ПОЛИПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОВНОСТЬЮ, И ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ

Список последовательностей

Настоящее изобретение включает список последовательностей.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим антимикробной активностью, и к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептиды. Изобретение также относится к конструкциям нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, включающим полинуклеотиды, а также к способам получения и применения полипептидов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Целью настоящего изобретения является предложение полипептидов, обладающих антимикробной активностью, и полинуклеотидов, кодирующих полипептиды.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим антимикробной активностью, выбранным из группы, состоящей из:

(a) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 60% идентичности с аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2;

(b) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется, по меньшей мере, при условиях средней жесткости с (i) нуклеотидной последовательностью, соответствующей положениям 496-558 из SEQ ID NO:1, (ii) с кДНК-последовательностью, содержащейся в нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 1-558 из SEQ ID NO:1, или (iii) с комплементарной цепью (i) или (ii);

(c) варианта, включающего консервативную замену, делецию и/или вставку одной или более аминокислоты аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2; и

(d) фрагмента (a) или (b), который обладает антимикробной активностью.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, обладающие антимикробной активностью, выбранные из группы, состоящей из:

(a) полинуклеотида, кодирующего полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 60% идентичности с аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2;

(b) полинуклеотида, имеющего, по меньшей мере, 60% идентичности с нуклеотидной последовательностью, соответствующей положениям 496-558 из SEQ ID NO:1; и

(c) полинуклеотида, который гибридизуется, по меньшей мере, при условиях средней жесткости с (i) нуклеотидной последовательностью, соответствующей положениям 496-558 из SEQ ID NO:1, (ii) с кДНК-последовательностью, содержащейся в нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 1-558 из SEQ ID NO:1, или (iii) с комплементарной цепью (i) или (ii).

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновых кислот, рекомбинантным экспрессирующим векторам и рекомбинантным клеткам-хозяевам, включающим полинуклеотиды.

Настоящее изобретение также относится к способам получения таких полипептидов, обладающих антимикробной активностью, включающим (a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, включающей полинуклеотид, кодирующий полипептид, при условиях, подходящих для получения полипептида; и (b) получение полипептида.

Настоящее изобретение также относится к способам применения полипептидов и полинуклеотидов по изобретению.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Антимикробная активность: Термин "антимикробная активность" определяется здесь как активность, которая способна уничтожать микробные клетки или ингибировать их рост. В контексте настоящего изобретения подразумевается, что термин "антимикробный" обозначает, что существует бактерицидный, и/или бактериостатический, и/или фунгицидный эффект, и/или фунгистатический эффект, и/или вируцидный эффект, где термин "бактерицидный" следует понимать, как «способный уничтожать бактериальные клетки». Термин "бактериостатический" следует понимать как «способный ингибировать бактериальный рост», т.е. ингибировать растущие бактериальные клетки. Термин "фунгицидный" следует понимать, как «способный уничтожать грибковые клетки». Термин "фунгистатический" следует понимать, как «способный ингибировать грибковый рост», т.е. ингибировать растущие грибковые клетки. Термин "вируцидный" следует понимать как «способный инактивировать вирус». Термин "микробные клетки" обозначает бактериальные или грибковые клетки (включая дрожжи). В контексте настоящего изобретения подразумевается, что термин "ингибирование роста микробных клеток" обозначает, что клетки не находятся в фазе роста, т.е. что они не способны размножаться.

Для целей настоящего изобретения антимикробную активность можно определить согласно процедуре, описанной Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2), p. 167-174 (1991). В качестве альтернативы, антимикробную активность можно определить согласно NCCLS-руководству из CLSI (Института клинических и лабораторных стандартов; широко известного как Национальный комитет клинических и лабораторных стандартов).

Полипептиды, обладающие антимикробной активностью, могут иметь способность уменьшать количество живых клеток Escherichia coli (DSM 1576) до 1/100 через 24 часа (предпочтительно, после 12 часов, более предпочтительно, через 8 часов, более предпочтительно, через 4 часа, более предпочтительно, через 2 часа, наиболее предпочтительно через 1 час, и в особенности через 30 минут) инкубирования при 20°C в 25%(масс./масс.) водном растворе полипептидов, обладающих антимикробной активностью; предпочтительно, в 10% (масс./масс.) водном растворе; более предпочтительно, в 5% (масс./масс.) водном растворе; еще более предпочтительно в 1% (масс./масс.) водном растворе; наиболее предпочтительно, в 0,5% (масс./масс.) водном растворе; и в особенности в 0,1% (масс./масс.) водном растворе полипептидов, обладающих антимикробной активностью.

Полипептиды, обладающие антимикробной активностью, также могут быть способны к ингибированию повышенного роста Escherichia coli (DSM 1576) в течение 24 часов при 25°C в субстрате микробного роста, при добавлении в концентрации 1000 м.д.; предпочтительно, при добавлении в концентрации 500 м.д.; более предпочтительно, при добавлении в концентрации 250 м.д.; еще более предпочтительно, при добавлении в концентрации 100 м.д.; наиболее предпочтительно, при добавлении в концентрации 50 м.д.; и в особенности, при добавлении в концентрации 25 м.д.

Полипептиды, обладающие антимикробной активностью, могут быть способны к уменьшению количества живых клеток Bacillus subtilis (ATCC 6633) до 1/100 через 24 часа (предпочтительно, через 12 часов, более предпочтительно, через 8 часов, более предпочтительно, через 4 часа, более предпочтительно, через 2 часа, наиболее предпочтительно, через 1 час, и в особенности, через 30 минут) инкубирования при 20°C в 25% (масс./масс.) водном растворе полипептидов, обладающих антимикробной активностью; предпочтительно, в 10% (масс./масс.) водном растворе; более предпочтительно, в 5% (масс./масс.) водном растворе; еще более предпочтительно в 1% (масс./масс.) водном растворе; наиболее предпочтительно, в 0,5% (масс./масс.) водном растворе; и в особенности в 0,1% (масс./масс.) водном растворе полипептидов, обладающих антимикробной активностью.

Полипептиды, обладающие антимикробной активностью, также могут быть способны к ингибированию повышенного роста Bacillus subtilis (ATCC 6633) в течение 24 часов при 25°C в субстрате микробного роста, при добавлении в концентрации 1000 м.д.; предпочтительно, при добавлении в концентрации 500 м.д.; более предпочтительно, при добавлении в концентрации 250 м.д.; еще более предпочтительно, при добавлении в концентрации 100 м.д.; наиболее предпочтительно, при добавлении в концентрации 50 м.д.; и в особенности, при добавлении в концентрации 25 м.д.

Полипептиды по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, и в наибольшей степени предпочтительно, по меньшей мере, 100% антимикробной активности полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в виде аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2.

Выделенный полипептид: Термин "выделенный полипептид", как он применяется здесь, обозначает полипептид, который является чистым, по меньшей мере, на 20%, предпочтительно, по меньшей мере, на 40% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 60% чистым, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% чистым, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 90% чистым, и в наибольшей степени предпочтительно, по меньшей мере, на 95% чистым, как определено с помощью SDS-PAGE.

По существу чистый полипептид: Термин "по существу чистый полипептид" обозначает здесь препарат полипептида, который содержит по большей части 10%, предпочтительно, по большей части 8%, более предпочтительно, по большей части 6%, более предпочтительно, по большей части 5%, более предпочтительно, по большей части 4%, по большей части 3%, еще более предпочтительно, по большей части 2%, наиболее предпочтительно, по большей части 1 %, и в наибольшей степени предпочтительно, по большей части 0,5% по массе другого полипептидного вещества, с которым он естественно ассоциирован. Таким образом, является предпочтительным, что по существу чистый полипептид является, по меньшей мере, на 94% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 96% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 96% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 97% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 98% чистым, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 99%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 99,5% чистым, и в наибольшей степени предпочтительно на 100% чистым по массе от общего полипептидного вещества, присутствующего в препарате.

Полипептиды по настоящему изобретению представлены, предпочтительно, в, по существу, чистой форме. В особенности является предпочтительным, чтобы пептиды были представлены в "по существу чистой форме", т.е. чтобы препарат полипептида был по существу свободен от другого полипептидного вещества, с которым он естественно ассоциирован. Это можно осуществить, например, путем получения пептида посредством хорошо известных рекомбинантных способов или с помощью классических способов очистки.

Здесь термин "по существу чистый полипептид" является синонимом терминов "выделенный полипептид" и "полипептид в выделенной форме".

Идентичность: Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывают параметром "идентичность".

Для целей настоящего изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с помощью программы FASTA, включенной в версию 2.Ox программного пакета FASTA (смотри W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; and W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). Применяемой выравнивающей матрицей является BLOSUM50, штраф на введение делеции составляет -12, и штраф на продолжение делеции составляет -2. Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с помощью того же алгоритма и пакета программного обеспечения, как описано выше. Применяемой выравнивающей матрицей является матрица идентичности, штраф на введение делеции составляет -16, и штраф на продолжение делеции составляет -4. В качестве альтернативы сравнение двух аминокислотных последовательностей определяют с помощью программы Needle из программного пакета EMBOSS (http://emboss.org) версии 2.8.0. Программа Needle применяет общий алгоритм сравнения, описанный в Needleman, S. B. и Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453. Применяемой замещающей матрицей является BLOSUM62, штраф на внесение делеции в выравнивание составляет 10, и штраф на продолжение делеции составляет 0,5. Степень идентичности между аминокислотной последовательностью по настоящему изобретению (такой, как аминокислотная последовательность, соответствующая положениям 1-43 из SEQ ID NO:2) и другой аминокислотной последовательностью рассчитывают как количество точных соответствий при сравнении двух последовательностей, деленное на длину (количество аминокислотных остатков) последовательности по настоящему изобретению; или в качестве альтернативы выходное устройство Needle "наибольшая идентичность" применяют как процент идентичности и рассчитывают следующим образом: (идентичные остатки × 100)/(длина сравнения - количество делеций при сравнении). Результат выражается как процент идентичности.

Полипептидный фрагмент: Термин "полипептидный фрагмент" определяется здесь как полипептид, имеющий одну или более аминокислот, делетированных из амино и/или карбоксильного конца SEQ ID NO:2 или ее гомологичной последовательности, где фрагмент обладает антимикробной активностью. В частном воплощении фрагмент включает, по меньшей мере, 15, предпочтительно, по меньшей мере, 16, более предпочтительно, по меньшей мере, 17, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 18, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 19 и в особенности, по меньшей мере, 20 расположенных друг за другом аминокислот из SEQ ID NO:2.

Фрагмент последовательности: Термин "фрагмент последовательности" определяется здесь как нуклеотидная последовательность, имеющая один или более нуклеотидов, делетированных из 5' и/или 3' конца SEQ ID NO:1, или ее гомологичная последовательность, где фрагмент последовательности кодирует полипептидный фрагмент, имеющий антимикробную активность.

Аллельный вариант: Термин "аллельный вариант" обозначает здесь одну из двух или более альтернативных форм гена, занимающего один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает естественно посредством мутации и может в результате привести к полиморфизму внутри популяций. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие альтернативные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

По существу чистый полинуклеотид: Термин "по существу чистый полинуклеотид", как он применяется здесь, обозначает полинуклеотидный препарат, свободный от других посторонних или не желательных полинуклеотидов и представленный в форме, подходящей для применения в системах получения белков методами генной инженерии. Таким образом, по существу чистый полинуклеотид содержит по большей части 10%, предпочтительно, по большей части 8%, более предпочтительно, по большей части 6%, более предпочтительно, по большей части 5%, более предпочтительно, по большей части 4%, более предпочтительно, по большей части 3%, еще более предпочтительно, по большей части 2%, наиболее предпочтительно, по большей части 1%, и в наибольшей степени предпочтительно, по большей части 0,5% по массе другого полинуклеотидного вещества, с которым он естественно ассоциирован. Однако по существу чистый полинуклеотид может включать природные 5' и 3' нетранслируемые участки, такие как промоторы и терминаторы. Является предпочтительным, чтобы по существу чистый полинуклеотид являлся, по меньшей мере, на 90% чистым, предпочтительно, по меньшей мере, на 92% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 94% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, 95% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 96% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере, на 97% чистым, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 98% чистым, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 99%, и в наибольшей степени предпочтительно, по меньшей мере, на 99,5% чистым по массе. Полинуклеотиды по настоящему изобретению представлены предпочтительно в по существу чистой форме. В особенности является предпочтительным, чтобы полинуклеотиды, описанные здесь, были представлены в "по существу чистой форме", т.е. чтобы препарат полинуклеотида являлся по существу свободным от другого полинуклеотидного вещества, с которым он естественно ассоциирован. Здесь, термин "по существу чистый полинуклеотид" является синонимом терминов "выделенный полинуклеотид" и "полинуклеотид в выделенной форме". Полинуклеотиды могут иметь геномное, кДНК-, РНК-, полусинтетическое, синтетическое происхождение или любые их комбинации.

кДНК: Термин "кДНК" определяется здесь как молекула ДНК, которую можно получить с помощью обратной транскрипции из матричной сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической клетки. кДНК лишена интронных последовательностей, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Инициирующий, первичный РНК транскрипт является предшественником мРНК, которая процессируется через ряд стадий пока не появится в виде матричной сплайсированной мРНК. Эти стадии включают удаление интронных последовательностей с помощью процесса, называемого сплайсинг. кДНК, выделенная из мРНК, таким образом, лишена любых интронных последовательностей.

