СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО АГЕНТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Изобретение относится к способу получения аптамеров - ДНК-аналогов антител, направленных на молекулярные мишени вирусов. Способ получения ДНК-аптамеров к вирусу клещевого энцефалита может найти широкое применение в области медицины, вирусологии и биотехнологии, а получаемый в результате продукт - в качестве диагностического и терапевтического препарата.

С открытием аптамеров и способа их отбора [Tuerk С. and Gold L., 1990 [1]; Ellington A.D., Szostak J.W., 1990] [2], востребованность в получении этих нуклеотидных аналогов иммуноглобулинов постоянно растет. Повышенный интерес обусловлен их уникальными особенностями: небольшими размерами (40-100 нуклеотидов), которые позволяют легко проникать внутрь клетки, специфичностью и эффективностью связывания с мишенями и рецепторами, отсутствием иммунного ответа организма, легкостью получения с помощью химического синтеза и нетребовательностью к условиям хранения. Обладая уникальными свойствами, аптамеры широко востребованы в качестве диагностических и терапевтических препаратов, так как позволяют выявлять поверхностные и внутриклеточные молекулярные мишени, а также изменять физиологическую активность белков, на которые они направлены.

Известен способ получения антивирусных олигонуклеотидов. [Patent 8008269 US. Int. Cl. A01N 43/04, C12Q 1/68, C12P 19/34, C07H 21/02. Antiviral oligonucleotides / Andrew Vaillant et. al.; Replicor Ink, Montreal, CA(US). - Опубл. August 30, 2011] [3].

Изобретение позволяет получать олигонуклеотиды к различным инфекционным агентам и является препаратом широкого спектра действия для терапии большого числа вирусных заболеваний человека и животных. В указанном патенте с помощью химического синтеза получают фосфорилированные олигонуклеотиды со случайной последовательностью, длиной от 20 до 120 нуклеотидных оснований. Воздействие олигонуклеотидов на вирусы человека и животных осуществляется за счет случайных стерических совпадений пространственных структур олигонуклеотидов и вирусов, попавших в организм, не связанных с комплементарным взаимодействием олигонуклеотидов с определенными нуклеотидными последовательностями в геноме возбудителей. Различные по длине и структуре олигонуклеотиды с разной эффективностью воздействуют на большинство известных вирусов, в том числе из семейств: герпесвирусов, цитомегаловирусов, гепаднавирусов, парамиксовирусов, флавивирусов, вирус гепатита B и других. Структура олигонуклеотидов представляет собой гетерополимер, который содержит различные комбинации нуклеотидов, содержащих основания: аденозин, гуанозин, цитидин, тимидин или уридин. Каждый олигонуклеотид может содержать не менее одного основания 5-метилцитозина и 2`-метоксиэтил модифицированные остатки рибозы.

Несмотря на простоту получения олигонуклеотидов и показанную эффективность для широкого спектра вирусов, эффект такого воздействия намного ниже, чем применение специфично отобранных аптамеров, высокочувствительных к определенному вирусному белку. Использование олигонуклеотидов не позволяет проводить детекцию определенного вируса. Отсутствие специфичности к вирусу клещевого энцефалита не позволяет применять известный способ для направленного выявления и лечения этой инфекции.

Известны способы получения аптамеров к вирусным белкам вируса гепатита В и вируса гриппа В человека [Gopinath S.C. et. al., 2005. [4]; Feng H. et. al., 2011 [5]. Для получения РНКаптамеров используют специфичные вирусные белки, гемагглютинин вируса гриппа В и рибонуклеопротеиновый комплекс вируса гепатита В, к которым проводят отбор аптамеров способом SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment).

Известен способ получения РНК-содержащих аптамеров, ингибирующих репликацию вируса гепатита С [Патент US 8,008,272, Int. Cl. C07H 21/02; C07H 21/04; A61K 31/70 C12Q 1/68. Nuclease-resistant RNA aptamer inhibiting replication of hepatitis C virus replicon / Lee, et al.; Bexcore Co., Ltd. (Seoul, KR), Daewon Pharm. Co., Ltd. (Seoul, KR). - Опубл. August 30, 2011] [6].

