СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГНОЙНЫХ И СЕРОЗНЫХ МЕНИНГИТОВ У ДЕТЕЙ

Изобретение относится к медицине и, в частности, к специальности педиатрия, разделу детских инфекционных болезней, и может быть использовано для дифференциальной диагностики гнойных и серозных менингитов у детей.

В настоящее время изучают многие аспекты диагностики и клинических проявлений нейроинфекций у детей, вместе с тем, остаются во многом нерешенными проблемы ранней дифференциальной диагностики гнойных и серозных менингитов.

Общепринятым в клинической практике методом дифференциального диагноза бактериального и вирусного менингита является оценка результатов гемограммы и ликворограммы в сопоставлении с клиническими данными. В периферической крови определяют содержание лейкоцитов, лейкоцитарную формулу и СОЭ, в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) - плеоцитоз, цитограмму, общий белок, осадочные пробы, глюкозу, хлориды. По этим показателям, в совокупности с данными клинического обследования, дифференцируют гнойный или серозный менингит [Лобзин Ю.В., Пилипенко В.В., Громыко Ю.Н. // Менингиты и энцефалиты. - СПб, Фолиант, 2003, 128 с.].

Биохимические и микроскопические исследования ЦСЖ, определение уровня давления позволяют во многих случаях поставить правильный диагноз. Высокий плеоцитоз за счет нейтрофилов с большим содержанием белка и низким уровнем глюкозы, высоким уровнем С-реактивного протеина (более 0,4 мг/л) свидетельствует о гнойном менингите. Значительный плеоцитоз за счет мононуклеаров, небольшое повышение уровня белка при нормальном или сниженном уровне глюкозы, соответствуют серозным менингитам. Вначале серозных менингитов в ЦСЖ могут преобладать полинуклеары, а мононуклеары появляются в течение ближайших 3 дней [Делягин В.М. Дифференциальная диагностика менингитов // Педиатрия: Приложение к журналу Consilium Medicum. - 2011. - №1. - С.71-74].

Недостатками данных способов дифференциальной диагностики менингитов являются: субъективность клинического осмотра. В начале развития острого бактериального менингита (или в случае антибактериальной терапии на догоспитальном этапе) у части больных не наблюдается нейтрофильного плеоцитоза ликвора (стадия серозного воспаления). В то же время в начале вирусного менингита у ряда больных может выявляться лейкоцитоз с нейтрофиллезом в гемограмме и смешанный (или даже нейтрофильный) нлеопитоз в ликворе.

Уровень общего белка также недостаточно информативен, и не позволяет провести дифференциальную диагностику гнойного и серозного менингита. Частота ошибок при сопоставлении клинических данных и результатов исследования ЦСЖ достигает 8-10% [Венгеров Ю.Я. Менингиты: Матер. I Российской науч.-прак. конфер. "Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов". - М., 2004, - С.37].

Известен способ ранней дифференциальной диагностики гнойных и серозных менингитов, заключающийся в определении белкового и пептидного профиля в ЦСЖ [Алексеева Л.Л., Сорокина М.Н. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2001. - №7. - С.15-19]. При серозных менингитах отмечены незначительное увеличение содержания высокомолекулярных фракций и преобладание низкомолекулярных компонентов над высокомолекулярными. При исследовании белкового состава ЦСЖ в острый период гнойного менингита выявлены значительные отклонения протеинограммы (гаптоглобины типа 2-1 и 2-2,-липопротеин, 2-макроглобулин) от условной нормы и протеинограмм ЦСЖ при серозном менингите. Недостатками способа являются: необходимость дополнительного многокомпонентного исследования и оценка уровня целого комплекса белков, возможность превалирования низкомолекулярной фракции над высокомолекулярной как при гнойном, так и при серозном менингитах.

Предложен способ дифференциального диагноза бактериальных и вирусных менингитов путем оценки состояния нитроксидергических процессов [Шабалин М.А. Состояние нитроксидергических процессов и некоторые аспекты их коррекции при менингитах у детей: Автореф. дисс… к.м.н. Челябинск, 2002]. Для этого определяют содержание нитритов и нитратов в ЦСЖ фотометрическим методом. При значениях NO3=2,6±0,18 мкмоль/л, NO 2=0,5±0,05 мкмоль/л, NOx=3,1±0,23 мкмоль/л (повышение суммарного значения в 4 раза) судят о гнойном менингите, а при показателях 4,6±0,15 мкмоль/л; 0,8±0,02 мкмоль/л и 5,4±0,17 мкмоль/л соответственно (повышение суммарного значения в 2 раза) - о серозном менингите.

