Результат интеллектуальной деятельности: ПРОИЗВОДНЫЕ АЛКИЛАММОНИЙНОГО ГЕМИНАЛЬНОГО ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ЭФФЕКТИВНУЮ ДОСТАВКУ ДНК В КЛЕТКИ

Изобретение относится к ряду химических соединений, а именно к алкиламмонийным геминальным поверхностно-активным веществам (ГПАВ) формулы (I),

где m=4, 6, 12, обеспечивающих эффективную доставку ДНК в клетки.

Данные соединения являются электролитами и диссоциируют в воде с образованием мицеллообразующего иона, имеющего заряд +2, создаваемого двумя положительно заряженными атомами азота, и двух противоионов: бромид-анионов.

Генная терапия имеет значительный потенциал для терапевтического лечения путем внутриклеточной доставки генов многих человеческих болезней, которые в настоящее время считаются неизлечимыми. Вирусные векторы на основе аденовирусов или ретровирусов очень эффективны в доставке генов. Тем не менее развитие способов доставки ДНК в эукариотические клетки без применения вирусных векторов остается очень актуальным из-за возможности использовать только целевые последовательности ДНК и существенно более низкого риска отдаленных осложнений.

В качестве альтернативы вирусным векторам для доставки ДНК в клетки используются разнообразные катионные полимеры и структуры, такие как полиэтиленимин [Bagnacani V. et al. Macrocyclic nonviral vectors: high cell transfection efficiency and low toxicity in a lower rim guanidinium calix[4]arene. Org Lett. 2008; 10 (18), 3953-6], поли (L-лизин) [Baldini L. et al. Calixarene-based multivalent ligands, Chem Soc Rev. 2007, 36 (2), 254-66], полиамидоамин дендример [Sun X. et al. Cationic polymer optimization for efficient gene delivery. Mini Rev Med Chem. 2010, 10 (2), 108-25] и катионные липосомы [V. Geromel et al. Mitochondria Transfection by Oligonucleotides Containing a Signal Peptide and Vectorized by Cationic Liposomes, Antisense and Nucleic Acid Drug Development. 2001, 11 (3), 175-180]. Эти катионные агенты связываются с ДНК посредством электростатических взаимодействий и формируют комплексы наночастиц [Won Y.W. et al. Intracellular organdie-targeted non-viral gene delivery systems, J Control Release. 2011, 152 (1), 99-109]. В результате ДНК становится защищенной от деградации нуклеазой, в то же время катионные агенты являются посредником при проникновении в клетку и последующем освобождении из эндосом, что повышает эффективность трансфекции.

В литературе есть данные о трансфекции ДНК в присутствии монокатионных ПАВ - цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) и цетилгидроксиэтилдиметиламмоний бромида (ЦГАБ) [Mel'nikov S.M. et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 2401], [Mel'nikov, S.M. Et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9951], [Clamme, J. P. et al. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1467, 347], [Pinnaduwage, P. et al. Biochim. Biophys. Acta 1989, 985, 33], [Antara Dasgupta et al. J. Phys. Chem. B, Vol.111, No.29, 2007], которые являются монокатионными структурными аналогами заявляемых соединений и выбраны нами в качестве соединений сравнения.

К недостаткам использования вышеуказанных ПАВ в качестве средств доставки ДНК в клетки можно отнести (1) значительно более высокие величины критических концентраций мицеллообразования и более низкий поверхностный потенциал, что требует более высоких концентраций ПАВ для достижения сравнимых эффектов компактизации ДНК и перезарядки комплексов ПАВ/ДНК; (2) пониженную трансфекцию ДНК.

В литературе также имеются данные о применении в качестве трансфектантов геминальных ПАВ [Jagbir Singh et al. Current drug delivery, 2011, 8 (3), 299-306], [Peng Yang et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 75 (2010) 311-320], [Marianna Foldvari et al., J. Experimental Nanoscience, 1, No.2, 2006, 165-176], [Cecilia Bombelli et al., J. Med. Chem. 2007, 50, 6274-6278]. Однако в описанных примерах трансфекция ДНК в клетки животных достигается только при использовании смеси ПАВ с липидами, а в некоторых случаях еще и при добавлении производных полиэтиленгликоля. Существенным моментом является также то, что независимо от соотношения геминальное ПАВ-липид именно липиды являются структурообразующим компонентом: во всех приведенных источниках рассматриваются липосомы и везикулы, которые формируются по специальной методике в системах в присутствии липидов.