Конструкция нуклеиновой кислоты: Термин "конструкция нуклеиновой кислоты", как он применяется здесь, обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, или одноцепочечную, или двухцепочечную, которая выделена из природного гена либо которую модифицировали с получением сегментов нуклеиновых кислот таким образом, что иначе они не могли бы существовать в природе. Термин конструкция нуклеиновой кислоты является синонимом термина "экспрессирующая кассета", когда конструкция нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, требующиеся для экспрессии кодирующей последовательности по настоящему изобретению.

Контрольная последовательность: Термин "контрольные последовательности" определяется здесь, чтобы включить все компоненты, которые необходимы или полезны для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению. Каждая контрольная последовательность может быть нативной или чужеродной по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Такие контрольные последовательности включают, но не ограничены ими, лидер, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум, контрольные последовательности включают промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Контрольные последовательности могут обеспечиваться линкерами с целью введения специфических сайтов рестрикции, облегчающих лигирование контрольных последовательностей с кодирующим участком нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид.

Функционально связанный: Термин "функционально связанный" обозначает здесь конфигурацию, в которой контрольная последовательность размещена в подходящем положении по отношению к кодирующей последовательности полинуклеотидной последовательности, так что контрольная последовательность направляет экспрессию кодирующей последовательности полипептида.

Кодирующая последовательность: При использовании здесь, термин "кодирующая последовательность" обозначает нуклеотидную последовательность, которая непосредственно определяет аминокислотную последовательность ее белкового продукта. Границы кодирующей последовательности в основном определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается с ATG-старт-кодона или альтернативных старт-кодонов, таких как GTG и TTG. Кодирующей последовательностью может быть ДНК, кДНК или рекомбинантная нуклеотидная последовательность.

Экспрессия: Термин "экспрессия" включает любую стадию, вовлеченную в продукцию полипептида, включающую, но не ограниченную ими, транскрипцию, пост-транскрипционную модификацию, трансляцию, пост-трансляционную модификацию и секрецию.

Экспрессирующий вектор: Термин "экспрессирующий вектор" определяется здесь как линейная или циклическая молекула ДНК, которая включает полинуклеотид, кодирующий полипептид по изобретению, и который функционально связан с дополнительными нуклеотидами, которые обеспечиваются для его экспрессирования.

Клетка-хозяин: Термин "клетка-хозяин", как он применяется здесь, включает любой тип клетки, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции и подобным конструкции нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотид по настоящему изобретению.

Модификация: Термин "модификация" обозначает здесь любую химическую модификацию полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2, а также обозначает генетическую манипуляцию с ДНК, кодирующей полипептид. Модификация(и) может представлять собой замену(ы), делецию(и) и/или вставку(и) аминокислоты(аминокислот), а также замену(ы) аминокислотной боковой цепи(ей); или может представлять собой применение не природных аминокислот с подобными характеристиками аминокислотной последовательности. В особенности, модификация(и) может представлять собой амидирования, такие как амидирование C-конца.

Искусственный вариант: При использовании здесь, термин "искусственный вариант" обозначает полипептид, обладающий антимикробной активностью, полученный с помощью организма, экспрессирующего модифицированную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. Модифицированную нуклеотидную последовательность получают посредством вмешательства человека с помощью модификации нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO:1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полипептиды, обладающие антимикробной активностью

В первом аспекте настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, имеющим аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности с аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2 (т.е. зрелый полипептид), по меньшей мере, 60%, предпочтительно, по меньшей мере, 65%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, и в наибольшей степени предпочтительно, по меньшей мере, 97%, и которые имеют антимикробную активность (здесь и далее "гомологичные полипептиды"). В предпочтительном аспекте гомологичные полипептиды имеют аминокислотную последовательность, которая отличается десятью аминокислотами, предпочтительно, пятью аминокислотами, более предпочтительно, четырьмя аминокислотами, еще более предпочтительно тремя аминокислотами, наиболее предпочтительно, двумя аминокислотами, и в наибольшей степени предпочтительно, одной аминокислотой от аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2.

Полипептид по настоящему изобретению предпочтительно включает аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, который обладает антимикробной активностью. В предпочтительном аспекте, полипептид включает аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте, полипептид включает аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 1-21 из SEQ ID NO:2, или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, который обладает антимикробной активностью. В другом предпочтительном аспекте, полипептид включает аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 1-21 из SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте, полипептид состоит из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:2 или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, который обладает антимикробной активностью. В другом предпочтительном аспекте, полипептид состоит из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте, полипептид состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2 или ее аллельного варианта; или ее фрагмента, который обладает антимикробной активностью. В другом предпочтительном аспекте, полипептид состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2.

Во втором аспекте, настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим антимикробной активностью, которые кодируются полинуклеотидами, которые гибридизуются при условиях очень низкой жесткости, предпочтительно, при условиях низкой жесткости, более предпочтительно, при условиях средней жесткости, более предпочтительно, при условиях средневысокой жесткости, еще более предпочтительно, при условиях высокой жесткости, и наиболее предпочтительно, при условиях очень высокой жесткости с (i) нуклеотидной последовательностью, соответствующей положениям 496-558 из SEQ ID NO:1, (ii) с кДНК-последовательностью, содержащейся в нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 1-558 из SEQ ID NO:1, (iii) с фрагментом последовательности (i) или (ii), или (iv) с комплементарной цепью (i), (ii), или (iii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). Фрагмент последовательности SEQ ID NO:1 содержит, по меньшей мере, 100 расположенных друг за другом нуклеотидов или предпочтительно, по меньшей мере, 200 расположенных друг за другом нуклеотидов. Кроме того, фрагмент последовательности может кодировать полипептидный фрагмент, который обладает антимикробной активностью.

Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:1 или ее фрагмент, а также аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2 или ее фрагмент могут применяться для создания зонда нуклеиновой кислоты для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей полипептиды, обладающие антимикробной активностью, из штаммов или видов различного происхождения согласно методам, хорошо известным из уровня техники. В особенности, такие зонды могут применяться для гибридизации с геномной или кДНК интересующего рода или вида, с последующими стандартными процедурами блоттинга по Саузерну для того, чтобы идентифицировать и выделить там соответствующий ген. Такие зонды предположительно могут быть короче, чем целая последовательность, но должны быть длиной, по меньшей мере, 14, предпочтительно, по меньшей мере, 25, более предпочтительно, по меньшей мере, 35, и наиболее предпочтительно, длиной, по меньшей мере, 70 нуклеотидов. Однако является предпочтительным, чтобы длина зонда нуклеиновой кислоты составляла, по меньшей мере, 100 нуклеотидов. Например, зонд нуклеиновой кислоты может быть длиной, по меньшей мере, 200 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере, 270 нуклеотидов. Могут применяться оба зонда ДНК и РНК. Зонды обычно метят для обнаружения соответствующего гена (например, с помощью ³²P, ³H, ³⁵S, биотина или авидина). Такие зонды охвачены настоящим изобретением.

Библиотека геномной ДНК или кДНК, полученная из каких-то других организмов, может быть, таким образом, проскринирована с ДНК, которая гибридизуется с зондами, описанными выше, и которая кодирует полипептид, обладающий антимикробной активностью. Геномная или другая ДНК из каких-то других организмов может быть разделена с помощью электрофореза на агарозном или полиакриламидном геле или с помощью других методов разделения. ДНК из библиотек или разделенная ДНК может быть перенесена и иммобилизована на нитроцеллюлозу или другую подходящую подложку. Для того чтобы идентифицировать клон или ДНК, которая является гомологичной с SEQ ID NO:1 или с ее фрагментом, в блоттинге по Саузерну применяется подложка.

Для целей настоящего изобретения гибридизация выявляет, что нуклеотидная последовательность гибридизуется с меченым зондом нуклеиновой кислоты, соответствующим нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, ее комплементарной цепью или фрагментом ее последовательности при условиях от очень низкой до очень высокой жесткости. Молекулы, с которыми при этих условиях гибридизуется зонд нуклеиновой кислоты, можно обнаруживать, используя рентгеновскую пленку.

В предпочтительном аспекте, зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид из SEQ ID NO:2, или фрагмент его последовательности. В другом предпочтительном аспекте, зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO:1. В другом предпочтительном аспекте, зонд нуклеиновой кислоты представляет собой участок из SEQ ID NO:1, кодирующий зрелый полипептид.

Для длинных зондов длиной, по меньшей мере, 100 нуклеотидов определяют условия предгибридизации и гибридизации от условий очень низкой до очень высокой жесткости при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 мкг/мл порезанной и денатурированной ДНК спермы лосося, и или 25% формамид для условий очень низкой и низкой жесткости, 35% формамид для условий средней и средневысокой жесткости, или 50% формамид для условий высокой и очень высокой жесткости, с последующими стандартными процедурами блоттинга по Саузерну оптимально в течение 12-24 часов.

Для длинных зондов длиной, по меньшей мере, 100 нуклеотидов, подложку в конце отмывают три раза каждый по 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS предпочтительно, по меньшей мере, при 45°C (очень низкая жесткость), более предпочтительно, по меньшей мере, при 50°C (низкая жесткость), более предпочтительно, по меньшей мере, при 55°C (средняя жесткость), более предпочтительно, по меньшей мере, при 60°C (средневысокая жесткость), еще более предпочтительно, по меньшей мере, при 65°C (высокая жесткость), и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, при 70°C (очень высокая жесткость).

Для коротких зондов, длина которых составляет примерно от 15 нуклеотидов до примерно 70 нуклеотидов, условия жесткости определяют как предгибридизацию, гибридизацию и отмывку после гибридизации при температуре ниже рассчетной Tm, рассчитанной согласно Bolton и McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) примерно на 5°C-10°C в 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 мМ EDTA, 0,5% NP-40, 1X растворе Денхардта, 1 мМ пирофосфате натрия, 1 мМ монофосфате натрия, 0,1 мМ ATP и 0,2 мг дрожжевой РНК на мл раствора с последующими стандартными процедурами блоттинга по Саузерну.

Для коротких зондов, длина которых составляет примерно от 15 нуклеотидов до примерно 70 нуклеотидов, подложку отмывают один раз в 6X SCC плюс 0,1% SDS в течение 15 минут с применением 6X SSC при температуре ниже рассчитанной Tm примерно на 5°C-10°C.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к искусственным вариантам, включающим консервативную замену, делецию и/или вставку одной или более аминокислот из SEQ ID NO:2 или ее зрелого полипептида. Предпочтительно, аминокислотные замены имеют минорную природу, то есть это консервативные аминокислотные замены или вставки, которые не оказывают значительного влияния на сборку и/или активность белка; короткие делеции, обычно от одной до примерно 10 аминокислот; короткие амино- или карбоксиконцевые удлинения, такие, как аминоконцевой остаток метионина; короткий линкерный пептид до примерно 20-25 остатков; или короткое удлинение, такое как полигистидиновый тракт, антигенный эпитоп или связывающий домен, которое облегчает очистку с помощью изменения результирующего заряда или другой функции.

Примеры консервативных замен представлены в группе основных аминокислот (аргинина, лизина и гистидина), кислых аминокислот (глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), полярных аминокислот (глутамина и аспарагина), гидрофобных аминокислот (лейцина, изолейцина и валина), ароматических аминокислот (фенилаланина, триптофана и тирозина) и коротких аминокислот (глицина, аланина, серина, треонина и метионина). Аминокислотные замены, которые в основном не изменяют специфической активности, известны из уровня техники и описаны, например, в H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Наиболее часто встречающиеся замены представляют собой Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

В дополнение к 20 стандартным аминокислотам, нестандартные аминокислоты (такие как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и альфа-метилсерин) могут быть заменены на аминокислотные остатки полипептидов дикого типа. Ограниченное количество неконсервативных аминокислот, аминокислоты, которые не кодируются генетическим кодом, и не природные аминокислоты могут быть заменены аминокислотными остатками. "Неприродные аминокислоты" были модифицированы после белкового синтеза и/или имеют химическую структуру в своей боковой цепи(ях), отличную от той, что имеют стандартные аминокислоты. Неприродные аминокислоты могут быть химически синтезированы и, предпочтительно, являются коммерчески доступными и включают пиперидин-N-карбоновую кислоту, тиазолидин-карбоксильную кислоту, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин и 3,3-диметилпролин.

В качестве альтернативы, аминокислотные замены имеют такую природу, что физико-химические свойства полипептидов изменяются. Например, аминокислотные замены могут улучшать термостабильность полипептида, изменять специфичность к субстрату, изменять оптимальное значение pH и подобные.

Незаменимые аминокислоты в родительском полипептиде можно идентифицировать согласно процедурам, известным из уровня техники, таким как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последнем методе единичные мутации аланина вводят в каждый остаток молекулы, и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность (т.е. на антимикробную активность) для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности молекулы. Смотри также, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Биологическое взаимодействие можно также определить с помощью физического анализа структуры, как определяют такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоафинное мечение совместно с мутацией предполагаемого сайта контакта аминокислот. Смотри, например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64. Идентичности незаменимых аминокислот можно также получить из анализа идентичности с полипептидами, которые относятся к полипептидам согласно изобретению.

