Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE-ПРОДУЦЕНТ МАЛЬТОГЕННОЙ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности при производстве кислой α-амилазы, применяемой в различных областях промышленности и сельского хозяйства для осахаривания (гидролиза) крахмалосодержащего сырья, а именно в хлебопечении, спиртовой, пивоваренной, кондитерской и крахмалопаточной промышленности (выработка паток, сиропов, глюкозы), при производстве крупяных изделий, овощных продуктов, изделий из фруктов (соков, сиропов, экстрактов, варений, пектина), детского питания, в текстильной, бумажной промышленности, при производстве моющих средств, а также в медицине.

Изобретение касается создания высокоактивного рекомбинантного штамма гриба Aspergillus oryzae - продуцента мальтогенной α-амилазы.

Штамм создан на основе запатентованного промышленного продуцента кислой α-амилазы - штамма Asp.oryzae ВКМ F-3927 D, с использованием методов генной инженерии (1).

Изобретение обеспечивает получение высокоактивных ферментных препаратов α-амилазы в результате глубинного культивирования нового рекомбинантного штамма на мучных ферментационных средах.

α-Амилаза (α-1,4-глюкан-глюканогидролаза, 3.2.1.1) является ферментом амилолитического действия, относится к классу гидролаз, подклассу гликозидаз, гидролизует внутренние α-1,4-глюкозидные связи в крахмале, гликогене и родственных им поли- и олигосахаридах, приводя к образованию мальтодекстринов различной молекулярной массы, мальтотриозы, изомальтозы и глюкозы.

Мальтогенная α-амилаза А.oryzae (Така-амилаза) эффективно гидролизует амилозу и амилопектин с образованием, главным образом, мальтозы. Роль мальтогенной α-амилазы в процессах биоконверсии крахмалосодержащего сырья в настоящее время значительно возросла в связи с разработкой и реализацией технологии производства топливного этанола из крахмалосодержащего сырья, предусматривающей использование низкотемпературной водно-тепловой обработки с применением высокоактивных и кислотоустойчивых ферментных препаратов α-амилазы и глюкоамилазы. Совместное использование ферментов способствует увеличению скорости и глубины деструкции крахмала, в результате степень гидролиза крахмала достигает 98-99%, при этом эффективность процесса ферментативной обработки может быть значительно повышена за счет применения высокоактивных ферментных препаратов.

В мировой практике для промышленного получения продуктов гидролиза крахмала используют, главным образом, амилазы, образуемые грибами, относящимися к роду Aspergilllus, с желто-зеленым пигментообразованием: Asp.flavus Asp.oryzae, Asp.glauscus, Asp.ochraceusi, Asp.fumigatm.

Известны такие продуценты кислой α-амилазы, как штаммы Asp.oryzae 740-А2 (2), Asp.oryzae НРВ-169 (коллекция Центрального Музея промышленных микроорганизмов «ВНИИГенетика», коллекционный номер ЦМПМ F-257) (3). Также известны штаммы Asp.oryzae 387 (ВКПМ F-683) (4), Asp.oryzae ВКПМ F-369 (5), Asp.awamori М-2002 (ВКМ F-3771D) (6, 7), синтезирующие комплекс гидролитических ферментов, включающий кислую α-амилазу.

Недостатками всех вышеперечисленных продуцентов являются низкая продуктивность штаммов применительно к кислой α-амилазе. Высокоактивные продуценты недоступны для организации отечественного производства, поскольку являются собственностью зарубежных фирм-производителей.

Наиболее близким к заявляемому объекту по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Asp.oryzae ВКМ F-3927 D (1), который при культивировании в глубинных условиях в колбах в течение 120 ч на питательной среде, содержащей в качестве источника муку злаковых культур, кукурузный экстракт и соли, синтезирует α-амилазу с активностью 400-500 ед/мл.

Однако для повышения рентабельности производства ферментных препаратов α-амилазы требуется создание более продуктивных штаммов.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - получение нового штамма-продуцента мальтогенной α-амилазы, способного при культивировании на дешевых технологичных средах обеспечивать высокий уровень активности целевого фермента.

