Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НАСТУПЛЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и лабораторной диагностике, и может быть использовано для повышения эффективности наступления беременности у групп тромбогенного риска, нуждающихся в стимуляции фибринолиза для повышения частоты наступления беременности в программе вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО).

Одной из актуальных проблем современной медицины является бесплодный брак, который по своей социальной значимости занимает одно из ведущих мест в акушерстве. В связи с этим большое распространение получил метод лечения бесплодия путем ЭКО. При этом эффективность программы ЭКО по частоте наступления беременности остается в мире на уровне 30-40%.

В настоящее время нет способов повышения эффективности наступления беременности в программе ЭКО по активности фибринолитических реакций крови.

Известен способ диагностики скрытого внутрисосудистого фибринообразования, основанный на выявлении повышения уровня Д-димера в результате проведения последовательной перемежающейся пневматической компрессии (ПППК) нижних конечностей, следствием чего является активация системы фибринолиза за счет выделения эндотелием сосудов тканевого активатора плазминогена (t-PA) и индукции трансформации плазминогена в плазмин, который в свою очередь лизирует фибрин до конечных продуктов, одним из которых является Д-димер (Залозный Д.А. Реакция системы гемостаза при применении перемежающейся последовательной пневматической компрессии нижних конечностей // Материалы XI научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» 17-20 ноября 2009 г. - Барнаул, 2010. - том II. - С.6-7).

Однако известный способ не применялся для снижения угрозы тромбообразования и улучшения исходов по наступлению беременности в процедуре ЭКО.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ повышения эффективности наступления беременности при ЭКО (прототип), отражающий количество и качество ооцитов путем определения овариального резерва по измерению базального уровня фолликуло-стимулирующего гормона (ФСГ), определяемого на 3-4 день менструального цикла (Серов В.Н., Прилепская В.Н., Овсянникова Т.В. Гинекологическая эндокринология. - М.: Медпресс-информ, 2006. - 528 С.).

Недостатком известного способа является низкая информативность в вероятности наступления беременности при проведении ЭКО.

Авторы предлагают способ повышения эффективности наступления беременности, заключающийся в формировании группы риска в зависимости от показателей индекса активирующего фибринолиз способности эндотелия (АФСЭ), характеризующего работу фибринолитической системы, и при его величине менее 11,0 ед. проведении ПППК.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение эффективности наступления беременности при ЭКО.

Технический результат достигается тем, что способ осуществляют с учетом состояния системы фибринолиза по индексу АФСЭ и при его значениях менее 11,0 ед. применяют последовательную перемежающуюся пневматическую компрессию.

Способ осуществляют следующим образом:

Информативность заявляемого способа представлена фигурами 1, 2 в виде таблиц и графиком 3.

На фигуре 1 приведены параметры фибринолиза у женщин, получавших ПППК.

На фигуре 2 даны параметры фибринолиза у женщин, не получавших ПППК.

На фигуре 3 указаны показатели индекса АФСЭ у женщин в программе ЭКО (А - до ПППК, Б - после ПППК; 1 - исследование женщин перед гормональной стимуляцией в цикле ЭКО; 2 - исследование за 2-3 дня до пункции фолликулов на фоне гормональной стимуляции; 3 - исследование на 12-14 день после переноса эмбрионов и в день определения наступления беременности по результатам ХГЧ).

Вазокомпрессия приводит к стимуляции стенки кровеносных сосудов и преимущественному выбросу в кровоток тканевого активатора плазминогена (t-PA), активность которого преобладает над активностью ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-I), лабораторным отражением чего является повышение индекса АФСЭ.

Определяют параметры фибринолиза и рассчитывают индекс АФСЭ.

Индекс АФСЭ, определяемый в единицах по формуле:

(Активность t-PA/Активность РА1-1)×100%, является интегральным показателем функционирования фибринолиза и оценивает активирующую фибринолиз активность эндотелия кровеносных сосудов. У здоровых людей индекс АФСЭ составляет не менее 11,0 ед. и, как показали проведенные ранее исследования, повышается, в среднем, в 1,8 раза после ПППК (Залозный Д.А. Реакция системы гемостаза при применении перемежающейся последовательной пневматической компрессии нижних конечностей // Материалы XI научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» 17-20 ноября 2009 г. - Барнаул, 2010. - том II. - С.6-7).

При снижении индекса АФСЭ менее 11,0 ед, у пациенток в программе ЭКО в срок за 2-3 дня до пункции фолликулов яичника, выполняется ПППК в виде курса из 4 сеансов (по 2 раза в неделю с интервалом в 2-3 дня) с использованием аппарата «Пневмомассажер-ПМ» (ЗАО «Химко», Россия) с наложением манжеты аппарата на верхнюю конечность (длительность одной процедуры составляет 30 минут).