Недостатком способа является зависимость изучаемых показателей от возраста пациентов (чем младше ребенок, тем выше показатели) и тяжести менингита (при тяжелом серозном и среднетяжелом гнойном менингите показатели близки по значению).

В качестве аналога может быть использован способ дифференциальной диагностики бактериальных и вирусных менингитов, описанный в SU 1534396 А1, 07.01.1990. Данное изобретение относится к медицинской микробиологии и основано на определении лизоцима в ЦСЖ методом диффузии в агаре с тест-культурой М.Lysodeikticus. Использование предлагаемого метода позволяет повысить чувствительность диагностики менингитов на 30%.

Предложен способ дифференциальной диагностики менингитов [Патент UA 17531 А 06.05.97], основанный на определении уровня олигопептидов средней молекулярной массы в спинномозговой жидкости спектрофотометрическим методом (при длине волны 254 и 280 нм). Разработан диагностический показатель (ДП), позволяющий провести дифференциальный диагноз гнойного и серзного менингитов, при ДП>2,0 диагностируется гнойный менингит, при ДП<2,0 - серозный. Вместе с тем, предложенный способ не уточняет диапазон значений при гнойном и серозном менингитах и не дает возможности провести дифференциальную диагностику при значении ДП=2,0.

Известен способ дифференциальной диагностики бактериальных и гнойных менингитов (RU 2323444 от 27.04.2008), основанный на определении в ЦСЖ содержание лактоферрина методом твердофазного иммуноферментного анализа. Содержание лактоферрина менее 0,1 (0,099±0,027) мг/л свидетельствует о серозном менингите. При значениях лактоферрина более 0,5 (0,91±0,28) мг/л диагностируют гнойный менингит. К недостаткам данного способа следует отнести большой объем ЦСЖ (1-2 мл), необходимый для исследования, что не позволяет использовать данный метод в педиатрической практике.

Предложен способ дифференциальной диагностики менингококкового и серозного менингита энтеровирусной этиологии на основании изучения свободнорадикального статуса ликвора у детей [Патент на изобретение RU 2339039 С1, зарегистрирован 20 ноября 2008 г.] с помощью метода хемилюминесценции. Метод дифференциальной диагностики состоит в определении параметров свободнорадикального окисления S₁, величина которого коррелирует с интенсивностью свободнорадикальных процессов и S₃ величина которого пропорциональна содержанию гидроксильных радикалов. При значениях S₁ в пределах 1,5±0,12 усл.ед. и S₃ - 1,98±0,19 усл.ед. диагностируют гнойный менингит, а при значениях S₁ в пределах 1,1±0,07 усл.ед. и S;, - 1,1±0,07 усл.ед. - серозный менингит.

Известен метод ранней дифференциальной диагностики менингитов с использованием лиофилизированного лизата амебоцитов Limulus (Method for differential diagnosis of meningitis with a limulus lysate test - US 4067776 A 10.01.1978 г.). Данный тест позволяет проводить раннюю диагностику гнойных менингитов, вызванных грамотрицательными возбудителями. Отрицательные результаты тестов с лизатом Limulus, отмеченные у пациентов с грамположительными бактериальными менингитами, туберкулезным и асептическим менингитом, и у пациентов без менингита, не дают достоверных критериев дифференциальной диагностики между гнойными и серозными менингитами.

Предложен метод дифференциальной диагностики бактериальных и вирусных менингитов (Distinction between bacterial meningitis and viral meningitis) [Патент US 20090221021 A1 от 03.09.2009), основанный на определении прокальцитонина в сыворотке крови и ЦСЖ.

Это изобретение относится, в частности, к способу обнаружения преимущественно гнойного (бактериального) менингита, на основании определения биологических параметров, таких как концентрации прокальцитонина в крови и концентрации белков, присутствующих в ЦСЖ. Концентрация прокальцитонина выше или равная 0,5 нг/мл (РСТ0,5 нг/мл) и концентрация белка в спинномозговой жидкости, выше или равная 0,5 г/л (CSF0,5 г/л), позволяет идентифицировать гнойный менингит. Изобретатели показали, что комбинация этих двух биологических параметров концентрации прокальцитонина (в крови человека и концентрацию белка в ЦСЖ) позволяет диагностировать бактериальный менингит у больного. Однако этот тест не может быть использован у пациентов, получивших лечение антибиотиками в течение 48 часов до взятия пробы крови и ЦСЖ.