Технический результат, получаемый от создания и использования нового рекомбинантного штамма Asp.oryzae Ату Т-52-3-21, содержащего дополнительную копию гена мальтогенной α-амилазы, заключается в получении высокоактивных ферментных препаратов кислой мальтогенной α-амилазы для использования в различных отраслях АПК.

В целях повышения уровня биосинтеза целевых ферментов грибными штаммами в настоящее время успешно применяются технологии рекомбинантных ДНК. Увеличения экспрессии секретируемых ферментов достигают за счет получения штаммов с увеличенным числом копий генов целевых ферментов (т.н. мультикопийных штаммов) или направленного изменения в механизме регуляции синтеза этих ферментов.

Сущность объекта изобретения - новый рекомбинантный штамм Aspergillus oryzae Amy Т-52-3-21 - продуцент мальтогенной α-амилазы.

Создание рекомбинантного штамма на основе мутантного штамма Asp.oryzae ВКМ F-3927 D проводили в несколько этапов. На первом этапе с использованием индуцированного мутагенеза был получен ауксотрофный реципиентный штамм Aspergillus oryzae 52-3 niaD^-, дефектный по нитратредуктазе, для отбора трансформантов по способности расти на минимальной среде с нитратом натрия в качестве единственного источника азота. На втором этапе реципиентный штамм Aspergillus oryzae 52-3 niaD^- котрансформировали плазмидой рАmу-Аmу, несущей ген гомологичной амилазы под амилазным промотором, с плазмидой pSTA10, несущей селективный маркер - ген нитратредуктазы (8). В результате последующей селекции был получен трансформант с уровнем активности на 20-30% выше исходного штамма.

Проводили сравнительную характеристику уровня активности α-амилазы заявляемого рекомбинантного штамма и исходного штамма Asp.oryzae ВКМ F-3927 D. Активность α-амилазы определяли согласно ГОСТ 20264.4-89 (9). В таблице 1 представлены данные по биосинтезу α-амилазы исходным мутантным штаммом (прототипом) и рекомбинантным штаммом Asp.oryzae.

Таким образом, предлагаемый штамм Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21 при культивировании на питательной среде на основе пшеничной и соевой муки, обеспечивает высокую активность мальтогенной α-амилазы в культуральной жидкости, что позволяет в значительной степени повысить выход целевого фермента с единицы субстрата и соответственно удешевить процесс производства ферментных препаратов, получаемых на его основе.

Штамм Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под №ВКМ F-4476D.

Кулыпурально-морфологические признаки штамма Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21

Макроскопические характеристики: Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA) при 25°С имеют диаметр 65-70 мм/7 сут, зеленовато-желтые, поверхность пушистая до хлопьевидной, край ровный; мицелий плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA) при 37°C имеют диаметр 60-65 мм/7 сут, оливково-желтоватые, поверхность пушистая, край ровный; мицелий плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S) при 25°C имеют диаметр колонии 67-71 мм/7 сут, оливково-желтые, поверхность пушистая до клочковатой, край ровный; мицелий плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на Мальц-агаре (MEA) при 25°C имеют диаметр 65-70 мм/7 сут, зеленовато-желтые, поверхность клочковатая, край ровный; мицелий не очень плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона желтовато-серая.

Микроскопические характеристики: Конидиальные головки шаровидные до рыхло колонковидных. Конидиеносцы не окрашены, гладкостенные до слабо шероховатых, 500-1000×10-25 мкм. Везикулы (апикальные расширения) полушаровидные до грушевидных, 22-50 мкм шириной; стеригмы одноярусные и двухъярусные в пределах одной колонии, покрывают от 1/2 до 2/3 поверхности везикулы, метулы - 8-12×4-6 мкм, фиалиды - 8-12×3-5 мкм. Конидии шаровидные, 4,0-8,5 мкм в диаметре, гладкостенные до слабо шероховатых при старении.

Физиолого-биохимические свойства штамма:

Культура штамма хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу и слабо - мальтозу, лактозу, галактозу и рамнозу. Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: крахмале, β-глюкане, пектине и галактоманнане.

Хорошо ассимилирует аммонийные соли неорганических кислот. Потребляет пептон, казеин, аминокислоты.