Материал для исследования, реактивы и оборудование:

Кровь берут утром натощак из локтевой вены иглой без шприца (самотеком) и немедленно смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия. Стабилизированную кровь до центрифугирования (в том числе и в процессе транспортировки) хранят при комнатной температуре (+18…+25°С) не более 1 ч. Исследование крови со сгустками или гемолизом не допускается. Стабилизированную кровь центрифугируют на центрифуге, например, «Eppendorf 581R», Германия, при 1000 об/мин (140-160g) в течение 5-7 мин. Богатую тромбоцитами плазму с помощью пипетки переносят в другую пробирку, в которой ее дополнительно центрифугируют при 3000-4000 об/мин (1200-1400 g) в течение 15 минут, в результате получают бедную тромбоцитами плазму (БТП).

Принцип метода определения активности t-PA:

Для определения активности t-PA используется набор реагентов для иммуноферментных исследований «t-PA Combi Actibind ELISA Kit», Technoclone, Австрия, кат. №ТС 16000.

Метод основан на использовании антител к t-PA, иммобилизованных в лунках микропланшета. Данные антитела связывают t-PA, содержащийся в плазме. После инкубации не связавшиеся компоненты плазмы удаляются промыванием. Затем в лунки добавляется смесь для определения активности, содержащая Glu-плазминоген, CNBr-фрагменты фибриногена и хромогенный субстрат для плазмина. Связавшийся t-PA активирует Glu-плазминоген в плазмин. В результате взаимодействия между плазмином и хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт реакции. Интенсивность развившегося окрашивания, пропорциональна количеству активного t-PA в исследуемом образце, измеряется фотометрически.

Реагенты:

1. Планшет, 96-луночный, покрытый моноклональными антителами к t-PA.

2. Стандартные образцы содержащие лиофилизированный рекомбинантный t-PA.

3. Инкубационный буфер (100 мл), содержащий белок-стабилизатор.

4. Субстрат (12 мл), содержащий ТМБ (тетраметилбензидин).

5. Буфер для промывки (100 мл), содержащий детергент и 0,01% мертиолат.

6. Реакционная смесь для определения активатора плазминогена, содержащая лиофилизированный H-D-норлейцилгексагидротирозил-лизин-р-нитроанилид диацитат, Glu-плазминоген и бромциан-фрагменты фибриногена.

7. Буфер для разведения реакционной смеси (20 мл), содержащий 50 MM Tris, 12 мМ NaCl.

Оборудование: Комплект для проведения иммуноферментных исследований в планшетном формате (Multiskan Plus Plate Reader, Labsystems). Ход определения:

1. Вносят по 0,1 мл стандарта или образца плазмы крови в лунку планшета, инкубируют в течение ночи при +4°C.

2. Промывание микропланшета: вносят по 0,2 мл промывочного буфера во все лунки и выливают содержимое. Промывают лунки еще 2 раза тем же буфером.

3. Добавляют в лунки планшета по 0,2 мл готовой реакционной смеси, затем инкубируют при +37°C в течение 75 минут.

4. Для определения результатов измеряют абсорбцию при длине волны 405 нм.

5. По предварительно построенной калибровочной кривой, с применением стандартных образцов t-PA, определяют активность t-PA в исследуемой плазме крови.

Принцип метода определения активности PAI-1

Для определения активности PAI-1 используется набор реагентов для иммуноферментных исследований «Actibind PAI-1 ELISA», Technoclone, Австрия, кат. №ТС 16075.

Метод основан на способности PAI-1 специфически связываться с t-PA. Активная форма PAI-1 остается иммобилизованной в лунке планшета и реагирует со специфичными к ней коньюгированными антителами. Интенсивность развившегося окрашивания, пропорциональная количеству активного PAI-1 в исследуемом образце, измеряется фотометрически.

Реагенты:

1. Планшет, 96-луночный, покрытый моноклональными антителами к t-PA.

2. Стандартные образцы содержащие лиофилизированный PAI-1.

3. Буфер для промывки (100 мл), содержащий детергент и 0,01% мертиолат.

4. Инкубационный буфер (100 мл), содержащий белок-стабилизатор.

5. Коньюгат моноклональных антител анти-РА1-1-ПХ с пероксидазой (0,2 мл).

6. Субстрат (12 мл), содержащий ТМБ (тетраметилбензидин).

7. Стоп-раствор (12 мл), содержащий 0,45 моль/л серной кислоты.

Оборудование: Аппарат для проведения иммуноферментных исследований в планшетном формате (Multiskan Plus Plate Reader, Labsystems).

Ход определения:

1. Вносят в лунки планшета 25 мкл стандарт нового образца плазмы крови, затем разведенный коньюгат 75 мкл, инкубируют при комнатной температуре в течение 45 минут.