Единичные или множественные аминокислотные замены могут быть произведены и протестированы с использованием известных методов мутагенеза, рекомбинации и/или перетасовки, с последующей существенной процедурой скрининга, такими как те, что описаны в Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; or WO 95/22625. Другие методы, которые могут применяться, включают подверженный ошибкам ПЦР, фаговый дисплей (например, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204), сайт-направленный мутагенез (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

Методы мутагенеза/перетасовки могут быть объединены с высоко производительными, автоматическими способами скрининга для обнаружения активности клонированных, подвергнутых мутагенезу полипептидов, экспрессирующихся клетками-хозяевами. Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно получить из клеток-хозяев, и их последовательность можно быстро определить с использованием стандартных методов, известных из уровня техники. Эти методы дают возможность быстрого определения важности индивидуальных аминокислотных остатков в интересующем полипептиде и могут применяться к полипептидам неизвестной структуры.

Общее количество аминокислотных замен, делеций и/или вставок аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2, составляет 10, предпочтительно 9, более предпочтительно 8, более предпочтительно 7, более предпочтительно по большей части 6, более предпочтительно по большей части 5, более предпочтительно 4, еще более предпочтительно 3, наиболее предпочтительно 2 и в наибольшей степени предпочтительно 1.

В отдельном воплощении пептиды по изобретению включают, по меньшей мере, 4 цистеиновых остатка, предпочтительно, полипептиды включают ровно 4 цистеиновых остатка. В другом воплощении, полипептиды являются циклическими полипептидами.

N-концевое продолжение

N-концевое продолжение полипептидов по изобретению соответственно может состоять из 1-50 аминокислот, предпочтительно, из 2-20 аминокислот, особенно из 3-15 аминокислот. В одном воплощении N-концевое продолжение пептида не содержит Arg (R). В другом воплощении N-концевое продолжение включает kex2 или kex2-подобные сайты расщепления, как дополнительно определено ниже. В предпочтительном воплощении, N-концевое продолжение представляет собой пептид, включающий, по меньшей мере, два GIu (E) и/или Asp (D) аминокислотных остатка, такое как N-концевое продолжение, включающее одну из следующих последовательностей: EAE, EE, DE и DD.

Kex2 сайты

Kex2 сайты (смотри, например, Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") и kex2-подобные сайты представляют собой сайты с двумя точками узнавания (т.е. сайты расщепления), обнаруженные между участком, кодирующим пропептид, и зрелым участком некоторых белков.

В определенных случаях было показано, что вставка kex2 сайта или kex2-подобного сайта улучшает правильное процессирование эндопептидазы в сайте расщепления пропептида, что приводит в результате к увеличению уровня секреции белка.

В контексте изобретения вставка kex2 или kex2-подобного сайта приводит в результате к возможности получения расщепления в определенном положении в N-концевом продолжении, приводящего в результате к получению более протяженного антимикробного полипептида по сравнению со зрелым полипептидом, показанным в виде аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2.

Слитые полипептиды

Полипептиды по настоящему изобретению также включают слитые полипептиды или способные к расщеплению слитые полипептиды, в которых другой полипептид сливается с N-концом или C-концом полипептида по изобретению или его фрагмента. Слитый полипептид получают путем сливания нуклеотидной последовательности (или ее части), кодирующей другой полипептид, с нуклеотидной последовательностью (или ее частью) по настоящему изобретению. Методы для получения слитых полипептидов известны из уровня техники и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, так, чтобы они находились в рамке и чтобы экспрессия слитого полипептида находилась под контролем того же промотора(ов) и терминатора.

Источники полипептидов, обладающих антимикробной активностью

Полипептид по настоящему изобретению можно получить из микроорганизмов любого происхождения. Для целей настоящего изобретения термин "полученный из", как он применяется здесь в связи с данным источником, будет обозначать, что полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, получают с помощью источника или штамма, в который вставили нуклеотидную последовательность из источника. В предпочтительном аспекте, полипептид, полученный из данного источника, секретируется во внеклеточное пространство.

Полипептид по настоящему изобретению может представлять собой бактериальный полипептид. Например, полипептид может представлять собой грамположительный бактериальный полипептид, такой как Bacillus полипептид, например, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis полипептид; или Streptomyces полипептид, например, Streptomyces lividans или Streptomyces murinus полипептид; или грамотрицательный бактериальный полипептид, например, E. coli или Pseudomonas sp. полипептид.

Полипептид по настоящему изобретению может также представлять собой грибковый полипептид и, более предпочтительно, дрожжевой полипептид, такой как Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia полипептид; или более предпочтительно, мицеллиальный грибковый полипептид, такой как Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium или Trichoderma полипептид.

В предпочтительном аспекте, полипептид представляет собой Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis полипептид, обладающий антимикробной активностью.

В другом предпочтительном аспекте, полипептид представляет собой Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma Iongibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride полипептид.

В другом предпочтительном аспекте, полипептид представляет собой Arenicola marina полипептид, например, полипептид из SEQ ID NO:2.

Следует понимать, что для вышеуказанных видов изобретение охватывает оба состояния - совершенное и несовершенные состояния, и другие таксономические эквиваленты, например анаморфы, вне зависимости от названия вида, под которым они известны. Специалисты в данной области легко распознают идентичность подходящих эквивалентов.

Штаммы этих видов легко коммерчески доступны из ряда коллекций клеточных культур, таких как Американская Типированная Коллекция Клеточных Культур (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), и Коллекция Клеточных культур Сельскохозяйственной Исследовательской Службы Патентов, Северного Регионального Исследовательского Центра (NRRL).

Кроме того, такие полипептиды можно идентифицировать и получить из других источников, включающих микроорганизмы, выделенные из природных источников (например, почвы, компоста, воды и т.д.) с применением вышеуказанных зондов. Методики выделения микроорганизмов из естественных сред обитания хорошо известны из уровня техники. Полинуклеоитид можно затем получить путем подобного скрининга геномной или кДНК библиотеки другого микроорганизма. Как только с помощью зонда(ов) обнаруживают полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, полинуклеотид можно выделить или клонировать с применением методов, которые являются хорошо известными из уровня техники специалисту в данной области (смотри, например, Sambrook et al., 1989, supra).

Полипептиды по настоящему изобретению также включают слитые полипептиды или способные к расщеплению слитые полипептиды, в которых другой полипептид сливается с N-концом или C-концом полипептида по изобретению или его фрагмента. Слитый полипептид получают путем сливания нуклеотидной последовательности (или ее части), кодирующей другой полипептид, с нуклеотидной последовательностью (или ее частью) по настоящему изобретению. Методы для получения слитых полипептидов известны из уровня техники и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, так чтобы они находились в рамке и чтобы экспрессия слитого полипептида находилась под контролем того же промотора(ов) и терминатора.

Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид по настоящему изобретению. В предпочтительном аспекте, нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO:1. В другом предпочтительном аспекте, нуклеотидная последовательность представляет собой участок, кодирующий зрелый полипептид, из SEQ ID NO:1. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2, или его зрелый полипептид, который отличается от SEQ ID NO:1 качеством вырожденности генетического кода. Настоящее изобретение также относится к фрагментам последовательностей SEQ ID NO:1, которые кодируют фрагменты SEQ ID NO:2, которые имеют антимикробную активность.

Настоящее изобретение также относится к мутантным полинуклеотидам, включающим, по меньшей мере, одну мутацию в кодирующую зрелый полипептид последовательность SEQ ID NO:1, в которой мутантная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2.

Методы, применяемые для выделения или клонирования полинуклеотида, кодирующего полипептид, известны из уровня техники и включают выделение из геномной ДНК, получение из кДНК или их комбинацию. Клонирование полинуклеотидов по настоящему изобретению из такой геномной ДНК может быть эффективным, например, при применении хорошо известной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или скрининга антителами экспрессирующих библиотек для обнаружения клонированных фрагментов ДНК с подобными структурными чертами. Смотри, например, lnnis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Могут применяться другие процедуры амплификации нуклеиновых кислот, такие как лигазная цепная реакция (LCR), активированная лигированием транскрипция (LAT), и амплификация, основанная на нуклеотидной последовательности (NASBA). Полинуклеотиды можно клонировать из штамма Arenicola или из другого родственного организма и, таким образом, например, можно получить аллельный или видовой вариант участка нуклеотидной последовательности, кодирующего полипептид.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, имеющим нуклеотидные последовательности, которые имеют степень идентичности с последовательностью SEQ ID NO:1, кодирующей зрелый полипептид (т.е. соответствующей положениям нуклеотидов 496-558), по меньшей мере, 60%, предпочтительно, по меньшей мере, 65%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 97% идентичности участка, который кодирует активный полипептид.

Модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид по настоящему изобретению, может быть необходимой для синтеза полипептидов, по существу подобных полипептиду. Термин "по существу подобный" полипептиду обозначает неприродные формы полипептида. Эти полипептиды могут отличаться некоторыми техническими моментами от полипептида, выделенного из его естественного источника, например искусственные варианты, которые отличаются специфической активностью, термостабильностью, оптимальным значением pH или тому подобным. Вариант последовательности можно создать на основе нуклеотидной последовательности, представленной в виде участка, кодирующего полипептид, из SEQ ID NO:1, например фрагмента ее последовательности, и/или путем введения нуклеотидных замен, которые не порождают другой аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью, но которые соответствуют применяемым кодонам организма-хозяина, предназначенного для продукции фермента, или путем введения нуклеотидных замен, которые могут породить другую аминокислотную последовательность. Для общего описания нуклеотидной замены смотри, например, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Для специалистов в данной области будет очевидно из уровня техники, что такие замены могут быть произведены вне участков, критических для функции молекулы, и все равно могут привести в результате к получению активного полипептида. Аминокислотные остатки, существенные для активности полипептида, кодируемого выделенным полинуклеотидом по изобретению, и, таким образом, предпочтительно не подвергающиеся заменам, могут быть идентифицированы согласно процедурам, известным из уровня техники, таким как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (смотри, например, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последнем методе мутации вводят в каждый положительно заряженный остаток в молекуле, и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на антимикробную активность для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности молекулы. Сайты взаимодействия субстрат-фермент можно также определить с помощью анализа трехмерной структуры, как это определяют с помощью таких методов, как анализ ядерным магнитным резонансом, кристаллография или фотоафинное мечение (смотри, например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et ai, 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептид по настоящему изобретению, которые гибридизуются при условиях низкой жесткости, предпочтительно, при условиях средней жесткости, более предпочтительно, при условиях средневысокой жесткости, еще более предпочтительно, при условиях высокой жесткости, и наиболее предпочтительно, при условиях очень высокой жесткости с (i) нуклеотидной последовательностью, соответствующей положениям 496-558 из SEQ ID NO:1, (ii) с последовательностью кДНК, содержащейся в нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 1-558 из SEQ ID NO:1, или (iii) с комплементарной цепью (i) или (ii); или с аллельными вариантами и фрагментами их последовательностей (Sambrook et ai., 1989, supra), как определено здесь.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, полученным путем (a) гибридизации популяции ДНК при условиях низкой, средней, средневысокой, высокой или очень высокой жесткости с (i) нуклеотидной последовательностью, соответствующей положениям 496-558 из SEQ ID NO:1, (ii) с последовательностью кДНК, содержащейся в нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 1-558 из SEQ ID NO:1, или (iii) с комплементарной цепью (i) или (ii); и (b) выделения гибридизующегося полинуклеотида, который кодирует полипептид, обладающий антимикробной активностью.

Конструкции нуклеиновых кислот

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновых кислот, включающим выделенный полинуклеотид по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или более контрольными последовательностями, которые направляют экспрессию кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине при условиях, совместимых с контрольными последовательностями.

Выделенным полинуклеотидом, кодирующим полипептид по настоящему изобретению, можно манипулировать разнообразными путями для обеспечения экспрессии полипептида. Манипуляция с полинуклеотидной последовательностью перед ее вставкой в вектор может быть желательна или необходима в зависимости от экспрессирующего вектора. Методы модификации полинуклеотидных последовательностей, применяющие технологии рекомбинантной ДНК, хорошо известны из уровня техники.

Контрольная последовательность может представлять собой подходящую промоторную последовательность, нуклеотидную последовательность, которую распознает клетка-хозяин для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению. Промоторная последовательность содержит транскрипционные контрольные последовательности, которые опосредуют экспрессию полипептида. Промотор может представлять собой любую нуклеотидную последовательность, которая показывает транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине, включающую мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получена из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, или гомологичные или гетеролигичные клетке-хозяину.

Примерами подходящих промоторов для направления транскрипции конструкций нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, особенно в бактериальной клетке-хозяине, являются промоторы, полученные из E. coli lac оперона, гена агаразы (dagA) Streptomyces coelicolor, гена левансахарозы (sacB) Bacillus subtilis, гена альфа-амилазы (amyL) Bacillus licheniformis, гена мальтогенной амилазы (amyM) Bacillus stearothermophilus, гена альфа-амилазы (amyQ) Bacillus amyloliquefaciens, гена пенициллиназы (penP) Bacillus licheniformis, генов xylA и xylB Bacillus subtilis, и прокариотического гена бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et ai, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731 ), а также tac промотора (DeBoer et ai, 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Дополнительные промоторы описаны в "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94; and in Sambrook et al., 1989, supra.

