазерного излучения (W. Denk, J.H. Strickler, and W.W. Webb, Science 248, 73, 1990), что оказывается возможным в связи с существенно большей глубиной проникновения излучения на основной длине волны (700-1000 нм) в биологические ткани (биологическое окно прозрачности - B.J. Tromberg, N.Shah, R. Lanning, A. Cerussi, J. Espinoza. T. Pham, L. Svaasand. J. Butler. Neoplasia. 2000, 2(1-2). Для исследования материалов методом двухфотонной микроскопии разработаны коммерческие образцы двухфотонных микроскопов. Такого рода приборы присутствуют в модельном ряду компаний, занимающихся изготовлением оптических микроскопов и комплектующих к ним, например Nikon (AlR МР), Olympus (FV1000 МРЕ), Carl Zeiss (LSM 510 NLO). Для исследования твердотельных микроструктур (для микроэлектроники) выпускаются конфокальные профилометры, однако эти приборы являются однофотонными и их функциональные возможности достаточно ограничены.

Так, например, известен конфокальный сканирующий микроскоп, характеризующийся тем, что содержит платформу для размещения исследуемого образца, источник лазерного излучения для направления излучения через ориентированно расположенные под углом к направлению излучения зеркала для последующей передачи излучения на образец, размещенный на платформе, кроме того, в системе присутствует большое количество направляющих зеркал и фокусирующих линз для передачи отраженного излучения в блоке его приема и обработки (US №7180661, G02B 21/06, G01J 3/30, F21V 9/16, опубл. 20.02.2007). Принято в качестве прототипа. Особенностью данного микроскопа является также то, что часть направляющих излучение зеркал выполнены с автономными приводами, используемыми для регулировки положения этих зеркал при настройке параметров излучения по отношению к исследуемому образцу.

В исследовательских лабораториях двухфотонная микроскопия используется для получения изображения полупроводниковых металлических наноструктур (Shuhua Yue, Mikhail N. Slipchenko, and Ji-Xin Cheng, Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev., 1-17 (2011), а также доменной структуры (V. Kirilyuk, A. Kirilyuk, and Th. Rasing. Appl. Phys. Lett. 70 (17), 28 April 1997; Th. Lottermoser, D. Meier, R.V. Pisarev, and M. Fiebig, Phys. Rev. В 80, 100101(R) (2009) в сегнетоэлектрических и мультиферроидных пленках. Очевидно, что для полноценного анализа параметров неорганических твердотельных структур функции микроскопов, ориентированных на биологические объекты, недостаточно. Это связано с особенностями генерации второй оптической гармоники и двухфотонной люминесценции в неорганических твердотельных микро- и наноструктурах.

С другой стороны, в случае двухфотонного микроскопа возможно использование методик фокусировки, разработанных для однофотонных микроскопов, однако эти методики работают только для «грубой» фокусировки. Это связано с тем, что в силу ахроматичности оптики положение фокуса для излучения накачки (основной длины волны) не совпадает с положением фокуса для излучения второй гармоники (ахроматические линзы и объективы для такого широкого спектрального диапазона не эффективны). Кроме того, переход от основного излучения к излучения второй гармоники требует добавление (замену) в оптическую схему целого ряда элементов, что приводит к нарушению фокусировки.

Настоящее изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в повышении технических характеристик за счет обеспечения автоматической настройки положения исследуемой точки поверхности образца точно в фокусе фокусатора при приеме отраженного от исследуемого образца излучения на частотах второй гармоники.