Задачей изобретения является создание новых эффективных средств доставки ДНК в эукариотические клетки, используемых в чистом виде (без вспомогательных агентов) и расширяющих арсенал известных средств указанного назначения.

Поставленная задача решается применением геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) формулы (I) с гидроксиэтилированной алкиламмонийной головной группой в качестве средств доставки ДНК в клетки.

Для сравнительного описания свойств ГПАВ, являющихся предметом изобретения, получены репрезентативные данные как для заявляемых соединений (3-5), различающихся между собой длиной спейсерного фрагмента (значением m), так и для незамещенных аналогов (1) и (2), где отсутствует гидроксиэтилированный фрагмент в головной группе.

m=4 (соединение 3)

m=6 (соединение 4)

m=12 (соединение 5)

Синтез геминальных алкиламмонийных ПАВ

Алканедил-α, ω-бис(метилдиалкиламмоний бромиды) получают кипячением в ацетоне смеси 2.2 моля метилдиалкиламина, в том числе содержащего гидроксиэтильную группу у атома азота, и 1.0 моля соответствующего α,ω-дибромалкана в течение 40-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок отфильтровывают, промывают ацетоном, перекристаллизуют из смеси растворителей ацетон/метанол и высушивают в вакууме. Строение полученных соединений было подтверждено данными элементного анализа, ИК- и ЯМР-спектроскопии.

Пример 1. Гексанедил-1.6-бис(диметилгексадециламмоний бромид) (1)

получен кипячением 1.0 моли N,N,N',N'-тетраметилгексаметилендиамина в среде ацетонитрила с 2.2 молями гексадецилбромида в течение 40 часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/этанол и высушен в вакууме.

¹Н ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.; J, Гц): 0.89 [т, 6Н, 2х N⁺ CH₂(CH₂)₁₃CH₂ CH ₃, J=7.0] 1.26-1.36 [уш.м, 52Н, 2х N⁺ CH₂(CH ₂)₁₃CH₂CH₃] 1.60 [с, 4Н, 2х N⁺ CH₂(CH₂)₁₃ CH ₂CH₃] 1.72-2.03 (м, 8Н, N⁺CH₂(CH ₂)₄CH₂N⁺) 3.39 [с, 12Н, 2х N⁺(CH ₃)₂] 3.45-3.56 [м, 4Н, 2х N⁺ CH ₂(CH₂)₁₃CH₂CH₃N⁺ CH ₂ sp.] 3.73-3.77 (м, 4Н, 2х N⁺ CH ₂sp.)

ИК-спектр (KBr), ν/см^-1: 2950, 2919, 2851, 1467, 1402, 1363, 1351, 1122, 1060, 974, 949, 900, 722.

Выход (84%). Формула: C₄₂H₉₀N₂Br₂. Вычислено (%): С 64.43, Н 11.58, N 3.58. Найдено (%): С 33, H 11.88, N 3.53.

Пример 2. Гексанедил-1.6-бис(диметилдециламмонимй бромид) (2)

получен кипячением 1.0 моли N,N,N',N'-тетраметилгексаметилендиамина в среде ацетонитрила с 2.2 молями децилбромида в течение 40 часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/этанол и высушен в вакууме.

¹Н ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.; J, Гц): 0.89 [т, 6Н, 2х N⁺CH₂(CH₂)₇CH₂ CH ₃, J=7.0] 1.26-1.36 [уш.м, 28Н, 2х N⁺СН₂(СН ₂)₇СН₂СН₃] 1.59 [с., 4Н, 2х N⁺СН₂(CH₂)₇ CH ₂CH₃] 1.72-2.01 (м, 8Н, N⁺CH₂(CH ₂)₄CH₂N⁺) 3.38 [с, 12Н, 2х N⁺(CH ₃)₂] 3.46-3.56 [м, 4Н, 2х N⁺ СН ₂(СН₂)₇СН₂СН₃] 3.72-3.76 (м., 4Н, 2х N⁺ CH ₂sp.)

ИК-спектр (KBr), ν/см^-1: 2953, 2922, 2853, 1485, 1467, 1401, 1377, 1128, 1062, 948, 898, 806, 724.

Выход (95%). Формула: C₃₀H₆₆N₂Br₂. Вычислено (%): С 58.62, Н 10.82, N 4.56. Найдено (%): С 58.31, Н 10.58, N 4.36.