В указанном патенте аптамер специфически связывается с главным каталитическим белком вирусной репликации - неструктурным белком NS5B, РНК-зависимой РНК-полимеразой и ингибирует пролиферацию вируса гепатита C. Оптимизированные аптамеры - РНК химически синтезированы. РНК-апатмеры получают из библиотеки случайных последовательностей РНК с применением метода SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) по способности специфично и высокоафинно связываться с белком NS5B. Резистентность к нуклеазам осуществляют за счет замещения флуорогруппы 2`-гидрокси урацилом и цитозином. Аптамер содержит холестерильную группу в 5` конце, которая позволяет модифицированному аптамеру проникать внутрь клетки и ингибировать вирус в клетках печени человека Huh-7. Способ позволяет выявлять вирус гепатита С в диагностических целях, а также осуществлять терапию, благодаря специфичному связыванию и ингибированию вирусного неструктурного белка NS5B.

Указанный способ не может быть применен для выявления и блокирования вируса клещевого энцефалита ввиду его высокой специфичности к белку другого вируса. Кроме того, РНК содержащий аптамер, в отличии от ДНК-аптамера, обладает меньшей устойчивостью к РНКазам, для его получения необходимо проводить большее количество стадий, а воздействие РНК-аптамера на неструктурный белок NS5B, позволяет применять его только для ингибирования вируса внутри клетки, то есть уже в период развития болезни.

В настоящее время в диагностике и терапии опасного вирусного заболевания, каким является клещевой энцефалит, отсутствуют безопасные для организма эффективные способы выявления и блокирования вируса клещевого энцефалита. Проблема воздействия на вирус клещевого энцефалита на начальных этапах, когда вирус присутствует пока в кровотоке организма-хозяина, до его проникновения в клетки мозга, является актуальной не только для многих регионов России. Для предотвращения заболевания используют препарат иммуноглобулин против клещевого энцефалита, выделяемый из крови людей, содержащей специфические антитела к вирусу. Недостатком широко применяемого в практике специфического иммуноглобулина является необходимость хранения его при температуре 4 градуса, ограниченное время хранения и необходимость применения только в амбулаторных условиях в связи с возможностью развития анафилактического шока [7].

Проблема может быть решена замещением специфических антител ДНК-лигандами-аптамерами.

Указанные выше способы не могут быть применены для выявления и блокирования вируса клещевого энцефалита ввиду их высокой специфичности к белкам других вирусов. Кроме того, РНК-содержащий аптамер, в отличие от ДНК-аптамера, обладает меньшей стабильностью и устойчивостью к РНКазам, для его получения необходимо проводить большее количество стадий, а воздействие РНК-аптамера на неструктурные белки, позволяет применять их только для ингибирования вируса внутри клетки, что требует разработки специальных способов доставки.

Техническим результатом заявляемого решения является снижение стоимости получения нового высокочувствительного и специфичного препарата нуклеотидной природы для повышения надежности и качества диагностики и терапии вируса клещевого энцефалита, повышение доступности воздействия полученного препарата на вирус, снижение стоимости получения препарата.

Способ получения терапевтического агента для лечения клещевого энцефалита людей, при котором получают аптамеры, третичная структура которых имеет стерическое соответствие и способна образовывать прочный комплекс с третичной структурой поверхностного белка вируса клещевого энцефалита. В качестве белкового компонента комплекса используют фрагмент поверхностного белка E вируса клещевого энцефалита, соответствующий аминокислотным остаткам 50-250 белка, ген которого амплифицируют и клонируют в плазмидном векторе. Клонированный рекомбинантный белок экспрессируют. Полученный рекомбинантный белок очищают и иммобилизуют на планшете. Далее из первоначального пула вырожденных олигонуклеотидов состава 5`-CTCCTCTGACTGTAACCACG-(N40)-GGCTTCTGGCTACCTATGC-3', где N - любой из нуклеотидов (G, А, Т, С), взятых в эквивалентном количестве при синтезе 40-звенных олигонуклеотидов, содержащих на 5'- конце флуоресцентный краситель FAM, с помощью 15 циклов экспоненциального обогащения с применением метода SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) проводят отбор специфично связывающихся с вирусным белком аптамеров, при этом на каждом этапе сорбции проводят денатурацию 25 рМ одноцепочечного олигонуклеотида. Далее денатурированный пул аптамеров наносят в лунку с иммобилизованным белком, инкубируют и отмывают от несвязавшихся олигонуклеотидов. Связанные с белком аптамеры снимают с поверхности буфером с низкой ионной силой и высоким pH. Пул аптамеров, после каждого этапа сорбции амплифицируют, полученные ампликоны двуцепочечной библиотеки аптамеров очищают и проводят реакцию ассиметричной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения одноцепочечного продукта, который очищают с помощью сорбции с получением целевого продукта в виде аптамеров - низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты, структура которой приведена в перечне последовательностей: SEQ ID NO: 1-48.