Указанный технический результат для устройства достигается тем, что двухфотонный сканирующий микроскоп с автоматической точной фокусировкой изображения содержит платформу для размещения исследуемого образца, выполненную с возможностью перемещения по крайней мере в вертикальном и горизонтальном направлениях, источник лазерного излучения для направления излучения, падающего на исследуемый образец через полуволновую пластинку, установленную на автоматизированной вращающейся платформе, систему зеркал и фокусатор, представляющий собой систему линз или расширитель светового пучка и градиентную линзу или объектив, закрепленные на автоматизированном микрометрическом трансляторе, связанном с контроллером перемещения фокусатора, приемную часть для автоматической настройки положения исследуемой точки поверхности образца точно в фокусе фокусатора при приеме отраженного от исследуемого образца излучения на частотах второй гармоники и двухфотонной люминесценции, включающую в себя детектор, используемый для приема отраженного излучения через поляризатор, устройство спектральной фильтрации и короткофокусную линзу на входную апертуру оптического волокна, связанного с устройством спектральной фильтрации путем измерения интенсивности генерации второй гармоники и двухфотонной люминесценции при изменении положения фокусатора и автоматического выбора и последующего фиксирования точки максимальной интенсивности для получения изображения в положении точного фокуса фокусатора.

Указанный технический результат для способа достигается тем, что способ автоматической точной фокусировки изображения на двухфотонном сканирующем микроскопе заключается в размещении исследуемого образца на расстоянии от фокусатора, равном фокусному расстоянию по паспорту этого микроскопа, направлении излучения на исследуемый образец и приеме отраженного излучения на длине волны второй гармоники, затем смещают фокусатор для его выхода из точки фокуса и смещают фокусатор вдоль оптической оси в направлении к точке фокуса по паспорту с шагом, меньшим первого смещения и с переходом через точку фокуса по паспорту, и регистрируют отраженное излучение на длине волны второй гармоники и двухфотонной люминесценции в каждом шаге смещения с регистрацией по крайней мере одной координаты положения фокусатора в каждой точке шагового смещения, а затем выстраивают график зависимости мощности, измеряемой детектором на длине волны второй гармоники и двухфотонной люминесценции, и определяют положение точного фокуса на линии оптической оси по координате на графике, абсолютные значения которой меньше значений каждой из всех остальных координат на этом графике.

Указанные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.

Настоящее изобретение поясняется конкретным примером исполнения, который, однако, не является единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.

На фиг.1 - вид функции размытия точки при фокусировке фокусатора;

фиг.2 - представлена блок-схема экспериментальной установки микроскопа согласно изобретению со схемой регистрации излучения от исследуемого объекта;

фиг.3 - зависимость диаметра перетяжки, координата z=0 - точка точного фокуса;

фиг.4 - зависимость мощности, детектируемой детектором на длине волны второй гармоники, при перемещении фокусатора, координата z=0 - точка точного фокуса;

фиг.5 - блок-схема устройства;

фиг.6 - представлен вид внешней панели программы управления транслятором фокусатора. В одном из окон показан график зависимости мощности ВГ, измеряемой детектором на длине волны второй гармоники при его автоматическом перемещении, координата z=3.4 mm - точка точного фокуса;

фиг.7 - изображение 80×80 мкм² образца пептидных трубок на поверхности стекла, полученное при освещении лазерным пучком с длиной волны 800 нм при положении линзы 2 мм, дополнительная подсветка осуществлялась лампой с широким сплошным спектром;

фиг.8 - изображение 80×80 мкм² образца пептидных трубок на поверхности стекла, полученное при освещении лазерным пучком с длиной волны 800 нм при положении линзы 3.4 мм, дополнительная подсветка осуществлялась лампой с широким сплошным спектром;

фиг.9 - изображения на длине волны второй гармоники для фокусатора в положении 2 мм;

фиг.10 - интенсивностные сечения вдоль красной линии для фокусатора в положении 2 мм;

фиг.11 - изображения на длине волны второй гармоники для фокусатора в положении 3.4 мм;

фиг.12 - интенсивностные сечения вдоль красной линии для фокусатора в положении 3.4 мм;

фиг.13 - алгоритм работы по наведению точной фокусировки изображения.