2. Промывание микропланшета: вносят по 0,2 мл промывочного буфера во все лунки и выливают содержимое. Промывают лунки еще 2 раза тем же буфером.

3. Добавляют в лунки планшета раствор субстрата по 0,1 мл, затем инкубируют в течение 75 минут при комнатной температуре.

4. Вносят в каждую лунку по 0,1 мл стоп-раствора.

5. Для определения результатов измеряют абсорбцию при длине волны 450 нм.

6. По предварительно построенной калибровочной кривой, с применением стандартных образцов PAI-1, определяют активность PAI-1 в исследуемой плазме крови.

На основании полученных результатов определения активности t-PA И PAI-1 рассчитывается индекс АФСЭ. При снижении индекса АФСЭ менее 11,0 ед., определенном при исследовании крови в срок за 2-3 дня до пункции фолликулов яичника, пациенткам выполняется ПППК в виде курса из 4 сеансов (2 раза в неделю).

Апробация заявляемого способа повышения эффективности наступления беременности в программе вспомогательных репродуктивных технологий с применением ПППК проведена нами на 17 женщинах с бесплодием при проведении программы ЭКО. В основную группу риска включены пациентки с выявленными нарушениями в системе фибринолиза и сниженными показателями индекса АФСЭ (менее 11,0 ед.). Контрольную группу составили 18 женщин с нарушениями фибринолиза и сниженным индексом АФСЭ, не получавшие ПППК. Динамическое исследование системы гемостаза с оценкой параметров фибринолиза пациенткам выполнялось трижды: перед гормональной стимуляцией в цикле ЭКО (1 исследование), за 2-3 дня до пункции фолликулов на фоне гормональной стимуляции (2 исследование). Третье исследование выполнено после 4 сеансов ПППК на 12-14 день после переноса эмбриона и в день определения наступления беременности по результатам ХГЧ. Результаты динамических обследований женщин основной группы, получавших ПППК, представлены на фигуре 1, а не получавших ПППК - на фигуре 2.

При этом в группе женщин, получавших ПППК индекс АФСЭ увеличивался более чем в 2 раза, достигнув значения, аналогичного контрольному у здоровых людей, а в группе женщин, не получавших ПППК, значимого увеличения АФСЭ зарегистрировано не было (фигура 3).

После получения результатов ХГЧ оказалось, что в группе женщин с нарушением фибринолиза, получавших ПППК, беременность наступила у 6 из 17 пациенток (35,3%), в контрольной группе (не получавших ПППК) - у 4 из 18 пациенток (22,2%), т.е. наступление беременности у женщин с нарушенным фибринолизом без ПППК было в 1,6 раза реже, чем в группе пациенток, получавших ПППК.

Клинический пример

Пациентка З.С., 31 год, обратилась 11.08.2011 г. в Центр сохранения и восстановления репродуктивной функции Краевой клинической больницы (г.Барнаул) по поводу трубного бесплодия для прохождения программы экстракорпорального оплодотворения. У нее имелся регулярный менструальный цикл, противопоказаний к беременностям и родам не выявлено.

Проводилось исследование активности t-PA, PAI-1 и расчет по полученным данным индекса АФСЭ. Обследование проводилось в динамике, в образцах плазмы крови, полученных перед началом гормональной стимуляции (исходный фон - 1-й этап), за 2 дня до пункции яйцеклеток (2-й этап) и на 14 день после переноса эмбрионов (3-й этап). Анализы выполнялись на аппарате для проведения иммуноферментных исследований в планшетном формате «Multiscan Plus Plate Reader, Labsystems».

До вхождения в цикл ЭКО (1-й этап) определено снижение индекса АФСЭ - 9,0 ед. (в норме >11,0 ед).

С учетом низкой фибринолитической активности больной выполнялась ПППК в виде курса из 4 сеансов (2 раза в неделю с интервалом в 2-3 дня) с использованием аппарата «Пневмомассажер-ПМ» (ЗАО «Химко», Россия), с наложением манжеты аппарата на одну из верхних конечностей (длительность одной процедуры составляла 30 мин).

При повторном обследовании после 4 сеансов ПППК, перед пункцией яйцеклеток (2-й этап), индекс АФСЭ увеличился в 2,23 раза, и оказался равным 20,1 ед. Далее, в конце цикла ЭКО, на 3-м этапе наблюдений, на фоне наступившей беременности, индекс АФСЭ составил 21,3 ед.

Заключение: Нарушение репродуктивной функции, связанное с трубным фактором. Угнетение фибринолитической активности по снижению индекса АФСЭ (менее 11,0 ед), купированное проведением курса ПППК.

Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить информативность, что приводит к повышению эффективности наступления беременности у групп тромбогенного риска, нуждающихся в стимуляции фибринолиза.