Указанный фрагмент гена белка Е амплифицируют с праймерами состава 5`-GACTCCATCCATATGGAGAATCCTGCC-3' и 5`-TACACGTCCTCGAGCACGGCGTG-3`. Полученный фрагмент ДНК клонируют в векторе рЕТ-22b(+) по сайтам рестрикции Ndel и Xhol, и экспрессируют рекомбинантный белок в штамме B834(DE3)pLysS при индукции 0,1 mM IPTG. Полученный рекомбинантный белок выделяют из телец включения путем нанесения лизата в буфере состава: 8 М мочевина, 1×PBS содержащим 0.1% Triton X-100 и 25 мМ имидазола на колонке с 5 мл агарозной смолы Ni-NTA-агарозы.

Очищенный рекомбинантный белок разводят бикарбонатным буфером (NaHCO3, рН~8) с добавлением 1 тМ DTT до концентрации 100 мкг/мл, наносят на планшет Nunk Immuno™ LockWell™ Module/Strip Plates, предварительно 3 раза промыв лунки 100 мкл 1×PBST (1×PBS содержащим 0.1% Tween-20). В каждую лунку вносят 10 мкг белка и оставляют на 18 часов при 40 ОС при легком покачивании. Затем промывают лунки от несвязавшегося белка 1×PBST. Планшеты с иммобилизованным белком хранят при 40°С во влажной камере не более 15 суток. Перед каждой реакцией сорбции аптамера лунку с иммобилизованным белком промывают 3 раза 1×PBST.

При проведении отбора аптамеров, специфично связывающихся с фрагментом вирусного белка, используют первоначальный пул вырожденных олигонуклеотидов, получаемый путем прямого фосфорамидного синтеза, при котором рандомизированный фрагмент длиной 40 нуклеотидных остатков фланкируют последовательностями CTCCTCTGACTGTAACCACG-(N40)-GGCTTCTGGCTACCTATGC-3', на 5'- конце которого помещают флуоресцентный краситель FAM. На каждом этапе сорбции проводят денатурацию 25 рМ одноцепочечного олигонуклеотида при 96 C° в течение 5 минут в 10 мМ TrisHCl pH~8, после чего сразу помещают в ледяную баню на 10 минут. Далее денатурированный пул аптамеров наносят в лунку с иммобилизованным фрагментом поверхностного белка вируса, инкубируют 30 минут и отмывают 5 раз от несвязавшихся олигонуклеотидов.

Пул аптамеров, образовавший прочный комплекс с третичной структурой поверхностного белка вируса, после каждого этапа сорбции амплифицируют с праймерами состава 5'-/FAM/-CTCCTCTGACTGTAACCACG-3' и 5'-GGCTTCTGG CTACCTATGC-3', полученные ампликоны двуцепочечной библиотеки аптамеров очищают и проводят реакцию асимметричной ПЦР, в соотношении правого и левого праймеров 50:1, для получения одноцепочечного пула аптамеров, который очищают с помощью сорбции на 10 мг силикагеля в реакционной смеси, содержащей 10 рМ целевого продукта, 2 М GTC, 50% EtOH.