В рамках настоящего изобретения рассматривается эффективный и надежный способ автоматической фокусировки двухфотонного микроскопа, используемого для исследования микроструктур на длинах волн второй оптической гармоники и двухфотонной люминесценции. Микроскоп позволяет исследовать зависимость изображений от угла падения и азимута, угла приема излучения, а также поляризационные характеристики в органических и неорганических структурах. В качестве примеров проведены исследования нелинейно-оптических свойств пептидных трубок и микроструктур на основе оксида цинка.

Микроскоп предназначен для детектирования спектров излучения на длинах волн в видимой области спектра (фиг.2). В качестве источника 1 лазерного излучения использовался фемтосекундный Ti:Sap лазер с частотой повторения импульсов 100 МГц и длительностью импульсов не более 100 фс. Лазер позволяет автоматически перестраивать рабочую длину волны в диапазоне от 690 до 1040 нм. Средняя выходная мощность излучения составляет от 0.5 до 2 Вт. Для модуляции, а также для предварительного снижения мощности падающего на образец излучения был использован оптико-механический прерыватель 2. После лазера установлен оптический вентиль 3. Далее излучение проходит через последовательно стоящие друг за другом зеркала 4 (систему зеркал) к полуволновой пластинке 5, установленной на автоматически вращающейся платформе для выбора падающей поляризации. Излучение фокусируется на образце 6 фокусирующей линзой 8 с фокусным расстоянием 3 см, закрепленной на автоматизированной микрометрической подвижке (образец закреплен на трехкоординатной или двухкоординатной трансляционной платформе 7, установленной на гониометре). Фокусирующая линза 8 изготовлена из стекла с градиентным показателем преломления. Такая конструкция линзы позволяет получить меньший диаметр лазерного пятна в перетяжке по сравнению с линзами, изготовленными из однородного стекла при аналогичных фокусных расстояниях. В данной экспериментальной установке диаметр пятна в перетяжке составляет 2 мкм. Приемная система расположена перпендикулярно поверхности образца на трехкоординатной или двухкоординатной трансляционной платформе 7, что позволяет точно позиционировать детектор. Приемная часть этой системы включает в себя поляризатор с функцией анализатора состояния поляризации излучения на удвоенной частоте 5, детектор, используемый для приема отраженного излучения через фильтр 9, и короткофокусную линзу на входную апертуру оптического волокна. При этом входная апертура волокна установлена на гониометре с возможностью изменения своего углового положения по отношению к поверхности образца с целью получения изображений с произвольной угловой направленностью и связан с монохроматором. Исследуемый образец 6 закреплен на трехкоординатной или двухкоординатной трансляционной платформе 7, которая перемещает образец в вертикальном и горизонтальном направлениях с точностью до 500 нм, а также позволяет вращать образец относительно оси перпендикулярной плоскости образца.

Излучение от образца проходит через фильтр 9 (Schott Glass BG-39, область пропускания от 320 до 650 нм) для того, чтобы отсечь излучение на основной частоте лазера, но пропустить излучение второй гармоники или двухфотонной люминесценции, прогенерированное в образце, затем с помощью короткофокусной линзы 10 собирается на входной апертуре 11 оптического волокна диаметром до 1 мм. Волокно представляет собой пучок из 19 волноводов диаметром 200 мкм (245 мкм с обкладкой). На одном конце волокна волноводы формируют линейку, что позволяет снизить потери при сопряжении со щелью монохроматора 12, служащего для спектрального анализа прогенерированного в образце излучения. На другом конце волноводы формируют круг для лучшего сопряжения с собирающей линзой. Перед входной щелью установлен еще один фильтр BG-39. Монохроматор 12 за счет поворотного зеркала позволяет переключаться между выходом, связанным с ПЗС матрицей 13, используемой для регистрации спектральных зависимостей, и выходом 14, связанным с ФЭУ, используемым для регистрации сигнала на определенной длине волны. Монохроматор 12 снабжен автоматизированной турелью, позволяющей программно менять дифракционные решетки. На турели установлены решетки 150, 300 и 600 штр/мм. Для снижения уровня шумов ПЗС матрица охлаждается при помощи жидкого азота до температуры -1200°С. Сигнал от ПЗС-матрицы направляется на плату регистрации, подключенную к компьютеру.