Острый инфекционный процесс, наряду со специфическими нарушениями гомеостаза, обусловленными свойствами конкретных возбудителей, характеризуется и рядом неспецифических реакций, обусловленных ответом метаболических систем макроорганизма на инфекционный стресс.

Нейтрофильные лейкоциты являются составными частями иммунофагоцитарной системы, и традиционно их рассматривают в неразрывной связи с воспалительной реакцией [Л.М. Сомова, Н.Г. Плехова, Е.И. Дробот // Успехи современной биологии. - 2011. Т.131. - №1. - С.37-49].

Микробицидные системы нейтрофилов подразделяют на: 1) систему НАДФ-производных оксидантов; 2) миелопероксидазно-перекись водорода-хлоридную систему; 3) систему, вклрочающую реактивные посредники азота, производные нитроксидсинтазы и 4) систему белков нейтрофильных гранул - различные.

Миелопероксидаза - фактор неспецифической защиты организма, относят к гем-содержашим белкам, находятся в азурофильных гранулах нейтрофилов, которые включают основной арсенал бактерицидных ферментов: миелопероксидазу, сериновые протеазы, катионные белки и лактоферрин [V.Witko-Sarsat, Р.Rieu, В.Descamps-Latscha et al. Neutrophils: molecules, functions and pathophy-siological aspects // Labor. Investig. - 2000. - Vol.80. - P.617-65].

Миелопероксидаза окисляет кофакторы, переводя их в активную форму, при этом генерируются эффективные микробицидные средства. Нейтрофилы с помощью МПО способны продуцировать гипохлорную кислоту, которая вместе с Н₂О₂ выполняет аптимикробную функцию, а также роль медиатора воспаления, увеличивая проницаемость сосудистого эндотелия. Механизм микробицидного действия миелонероксидазы также связан с декарбоксилированием и дезаминированием аминокислот бактерий, быстрым и обширным подавлением синтеза бактериальной ДНК.

Цитохромоксидаза является важнейшим звеном дыхательной цепи и основным компонентам нормальной аэробной окислительной системы тканевых клеток. Активность цитохромоксидазы служит достоверным показателем уровня окислительного метаболизма.

К лизосомальным ферментам, обеспечивающим протеолитическую и переваривающую функции макрофагов, относят кислую фосфатазу [Плехова И.Г., Охотина С.В. Нитроксидобразующая активность нейтрофилов при псевдотуберкулезной и листериозной инфекциях // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2007. - №4. - С.47-50].

Сведения об активности миелонероксидазы, нитохромоксидазы и кислой фосфатазы на локальном уровне (в ЦСЖ) у больных нейроинфекциями представлены единичными сообщениями.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) может быть использован способ дифференциальной диагностики гнойного и серозного менингита путем определения активности щелочной фосфатазы в ЦСЖ, в том числе у детей, описанный в SU 1406482, 30.06.1988 г.

В данном изобретении с целью повышения точности диагностики рекомендуется исследование активности щелочной фосфатазы в ЦСЖ. Предложенный способ повышает точность дифференциальной диагностики гнойного и серозного менингита по сравнению с известными ранее на 27%.

Для диагностики нейроинфекций предлагается исследование уровня ферментов ЦСЖ. В качестве прототипа может быть использован метод определение фосфатаз - щелочной и кислой [Марданлы С.Г., Первушин Ю.В., Иванова В.Н. Спинномозговая жидкость: лабораторные методы исследования и их клинико-диагностическое значение: Учебное пособие для специалистов по клинической лабораторной диагностике. - Электрогорск, 2011 г.].

При гнойных менингитах отмечается повышение уровня фосфатаз в ЦСЖ. Вместе с тем, активность данных ферментов повышается и при других заболеваниях нервной системы, так, к примеру, активность фосфатаз повышается при менингитах и полиомиелите. Уровень щелочной фосфатазы значительно повышается при нейтрофильном плеоцитозе, однако повышение активности щелочной фосфатазы в ЦСЖ также характерно для инсульта. Увеличение активности кислой фосфатазы в ЦСЖ наблюдается при церебральной атрофии, при хорее Гентингтона, что не позволяет провести раннюю диагностику серозных и гнойных менингитов.