В результате осуществления изложенного выше способа получают терапевтический агент для предотвращения заболевания и лечения клещевого энцефалита в виде аптамеров - низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты - структура которой приведена в перечне последовательностей: SEQ ID NO: 1-48.

Молекулярную мишень для воздействия аптамера или белковый компонент, на который направлен аптамер выбирают на основе анализа пространственной структуры белка Е с помощью модели 1URZ [Bressanelli S., Rey, F.A.] [8] из базы данных пространственных структур белков.

Возможность осуществления способа получения аптамеров к вирусу клещевого энцефалита иллюстрирует приведенный ниже пример его получения в лабораторных условиях.

Пример конкретного осуществления.

Фрагмент гена белка Е соответствующий 50-250 аминокислотным остаткам амплифицируют с олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими указанный участок, с включенными в олигонуклеотиды адаптерами для рестриктаз Ndel и Xhol (TBE-F 5'-GACTCCATCCATATGGAGAATCCTGCC-3' и TBE-R 5'-TACACGTCCTCGAGCACGGCGTG-3'). Реакционная смесь содержит 1×ПЦР буфер состава 65 mM TrisHCl, 15 тМ (NH4)2SO4, 2 тМ MgSO4, 0.2 тМ каждого dNTP, 5U Taq ДНК-полимеразы в 50 мкл реакционной смеси и 100 нг к ДНК вируса клещевого энцефалита. После амплификации 5 мкл смеси анализируют в 1% агарозном геле в 1 × трис-ацетатном буфере (20 mM трис-ацетат рН~8.5, 0.1 mM EDTA). Оставшуюся реакционную смесь переосаждают тремя объемами этанола, отмывают 80% этанолом и подвергают рестрикции с рестриктазами Ndel и Xhol в буфере, рекомендованном фирмой-производителем ("NEB", UK). Вектор pET-22b(+) Vector ("Novagen", Germany) прелинеаризуют посредством вышеуказанных рестриктаз.

После рестрикции вектор и вставку очищают переосаждением этанолом и лигируют в соотношении вектор:вставка 1:5. Лигазную смесь для трансформации recA- штамма XL1-Blue используют без дополнительной очистки.

Наличие вставки и уточнение рамки считывания осуществляют прямым секвенированием плазмид с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров T7-F и T7-R ("NEB", UK) на приборе ABI3730×1 (AppliedBiosystems, USA) и BigDye V.3 chemistry, согласно протоколу фирмы производителя. Отвечающие требованиям конструкты субклонируют в экспрессионный штамм B834(DE3)pLysS. Экспрессию рекомбинантного белка индуцируют добавлением в ростовую среду IPTG в концентрации 0.1 mM.

Анализ экспрессии рекомбинантного белка Е вируса клещевого энцефалита осуществляют одномерным разделением в полиакриламидном геле с окраской Кумасси G-250. Анализ целевого белка осуществляют с помощью пептидного фингерпринта, для чего из полосы белка в геле выкалывают фрагмент 1-2 мм2, отмывают от красителя, дегидратируют ацетонитрилом и подвергают гидролизу трипсином в геле по стандартной методике. Анализ масс пептидов осуществляют на масс-спектрометре UltraFlex и MaXis (MALDI, Esi-Q-TOF соответственно, Bruker Daltonics, USA).

После трансформации экспрессирующими конструктами клетки подращивают на среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина до O.D.-0.5, после чего индуцируют 2 часа клетки IPTG в конечной концентрации 0.1 mM. Индуцированную культуру собирают центрифугированием 3500 об/мин в течение 30 минут, далее разрушают клетки ультразвуком (3 импульса мощностью 750 Ватт, 30 секунд). Тельца включения трижды отмывают буфером 1×PBS (Phosphate Buffered Saline, 20 mM phosphate, 150 mM NaCl, pH~7.5), содержащим 0.1% Triton X-100 для отмывки от мембранных белков. Тельца включения растворяют в буфере 8 М мочевина, 1×PBS содержащим 0.1% Triton X-100 и 25 мМ имидазола. Полученный лизат наносят на колонку с 5 мл Ni-NTA Resin (Invitrogen, USA), отмывают несвязавшиеся белки пятью объемами колонки и элюируют буфером: 8 М мочевина, 1×PBS содержащим 0.1% Triton X-100 и 250 мМ имидазола. Чистоту рекомбинантного белка во фракциях анализируют электрофорезом в ПААГ с окраской Кумасси G-250.