Пример 3. Бутанедил-1.4-бис(гидроксиэтилметилгексадециламмоний бромид) (3)

получен кипячением 2.2 молей гидроксиэтилметилгексадециламина в среде ацетонитрила с 1.0 молем соответствующего α,β-дибромбутана в течение 50-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, промыт ацетоном, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/метанол и высушен в вакууме.

¹Н ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.; J, Гц): 0.89 [т. 6Н, 2х N⁺ СН₂(CH₂)₁₃CH₂ CH ₃, J=6.75] 1.27-1.36 [уш.м., 52Н, 2х N⁺ СН₂(СН ₂)₁₃СН₂СН₃] 1.75 (с., 4Н, 2х N⁺ CH₂(CH₂)₁₃ CH ₂CH₃] 2.12 (с., 4Н, N⁺CH₂(CH ₂)₂CH₂N⁺) 3.27 (с, 6Н, 2х N⁺ CH ₃) 3.43-3.88 (м., 12Н, 2х N⁺ CH ₂)₃ 4.12 (с., 4Н, 2х CH₂ CH ₂OH) 5.0 (с., 2Н, 2х CH₂CH₂OH).

ИК-спектр (KBr), ν/см^-1: 3264, 2959, 2920, 2851, 1469, 1404, 1378, 1101, 1085, 1055, 721.

Выход (83%). Формула: C₄₂H₉₀O₂N₂Br₂. Вычислено (%): С 61.89, Н 11.13, N 3.43. Найдено (%): С 61.72, Н 11.62, N 3.27.

Пример 4. Гексанедил-1.6-бис(гидроксиэтилметилгексадециламмоний бромид) (4)

получен кипячением 2.2 молей гидроксиэтилметилгексадециламина в среде ацетонитрила с 1.0 молем соответствующего α,β-дибромгексана в течение 50-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, промыт ацетоном, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/метанол и высушен в вакууме.

¹Н ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.; J, Гц): 0.89 [т, 6Н, 2х N⁺ CH₂(CH₂)₁₃CH₂ CH ₃, J=6.97] 1.27-1.367 [уш.м., 52Н, 2х N⁺ СН₂(СН ₂)₁₃СН₂СН₃] 1.57 (с, 4Н, 2х N⁺ СН₂(СН₂)₁₃ СН ₂СН₃] 1.73-1.98 (м, 8Н, N⁺CH₂(CH ₂)₄CH₂N⁺) 3.31 (с, 6Н, 2х N⁺ CH ₃,) 3.50-3.73 (м, 12Н, 2х N⁺ CH ₂)₃ 4.11 (с, 4Н, 2х CH₂ CH ₂OH) 5.06 (с, 2Н, 2х CH₂CH₂OH).

ИК-спектр (KBr), ν/см^-1: 3227, 2918, 2850, 1468, 1377, 1095, 1058, 721.

Выход (87%). Формула: C₄₄H₉₄O₂N₂Br₂. Вычислено (%): С 62.70, Н 11.16, N 3.33. Найдено (%): С 62.85, Н 11.73, N 3.35.

Пример 5. Додеканедил-1.12-бис(гидроксиэтилметилгексадециламмоний бромид) (5)

получен кипячением 2.2 молей гидроксиэтилметилгексадециламина в среде ацетонитрила с 1.0 молем соответствующего α,β-дибромдодекана в течение 50-60-часов. Выпавший после окончания реакции солевой осадок был отфильтрован, промыт ацетоном, перекристаллизован из смеси растворителей - ацетон/метанол и высушен в вакууме.

¹Н ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.; J, Гц): 0.85 [т, 6Н, 2х N⁺CH₂(CH₂)₁₃CH₂ CH ₃, J=7.13] 1.23-1.34 {уш.м., 68Н, [52Н, 2х N⁺CH₂(CH ₂)₁₃CH₂CH₃+16H, (CH ₂)₈sp.]} 1.71 {с, 8Н [4Н, 2х N⁺CH₂(CH₂)₁₃ CH ₂CH₃+4Н, 2х N⁺CH₂ CH ₂sp.]} 3.27 (с, 6Н, 2x N⁺ CH ₃) 3.45-3.51 [м, 8H, 2x N⁺(CH ₂)₂] 3.65 (с, 4Н, 2х N⁺CH₂ CH ₂OH) 4.07 (с, 4Н, 2х N⁺ CH ₂CH₂OH) 5.06 (с, 2Н, 2х N⁺CH₂CH₂OH).

ИК-спектр (KBr), ν/см^-1: 3261, 2919, 2850, 1469, 1379, 1085, 1053, 720.

