СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИМИКРОБНЫМ ВЕЩЕСТВАМ

Изобретение относится к средствам для определения чувствительности различных микроорганизмов, в том числе, бактерий и грибов, вызывающих заболевания людей, животных, растений, а также являющихся причиной порчи пищевой и промышленной продукции, к антимикробным веществам - антибиотикам и антисептикам, и может быть использовано, преимущественно, в медицине, а также в ветеринарии, сельском хозяйстве и промышленности.

Одной из наиболее серьезных проблем современной медицины, ветеринарии, растениеводства и промышленности является жизнедеятельность различных микроорганизмов, и прежде всего бактерий и грибов, приводящих к возникновению болезней и порче продуктов. Борьба с бактериями и грибами остается недостаточно эффективной вследствие быстрой изменчивости микроорганизмов, приводящей к появлению устойчивых форм, неумения выращивать значительное число микробов и отсутствием эффективных методов подбора противомикробного средства. В этой связи в первые 3-4 дня антимикробные препараты применяются эмпирически. В медицине и ветеринарии при этом используют антибиотики широкого спектра действия, число которых ограничено, вследствие чего, быстро формируется и распространяется устойчивость к ним, что приводит к осложнениям и не редко, к летальному исходу в медицине и ветеринарии и к необратимой порче и разрушению пищевой и промышленной продукции.

В этой связи быстрая и точная оценка чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам - антибиотикам и антисептикам остается актуальной и нерешенной проблемой.

Известен способ определения чувствительности к антимикробным препаратам, включающий предварительное выделение чистой культуры микроорганизма и ее идентификацию.

Однако выделение чистой культуры микроорганизмов обусловливает ряд негативных последствий, прежде всего, потерю времени (48-96 часов). Кроме того, при наличии двух и более микроорганизмов часть из них не выделяется в виде чистой культуры. Следует также указать, что вообще не выделяются так называемые «пока не культивируемые» (not-yet-cultivated) микробы, которые по разным данным могут составлять до 90-95%.

Трудности в работе с такими микробами связаны, прежде всего, с отсутствием методов их выделения, выращивания и идентификации. Последнее определяется организацией жизни бактерий в составе микробных сообществ - биопленок, которая определяет большую взаимозависимость микроорганизмов. Эти условия пока невоспроизводимы в лаборатории, см. Lewis K., Epstein S.S. Persisters, biofilms, and the problem of culturability. in incultivated microorganisms. In Series: Microbiology Monographs. Steinbuchel A. (ed.). Berlin / Heidelberg: Springer; 2009. 181-194. Epstein S.S. General model of microbial uncultivability in uncultivated microorganisms. In Series: Microbiology Monographs. Steinbuchel A. (ed.). Berlin / Heidelberg: Springer; 2009, c.c.131-150.

Известен способ, при котором антимикробные вещества определенным образом нанесены на полоски, см. Isenberg H.D. Essential Procedures for clinical Microbiology, ASM-Press, 1998, USA, c.c.235-240. Метод серийных разведении включает засев чистой культуры на специальную жидкую среду Muller Hinton, в которую также добавлены антимикробные вещества (антибиотики) в разных концентрациях, см. Isenberg H.D. Essential Procedures for clinical Microbiology, ASM-Press 1998, USA, c.c.216-223. Существуют способы полуавтоматического определения антибиотикочувствительности, при котором детекция проводится на специальном оборудовании (например, панели Vitec - 2 BioMerie). Однако в основе способа также лежит предварительное выделение чистой культуры предполагаемого возбудителя с последующей их экспозицией в лунках панели. Генетические методы позволяют выявлять некоторые изученные гены антибиотикоустойчивости у идентифицированных бактерий или прямо в патологическом материале. Данный метод является сравнительно быстрым, однако пока не позволяет полностью оценить чувствительность к антимикробным препаратам. Это связано с неизученностью значительной части микроорганизмов и, как следствие, отсутствием данных по их геному и генам антибиоустойчивости. Вторая причина связана с тем, что даже у известных и культивируемых бактерий устойчивость к одному анитимикробному препарату может кодироваться совершенно различными генами, многие из которых по-прежнему остаются не изученными.

Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу, включающий забор биологического материала и выделение чистой культуры микроорганизма. Для выделения чистой культуры биологический материал засевают на питательные среды, которые создают благоприятные условия для роста определенного микроорганизма, который предположительно вызывает заболевания или порчу продуктов и материалов. В случае, если микроорганизм вырастает, осуществляют его идентификацию. После этого определяют его чувствительность к антимикробному веществу, для чего проводят засев выделенной чистой культуры микроорганизма на питательную среду Muller Hinton или аналогичную не богатую среду, не содержащую антимикробное вещество, наложение на поверхность засеянной микроорганизмами питательной среды бумажных дисков, пропитанных различными антимикробными веществами, инкубацию микроорганизмов на питательной среде в присутствии исследуемых антимикробных веществ с последующей оценкой результата, см. Isenberg H.D. Essential Procedures for clinical Microbiology, ASM-Press, 1998, USA, 1998, 205-215.

Известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу (антибиотикам), включающий забор биологического материала, культивирование содержащихся в нем микроорганизмов на питательной среде, не содержащей антимикробное вещество, введение в среду исследуемого антимикробного вещества и последующую оценку результата; биологический материал культивируют в сахарном бульоне не менее двух часов, после чего вводят стандартные диски с исследуемыми антибиотиками и дополнительно инкубируют в течение не менее двух часов, результат оценивают по степени мутности содержимого в пробе, считая, что чем меньше мутность, тем выше чувствительность микроорганизмов к антибактериальным веществам, RU 2262533 C2.

Недостатки данного способа, принятого за прототип настоящего изобретения, состоят в следующем:

- весьма низкая точность определения результатов, поскольку уменьшение мутности содержимого в пробе может быть связано с угнетением роста микробов, не являющихся теми возбудителями, чувствительность которых к антимикробному веществу исследуется;

- нахождение биологического материала в питательной среде, не содержащей антимикробное вещество продолжительное время (более двух часов) за счет избирательного роста некоторых микроорганизмов приводят к изменению общего состава микроорганизмов по сравнению с исходным материалом, что резко искажает результаты исследования;

- введение антимикробного вещества в питательную среду на стандартных дисках имеет смысл только в условиях выделенной чистой культуры, поскольку только для чистых культур установлены нормы величин зон угнетения роста микроорганизмов, которые позволяют оценить их чувствительность и устойчивость к данному антимикробному веществу. В данном способе, поскольку чистая культура микроорганизма не выделяется, невозможно учесть ни особенности микроорганизма, ни концентрацию антимикробного вещества, максимально возможную в месте выделения биологического материала;

- использование не богатой жидкой питательной среды не обеспечивает рост большей части микроорганизмов.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи повышения точности определения чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу.

Согласно изобретению в способе определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам, включающем забор биологического материала, инкубацию содержащихся в нем микроорганизмов на питательной среде, введение в питательную среду исследуемого антимикробного вещества с последующей оценкой результата, для культивирования микроорганизмов используют плотную богатую питательную среду, исследуемое антимикробное вещество вводится в питательную среду до начала культивирования микроорганизмов в концентрации, близкой к максимально достижимой в месте забора биологического материала, при этом оценку чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу осуществляют после появления видимого роста микроорганизмов в контрольном посеве; в качестве плотной богатой питательной среды для инкубации бактерий используют среду бруцелла агар или среду Колумбия агар, а для инкубации грибов используют среду Сабуро; к питательной среде может быть добавлена сыворотка крови человека или животных и/или эритроциты; к питательной среде могут быть добавлены витамины, и/или аминокислоты, и/или пищевые добавки; питательная среда может дополнительно содержать микроорганизмы, способствующие при совместном культивировании росту исследуемых микроорганизмов; микроорганизмам, способствующим при совместном культивировании росту исследуемых микроорганизмов, могут быть предварительно переданы гены устойчивости к различным антимикробным веществам; в питательную среду для инкубации грибов могут быть добавлены противобактериальные препараты; в питательную среду для инкубации бактерий могут быть добавлены противогрибковые препараты; инкубацию микроорганизмов могут осуществлять в аэробных условиях; инкубацию микроорганизмов могут осуществлять в анаэробных условиях; инкубацию могут осуществлять в присутствии одного или более дополнительных антимикробных веществ; питательную среду могут размещать в чашки Петри; питательную среду могут размещать на плате из пластика или бумаги; в плате могут быть выполнены углубления для питательной среды.