Наиболее близким является способ дифференциальной диагностики серозного и гнойного менингитов, основанный на определении лактоферрина в ЦСЖ методом твердофазного иммуноферментного анализа [Ботерашвили Н.М. и др. Миелопероксидаза и лактоферрин в сыворотке крови и ликворе детей, больных менингитом // Медицинская иммунология. 2002. - №4-5. - С.565-572].

При этом показано, что концентрация миелопероксидазы в сыворотке крови у всех исследованных группах больных повышена по сравнению со здоровыми донорами, причем в случае гнойного менингита уровень миелопероксидазы в сыворотке крови достоверно выше, чем у больных серозным менингитом. Концентрация миелопероксидазы в ЦСЖ у больных гнойным менингитом составляет 703,0±240,0 нг/мл соответственно, в то время как для серозного менингита эти значения составляют 16,0±5,0 и 138,0±60,0 нг/мл. Данный способ не уточняет уровень минимальной концентрации миелопероксидазы в сыворотке крови и предусматривает одновременное определение концентраций нейтрофильных гранулярных белков в сыворотке крови и ликворе больных для повышения эффективности метода.

Предложенный нами способ является более экономичным в использовании биологического материала (на анализ требуется 0,5 мл ЦСЖ), что имеет важное значение в педиатрической практике. Способ является достаточно оперативным, дающим возможность получения результата в день пункции, что позволяет своевременно установить диагноз гнойного или серозного менингита и назначить адекватную терапию больным с нейроинфекциями.

Задача изобретения - предложить способ дифференциальной диагностики гнойных и серозных менингитов у детей.

Технический результат - возможность проведения сравнительного анализа микробицидной активности нейтрофильных лейкоцитов в ЦСЖ детей, больных гнойными и серозными менингитами.

Технический результат достигается изучением ферментативной активности нейтрофилов: миелопероксидазы, цитохромоксидазы и кислой фосфатазы в ЦСЖ детей, больных гнойными и серозными менингитами, с использованием методик определения функциональной активности лейкоцитов, разработанных в НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН [Сомова Л.М., Плехова Н.Г., 2005] на спектрофотометре «Multiscan spectrum» производства фирмы «Thermo Electron» Оу (Финляндия).

Для приготовления лейкоцитарной взвеси берут ликвор с добавлением гепарина (10 ед/мл) и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 40 минут. Затем надосадочную жидкость собирают и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 минут, после чего к осадку добавляют холодную среду 199 и осадок ресуспендируют дважды в том же режиме по 5 минут. Клеточный осадок вновь ресуспендируют в 1 мл среды 199. Концентрацию клеток доводят до 2 млн/мл и клеточную суспензию разносят по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета. Показатели активности МПО, ЦХО и КФС учитывают при длине волны 492, 492 и 405 соответственно с использованием спектрофотометра Multiscan spectrum.

Преимущества предлагаемого способа:

- достаточная чувствительность для дифференциальной диагностики гнойного и серозного менингита;

- возможности определения активности миелопероксидазы, цитохромоксидазы и кислой фосфатазы в ранние сроки заболевания;

- уменьшение количества забираемого биологического материала (для анализа требуется 0,5 мл ЦСЖ);

- возможность получения результата в день взятия пункции, что особенно важно для ранней дифференциальной диагностики гнойного и серозного менингитов.

Обследовано 85 детей с нейроинфекциями. Из них I группу составили 35 детей с гнойными менингитами, II группу - 50 детей с серозным менингитом. Этиологическую расшифровку диагноза провели с использованием бактериологических, вирусологических методов исследования, ПЦР-Диагностики.

В качестве контроля (III группа) при исследовании ликвора были использованы данные, полученные от больных с нейротоксикозом, которым люмбальную пункцию проводили по клиническим показаниям, но получили нормальное количество клеток в ЦСЖ (n=10).

Средний возраст обследованных детей составил: в I группе - 2,5±0,5 года, во II - 3,2±0,16 года и в III - 2,9±0,5 года.

Показатели микробицидной активности ферментов в ликворе больных гнойными и серозными менингитами представлены в табл.1.

Как следует из данных, представленных в табл.1, выявлено, что в группе больных гнойными менингитами отмечают повышение активности всех показателей по сравнению с показателями, выявленными у здоровых детей.