Первоначальный пул синтетических ДНК-олигонуклеотидов, пригодных для идентификации аптамеров получают путем прямого фосфорамидитного синтеза. Рандомизированный фрагмент длиной 40 нуклеотидных остатков фланкируют последовательностями 5'-/FAM/-CTCCTCTGACTGTAACCACG-(N40)-GGCTTCTGGCTACCTATGC-3'. На 5' конце исходного пула помещают флуорофор FAM (карбоксифлюоресцеин) для облегченной детекции продуктов амплификации библиотеки с помощью флуоресцентного сканера. Для детекции гетеродуплекса состава белок-аптамер анализируют пул фрагментов одноцепочечной ДНК с помощью методики SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) с 15 раундами селекции.

Рекомбинантный белок разводят бикарбонатным буфером (NaHCO3, рН~8) с добавлением 1 mM DTT до концентрации 100 мкг/мл. Наносят в лунки планшета Nunk Immuno™ LockWell™ Module/Strip Plates предварительно 3 раза промыв лунки 100 мкл 1×PBST (1×PBS содержащим 0.1% Tween-20). Суммарно в каждую лунку вносят 10 мкг белка. Пассивную иммобилизацию осуществляют 18 часов при 40°С с легким покачиванием. Затем 5 раз промывают лунки от несвязавшегося белка 1×PBST. Планшеты с иммобилизованным белком хранят при 40°С во влажной камере не более 15 суток. Перед каждой реакцией сорбции аптамера лунку с иммобилизованным белком промывают 3 раза 1×PBST.

На каждом этапе сорбции проводят денатурацию 25 рМ одноцепочечного олигонуклеотида при 96°С в течение 5 минут в 10 мМ TrisHCl pH~8, после чего сразу помещают в ледяную баню на 10 минут. Далее денатурированный пул аптамеров наносят в лунку с иммобилизованным заранее фрагментом белка Е и инкубируют 30 минут. За это время часть олигонуклеотидов, подходящая стерически к белку, связывается с лигандом, в то время как большинство оставалось несвязанным с иммобилизованным белком. По прошествии 30 минут лунку с иммобилизованным белком промывают 5 раз от несвязавшихся олигонуклеотидов. Связанные с белком и отмытые от несвязавшихся олигонунуклеотидов аптамеры снимают с поверхности буфером с низкой ионной силой, но высоким pH.

Пул аптамеров после каждого этапа сорбции амплифицируют по стандартной процедуре: на амплификаторе AppliedBiosystems Siquence Detection System 8000 с использованием SybrGreenI (Invitrogen, USA) и олигонуклеотидных праймеров 5'-/FAM/-CTCCTCTGACTGTAACCACG-3' и 5'-GGCTTCTGG CTACCTATGC-3' в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1×ПЦР буфер состава 65 mM TrisHCl, 15 тМ (NH4)2SO4, 2 тМ MgSO4, 0.2 mM каждого dNTP, 5U Taq ДНК-полимеразы и 5 мкл элюата пула аптамеров. Время выхода Ct на плато определяют визуально в режиме реального времени, после чего останавливают амплификацию. Для каждого этапа сорбции помимо регистрации продуктов амплификации в реальном времени проводят раститровку ДНК-матрицы. Полученные ампликоны двуцепочечной библиотеки аптамеров вырезают из геля и элюируют для дальнейшей наработки уже одноцепочечной библиотеки аптамеров для следующего этапа сорбции (селекции). Для этого проводят реакцию ассиметричной полимеразной цепной реакции (ПЦР), суть которой заключается в использовании в реакции разного соотношения олигонуклеотидных праймеров. Оптимальное соотношение праймеров для большего выхода одноцепочечного продукта составляет 50:1 для правого и левого фланкирующего праймера соответственно.