Заявителем не выявлены какие-либо технические решения, идентичные заявленному, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию «Новизна».

Заявленное изобретение в отличие от прототипа и других известных аналогов не предполагает определение чувствительности определенных микроорганизмов, характерных для данного заболевания человека, животных, растений или повреждения и порчи продуктов и материалов.

Новым принципом, положенным в основу заявленного способа, является то обстоятельство, что стараются вырастить по возможности все микроорганизмы, содержащиеся в забранном материале, и затем определить, какое именно антимикробное вещество наиболее эффективно подавляет совокупность этих микроорганизмов, без того, чтобы реально или предположительно идентифицировать данные микроорганизмы, как это имеет место в известных способах.

То есть, для решения проблемы борьбы с источником заболеваний и порчи продуктов и материалов не требуется знать, что этот источник собой представляет, важно знать, какое средство позволяет устранить или уменьшить вредное воздействие этого источника.

Реализация отличительных признаков изобретения обеспечивает указанное выше принципиально новое свойство объекта изобретения и, соответствующий технический результат, состоящий в существенном повышении точности результатов исследования.

Плотная богатая питательная среда позволяет вырастить максимальное количество различных микроорганизмов, содержащихся в пробе, при этом важно, что исследуемое антимикробное вещество вводят в питательную среду до того, как осуществляется культивирование микроорганизмов. Это обеспечивает предотвращение изменения общего состава микроорганизмов в процессе культивирования по сравнению с исходным материалом. При этом важно, что антимикробное вещество вводится в концентрации, близкой к максимально достижимой в месте забора биологического материала, а не в произвольной концентрации, как это имеет место при введении антимикробного вещества на стандартных дисках. При этом оценку чувствительности микроорганизмов определяют не по степени мутности содержимого в пробе, что может быть связано с угнетением микробов, не являющихся патогенными (вредоносными), а по результатам появления видимого роста микроорганизмов в контрольном посеве.

Существенно новым в заявленном способе является то обстоятельство, что добавление в питательную среду некоторых микроорганизмов может способствовать при совместном культивировании с возбудителями болезней росту даже тех микроорганизмов в пробе, которые иначе являются «некультивируемыми».

Для большей выраженности данного эффекта микроорганизмам, способствующим при совместном культивировании росту исследуемых микроорганизмов, передают гены устойчивости к различным антимикробным веществам.

Указанные выше новые свойства заявленного способа обусловливают, по мнению заявителя, его соответствие требованию патентоспособности «Изобретательский уровень».

Реализация способа поясняется приведенными ниже примерами.

Пример 1. Экспресс определение чувствительности к азитромицину бактерий, при посеве материала, полученного у больного с инфекцией мочевыделительной системы.

Осуществляли забор биологического материала - мочи больного циститом.

Питательная среда: плотная, богатая - бруцелла агар, обогащенный лошадиной сывороткой и эритроцитами человека и барана. В среду предварительно добавили азитромицин в максимально достаточной в моче концентрации - 4 мкг/мл.

Материал высевали в количестве 0,2 мл в чашки Петри. В контроле использовали аналогичную среду и условия культивирования. Посев инкубировали при температуре 37°C.

Результат исследования. В контроле через 4-6 часов роста при температуре 37°C зарегистрировано образование газона.