Температурный оптимум роста 34-35°C, рН 4,5-6,0. Аэроб.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерии, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Полученный рекомбинантный штамм отличается от исходного наличием в геноме дополнительной копии гена Аmу, кодирующего мальтогенную α-амилазу (Така-амилазу), что обеспечивает повышенную способность продуцента к биосинтезу α-амилазы при глубинном культивировании на жидких средах и стабильность при пересевах.

Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой Сабуро или Мальц-агаре при +4°C с обязательным пересевом не реже одного раза в 3 месяца.

Культивирование рекомбинантного штамма Aspergillus oryzae Amy Т-52-3-21 осуществляют в аэробных условиях при температуре 30°C в течение 120 ч, рН среды 5,8-6,2. Для роста культуры и биосинтеза кислой α-амилазы источником углерода и азота могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, соевая, кукурузная или другая зерновая мука, либо их экстракты, аммонийный азот, кукурузный экстракт.

При культивировании штамма Aspergillus oryzae Amy 7-52-3-21 в течение 120 ч в колбах на среде, содержащей пшеничную и соевую муку, кукурузный экстракт и неорганические соли, активность α-амилазы в культуральной жидкости составляет от 580 до 640 ед/мл.

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов (Амилоризин Г10х, Г20х), получаемых осаждением этанолом или другими органическими растворителями из ультрафильтрата культуральной жидкости, а также высушиванием или гранулированием.

α-Амилаза Asp.oryzae активна при температуре от 30° до 70°C с оптимумом действия при 58-60°; стабильна в широком интервале значений рН - от 3.5 до 8.0, с оптимумом действия при рН 5,0-6,0; в более кислой зоне, характерной для мучных замесов (рН 4,5), проявляет активность на 85-95%; является мальтогенной α-амилазой, предельная степень гидролиза растворимого и нерастворимого крахмала составляет 38 и 34% соответственно.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Посевной материал (инокулюм) получают выращиванием штамма на жидкой питательной среде состава: пшеничная мука - 6%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NН₄NO₃ - 0,3%, КН₂РO₄ - 0,02%, СаСO₃ - 1,2%, вода дистиллированная, рН среды 5,8-6,2, в колбах, содержащих 50 мл стерильной среды, на качалке с 240 об/мин при 30°C в течение 48 ч.

Полученный посевной материал в количестве 2% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащей 50 мл среды следующего состава (мас.%): пшеничная мука - 6%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NН₄NO₃ - 0,3%, КН₂РO₄ - 0,02%, СаСO₃ - 1,2%, вода водопроводная, рН среды 5,8-6,2. Среду предварительно обрабатывают ферментным препаратом бактериальной α-амилазы из расчета 2 ед/г крахмала при 70°C в течение 20 мин.

Культивирование осуществляют в аэробных условиях на качалке (240 об/мин) при температуре 30°C.

Максимальная ферментативная активность α-амилазы (120 ч роста) составляет 640 ед/мл.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах, как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава (масс.%): кукурузный крахмал - 10%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NН₄NO₃ - 0,3%, КН₂РO₄ - 0,02%, СаСO₃ - 1,2%, вода водопроводная, рН среды 5,8-6,2. Максимальные ферментативная активность термостабильной α-амилазы (120 ч роста) составляет 600 ед/мл.

Источники литературы

1. Патент РФ №2245364 от 27.01.2005.

2. Калунянц К.А. и Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты. М., Пищевая промышленность, 1979, с.8-9.

3. Авторское свидетельство SU №1158579.

4. Патент РФ №2070921 от 27.12.1996.

5. Авторское свидетельство SU №1440922.

6. Патент РФ 2196821 от 20.01.2003.

7. Семенова М.В. и др. Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК/ - М.: ВНИИПБТ, 2006. 304 с.

8. Gomi et al. Molecular cloning and characterization of a transcriptional activator gene, amyR, involved in the amylolytic gene expression in Aspergillus oryzae. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64(4). P. 816-827.

9. Препараты ферментные. ГОСТ 20264-4.89.-М.:Изд. Государственный комитет СССР по стандартам, 1995. С.70.

Аналогичные патенты РФ

1. Патент РФ №2196821 от 20.01.2003.

2. Патент РФ №2245364 от 27.01.2005.

3. Патент РФ №2354697 от 10.05.2009.