Примерами подходящих промоторов для направления транскрипции конструкций нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в мицеллиальной грибковой клетке-хозяине являются промоторы, полученные из генов TAKA амилазы Aspergillus oryzae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, кислотоустойчивой альфа-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы (glaA) Aspergillus niger или Aspergillus awamori, липазы Rhizomucor miehei, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфат изомеразы Aspergillus oryzae, ацетамидазы Aspergillus nidulans, амилоглюкозидазы (WO 00/56900) Fusarium venenatum, Daria (WO 00/56900) Fusarium venenatum, Quinn (WO 00/56900) Fusarium venenatum, трипсин-подобной протеазы (WO 96/00787) Fusarium venenatum, бета-глюкозидазы Trichoderma reesei, целлобиогидролазы I Trichoderma reesei, эндоглюканазы I Trichoderma reesei, эндоглюканазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы III Trichoderma reesei, эндоглюканазы IV Trichoderma reesei, эндоглюканазы V Trichoderma reesei, ксиланазы I Trichoderma reesei, ксиланазы II Trichoderma reesei, бета-ксилозидазы Trichoderma reesei, а также промотора NA2-tpi (гибрида промоторов генов нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger и триозофосфат изомеразы Aspergillus oryzae); и их мутантных, усеченных и гибридных промоторов.

В дрожжевом хозяине применяемые промоторы получают из генов энолазы (ENO-1) Saccharomyces cerevisiae, галактокиназы (GAL1) Saccharomyces cerevisiae, алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ADH1,ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae, триозифосфат изомеразы (TPI) Saccharomyces cerevisiae, металлотионина (CU P1) Saccharomyces cerevisiae, и 3-фосфоглицерат киназы Saccharomyces cerevisiae. Другие применяемые промоторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

Контрольная последовательность может также представлять собой подходящую последовательность терминатора транскрипции, последовательность, распознаваемую клеткой-хозяином при терминации транскрипции. Терминаторная последовательность функционально связана с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. По настоящему изобретению может применяться любой терминатор, который функционален в выбранной клетке-хозяине.

Предпочтительные терминаторы для мицеллиальных грибковых клеток-хозяев получают из генов TAKA амилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, синтетазы Aspergillus nidulans anthranilate, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger и трипсин-подобной протеазы Fusarium oxysporum.

Предпочтительные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов энолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома (CYC1) Saccharomyces cerevisiae и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae. Другие применяемые терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны Romanos et al., 1992, supra.

Контрольная последовательность может также представлять собой подходящую лидерную последовательность, нетранслируемый участок мРНК, который является важным для трансляции клеткой-хозяином. Лидерная последовательность функционально связана с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Любая лидерная последовательность, которая является функциональной в выбранной клетке-хозяине, может применяться по настоящему изобретению.

Предпочтительные лидеры для мицеллиальных грибковых клеток-хозяев получают из генов TAKA амилазы Aspergillus oryzae и триозофосфат изомеразы Aspergillus nidulans. Подходящие лидеры для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов энолазы (ENO-1) Saccharomyces cerevisiae, 3-фосфоглицерат киназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae.

Контрольная последовательность может также представлять собой последовательность полиаденилирования, последовательность, функционально связанную с 3'-концом нуклеотидной последовательности и которая, транскрибируясь, распознается клеткой-хозяином как сигнал для добавления полиаденозиновых остатков к транскрибируемой мРНК. Любая последовательность полиаденилирования, которая является функциональной в выбранной клетке-хозяине, может применяться по настоящему изобретению.

Предпочтительные последовательности полиаденилирования для мицеллиальных грибковых клеток-хозяев получают из генов TAKA амилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилат синтетазы Aspergillus nidulans, трипсин-подобной протеазы Fusarium oxysporum и альфа-глюкозидазы Aspergillus niger.

Применяемые последовательности полиаденилирования описаны Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

Контрольная последовательность может также представлять собой кодирующий сигнальный пептид участок, который кодирует аминокислотную последовательность, связанную с аминоконцом полипептида, и направляет кодируемый полипептид по пути клеточной секреции. 5'-конец кодирующей последовательности нуклеотидной последовательности может, по сути, содержать кодирующий сигнальный пептид участок, природно связанный в трансляционную рамку считывания с сегментом кодирующего участка, который кодирует секретирующийся полипептид. В качестве альтерантивы, 5'-конец кодирующей последовательности может содержать кодирующий сигнальный пептид участок, который является чужеродным по отношению к кодирующей последовательности. Кодирующий сигнальный пептид чужеродный участок может требоваться там, где кодирующая последовательность не содержит природного кодирующего сигнальный пептид участка. В качестве альтернативы, кодирующий сигнальный пептид чужеродный участок может просто замещать природный кодирующий сигнальный пептид участок для того, чтобы усилить секрецию полипептида. Однако по настоящему изобретению может применяться любой кодирующий сигнальный пептид участок, который направляет экспрессирующийся полипептид по секреторному пути в выбранной клетке-хозяине.

Эффективные кодирующие сигнальный пептид участки для бактериальных клеток-хозяев представляют собой кодирующие сигнальный пептид участки, полученные из генов NCIB 1 1837 мальтогенной амилазы Bacillus, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis, нейтральных протеаз (nprT, nprS, nprM) Bacillus stearothermophilus и prsA Bacillus subtilis. Дополнительные сигнальные пептиды описаны Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Эффективные кодирующие сигнальный пептид участки для мицеллиальных грибковых клеток-хозяев представляют собой кодирующие сигнальный пептид участки, полученные из генов TAKA амилазы Aspergillus oryzae, нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, целлюлазы Humicola insolens и липазы Humicola lanuginosa.

В предпочтительном аспекте, кодирующий сигнальный пептид участок представляет собой нуклеотидную последовательность, соответствующую положениям 1-72 из SEQ ID NO:1, которая кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую положениям от -165 до -142 из SEQ ID NO:2.

Применяемые сигнальные пептиды для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и инвертазы Saccharomyces cerevisiae. Другие применяемые кодирующие сигнальный пептид участки описаны Romanos et al., 1992, supra.

Контрольная последовательность может также представлять собой кодирующий пропептид участок, который кодирует аминокислотную последовательность, расположенную на аминоконце полипептида. Полученный в результате полипептид известен как профермент или прополипептид (или в некоторых случаях зимоген). Прополипептид является в основном неактивным и может быть превращен в активный зрелый полипептид с помощью каталитического или автокаталитического расщепления пропептида от прополипептида. Кодирующий пропептид участок можно получить из генов щелочной фосфатазы (aprE) Bacillus subtilis, нейтральной протеазы (nprf) Bacillus subtilis, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei и лакказы (WO 95/33836) Myceliophthora thermophila.

В предпочтительном аспекте, кодирующий пропептид участок представляет собой нуклеотидную последовательность, соответствующую положениям 73-495 из SEQ ID NO:1, которая кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую положениям от -141 до -1 из SEQ ID NO:2.

Там, где на аминоконце полипептида присутствуют оба участка - сигнальный пептид и пропептид, пропептидный участок располагается за аминоконцом полипептида, и участок сигнального пептида располагается за аминоконцом пропептидного участка.

Также может быть желательным добавление регуляторных последовательностей, которые дают возможность регулировать экспрессии полипептида по отношению к росту клетки-хозяина. Примеры регуляторных систем представляют собой те, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, включающий присутствие регуляторного соединения. Регуляторные системы в прокариотических системах включают системы операторов lac, tac и trp. В дрожжах может применяться система ADH2 или система GAL1. В мицеллиальных грибах в качестве регуляторных последовательностей может применяться промотор TAKA альфа-амилазы, глюкоамилазный промотор Aspergillus niger и глюкоамилазный промотор Aspergillus oryzae. Другие примеры регуляторных последовательностей представляют собой те, которые дают возможность амплифицировать ген. В эукариотических системах они включают ген дигидрофолат-редуктазы, который амплифицируется в присутствии метотрексата, и гены металлотионеина, которые амплифицируются с тяжелыми металлами. В этих случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, будет функционально связана с регуляторной последовательностью.

Экспрессирующие векторы

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным экспрессирующим векторам, включающим полинуклеотид по настоящему изобретению, промотор и транскрипционный и трансляционный стоп-сигналы. Разнообразные нуклеиновые кислоты и контрольные последовательности, описанные выше, можно объединить вместе для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора, который может включать один или более подходящих рестрикционных сайтов, чтобы дать возможность вставки или замены по таким сайтам нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. В качестве альтернативы, нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению можно экспрессировать путем вставки нуклеотидной последовательности или конструкции нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, в подходящий вектор для экспрессии. При создании экспрессирующего вектора кодирующую последовательность располагают в векторе так, чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с подходящими контрольными последовательностями для экспрессии.

Рекомбинантным экспрессирующим вектором может являться любой вектор (например, плазмидный или вирусный), который легко может быть подвержен процедурам рекомбинантной ДНК и может осуществлять экспрессию нуклеотидной последовательности. Выбор вектора обычно зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую следует ввести вектор. Векторы могут быть линейными или замкнутыми циклическими плазмидами.

Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует как внехромосомный объект, репликация которого независима от хромосомной репликации, например плазмида, внехромосомный элемент, минихромосома или искусственная хромосома. Вектор может содержать любые инструменты для обеспечения собственной репликации. В качестве альтернативы, вектор может быть таким, что при введении в клетку-хозяин, он интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он был интегрирован. Более того, может применяться единичный вектор или плазмида, или два или более вектора или плазмиды, которые вместе содержат общую ДНК, которую следует ввести в геном клетки-хозяина, либо может применяться транспозон.

Векторы по настоящему изобретению предпочтительно содержат один или более маркеры селекции, которые дают возможность легкой селекции трансформированных клеток. Маркер селекции представляет собой ген, продукт которого обепечивает биоцидную или вирусную устойчивость, устойчивость к тяжелым металлам, устойчивость ауксотрофов, подобную устойчивости прототрофов и подобные.

Примеры бактериальных маркеров селекции представляют собой гены dal из Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis, или маркеры, которые дают устойчивость к антибиотикам, таким как ампициллин, канамицин, хлорамфеникол или устойчивость к тетрациклину. Подходящими маркерами для дрожжевых клеток-хозяев являются ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Маркеры селекции для применения в мицеллиальной грибковой клетке-хозяине включают, но не ограничены ими, amdS (ацетамидазу), argB (орнитин карбамоилтрансферазу), bar (фосфинотрицин ацетилтрансферазу), hph (гигромицин фосфотрансферазу), niaD (нитрат редуктазу), pyrG (орнитин-5'-фосфат декарбоксилазу), sC (сульфат аденилтрансферазу) и trpC (антранилат синтетазу), а также их эквиваленты. Предпочтительными для применения в клетке Aspergillus являются гены amdS и pyrG из Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae и ген bar из Streptomyces hygroscopicus.

Векторы по настоящему изобретению предпочтительно содержат элемент(ы), который дает возможность интегрировать вектор в геном клетки-хозяина или автономной репликации вектора в клетке независимо от генома.

Для интеграции в геном клетки-хозяина вектор может полагаться на полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, или на любой другой элемент вектора для интеграции в геном путем гомологичной или негомологичной рекомбинации. В качестве альтерантивы, вектор может содержать дополнительные нуклеотидные последовательности для направления интеграции путем гомологичной рекомбинации в геном клетки-хозяина в определенное место(а) в хромосоме(ах). Для увеличения вероятности интеграции в определенное место интеграционные элементы должны предпочтительно содержать подходящее количество нуклеиновых кислот, такое как 100-10000 пар оснований, предпочтительно, 400-10000 пар оснований, и наиболее предпочтительно, 800-10000 пар оснований, которые имеют высокую степень идентичности с соответствующей последовательностью мишени для усиления возможности гомологичной рекомбинации. Интеграционные элементы могут представлять собой любую последовательность, которая является гомологичной последовательности мишени в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интеграционные элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие нуклеотидные последовательности. С другой стороны, вектор может быть интегрирован в геном клетки-хозяина путем не гомологичной рекомбинации.

Для автономной репликации вектор может дополнительно включать последовательность начала репликации, дающую возможность вектору автономно реплицироваться в данной клетке-хозяине. Последовательность начала репликации может представлять собой любой плазмидный репликатор, который функционирует в клетке и опосредует автономную репликацию. Термин "последовательность начала репликации" или "плазмидный репликатор" определяется здесь как нуклеотидная последовательность, которая дает возможность плазмиде или вектору реплицироваться in vivo.

Примеры бактериальных последовательностей начала репликации представляют собой последовательности начала репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 и pACYC184, дающие возможность репликации в E. coli, и pUB1 10, pE194, pTA1060 и pAMβ1, обеспечивающие возможность репликации в Bacillus.

Примеры последовательностей начала репликации для применения в дрожжевой клетке-хозяине представляют собой последовательности начала репликации 2 микрон, ARS1, ARS4, комбинацию ARS1 и CEN3, и комбинацию ARS4 и CEN6.

Примеры последовательностей начала репликации, применяемые в мицеллиальной грибковой клетке, представляют собой AMA1 и ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163- 9175; WO 00/24883). Выделение гена и конструкции плазмид или векторов, включающих ген, может быть выполнено согласно способам, описанным в WO 00/24883.

Более чем одна копия полинуклеотида по настоящему изобретению может быть вставлена в клетку-хозяин для увеличения продукции генного продукта. Увеличение количества копий полинуклеотида может быть получено путем интеграции, по меньшей мере, одной дополнительной копии в геном клетки-хозяина или путем включения способного к амплификации гена-маркера селекции с полинуклеоитидом, где клетки, содержащие амплифицированные копии гена-маркера селекции и, таким образом, дополнительные копии полинуклеотида, могут быть селектированы путем культивирования клеток в присутствии подходящего агента селекции.