Таким образом, на плотной богатой питательной среде в контрольном посеве зарегистрирован рост большого числа разных неродственных бактерий, которые не дали роста в присутствии азитромицина, который может быть с успехом использован для лечения данного больного. При этом не потребовалось идентификация конкретных возбудителей и выделение чистой культуры. Ответ для назначения антибиотика был получен через 4 часа.

Пример 2. Экспресс определение чувствительности к ампициллину бактерий, при посеве материала, полученного у животного (собака) с раневой инфекцией.

Способ осуществляли аналогично описанному в примере 1.

Материал для исследования: отделяемое из раны.

Питательная среда: агар Колумбия, обогащенный лошадиной сывороткой с эритроцитами барана, витаминами и аминокислотами. В среду добавлен апициллин в максимально достижимой в месте забора концентрации - 1 мкг/мл.

Материал из раны высевали тампоном на среду в чашке Петри. В контроле использовали ту же среду и условия культивирования без ампициллина.

Посев инкубировали при температуре 37°C.

Результат исследования. В контроле через 4-6 часов роста при температуре 37°C зарегистрировано образование газона. На чашке с ампициллином рост бактерий не зарегистрирован.

Таким образом, на плотной богатой среде зарегистрирован рост большого числа разных неродственных бактерий, которые не давали роста в присутствии ампициллина, который может быть с успехом использован для лечения данного животного. При этом не потребовалась идентификация конкретных возбудителей и выделение чистой культуры. Ответ для назначения антибиотика был получен через 4 часа.

Пример 3. Выбор антисептика для уничтожения бытовой плесени, полученной из зараженной штукатурки.

Материал для исследования: кусочки пораженной штукатурки, имеющие признаки роста плесени. Готовили взвесь штукатурки (0,5 г) в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Питательная среда: Сабуро агар, обогащенный минеральными компонентами, размещен в трех чашках Петри. В среду предварительно добавлены препараты: первая чашка - антисептик Мультицид, гидразиновое производное полигуанидина, растворитель вода в конечной концентрации 0,5% (может быть достигнута без изменения свойств штукатурки и подобных материалов - цвета, запаха и механических свойств); вторая чашка - антисептики: Тефлекс - комплекс сополимеров гуанидина. Растворитель - вода (0,5%); третья чашка - контроль без антисептиков.

Материал засевали бактериологической петлей.

Посевы культивировали при 30°C. Учет результатов производили через 4, 6, 8, 12, 20, 24 и 48 часов после засева.

Результаты. Через 6 часов культивирования рост зарегистрирован в контрольной чашке и в чашке, где агар содержал препарат Тефлекс. В чашках с Мультицидом рост отсутствовал. Плесень оказалась устойчивой к препарату Тефлекс и чувствительна к антисептику Мультицид. При этом не потребовалась идентификация конкретных возбудителей и выделение чистой культуры. Ответ для выбора антисептика был получен через 8 часов.

Пример 4. Выбор антибиотика при лечении заболеваний дыхательной системы.

Материал для исследования - мокрота больного.

Питательная среда: Бруцелла агар, обогащенный лошадиной сывороткой и эритроцитами человека. В среду добавлены Haemophilus influenzae - бактерии, вызывающие заболевания дыхательной системы и способствующие росту другого возбудителя - Streptococcus pneumoniae, очень плохо культивируемого в обычных условиях. В среду был также добавлен левофлоксацин в максимальной концентрации, достижимой в мокроте - 10 мкг/мл.

Свежесобранную мокроту больного развели в 5 раз в изотоническом растворе хлорида натрия, засеяли по 0,2 мл/чашка шпателем и инкубировали при температуре 37°C. Учет результатов производили через 4, 6, 12, 20 и 24 часа после засева.

Результаты. В контроле через 4 часа при температуре 37°C зарегистрировано образование газона. На среде с добавлением левофлоксацина: через 4, 6, 12, 20 и 24 часа - отсутствие роста. По данным микроскопии: через 24 часа рота на мазках, приготовленных из бактерий, выросших в контрольном образце - более 12 морфотипов микроорганизмов; на среде с добавлением левофлоксацина - отсутствие роста.