В микроскопе элементами отсечения являются «фильтр 9 (Schott Glass BG-39, область пропускания от 320 до 650 нм) для того, чтобы предварительно отсечь излучение на основной частоте, затем с помощью короткофокусной линзы 10 собирается на входной апертуре 11 монохроматора 12, дополнительно позволяющего анализировать спектральный состав излучения двухфотонной люминесценции (то есть отсекающие элементы - это фильтр 9 и монохроматор 12).

Сигнал, зарегистрированный фотоэлектронным умножителем (ФЭУ), поступает на синхронный детектор 15, синхронизированный с оптико-механическим прерывателем. ФЭУ работает в режиме регистрации фототока, однако для регистрации световых потоков низкой интенсивности возможна работа в режиме счета фотонов. Для этого в установку должны быть включены счетчик фотонов и предусилитель сигнала. Сбор данных от синхронного детектора 15 или счетчика фотонов осуществляется через интерфейс GPIB в компьютере 16. Положение лазерного пятна на образце контролируется с помощью камеры 17 с увеличивающим объективом и микроскопом. Автоматизация экспериментальной установки осуществлена в программной среде LabView. Установка позволяет проводить сканирование поверхности образца и регистрацию в отдельной точке, как спектров, так и излучения на отдельных длинах волн. Полученные экспериментальные данные могут дать представление о спектральном составе излучения в различных точках образца, а также свойствах кристаллической структуры материала. Программа позволяет управлять такими параметрами сканирования, как область сканирования, шаг сканирования и получать предварительные данные о топографии поверхности. Также она позволяет контролировать параметры лазера (длина волны, мощность накачки) и монохроматора. В частности, можно управлять шириной входной щели монохроматора, временем выдержки, сменой дифракционных решеток.

Способ автоматической фокусировки двухфотонного микроскопа основан на самом физическом принципе процесса генерации двухфотонных процессов (второй гармоники ВГ и двухфотонной люминесценции). Фокусирующий элемент (это может быть градиентная линза, система линз или объектив) установлен на автоматизированном микрометрическом трансляторе. Работа автофокусатора основана на одном из основных свойств двухфотонных процессов (ДФП) (это может быть и генерация ВГ и двухфотонная люминесценция) - квадратичной зависимости интенсивности излучения L_2ω от падающей интенсивности (==плотности мощности): поскольку , то .

Плотность мощности определяется отношением мощности падающей волны W к площади светового пятна S:

С другой стороны, детектор измеряет мощность излучения:

W_2ω=I_2ω·S,

то есть

Графики зависимостей (1) и (2) представлены на фиг.7-12 соответственно.

В двухфотонном сканирующем микроскопе (фиг.2 и 5) с автоматической точной фокусировкой изображения излучение от источника 1 лазерного излучения падает на исследуемый образец через полуволновую пластинку 3, установленную на автоматизированной вращающейся платформе, систему зеркал 4 и фокусатор. Фокусатор 19 представляет собой систему линз или расширитель светового пучка и градиентную линзу или объектив, закрепленные на автоматизированном микрометрическом трансляторе 20, связанном с контроллером 21 перемещения фокусатора. Приемная часть служит для автоматической настройки положения исследуемой точки поверхности образца точно в фокусе фокусатора при приеме отраженного от исследуемого образца излучения на частотах второй гармоники и двухфотонной люминесценции. Эта приемная часть включает в себя детектор, используемый для приема отраженного излучения через поляризатор, устройство спектральной фильтрации и короткофокусную линзу на входную апертуру оптического волокна, связанного с устройством спектральной фильтрации путем измерения интенсивности генерации второй гармоники и двухфотонной люминесценции при изменении положения фокусатора и автоматического выбора и последующего фиксирования точки максимальной интенсивности для получения изображения в положении точного фокуса фокусатора.