Процедуры, применяемые для лигирования элементов, описанных выше, с конструкцией рекомбинантных экспрессирующих векторов по настоящему изобретению хорошо известны специалисту в данной области из уровня техники (смотри, например, Sambrook et al., 1989, supra).

Клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, включающим полинуклеотид по настоящему изобретению, которые преимущественно применяются для рекомбинантной продукции полипептидов. Вектор, включающий полинуклеотид по настоящему изобретению, вводят в клетку-хозяин так, чтобы вектор поддерживался как хромосомный компонент или как самореплицирующийся внехромосоный вектор, как описано ранее. Термин "клетка-хозяин" охватывает любое потомство родительской клетки, которое не является идентичным родительской клетке благодаря мутациям, которые встречаются во время репликации. Выбор клетки-хозяина в большой степени будет зависеть от гена, кодирующего полипептид, и его источника.

Клетка-хозяин может представлять собой одноклеточный микроорганизм, например, прокариоты, или не одноклеточный организм, например, эукариоты.

Применяемые одноклеточные микроорганизмы представляют собой бактериальные клетки, такие как грамположительные бактерии, включающие, но не ограниченные ими, клетку Bacillus, например, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, и Bacillus thuringiensis; или клетку Streptomyces, например, Streptomyces lividans и Streptomyces murinus, или грамотрицательные бактерии, такие как, E. coli и Pseudomonas sp. В предпочтительном аспекте, бактериальная клетка-хозяин представляет собой клетку Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus или Bacillus subtilis. В другом предпочтительном аспекте, клетка Bacillus представляет собой алкалофильную клетку Bacillus.

Введение вектора в бактериальную клетку-хозяин, может, например, быть эффективным при трансформации протопластов (смотри, например, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 1 11-1 15), с применением компетентных клеток (смотри, например, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), электропорации (смотри, например, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) или конъюгации (смотри, например, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

Клетка-хозяин может также представлять собой эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающих, насекомых, растений или грибковую клетку.

В предпочтительном аспекте клетка-хозяин является грибковой клеткой. "Грибы", как применяется здесь, включают отделы Аскомикоты, Базидиомикоты, Хитридиомикоты и Зигомикоты (как определено у Hawksworth et al, In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), а также Оомикоты (как процитировано у Hawksworth et al., 1995, supra, page 171) и все митоспоровые грибы (Hawksworth et al., 1995, supra).

В более предпочтительном аспекте, грибковая клетка-хозяин является дрожжевой клеткой. "Дрожжи", как этот термин применяется здесь, включают аскоспорогенные дрожжи (Эндомицеты (Endomycetales)), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к классу Несовершенных Грибов (Бластомицеты). Поскольку классификация грибов может в будущем измениться, для целей этого изобретения дрожжи будут определять, как описано в Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passболее, S. M., and Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

В еще более предпочтительном аспекте, дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia. В наиболее предпочтительном аспекте, дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или клетку Saccharomyces oviformis. В другом наиболее предпочтительном аспекте, дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Kluyveromyces lactis. В другом наиболее предпочтительном аспекте, дрожжевая клетка-хозяин представляет собой клетку Yarrowia lipolytica.

В другом более предпочтительном аспекте, грибковая клетка-хозяин представляет собой мицеллиальную грибковую клетку. "Мицеллиальные грибы" включают мицеллиальные формы отделов Эумикота и Оомикота (как определено у Hawksworth et al., 1995, supra). Мицеллиальные грибы в основном характеризуются мицеллиальной стенкой, состоящей из хитина, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост осуществляется посредством гифальной элонгации, и катаболизм углерода обязательно является аэробным. Напротив, вегетативный рост дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae, осуществляется посредством почкования одноклеточного таллома, и углеродный катаболизм может являться ферментативным.

В еще более предпочтительном аспекте, мицеллиальная грибковая клетка-хозяин представляет собой клетку Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes или клетку Trichoderma.

В наиболее предпочтительном аспекте, мицеллиальная грибковая клетка-хозяин представляет собой клетку Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger или клетку Aspergillus oryzae. В другом наиболее предпочтительном аспекте, мицеллиальная грибковая клетка-хозяин представляет собой клетку Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides или клетку Fusarium venenatum. В другом наиболее предпочтительном аспекте, мицеллиальная грибковая клетка-хозяин представляет собой клетку Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa или штамм клетки Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или штамм клетки Trichoderma viride.

Грибковые клетки могут быть трансформированы с помощью процесса, включающего образование протопластов, трансформацию протопластов и регенерацию клеточной стенки способом, по существу известным. Подходящие процедуры для трансформации клеток-хозяев Aspergillus и Trichoderma описаны в EP 238 023 and Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Подходящие способы для трансформации вида Fusarium описаны у Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, and WO 96/00787. Дрожжи могут быть трансформированы с применением процедур, описанных у Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M. I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182- 187, Academic Press, Inc., New York; lto et ai, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Способы получения

Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептида по настоящему изобретению, включающим (a) культивирование клетки, которая в своей форме дикого типа способна к продукции полипептида при условиях, подходящих для продукции полипептида; и (b) получение полипептида. Предпочтительно, клетка представляет собой вид Arenicola, и более предпочтительно, Arenicola marina.

Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептида по настоящему изобретению, включающим (a) культивирование клетки-хозяина при условиях, подходящих для продукции полипептида; и (b) получение полипептида.

Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептида по настоящему изобретению, включающим (a) культивирование клетки-хозяина при условиях, подходящих для продукции полипептида, где клетка-хозяин включает мутантную нуклеотидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, одну мутацию в кодирующем зрелый полипептид участке из SEQ ID NO:1, где мутантная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, который состоит из аминокислотной последовательности, соответствующую положениям 1-21 из SEQ ID NO:2, и (b) получение полипептида.

В способах продукции по настоящему изобретению клетки культивируют в питательной среде, подходящей для продукции полипептида с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Например, клетку можно культивировать с помощью культивирования во встряхиваемой колбе и с помощью мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (включая непрерывную, порционную, с подпиткой или твердофазную ферментации) в лабораторных или промышленных ферментерах, осуществляемой в подходящей среде при условиях, дающих возможность экспрессии и/или выделения полипептида. Культивирование имеет место в подходящей питательной среде, включающей источники углерода и азота и неорганические соли, с применением процедур, известных из уровня техники. Подходящие среды поставляются коммерческими поставщиками или могут быть приготовлены согласно опубликованным составам (например, в каталогах Американской Типированной Коллекции Клеточных Культур). Если полипептид секретируется в питательную среду, то полипептид можно получить непосредственно из среды. Если полипептид не секретируется, то его можно получить из клеточных лизатов.

Полипептиды можно обнаружить методами, известными из уровня техники, которые являются специфическими для полипептидов. Эти методы обнаружения могут включать применение специфических антител. Например, как описано здесь, для определения активности полипептида может применяться тест на антимикробную активность.

Полученный в результате полипептид можно получить с применением методов, известных из уровня техники. Например, полипептид можно получить из питательной среды с помощью подходящих процедур, включающих, но не ограниченных ими, центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, распылительную сушку, выпаривание или осаждение.

Полипептиды по настоящему изобретению можно очистить с помощью разнообразных процедур, известных из уровня техники, включающих, но не ограниченных ими, хроматографию, (например, ион-обменную, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирование и разделение по размеру), процедуры электрофореза (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония), SDS-PAGE, или экстракцию (смотри, например, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

Растения

Настоящее изобретение также относится к трансгенному растению, части растения или растительной клетке, которую трансформировали нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид по настоящему изобретению, обладающий антимикробной активностью, так чтобы экспрессировать и получить полипептид в извлекаемых количествах. Полипептид можно получить из растения или из части растения. В качестве альтернативы, растение или часть растения, содержащую рекомбинантный полипептид, можно применять как таковую для улучшения качества пищи или корма, например, для улучшения питательной ценности, аппетитности и реологических свойств, или для разрушения антипитательного фактора.

Трансгенное растение может быть двудольным или однодольным. Примеры однодольных растений представляют собой травы, такие как луговая трава (голубая трава, мятлик луговой), фуражная трава, такая как овсянница, плевел, трава умеренной зоны, такая как полевица, и зерновые культуры, например пшеница, овес, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза).

Примеры двудольных растений представляют собой табак, бобовые, такие как лупинин, картошка, сахарная свекла, горох, боб и соя, и крестоцветные растения (семейство Brassicaceae), такие как цветная капуста, рапсовое семя и близкородственный модельный организм Arabidopsis thaliana.

Примеры частей растения представляют собой ствол, каллюс, листья, корень, плоды, семена и клубни, а также индивидуальные ткани, включающие эти части, например эпидермис, мезофилл, паренхим, васкулярные ткани, меристемы. Также предполагается, что специфические компартменты растительной клетки, такие как хлоропласты, апопласты, митохондрии, вакуоли, пероксисомы и цитоплазма являются частью растения. Кроме того, предполагается, что любая растительная клетка любого тканевого происхождения является частью растения. Более того, предполагается, что части растения, такие как специфические ткани и клетки, выделенные для облегчения применения по изобретению, также являются частями растения, например завязь, эндосперм, алейрон и семенные покрытия.

Также включено в рамки настоящего изобретения потомство таких растений, частей растений и растительных клеток.

Трансгенное растение или растительная клетка, экспрессирующая полипептид по настоящему изобретению, могут быть созданы согласно методам, известным из уровня техники. Коротко, растение или растительную клетку создают путем введения одной или более экспрессирующих конструкций, кодирующих полипептид по настоящему изобретению, в геном растения-хозяина и развитие полученного в результате модифицированного растения в трансгенное растение или растительную клетку.

Экспрессирующая конструкция представляет собой подходящую конструкцию нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, функционально связанный с подходящими регуляторными последовательностями, требующимися для экспрессии нуклеотидной последовательности в выбранном растении или части растения. Кроме того, экспрессирующаяся конструкция может включать маркер селекции, применяемый для идентификации клеток-хозяев, в которые была введена экспрессирующая конструкция, и последовательностей ДНК, необходимых для введения конструкции в данное растение (последнее зависит от применяемого способа введения ДНК).

Выбор регуляторных последовательностей, таких как последовательности промотора и терминатора и, по желанию, сигнальных или транзитных последовательностей определяется, например, на основании того, когда, где и как желательно экспрессировать полипептид. Например, экспрессия гена, кодирующего полипептид по настоящему изобретению, может быть конститутивной или индуцируемой, или может быть связанной с развитием, может быть специфичной для определенной стадии или ткани, и продукт гена может быть направлен в специфическую ткань или часть растения, такую как семена или листья. Регуляторные последовательности описаны, например, у Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Для конститутивной экспрессии может применяться промотор 35S-CaMV, промотор убиквитина 1 маиса и промотор актина 1 риса (Franck et al., 1980, Ce// 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mo. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Промоторы, специфические для определенного органа, могут представлять собой, например, промотор из акцептирующих тканей, таких как семена, клубни картофеля и плоды (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), или из тканей, являющихся вместилищем притекающих метаболитов, таких как меристемы (Ito et al., 1994, Plant MoI. Biol. 24: 863-878), промотор, специфический для семян, такой как глутелиновый, проламиновый или альбуминовый промотор из риса (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), промотор гена легумин В4 из Vicia faba и промотор гена неизвестного белка семян из Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), промотор из белкового тельца масла семян (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), промотор запасного белка napA из Brassica napus, или любой другой промотор, специфический для семян, известный из уровня техники, например, как описано в WO 91/14772. Кроме того, промотор может представлять собой промотор, специфический для листа, такой как rbcs-промотор из риса или томата (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), промотор гена аденин метилтрансферазы вируса хлорелла (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), или промотор гена aldP из риса (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), промотор, индуцируемый раной, такой, как промотор pin2 картофеля (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Также промотор может быть индуцирован с помощью таких абиотических воздействий, как температура, сухость или изменения в солености, или может быть индуцирован с помощью экзогенно применяемых веществ, которые активируют промотор, например, с помощью этанола, эстрогенов, растительных гормонов, таких как этилен, абсцизиновая кислота и гибберелловая кислота, и с помощью тяжелых металлов.

Энхансерный элемент промотора также может применяться для достижения более высокой экспрессии полипептида по настоящему изобретению в растении. Например, энхансерный элемент промотора может представлять собой интрон, который располагается между промотором и нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид по настоящему изобретению. Например, Xu et al., 1993, supra, описывают применение первого интрона гена актина 1 риса для усиления экспрессии.

Ген-маркер для селекции и любые другие части экспрессирующей конструкции могут быть выбраны из тех, что доступны из уровня техники.

Конструкцию нуклеиновой кислоты вводят в геном растения согласно подходящим методам, известным из уровня техники, включающим Agrobacterium-опосредованную трансформацию, вирусно-опосредованную трансформацию, микроинъекцию, бомбардировку частицами, биолистическую трансформацию и электропорацию (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

В настоящее время, Agrobacterium tumefaciens-опосредованный перенос генов представляет собой метод, выбранный для получения трансгенных двудольных растений (в качестве обзора смотри Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38), и также может применяться для трансформации однодольных растений, хотя для этих растений часто применяются другие способы трансформации. В настоящее время, метод, выбранный для получения трансгенных однодольных растений, представляет собой бомбардировку частицами (микроскопическими частицами золота или вольфрама, покрытыми трансформирующей ДНК) каллюсов завязи или развивающихся завязей (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Альтернативный способ трансформации однодольных растений основан на трансформации протопластов, как описано у Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Следом за трансформацией селектируют трансформанты, имеющие введенную экспрессирующую конструкцию, и регенерируют в цельные растения согласно способам, хорошо известным из уровня техники. Часто процедуру трансформации разрабатывают для селективного исключения генов селекции или во время регенерации, или в последующие регенерации с применением, например, котрансформации двумя отдельными конструкциями Т-ДНК, или с применением сайт-специфического удаления гена селекции с помощью специфической рекомбиназы.

Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептида по настоящему изобретению, включающим (a) культивирование трансгенного растения или растительной клетки, включающей полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий антимикробной активностью по настоящему изобретению, при условиях, подходящих для продукции полипептида; и (b) получение полипептида.

Композиции

Настоящее изобретение также относится к композициям, таким как фармацевтические композиции, включающие полипептид по настоящему изобретению. Предпочтительно, композиции являются обогащенными таким полипептидом. Термин "обогащенный" выявляет, что антимикробная активность композиции была увеличена, например, фактором обогащения 1.1.

Композиции могут дополнительно включать другой фармацевтически активный агент, такой как дополнительный биоцидный или биостатический агент, такой как другой антимикробный полипептид, проявляющий антимикробную активность, как определено выше. Биоцидный агент может представлять собой антибиотик, как известно из уровня техники. Классы антибиотиков включают пенициллины, например пенициллин G, пенициллин V, метициллин, оксациллин, карбенициллин, нафциллин, ампициллин и т.д.; пенициллины в комбинации с бета-лактамазными ингибиторами, цефалоспорины, например цефаклор, цефазолин, сефуроксим, моксалактам и т.д.; карбапенемы; монобактамы; аминогликозиды; тетрациклины; макролиды; линкомицины; полимиксины; сульфонамиды; хинолоны; хлорамфеникол; метронидазол; спектиномицин; триметоприм; ванкомицин и т.д. Биоцидный агент может также представлять собой антимикотический агент, включающий полиены, например, амфотерицин B, нистатин; 5-флукозин; и азолы, например, миконазол, кетоконазол, итраконазол и флуконазол.

В одном воплощении биоцидный агент представляет собой не ферментативный химический агент. В другом воплощении биоцидный агент представляет собой не полипептидный химический агент.

Композиции могут включать подходящее вещество-носитель. Композиции могут также включать подходящий носитель для доставки, способный к доставке антимикробных полипептидов по изобретению в желаемое место, в случае, когда композиции применяют в качестве лекарственного средства.

Полипептидные композиции могут быть получены в соответствии с методами, известными из уровня техники, и могут быть представлены в жидкой или сухой форме. Например, полипептидная композиция может быть представлена в форме гранул или микрогранул. Полипептид, который должен быть включен в композицию, может быть стабилизирован в соответствии с методами, известными из уровня техники.

Ниже приведены примеры предпочтительных применений полипептидных композиций по изобретению. Дозировка полипептидной композиции по изобретению и другие условия, при которых применяют композицию, могут быть определены на основе методов, известных из уровня техники.

Методы и применения

Настоящее изобретение также относится к способам применения полипептидов, обладающих антимикробной активностью. Антимикробные полипептиды обычно применяют в любом месте, подверженном загрязнению бактериями, грибками, дрожжами или водорослями. Обычно такие места представляют собой водные системы, такие как системы охлаждения воды, система полоскания водой в прачечной, масляные системы, такие как эмульсионные масла, смазочные вещества, нефтяные месторождения и подобные места, где необходимо, чтобы микроорганизмы были убиты, или где необходимо контролировать их рост. Однако настоящее изобретение также можно применять во всех областях, в которых используются известные антимикробные композиции, таких как защита дерева, латекса, адгезивного материала, клея, бумаги, картона, текстиля, кожи, пластика, уплотнителя и корма. Другие области применения включают консервацию пищи, напитков, косметики, такой как лосьоны, кремы, гели, мази, мыла, шампуни, кондиционеры, антиперспиранты, дезодоранты, жидкости для промывания полости рта, продукты для контактных линз, ферментативных составов или пищевых ингредиентов.

Таким образом, антимикробные полипептиды по изобретению могут применяться в качестве дезинфицирующего средства, например, для лечения инфекций глаз или ротовой полости, или инфекций кожи; в антиперспирантах или дезодорантах; для очистки и дизинфекции контактных линз и зубов (пероральный уход).

В основном предполагается, что антимикробные полипептиды по настоящему изобретению применяются для очистки, дезинфекции или ингибирования микробного роста на любой поверхности. Примеры поверхностей, которые преимущественно могут контактировать с антимикробными полипептидами по изобретению, представляют собой поверхности технологического оборудования, применяемого, например, в производствах молочных продуктов, в технологических установках для непрерывного химического или фармацевтического производства, в водных системах канализации, в установках для нефтепереработки, в установках для целлюлозно-бумажных производств, в установках водоочистки и в башенных охладителях. Антимикробные полипептиды по изобретению следует применять в количестве, которое является эффективным для очистки, дезинфекции или ингибирования микробного роста на данной поверхности.

Антимикробные полипептиды по изобретению дополнительно могут применяться для очистки поверхностей и кухонной утвари в пищевой промышленности и в любой области, в которой осуществляется приготовление или подача пищи, в таких учреждениях, как больницы, дома престарелых и рестораны.

Антимикробные полипептиды по изобретению также могут применяться в качестве консервирующего агента или дезинфицирующего агента в красках на водной основе.

Изобретение также относится к применению антимикробного полипептида или композиции по изобретению в качестве лекарственного средства. Кроме того, антимикробный полипептид или композиция по изобретению могут также применяться в производстве лекарственного средства для контроля или борьбы с микроорганизмами, такими как грибковые организмы или бактерии, предпочтительно, грамположительные бактерии.

Композиция и антимикробный полипептид по изобретению могут применяться в качестве антимикробного терапевтического или профилактического агента для животных или человека. Таким образом, композиция и антимикробный полипептид по изобретению могут применяться в получении терапевтического или профилактического агентов для животных или человека, предназначенных для лечения микробных инфекций, таких как бактериальные или грибковые инфекции, предпочтительно, инфекции грамположительных бактерий. В особенности, микробные инфекции могут быть ассоциированы с легочными заболеваниями, включающими, но не ограниченные ими, туберкулез, пневмонию и кистозный фиброз; и заболевания, передающиеся половым путем, включающие, но не ограниченные ими, гонорею и хламидиоз.

Композиция по изобретению включает эффективное количество антимикробного полипептида по изобретению.

Подразумевается, что термин "эффективное количество", когда используется здесь, обозначает количество антимикробных полипептидов по изобретению, которое является эффективным для ингибирования роста данных микроорганизмов.

Изобретение также относится к ранозаживляющим композициям или таким продуктам, как бинты, медицинским приборам, таким, как, например, катетеры, и дополнительно относится к таким продуктам против перхоти в волосах, как шампуни.

Составы антимикробных полипептидов по изобретению вводят в организм-хозяин, страдающий от микробной инфекции или предрасположенный к микробной инфекции. Введение может быть местным, локализованным или системным в зависимости от специфического микроорганизма, предпочтительно, оно является локализованным. В основном, дозы антимикробного полипептида по изобретению будет достаточно для уменьшения микробной популяции, по меньшей мере, примерно на 50%, обычно, по меньшей мере, на 1 порядок (log), и, возможно, на 2 или более порядков. Соединения по настоящему изобретению вводят в дозировке, которая уменьшает микробную популяцию, при этом минимизируя любые побочные эффекты. Предполагается, что при применении in vivo композиция будет получена и использована под руководством медика. Антимикробные полипептиды по изобретению в особенности применяют для уничтожения грамотрицательных бактерий, включающих Pseudomonas aeruginosa и Chlamydia trachomatis; и грамположительных бактерий, включающих стрептококки, такие как Streptococcus pneumonia, S. uberis, S. hyointestinalis, S. pyogenes и S. agalactiae; и стафилококки, такие как Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. simulans, S. xylosus и S. carnosus.

Составы антимикробных полипептидов по изобретению можно вводить в организм-хозяин, страдающий от микробной легочной инфекции или предрасположенный к микробной легочной инфекции, такой как пневмония; или микробной раневой инфекции, такой как бактериальная раневая инфекция.

Составы антимикробных полипептидов по изобретению также можно вводить в организм-хозяин, страдающий от кожной инфекции, или предрасположенный к кожной инфекции, такой как угри, атопический дерматит или себорейный дерматит; предпочтительно, кожной инфекцией является бактериальная кожная инфекция, например, вызванная Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes, Pityrosporum ovale или Malassezia furfur.

Антимикробные полипептиды по изобретению также применяют для in vitro составов для уничтожения микробов, в особенности, когда не желательно вводить количества подходящих антибиотиков. Например, антимикробные полипептиды по изобретению можно добавлять при приготовлении пищи для животных и/или человека; или их могут включать в качестве добавки для in vitro культур клеток, чтобы предотвратить разрастание микробов в тканевой культуре.

Чувствительность конкретного микроба к уничтожению антимикробными полипептидами по изобретению может быть определена с помощью тестирования in vitro, как подробно описано в разделе экспериментов. Обычно культуру микроба объединяют с антимикробным полипептидом в различных концентрациях в течение периода времени, достаточного, чтобы дать возможность действовать белку, обычно примерно от одного часа до одного дня. Выжившие микробы затем подсчитывают и определяют уровень уничтожения.

Интересующие микробы включают, но не ограничены ими, грамотрицательные бактерии, например: Citrobacter sp.; Enterobacter sp.; Escherichia sp., например, E. coli; Klebsiella sp.; Morganella sp.; Proteus sp.; Providencia sp.; Salmonella sp., например, S. typhi, S. typhimurium; Serratia sp.; Shigella sp.; Pseudomonas sp., например, P. aeruginosa; Yersinia sp., например, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica; Franciscella sp.; Pasturella sp.; Vibrio sp., например, V. cholerae, V. parahemolyticus; Campylobacter sp., например, C. jejuni; Haemophilus sp., например, H. influenzae, H. ducreyi; Bordetella sp., например, B. pertussis, B. bronchiseptica, B. parapertussis; Brucella sp., Neisseria sp., например, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, и т.д. Другие интересующие бактерии включают Legionella sp., например, L. pneumophila; Listeria sp., например, L. monocytogenes; Mycoplasma sp., например, M. hominis, M. pneumoniae; Mycobacterium sp., например, M. tuberculosis, M. leprae; Treponema sp., например, T. pallidum; Borrelia sp., например, B. burgdorferi; Leptospirae sp.; Rickettsia sp., например, R. rickettsii, R. typhi; Chlamydia sp., например, C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci; Helicobacter sp., например, H. pylori, и т.д.

Небактериальные интересующие патогены включают патогены грибков и простейших, например, Plasmodia sp., например, P. falciparum, Trypanosoma sp., например, T. brucei; shistosomes; Entaemoeba sp., Cryptococcus sp., Candida sp., например, C. albicans; и т.д.

Могут применяться разнообразные способы введения. Полипептидный состав может быть введен перорально или может быть инъецирован интраваскулярно, подкожно, внутрибрюшинно, посредством аэрозоля, внутрь глаза, внутрь мочевого пузыря, местно и т.д. Например, хорошо известны из уровня техники способы введения посредством ингаляции. Дозировка терапевтического состава широко варьируется в зависимости от специфического антимикробного полипептида, который следует ввести, от природы заболевания, частоты введения, способа введения, скорости выведения агента из организма-хозяина и подобных. Первичная доза может быть больше, с последующими дозами меньшего содержания. Дозу можно вводить с такой частотой, как еженедельно или раз в две недели, или дозу можно фракционировать на меньшие дозы и вводить один или несколько раз в день, два раза в неделю и т.д. для поддержания эффективного уровня дозировки. Во многих случаях при пероральном введении требуется большая доза, чем при внутривенном введении. Амидные связи, также как амино- и карбоксиконцы могут быть модифицированы для большей стабильности при пероральном введении. Например, карбоксиконец может быть амидирован.

Составы

Соединения по этому изобретению могут быть введены в разнообразные составы для терапевтического введения. Более конкретно, соединения по настоящему изобретению могут быть включены в состав фармацевтических композиций посредством комбинации с подходящими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями и могут быть включены в состав в твердых, полутвердых, жидких или газообразных препаративных форм, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, кремы, пенки, растворы, суппозитории, инъекции, ингаляторы, гели, микросферы, лосьоны и аэрозоли. По существу, введение соединений может быть достигнуто разнообразными путями, включающими пероральное, буккальное, ректальное, парентеральное, внутрибрюшинное, интрадермальное, трансдермальное, внутритрахейное введение и т.д. Антимикробные полипептиды по изобретению могут распределяться системно после введения или могут быть локализованы с помощью применения имплантанта или другого состава, который действует сохраняя активную дозу на участке имплантации.

В одном воплощении, состав для местного применения включает хелатирующий агент, который уменьшает эффективную концентрацию двухвалентных катионов, особенно кальция и магния. Например, могут быть включены такие агенты, как цитрат, EGTA или EDTA, где цитрат является предпочтительным. Концентрация цитрата обычно составляет примерно от 1 до 10 мМ.