Выход (92%). Формула: C₅₀H₁₀₆O₂N₂Br₂. Вычислено (%): С 64.75, Н 11.52, N 3.02. Найдено (%): С 64.42, Н 11.17, N 3.05.

Биологическая активность (цитотоксичность, доставка ДНК в клетки)

Пример 6. Определение цитотоксичности соединений к клеткам линии 293Т

Цитотоксичность определяли с помощью 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ реагента). Культуру клеток человека линии НЕК293Т рассаживают по 40 тыс клеток на лунку 96-луночного планшета за день до определения цитотоксичности из расчета получить на следующий день 50-70% монослоя. За час до добавления МТТ-реагента клеткам дают свежую среду DMEM без сыворотки и антибиотика. Делают серию последовательных разведений потенциальных трансфектантов в фосфатно-солевом буфере (ФСБ×1) рН 7.0 с конечной концентрацией 10^-3, 10^-2, 0,1 и 1 мг/мл, добавляют к раствору плазмидной ДНК и аккуратно пипетируют один раз. По истечении 15 минут инкубирования липокомплексы с 0.6 мкг плазмидной ДНК в суммарном объеме 20 мкл добавляют к клеткам без значительного перемешивания. Параллельно к клеткам добавляют индивидуальные вещества без ДНК в соответствующем количестве. По истечении 48 часов инкубации с соединениями к пробам добавляют по 20 мкл р-ра МТТ (5 мг/мл). После 3 часов инкубации с МТТ удаляют среду из лунок, стараясь не затрагивать кристаллы, растворяют кристаллы формазана в 200 мкл ДМСО. Далее определяют оптическую плотность на приборе Тесал Sunrise Basic при длине волны 492 нм с вычитанием фона. По полученным данным определяется CD₅₀ (концентрация соединения, при которой гибнет 50% популяции клеток). На диаграмме Фиг.1 представлены результаты определения цитотоксичности потенциальных трансфектантов методом МТТ-теста.

Штриховкой отмечены данные, соответствующие пробам ДНК+ исследуемые соединения, ромбами - пробы только с исследуемыми соединениями.

Как видно из диаграммы, заявляемые соединения (3-5) в комплексах с ДНК проявляют цитотоксичность, сравнимую с незамещенными аналогами (1) и (2). Все исследуемые соединения с ДНК оказывают менее токсичное воздействие на клетки, чем без ДНК. Полученные концентрации, при которых наблюдается 50% гибель клеток, оказываются ниже, чем требуется для эффективной доставки ДНК.

Пример 7. Проведение трансфекции с помощью соединения (5)

Монослойную культуру клеток человека линии НЕК293Т рассаживают по 40 тыс клеток на лунку за день до трансфекции из расчета получить на следующий день конфлуэнтность 50-70%. Для трансфекции НЕК293Т используют концентрацию 50-100 тыс клеток на лунку 96-луночного планшета. За час перед трансфекцией клеткам дают свежую среду DMEM без сыворотки и антибиотика. Трансфекции проводят также в 96-луночном планшете, эксперименты проводят в тройном повторе. Сначала делают серию последовательных разведений потенциальных трансфектантов в ФСБ (×1) рН 7.0 с конечной концентрацией 10^-3, 10^-2, 0,1 и 1 мг/мл, добавляют к раствору ДНК и аккуратно пипетируют один раз. По истечении 15 минут инкубирования липокомплексы с 0,6 мкг плазмидной ДНК peGFP-N1 (Clontech) в суммарном объеме 20 мкл добавляют к клеткам без значительного перемешивания. На следующие сутки флуоресценцию популяции клеток в планшете наблюдают на флуоресцентном микроскопе с обращенной оптикой. Через 48 часов после трансфекции проводят анализ методом проточной цитометрии, как описано далее. Получив результаты о предварительной функциональности новых соединений как трансфектантов, проводят оптимизацию соотношения количества трансфектанта к количеству плазмидной ДНК вблизи значений, при которых наблюдается максимальная трансфекционная эффективность. Используемый шаг в выбранном диапазоне составляет последовательное двукратное увеличение концентрации. Также оптимизируют продолжительность инкубации клеток с трансфекционной смесью и возможность комбинирования трансфекции. Оптимальное время инкубации с трансфектантом составляет 4 часа, по истечении которых среду в клетках меняют на полную среду DMEM с сывороткой и антибиотиком.