Способ автоматической точной фокусировки изображения на двухфотонном сканирующем микроскопе заключается в размещении исследуемого образца на расстоянии от фокусатора, равном фокусному расстоянию по паспорту этого микроскопа, направлении излучения на исследуемый образец и приеме отраженного излучения на длине волны второй гармоники, затем смещают фокусатор для его выхода из точки фокуса и смещают фокусатор вдоль оптической оси в направлении к точке фокуса по паспорту с шагом, меньшим первого смещения и с переходом через точку фокуса по паспорту, и регистрируют отраженное излучение на длине волны второй гармоники и двухфотонной люминесценции в каждом шаге смещения с регистрацией по крайней мере одной координаты положения фокусатора в каждой точке шагового смещения, а затем выстраивают график зависимости мощности, измеряемой детектором на длине волны второй гармоники и двухфотонной люминесценции, и определяют положение точного фокуса на линии оптической оси по координате на графике, абсолютные значения которой меньше значений каждой из всех остальных координат на этом графике.

Описание работы устройства по данному способу (производится автоматически программой, алгоритм которой представлен на фиг.13):

1. Грубо устанавливаем расстояние между образцом и фокусатором (в англоязычной патентной литературе использован термин "self-focusing" - фокусатор) (объективом, линзой и т.д.), равным фокусному расстоянию (по паспорту).

2. Грубо перемещаем фокусатор на расстояние, равное 5 мм.

3. Аккуратно сканируем фокусатор вдоль оптической оси с шагом в несколько десятков микрон (50 микрон в нашем примере).

4. Получаем картинку, представленную на фиг.6.

5. Производим аппроксимацию полученной экспериментальной зависимости по формуле (2), определяем положение z=z₀ точного фокуса.

6. Устанавливаем фокусатор в положение z₀.

Точный фокус установлен, сканируем изображение. На фиг.6 представлен вид передней панели программы управления фокусатором. В одном из окон показан график зависимости мощности ВГ, измеряемой детектором на длине волны второй гармоники при его автоматическом перемещении, координата z=3.4 мм - точка точного фокуса. По выставленному графику на мониторе можно точно установить координаты точки точного фокуса.

Исследования достижения поставленного технического результата проводились на примерах сканирования пептидных трубок. На фиг.7 представлено изображение 80×80 мкм² образца пептидных трубок на поверхности стекла, полученное при освещении лазерным пучком с длиной волны 800 нм при положении линзы 2 мм, дополнительная подсветка осуществлялась лампой с широким сплошным спектром. А на фиг.8 - изображение 80×80 мкм² образца пептидных трубок на поверхности стекла, полученное при освещении лазерным пучком с длиной волны 800 нм при положении линзы 3.4 мм, дополнительная подсветка осуществлялась лампой с широким сплошным спектром. Как видно, различия в изображениях по фиг.7 и по фиг.8 отсутствуют.

На фиг.9 представлено изображение образца на длине волны второй гармоники для фокусатора в положении 2 мм, а на фиг.10 - интенсивностные сечения вдоль красной линии для фокусатора в положении 2 мм для этого изображения. На фиг.11 - изображения на длине волны второй гармоники для фокусатора в положении 3.4 мм, а на фиг.12 - интенсивностные сечения вдоль красной линии для фокусатора в положении 3.4 мм для изображения по фиг.11. Из фиг.9-12 видно, что сдвиг фокуса на 1.4 мм от оптимальной точки (что соответствует разбросу положения объектива при фокусировке «на глаз») уменьшает яркость изображения в 3 раза и существенным образом ухудшает пространственное разрешение или «размазывает» изображение: трубки, которые четко видны раздельно в режиме автофокуса, неразличимы при фокусировке «на глаз».

Таким образом, видно, что указанные в формуле совокупности существенных признаков, отражающие особенности исполнения автоматизированной фокусировки в двухфотонном сканирующем микроскопе, обеспечивает настройку положения исследуемой точки поверхности образца точно в фокусе фокусатора при приеме отраженного от исследуемого образца излучения на частотах второй гармоники.