Таким образом, предложенная технология позволяет быстро, в течение 4 часов выбрать антибиотик, который будет ингибировать рост всех потенциальных возбудителей данной патологии, в том числе практически не культивируемых в обычных условиях. При этом не потребовалась идентификация конкретного возбудителя и выделение чистой культуры.

Пример 5. Экспресс определение чувствительности к смеси антибиотиков гентамицина (действует преимущественно на аэробные бактерии) и метронидазола (активен по отношению к анаэробных бактериям и микроарофилам), при посеве материала, полученного от больного с заболеванием пародонта.

Материал для исследования: свежесобранное отделяемое десневого кармана.

Питательная среда: для культивирования в аэробных условиях использовали среду Колумбия агар, обогащенный эритроцитами барана и лошадиной сывороткой. Для выявления анаэробных микроорганизмов использовали агар Шедлера, содержащий эритроциты барана и сыворотку. В среду были добавлены 2 антибиотика: гентамицин (активен против широкого спектра аэробов) и метронидазол, избирательно действующий на анаэробные бактерии. Среда в чашках №1 и №1а содержит гентамицин; среда в чашках №2 и №2а содержит метронидазол; среда в чашках №3 и №3а содержит гентамицин и метронидазол; в чашках №4 и №4 находится только питательная среда (контроль).

Отделяемое десневого кармана развели в 5 раз изотоническим растровом хлорида натрия, засеяли по 0,05 мл/чашка (засев шпателем). Посевы культвировали для аэробов (чашки 1-4) в обычном термостате и для анаэробов (чашки 1a-4а) в термостате в анаэробных условиях при 37°C 48-72 часа. Для создания анаэробных условий использовали газогенерирующие пакеты. Учет результатов производили через 4, 8, 12, 20, 24 и 48 часов после засева (анаэробные бактерии характеризуются продолжительным ростом).

Результаты. В контроле в аэробных (через 4 часа) и анаэробных (через 8 часов) условиях роста при температуре 37°C зарегистрировано образование газона. В аэробных условиях в опытной чашке №3 содержит (гентамицин и метронидазол) рост отсутствовал на всем протяжении наблюдения. В анаэробных условиях через 8 часов в опытной чашке №3а (содержит гентамицин и метронидазол) рост отсутствовал. Микробный рост зарегистрирован в чашках №№1, 1a, 2 и 2а. Полученные данные свидетельствуют об эффективности смеси гентамицина и метронидазола и наличии устойчивых клонов при использовании препаратов по отдельности.

Таким образом, заявляемый способ в отличие от прототипа позволяет оценивать чувствительность к смеси антимикробных препаратов.

Пример 6. Экспресс определение чувствительности грибов, возбудителей заболевания растений (мучнистая роса) противогрибковым препаратам.

Материал для исследования: смыв изотонического раствора хлорида натрия с пораженных участков листа растения, имеющих признаки роста грибов.

Питательная среда: Сабуро агар, обогащенный минеральными компонентами, размещен на планшете с шестью лунками. Для предотвращения роста бактерий в агар был добавлен гентамицин в количестве 0,01 мг/л. В среду также добавлены испытуемые противогрибковые препараты: 1-я лунка - пропиканозол, в конечной концентрации 1%; 2-ая лунка - нистатин (0,4 мг/л); 3-я лунка - контроль без противогрибковых препаратов.

Делали смыв с 4 см³ пораженного участка 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия. Материал засевали бактериалогической петлей.

Посевы культивировали при 30°C. Учет результатов производили через 6, 8, 12, 20, 24 и 48 часов после засева.

Результаты. Через 8 часов культивирования зарегистрирован рост в контрольной лунке и в лунке, где агар содержал препарат нистатин. В лунке с пропиканозолом рост отсутствовал. Плесень оказалась устойчивой к препарату нистатин. При этом не потребовалась идентификация конкретного возбудителя и выделение чистой культуры. Ответ для выбора противогрибкового препарата был получен через 8 часов.