Соединения по настоящему изобретению могут быть введены индивидуально, в комбинации друг с другом, или они могут применяться в комбинации с другими известными соединениями (например, перфорином, противовоспалительными агентами, антибиотиками и т.д.). В фармацевтических дозированных формах соединения могут быть введены в форме их фармацевтически приемлемых солей. Следующие способы и вспомогательные вещества являются только примерами и никоим образом не ограничены.

Для пероральных препаратов соединения могут применяться по одиночке или в комбинации с подходящими добавками с получением таблеток, порошков, гранул или капсул, например с такими подходящими добавками, как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал; со связующими веществами, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, акация, кукурузный крахмал или желатины; с дезинтеграторами, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или карбоксиметилцеллюлоза натрия; со смазочными веществами, такими, как тальк или стеарат магния; и, если желательно, с разбавителями, буферными агентами, увлажняющими агентами и ароматизирующими агентами.

Соединения могут быть включены в состав препаратов для инъекций путем их разведения, суспендирования или эмульгирования в водном или не водном растворителе, таком как растительное или другие подобные масла, глицериды синтетических алифатических кислот, эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоли; и, если желательно, с подходящими добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, стабилизаторы и консерванты.

Соединения могут применяться в составе аэрозоля, который следует вводить посредством ингаляции. Соединения по настоящему изобретению могут быть включены в состав в приемлемых герметизованных сжатых веществах, таких как дихлордифторметан, пропан, азот и подобные.

Соединения могут применяться в виде лосьонов, например, для предотвращения инфекций после ожогов, путем включения в состав с подходящими добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, стабилизаторы и консерванты.

Кроме того, соединения могут быть произведены в виде суппозиториев путем смешивания с разнообразными основами, такими как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Соединения по настоящему изобретению могут быть введены ректально посредством суппозитория. Суппозиторий может включать носители, такие как масло какао, карбовоски и полиэтиленгликоли, которые плавятся при температуре тела, оставаясь твердыми при комнатной температуре.

Могут быть предложены стандартные дозированные формы для перорального или ректального введения, такие как сиропы, эликсиры и суспензии, где каждая стандартная доза, например чайная ложка, столовая ложка, таблетка или суппозиторий, содержит определенное количество композиции, содержащей одно или более соединений по настоящему изобретению. Подобным образом, стандартные дозированные формы для инъекции или внутривенного введения могут включать соединение по настоящему изобретению в композиции в виде раствора в стерильной воде, нормальном солевом растворе или другом фармацевтически приемлемом носителе.

Имплантанты для составов с непрерывным высвобождением хорошо известны из уровня техники. Имплантанты включены в состав в виде микросфер, пластинок и т.д. с биодеградируемыми или небиодеградируемыми полимерами. Например, полимеры молочной кислоты и/или гликолевой кислоты образуют деградируемый полимер, который хорошо переносится организмом-хозяином. Имплантант, содержащий антимикробные полипептиды по изобретению, располагается вблизи от сайта инфекции, так что локальная концентрация активного агента увеличена по отношению к остальным частям тела.

Термин "стандартная дозированная форма", как применяется здесь, обозначает физически дискретные единицы, применяемые в виде стандартных доз для человека или животного, причем каждая единица содержит определенное количество соединений по настоящему изобретению, рассчитанное в количестве, достаточном для получения желаемого эффекта при ассоциировании с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или средством доставки. Спецификации для стандартных дозированных форм по настоящему изобретению зависят от конкретного применяемого соединения и от эффекта, которого следует достичь, и от фармакодинамики, ассоциированной с соединением в организме-хозяине.

Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как средства доставки, адъюванты, носители или разбавители, легко коммерчески доступны. Кроме того, фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как регулирующие pH и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, стабилизаторы, увлажняющие агенты и подобные, легко коммерчески доступны.

Обычные дозировки для системного введения находятся в пределах от 0,1 пг до 100 миллиграмм на кг веса субъекта при одном введении. Обычная дозировка может представлять собой одну таблетку, принимаемую от двух до шести раз в день, или может представлять собой одну капсулу с регулируемым временем высвобождения или таблетку, принимаемую раз в день и содержащую пропорционально большее количество активного ингредиента. Эффект регулируемого времени высвобождения может быть получен с помощью веществ капсулы, которые растворяются при различных значениях pH, с помощью капсул, которые высвобождают активное вещество медленно под осмотическим давлением, или с помощью любых других известных методов контролируемого высвобождения.

Специалисты в данной области легко поймут, что уровни дозы могут варьироваться в зависимости от специфического соединения, серьезности симптомов и чувствительности субъекта к побочным эффектам. Некоторые из специфических соединений являются более сильнодействующими, чем другие. Предпочтительные дозировки для данного соединения легко определяются специалистами в данной области посредством разнообразных способов. Предпочтительным способом является измерение физиологической силы данного соединения.

Применение липосом в качестве средства доставки представляет собой один из способов, представляющих интерес. Липосомы сливаются с клетками сайта мишени и доставляют содержащееся внутри липосом вещество внутрь клетки. Липосомы поддерживают в контакте с клетками в течение достаточного для слияния времени с применением различных способов для поддержания контакта, таких как выделение, применение связывающих агентов и тому подобное. В одном аспекте изобретения липосомы разрабатывают в виде аэрозоля для легочного введения. Липосомы могут быть получены с очищенными белками или пептидами, которые опосредуют слияние мембран, с такими белками, как белки вируса Sendai или вируса influenza и т.д. Липиды могут быть представлены в виде любой применяемой комбинации из известных образующих липосомы липидов, включающих катионные или цвиттерионные липиды, такие как фосфатидилхолин. Остальные липиды обычно представляют собой нейтральные или кислые липиды, такие как холестерин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и подобные.

Для получения липосом могут применять процедуру, описанную Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361. Коротко, объединяют липиды и композицию для включения внутрь липосомы, содержащую пептиды, в подходящей водной среде, обычно в среде солевого раствора, где общее содержание сухого вещества находится в пределах примерно 1-10 процентов от веса. После интенсивного перемешивания в течение коротких периодов времени, примерно 5-60 с, пробирку помещают в теплую водяную баню примерно при 25-40°C, и этот цикл повторяют примерно 5-10 раз. Композицию затем обрабатывают ультразвуком в течение подходящего периода времени, в основном примерно в течение 1-10 с, и могут дополнительно перемешать посредством встряхивания. Объем затем увеличивают посредством добавления водной среды, в основном с увеличением объема примерно в 1-2 раза, с последующим перемешиванием и охлаждением. Этот способ дает возможность введения внутрь липосом молекул с высоким молекулярным весом.

Составы с другими активными агентами

Для применения в целевых способах, антимикробные полипептиды по изобретению могут быть включены в состав с другими фармацевтически активными агентами, особенно с другими антимикробными агентами. Другие интересующие агенты включают широкое разнообразие антибиотиков, как известно из уровня техники. Классы антибиотиков включают пенициллины, например пенициллин G, пенициллин V, метициллин, оксациллин, карбенициллин, нафциллин, ампициллин и т.д.; пенициллины в комбинации с бета-лактамазными ингибиторами, цефалоспорины, например цефаклор, цефазолин, сефуроксим, моксалактам и т.д.; карбапенемы; монобактамы; аминогликозиды; тетрациклины; макролиды; линкомицины; полимиксины; сульфонамиды; хинолоны; хлорамфеникол; метронидазол; спектиномицин; триметоприм; ванкомицин и т.д.

Применяются также антимикотические агенты, включающие полиены, например, амфотерицин B, нистатин; 5-флукозин; и азолы, например, миконазол, кетоконазол, итраконазол и флуконазол. Антитуберкулезные лекарственные средства включают изониацид, этамбутол, стрептомицин и рифампин. Цитокины также могут быть включены в состав антимикробных полипептидов по изобретению, например, интерферон гамма, фактор некроза опухолей, интерлейкин 12 и т.д.

Синтез in vitro

Антимикробные пептиды по изобретению могут быть получены путем синтеза in vitro с использованием обычных методов, известных из уровня техники. Доступны разнообразные коммерческие синтетические приборы, например автоматические синтезаторы фирм Applied Biosystems Inc., Beckman и т.д. Посредством применения синтезаторов природные аминокислоты могут быть заменены на не природные аминокислоты, особенно D-изомеры (или D-формы), например D-аланин и D-изолейцин, диастереоизомеры, боковые цепи, имеющие различную длину, и функциональные группы, и подобные. Конкретная последовательность и способ получения определяются удобством, экономичностью, требуемой чистотой и подобными.

Химическое связывание может обеспечиваться различными пептидами или белками, включающими подходящие функциональные группы для связывания, такие как аминогруппы для образования амида или замещенного амина, например, посредством восстановительного аминирования, тиольные группы для образования тиоэфира или дисульфида, карбоксильные группы для образования амида и подобные им.

Если желательно, в пептид во время синтеза или во время экспрессии могут быть введены разнообразные группы, которые дают возможность связывания с другими молекулами или с поверхностью. Таким образом, цистеины могут применяться для получения тиоэфиров, гистидины для связывания с комплексом ионов металлов, карбоксильные группы для образования амидов или эфиров, аминогруппы для образования амидов, и подобные им.

Полипептиды также могут быть выделены и очищены в соответствии с подходящими способами рекомбинантного синтеза. Лизат может быть получен из экспрессирующего организма-хозяина, и этот лизат может быть очищен с применением HPLC, хроматографии разделения по размеру, гель электрофореза, аффинной хроматографии или с помощью других методик очистки. Большей частью, композиции, которые применяются, включают, по меньшей мере, 20% по массе от целевого продукта, более типично, по меньшей мере, примерно 75% по массе, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95% по массе, и для терапевтических целей, типично, по меньшей мере, примерно 99,5% по массе, по отношению к загрязняющим веществам, связанным со способом получения продукта и способом его очистки. Типично, процентное отношение рассчитывается на основе общего количества белка.

Корм животных

Настоящее изобретение также относится к способам с использованием полипептидов, обладающих антимикробной активностью, в корме животных, а также относится к кормовым композициям и кормовым добавкам, включающим антимикробные полипептиды по изобретению.

Термин "животное" включает всех животных, включая человека. Примеры животных представляют собой нежвачных животных и жвачных животных, таких как коровы, овцы и лошади. В конкретном воплощении животное является нежвачным животным. Нежвачные животные включают одножелудочных животных, например свиней или поросят (включая, но не ограничеваясь ими, поросят, молодых свиней и свиноматок); домашнюю птицу, такую как индейка и курица (включая, но не ограничиваясь ими, бройлерных цыплят, несушек); молодых телят; и рыбу (включая лосося, но не ограничиваясь им).

Термин "корм" или "кормовая композиция" обозначает любое соединение, препарат, смесь или композицию, подходящую для приема животным или предназначенную для приема животными.

В применении согласно изобретению антимикробные полипептиды могут быть скормлены животному до, после пищи или одновременно с пищей. Последнее является предпочтительным.

В конкретном воплощении антимикробный полипептид, представленный в форме, в которой его добавляют в корм или когда его включают в кормовую добавку, является вполне определенным. "Вполне определенный" означает, что препарат антимикробного полипептида имеет, по меньшей мере, 50% чистоту, определенную путем хроматографии, разделяющей по размеру (смотри Пример 12 из WO 01/58275). В других конкретных воплощениях, препарат антимикробного полипептида является чистым, по меньшей мере, на 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, или, по меньшей мере, на 95%, как определено этим способом.

Применение вполне определенного препарата антимикробного полипептида является предпочтительным. Например, значительно легче правильно дозировать в корме антимикробный полипептид, который является, по существу свободным от примесей или загрязнений, другими антимикробными полипептидами. Термин "правильно дозировать" относится, в особенности, к получению непротиворечивых и постоянных результатов и способности оптимизации дозировки, основанной на желаемом эффекте.

Однако для применения в корме животных нет необходимости, чтобы антимикробный полипептид был чистым; он может, например, включать другие ферменты, в этом случае он должен быть определен как препарат антимикробного полипептида.

Препарат антимикробного полипептида может быть (a) непосредственно добавлен в корм (или применен непосредственно в процессе обработки растительных белков), или (b) он может быть применен в одной или более промежуточных композициях, таких как кормовые добавки или предварительные смеси, которые последовательно добавляют в корм (или он может быть применен в процессе обработки). Степень чистоты, описанная выше, обозначает чистоту исходного препарата антимикробного полипептида, при применении согласно (a) или (b), как описано выше.

В особенности препараты антимикробного полипептида с величиной чистоты такого порядка являются доступными путем применения рекомбинантных технологий получения, однако их не так легко получить, а также обеспечить достаточную степень воспроизводимости, когда антимикробный полипептид получают традиционными способами ферментации.

Конечно, такой препарат антимикробного полипептида может быть смешан с другими ферментами.

Термин "растительные белки", как он применяется здесь, обозначает любое соединение, композицию, препарат или смесь, которая включает, по меньшей мере, один, выделенный из растения, или происходящий из растения, белок, включающий модифицированные белки и производные белков. В конкретных воплощениях, содержание растительных белков составляет, по меньшей мере, 10, 20, 30, 40, 50, или 60% (масс./масс.).

Растительные белки могут быть выделены из растительных белковых источников, таких как бобы и злаки, например вещества из растений семейства Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae и Poaceae, таких как измельченные соевые бобы, измельченный люпин и измельченные рапсовые семена.

В конкретном воплощении, источником растительного белка является вещество из одного или более растений семейства Fabaceae, например соя, люпин, горох или боб.

В другом конкретном воплощении, источником растительного белка является вещество из одного или более растений семейства Chenopodiaceae, например свекла, сахарная свекла, шпинат или киноа.