Определение эффективности трансфекции клеток методом проточной цитометрии

В исследовании степени трансфекции клеток используют метод проточной цитометрии. Каждую лунку планшета с клетками после инкубации с экспериментальными препаратами в течение 48 часов отмывают 200 мкл ФСБ (×1), обрабатывают трипсином, определяют цитотоксичность и фиксируют в 0,5% формалине. В полученной таким образом клеточной суспензии определяют методом проточной цитометрии процент клеток, экспрессирующих eGFP. Эта величина является мерой эффективности трансфекции. Клетки, инкубируемые без экспериментальных препаратов при тех же условиях, используют в качестве отрицательного контроля. Для сравнения проводится измерение процента eGFP положительных клеток, трансфицированных с помощью коммерческого препарата Metafectene easy по протоколу, предлагаемому производителем (Biontex, EU). Далее из полученных данных рассчитывают процент флуоресцентных клеток с использованием программы FACS Diva («Becton Dickinson», США), средние значения и стандартные отклонения для популяций. Результаты представляют как среднее значение и ошибку среднего для анализируемого соединения.

Микрофотография культуры трансфицированных клеток в флуоресцентном свете и данные эффективности трансфекции представлены на фигуре 2. Для соединения (5) наибольший процент трансфицированных клеток составляет 52±10% при концентрации 0.01 мг/мл (11 мкмоль/л). Эта рабочая концентрация ниже уровня CD₅₀ (концентрации, при которой гибнет 50% популяции клеток), что говорит о малой токсичности соединения.

Пример 8. Проведение трансфекции с помощью соединения ЦТАБ

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения ЦТАБ. Получены результаты количества трансфицированных клеток на уровне контроля.

Пример 9. Проведение трансфекции с помощью соединения (1)

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (1). Полученные результаты представлены на фигуре 3.

Для соединения (1) наибольший процент трансфицированных клеток составляет 6.2±1.2% при концентрации 0.01 мг/мл (130 мкмоль/л).

Пример 10. Проведение трансфекции с помощью соединения (2)

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (2). Полученные результаты представлены на фигуре 4.

Для соединения (2) наибольший процент трансфицированных клеток составляет 1.6±0.6% при концентрации 0.1 мг/мл (160 мкмоль/л).

Сравнение результатов по исследованию трансфекции при помощи соединений (2) и (1) показывает, что увеличение гидрофобности (длины алкильного радикала) существенно улучшает эффективность трансфекции (процент трансфицированных клеток). Аналогичная корреляция прослеживается и для гидроксиэтилированных ГПАВ. Поэтому в качестве заявляемых соединений предлагаются наиболее активные гексадецильные производные (3-5)

Пример 11. Проведение трансфекции с помощью соединения ЦГАБ

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения ЦГАБ. Получены результаты количества трансфицированных клеток на уровне негативного контроля.

Пример 12. Проведение трансфекции с помощью соединения (3)

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (3). Полученные результаты представлены на фигуре 5.

Наибольший процент трансфицированных клеток составляет 32±5% при концентрации 0.01 мг/мл (25 мкмоль/л). Таким образом, эта рабочая концентрация ниже уровня CD₅₀ (концентрации, при которой гибнет 50% популяции клеток), что говорит о малой токсичности соединения.

Пример 13. Проведение трансфекции с помощью соединения (4)

По указанному в примере 7 протоколу проводят тестирование трансфекционной эффективности соединения (4). Полученные результаты представлены на фигуре 6.

Наибольший процент трансфицированных клеток составляет 6.2±0.2% при концентрации 0.1 мг/мл (120 мкмоль/л).

Данные эффективности трансфекции по результатам проточной цитометрии клеток НЕК293Т через 48 часов после трансфекции объединены в таблице 1.

Данные табл.1 показывают, что

1. Гидроксиэтильные геминальные ПАВ проявляют более высокую трансфекционную эффективность при более низких концентрациях, чем соединения сравнения (монокатионные ПАВ ЦТАБ и ЦГАБ и незамещенные геминальные аналоги (1) и (2).

2. Среди заявляемых соединений наиболее высокий процент трансфицированных клеток получен для соединений (3) (m=4) и (5) (m=12).

3. Даже незначительное изменение структуры заявляемых ПАВ (изменение количества метиленовых звеньев в спейсере) приводит к значительному, в 5-9 раз, изменению эффективности трансфекции.

Таким образом, заявляемые гидроксиэтильные производные алкиламмонийного геминального поверхностно-активного вещества обладают способностью эффективно доставлять ДНК в клетки без вспомогательных агентов и низкой токсичностью.