Анализ ампликонов проводят с помощью сканера TyphoonTrio (Amersham, USA). Очистку одноцепочечного пула аптамеров осуществляют по разработанной в лаборатории методике. Реакционную смесь содержащую 10 рМ продукта инкубируют в смеси 2 М GTC:50% EtOH с 10 мг силикагеля (Sigma.USA). При таком воздействии двуцепочечная ДНК остается в растворе, в то время как одноцепочечная ДНК сорбируется на силикагель. Отмывают дважды 80% EtOH и элюируют в 10 mM TrisHCl pH~7.5. Концентрацию полученного и очищенного одноцепочечного препарата библиотеки аптамеров определяют с помощью NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, USA).

Анализ ингибирующей активности проводят, определяя индекс нейтрализации в культуре клеток СПЭВ (эпителия почки эмбриона свиньи). Вирус клещевого энцифалита (КЭ) (изолят 92М, Сибирского субтипа, титр в культуре клеток СПЭВ 4,2х108 PFU/ml) смешивают с пулом аптамеров, титруют и заражают монослой культуры клеток СПЭВ. В контроле используют вирус КЭ без аптамеров. При обработке библиотекой аптамеров в концентрации 150 pmol/ml в течение 15 мин происходит снижение инфекционности вируса клещевого энцефалита в среднем в 17,5 раз.

Для выяснения структуры аптамеров, полученный пул аптамеров клонируют в вектор pGEM-T Easy (Promega, USA) и определяют первичную нуклеотидную структуру с помощью анализа вставок в 192 индивидуальных клонах. Первичная структура аптамеров представлена в перечне последовательностей.

Предлагаемый способ получения аптамеров к вирусу клещевого энцефалита, позволяет получить целевой продукт, который может быть использован в диагностических или терапевтических целях в качестве высокочувствительного и специфичного препарата нуклеотидной природы. По сравнению с известными способами получения аптамеров для различных инфекционных заболеваний, заявляемый способ впервые позволяет получать высокоспецифичные аптамеры, эффективно связывающие и ингибирующие вирус клещевого энцефалита. Способ позволяет значительно повысить доступность воздействия полученного препарата на вирус и надежно предотвращать заболевание при инфицировании человека вирусом клещевого энцефалита на ранних стадиях. Способ является простым, надежным и эффективным.

Изобретение позволяет получать пул ДНК - аптамеров, которые специфично и с высокой афинностью связываются с поверхностным белком Е вируса клещевого энцефалита и ингибируют способность вируса связываться с поверхностью и проникать внутрь клеток.

Источники информации:

1. Tuerk С., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science., 1990. - Vol. - 249. - No.4968. P. - 505-510.

2. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands // Nature., 1990. - Vol.346(6287). - P.818-22.

3. Патент US 8008269 Int. Cl. A01N 43/04, C12Q 1/68, C12P 19/34, C07H 21/02. Antiviral oligonucleotides / Andrew Vaillant et. al.; Replicor Ink, Montreal, CA(US). - Опубл. August 30, 2011

4. Feng H., Beck J., Nassal M., Hu К.Н. A SELEX-screened aptamer of human hepatitis В virus RNA encapsidation signal suppresses viral replication // PLoS One., 2011. - Vol.6(11): e27862

5. Gopinath S.C., Kawasaki K., Kumar P.K. Selection of RNA-aptamer against human influenza В virus // Nucleic Acids Symp Ser (Oxf)., 2005. - Vol.(49). - P.85-86.

6. Патент 8,008,272 US, Int. Cl. Nuclease-resistant RNA aptamer inhibiting replication of hepatitis С virus replicon / Lee, et al. - Опубл. August 30, 2011.

7. Девятков М.Ю., Лебедева Т.М., Комков Б.Д., Гусманова А.Г., Горбань Л.Я.. К вопросу профилактики клещевого энцефалита // http://www.rusmed_serv.com/epidinf/ke_st.htm

8. Bressanelli, S., Rey, F.A., Structure of a Flavivirus Envelope Glycoprotein in its Low-Ph-Induced Membrane Fusion Conformation // Embo J., 2004. - 23: 728.