Другие примеры источников растительного белка представляют собой рапсовое семя и капусту. Соя является предпочтительным источником растительного белка.

Другие примеры источников растительного белка представляют собой злаки, такие как ячмень, пшеница, рожь, овес, маис (кукуруза), рис и сорго.

Антимикробные полипептиды могут быть добавлены в корм в любой форме, будь то относительно чистый антимикробный полипептид или смесь с другими компонентами, предназначенными для добавления в корм животных, т.е. в форме кормовых добавок для животных, таких добавок, как так называемые предварительные смеси для корма животных.

В следующем аспекте, настоящее изобретение относится к композициям для применения в корме животных, таком, как корм животных и кормовые добавки для животных, например предварительные смеси.

Кроме антимикробного полипептида по изобретению, кормовые добавки для животных по изобретению содержат, по меньшей мере, один жирорастворимый витамин, и/или, по меньшей мере, один водорастворимый витамин, и/или, по меньшей мере, один редкий минерал, и/или, по меньшей мере, один макроминерал.

Кроме того, необязательно, ингредиенты кормовых добавок представляют собой агенты, придающие цвет, ароматические соединения, стабилизаторы и/или, по меньшей мере, еще один дополнительный фермент, выбранный из числа фитаз EC 3.1.3.8 или 3.1.3.26; ксиланаз EC 3.2.1.8; галактаназ EC 3.2.1.89; и/или бета-глюканаз EC 3.2.1.4.

В конкретном воплощении, эти дополнительные ферменты представляют собой вполне определенные ферменты (как определено выше для препаратов антимикробных полипептидов).

Примеры дополнительных антимикробных пептидов (AMP) представляют собой CAP18, Лейкоцин A, Триптицин, Протегрин-1, Танатин, Дефенсин, Овиспирин, такой как Новиспирин (Robert Lehrer, 2000), и их варианты или фрагменты, которые сохраняют антимикробную активность.

Примеры дополнительных антигрибковых полипептидов (AFP) представляют собой пептидазы Aspergillus giganteus и Aspergillus niger, а также их варианты и фрагменты, которые сохраняют антигрибковую активность, как описано в WO 94/01459 и WO 02/090384.

Типичные жирорастворимые и водорастворимые витамины, а также редкие минералы образуют часть так называемой предварительной смеси, предназначенной для добавления в корм, тогда как макроминералы обычно добавляют в корм отдельно. Любой из этих типов композиций при обогащении с антимикробным полипептидом по изобретению представляет собой кормовую добавку для животных по изобретению.

В конкретном воплощении, кормовая добавка для животных по изобретению предназначена для включения (или предписано, что она должна быть включена) в пищу или корм животных на уровне 0,01-10,0%; более конкретно 0,05-5,0%; или 0,2-1,0% (% обозначает грамм добавки на 100 г корма). В особенности это относится к предварительным смесям.

Далее представлены не ограничивающие списки примеров этих компонентов:

Примеры жирорастворимых витаминов представляют собой витамин A, витамин D3, витамин E и витамин K, например витамин K3.

Примеры водорастворимых витаминов представляют собой витамин B12, биотин и холин, витамин B1, витамин B2, витамин B6, ниацин, фолиевая кислота и пантотенат, например Ca-D-пантотенат.

Примеры редких минералов представляют собой марганец, цинк, железо, медь, иод, селен и кобальт.

Примеры макроминералов представляют собой кальций, фосфор и натрий.

Пищевые требования для этих компонентов (приведенные для примера для домашней птицы и поросят/свиней) приведены в Таблице A из WO 01/58275. Пищевые требования обозначают, что эти компоненты должны обеспечиваться в пище в указанных концентрациях.

В качестве альтернативы, кормовая добавка для животных по изобретению включает, по меньшей мере, один из индивидуальных компонентов, определенных в Таблице A из WO 01/58275, по меньшей мере, один обозначает или один, или более из одного или двух, или трех, или четырех, и так далее до всех тринадцати или до всех пятнадцати индивидуальных компонентов. Более конкретно, этот, по меньшей мере, один компонент включают в добавку по изобретению в таком количестве, чтобы обеспечить концентрацию в корме в пределах, указанных в колонке четыре или в колонке пять или в колонке шесть Таблицы A.

Настоящее изобретение также относится к композициям корма животных. Композиции корма животных или рацион имеют относительно высокое содержание белка. Рацион поросенка и свиньи может быть охарактеризован, как указано в Таблице B из WO 01/58275, колонки 2-3. Рацион рыбы может быть охарактеризован, как указано в колонке 4 этой Таблицы B. Кроме того, такой рацион рыбы типично имеет содержание неочищенного жира 200-310 г/кг.

Композиция корма животных согласно изобретению имеет содержание неочищенного белка 50-800 г/кг, и, кроме того, включает, по меньшей мере, один антимикробный полипептид, как заявлено здесь.

Кроме того, или в качестве альтернативы (к содержанию неочищенного белка, указанному выше) композиция корма животных по изобретению имеет содержание способной к метаболизму энергии 10-30 МДж/кг; и/или содержание кальция 0,1-200 г/кг; и/или содержание доступного фосфора 0,1-200 г/кг; и/или содержание метионина 0,1-100 г/кг; и/или содержание метионина в сочетании с цистеином 0,1-150 г/кг; и/или содержание лизина 0,5-50 г/кг.

В конкретных воплощениях, содержание энергии, способной к метаболизму, неочищенного белка, кальция, фосфора, метионина, метионина в сочетании с цистеином и/или лизина, находится в любом из пределов 2, 3, 4 или 5 в Таблице B из WO 01/58275 (R. 2-5).

Содержание неочищенного белка рассчитывается как количество азота (N), умноженное на фактор 6.25, т.е. Содержание неочищенного белка (г/кг)= N (г/кг)×6.25. Содержание азота определяют по методу Кьельдаля (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

Способная к метаболизму энергия может быть рассчитана на основе NRC публикации Пищевых требований для свиньи, девятое исправленное издание 1988, подкомитет по питанию свиньи, комитет по питанию животных, сельскохозяйственный отдел, национальный исследовательский совет. National Academy Press, Washington, D. C, p. 2-6, и на основе Европейской Таблицы Значений Энергии для для материала Корма Домашней Птицы, Spelderholt Центр по исследованию и развитию домашней птицы, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

Пищевое содержание кальция, доступного фосфора и аминокислот в полноценном рационе животных рассчитывается на основе кормовых таблиц, таких как Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

В конкретном воплощении, композиция корма животных по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, один растительный белок или источник белка, как определено выше.

В следующих конкретных воплощениях композиция корма животных по настоящему изобретению содержит 0-80% маиса; и/или 0-80% сорго; и/или 0-70% пшеницы; и/или 0-70% ячменя; и/или 0-30% овса; и/или 0-40% соевой муки; и/или 0-10% рыбной муки; и/или 0-20% сыворотки. Пища для животных может быть произведена, например, в виде кормовой смеси (негранулированной) или гранулированной. Обычно, материал корма в виде муки смешивают и добавляют подходящие количества существенных витаминов и минералов согласно спецификациям для данных видов. Ферменты могут быть добавлены в виде твердых или жидких ферментных составов. Например, твердый ферментный состав обычно добавляют перед стадией смешивания или во время ее; и жидкий ферментный препарат обычно добавляют после стадии гранулирования. Фермент также может быть введен в кормовую добавку или предварительную смесь.

Конечная концентрация фермента в пище находится в пределах 0,01-200 мг белка фермента на кг пищи, например, в пределах 5-30 мг белка фермента на кг пищи животного.

Антимикробный полипептид может быть введен в одном или более из следующих количеств (пределы дозировки): 0,01-200; или 0,01-100; или 0,05-100; или 0,05-50; или 0,10-10 - все эти пределы указаны в мг белка антимикробного полипептида на кг корма (м.д.).

Для определения количества в мг белка антимикробного полипептида на кг корма, антимикробный полипептид очищают от кормовой композиции и определяют удельную активность очищенного антимикробного полипептида с применением подходящего теста (смотри по антимикробной активности, субстратам и тестам). Антимикробную активность кормовой композиции как таковую также определяют с применением того же теста, и на основе этих двух определений рассчитывают дозировку антимикробного полипептида в мг белка на кг корма.

Те же принципы применяют для определения количества антимикробного полипептида в мг белка в кормовых добавках. Конечно, если образец антимикробного полипептида, применяемого для получения кормовой добавки или корма, является доступным, то определяют специфическую активность из этого образца (нет необходимости очистки антимикробного полипептида из кормовой композиции или добавки).

Сигнальный пептид и пропептид

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, включающим ген, кодирующий белок, функционально связанный с одной или обеими последовательностями из первой нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 1-72 из SEQ ID NO:1, кодирующей сигнальный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям от -165 до -142 из SEQ ID NO:2, и из второй нуклеотидной последовательности, состоящей из нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 73-495 из SEQ ID NO:1, кодирующей пропептид, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей положениям от -141 до -1 из SEQ ID NO:2, где ген является чужеродным для первой и второй нуклеотидных последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным экспрессирующим векторам и рекомбинантным клеткам-хозяевам, включающим такие конструкции нуклеиновых кислот.

Настоящее изобретение также относится к способам получения белка, включающим (a) культивирование такой рекомбинантной клетки-хозяина при условиях, подходящих для продукции белка; и (b) получение белка.

Первая и вторая нуклеотидная последовательности могут быть функционально связаны с чужеродными генами индивидуально с другими контрольными последовательностями или в комбинации с другими контрольными последовательностями. Такие другие контрольные последовательности описаны выше. Как описано ранее, там, где на аминоконце белка представлены последовательности, как сигнального пептида, так и пропептидных участков, пропептидный участок располагается рядом с аминоконцом белка, и участок сигнального пептида располагается рядом с аминоконцом пропептидного участка.

Белок может быть нативным или гетерологичным по отношению к клетке-хозяину. Термин "белок" не предназначен здесь для обозначения кодируемого продукта специфической длины, и, таким образом, охватывает пептиды, олигопептиды и белки. Термин "белок" также охватывает два или более полипептида, объединенных с образованием кодируемого продукта. Белки также включают гибридные полипептиды, которые включают комбинацию частичной или полной полипептидных последовательностей, полученных из по меньшей мере, двух различных белков, где один или более белков могут быть гетерологичными или нативными по отношению к клетке-хозяину. Белки дополнительно включают природные аллельные или полученные генно-инженерными методами вариации вышеуказанных белков и гибридных белков.

Предпочтительно, белок представляет собой гормон или его вариант, фермент, рецептор или его часть, антитело или его часть или репортер. В более предпочтительном аспекте, белок представляет собой оксидоредуктазу, трансферазу, гидролазу, лиазу, изомеразу или лигазу. В еще более предпочтительном аспекте, белок представляет собой аминопептидазу, амилазу, карбогидразу, карбоксипептидазу, каталазу, целлюлазу, хитиназу, кутиназу, циклодекстрингликозилтрансферазу, дезоксирибонуклеазу, естеразу, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, глюкоамилазу, альфа-глюкозидазу, бета-глюкозидазу, инвертазу, лакказу, липазу, маннозидазу, мутаназу, оксидазу, пектинолитический фермент, пероксидазу, фитазу, полифенолоксидазу, протеолитический фермент, рибонуклеазу, трансглутаминазу или ксиланазу.

Ген может быть получен из прокариот, эукариот или из другого источника.

Настоящее изобретение дополнительно описано с помощью следующих примеров, которые не следует понимать как ограничивающие рамки изобретения.

ПРИМЕРЫ

Химические вещества, применяемые в качестве буферов, представляли собой коммерческие продукты, по меньшей мере, класса реагентов. В следующих примерах антимикробный полипетид, показанный в виде аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2, обозначают как "ареницин".

ПРИМЕР 1

Антимикробная активность ареницина

Антимикробный полипетид, показанный в виде аминокислотной последовательности, соответствующей положениям 1-21 из SEQ ID NO:2, получали синтетически. Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) определяли, используя тест на антимикробную активность ареницина, следуя руководству NCCLS из CLSI (Институт Клинических и Лабораторных Стандартов; широко известный как Национальный Комитет по Клиническим и Лабораторным Стандартам) - протокол M7-A6, vol. 20, No. 2: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically.

Антимикробный пептид по изобретению тестировали против 12 бактериальных штаммов, полученных из Американской Типированной Коллекции Клеточных Культур (ATCC). Результаты в Таблице 1 представляют собой средние значения двух независимых оценок.

ПРИМЕР 2

Минимальная ингибирующая концентрация против клинических грибков

Минимальные ингибирующие концентрации ареницина против дрожжей и грибков определяли, по существу, как описано у NCCLS/CLSI (институт клинических и лабораторных стандартов).

Кратко, грибковые и дрожжевые суспензии приблизительно с 1 единицей Макфарланда (McFarland) разводили 1:100 в PD бульоне (8 г/л картофельной декстрозы) и тестировали рост в зависимости от серийных разведений ареницина в 2 раза (0,03-32 мкг/мл). Тестируемые платы инкубировали при 25-27°C в случае Candida albicans, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes и Epidermophyton floccosum, и при 30°C в случае Candida glabrata, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Aspergillus niger. Рост оценивали визуально (невооруженным глазом, с наклонным освещением) через приблизительно 40 часов инкубации. Результаты представлены в таблице 2 ниже.