При этом показатели миелопероксидазы и цитохромоксидазы превышают не только показатели условной нормы (Р<0,002 и Р<0,001, соответственно), но и показатели, выявленные в группе больных с серозным менингитом. Уровень активности кислой фосфатазы имеет тенденцию к повышению и достоверно отличается от показателей установленной нормы (Р<0,001).

Уровень миелонероксидазы в ликворе больных гнойным менингитом в 3,2 раза превышает аналогичный показатель, полученный у больных серозным менингитом.

Уровень активности цитохромоксидазы в ЦСЖ больных серозным менингитом был в 2,9 раза ниже показателя активности цитохромоксидазы у больных гнойным менингитом (Р<0,001). Уровень активности кислой фосфатазы у больных с серозным менингитом регистрировался в 1,4 раза ниже, чем в группе контроля (Р<0,001).

Таким образом, в ЦСЖ выявлялось повышение активности ферментов при гнойных менингитах в сравнении с показателями группы контроля и группы больных серозными менингитами.

При значениях миелопероксидазы в пределах 0,18-0,2 усл.ед. диагностируют гнойный менингит, а при значениях 0,059-0,061 усл.ед. - серозный менингит. Показатель активности цитохромоксидазы в пределах 0,49-0,57 усл.ед. свидетельствует о гнойном менингите, в пределах 0,186-0,174 усл.ед. - о серозном менингите. Показатель активности кислой фосфатазы в ЦСЖ в пределах 0,14-0,18 усл.ед., расценивают как гнойный менингит, а в пределах 0,069-0,071 усл.ед. - как серозный менингит.

В качестве примера использования предлагаемого метода в клинико-лабораторном обследовании больных нейроинфекциями приводим выписки из историй болезни.

Пример 1. История болезни №1394. Больная С. Катя, 1,5 мес. поступила в клинику 13.04.2012 г. в первые сутки от начала заболевания. Заболела остро, когда температура тела повысилась до 38,7°С, появилось беспокойство. Ребенок был доставлен в стационар врачом скорой помощи.

При поступлении в стационар состояние расценено как среднетяжелое за счет интоксикационного синдрома. Ребенок в сознании, отмечалось выраженное беспокойство. При беспокойстве отмечался тремор подбородка, кистей рук. Отмечается выбухание и пульсация большого родничка. Кожные покровы бледно-розовые, с мраморным оттенком. В ротоглотке умеренная гиперемия, налетов нет. Тоны сердца громкие, ритмичные, ЧСС 142 в 1 мин. Дыхание пуэрильное, хрипов нет. ЧД - 32 в 1 мин. Живот мягкий, безболезненный.

В анализе ЦСЖ цитоз составил 271 кл/мл (нейтрофилов - 77, лимфоцитов - 194), белок - 0,9 г/л, что следовало бы трактовать как серозный менингит.

При исследовании ферментов ЦСЖ получены следующие результаты: миелопероксидаза - 0,19 усл.ед. (норма - 0,1 19-0,121 усл.ед.), цитохромоксидаза - 0,53 усл.ед. (норма - 0,049-0,051 усл.ед.), кислая фосфатаза - 0,17 усл.ед. (норма - 0,098-0,102 усл.ед.), что позволило диагностировать гнойный менингит и назначить соответствующую гнойному менингиту терапию. Клинический диагноз:

Менингококковая инфекция, гнойный менингит (серозный вариант), средней степени тяжести (выделение Neisseria meningilides из ЦСЖ).

Пример 2. История болезни №2716. Больная В.Таня, 1 год 6 мес.поступила в клинику 25.08.2011 г. на 3 сутки от начала заболевания. Заболевание началось с подъема температуры до 38-38,6°С, рвоты 2-3 раза в сутки, головной боли.

При поступлении в стационар состояние было расценено как среднетяжелое за счет умеренного интоксикационного и менингеального синдромов. Ребенок был вялым. Кожные покровы бледные, румянец на щеках, слизистые ротоглотки бледно-розовые, чистые. Тоны сердца громкие, ритмичные, ЧСС - 124 в 1 мин. Дыхание везикулярное, хрипов нет. ЧД - 26 в 1 мин. Живот мягкий, безболезненный при пальпации. Определялись менингеальные симптомы: ригидность затылочных мышц (1,0 см), симптом Кернига слева (130°), симптом Брудзинского верхний.

В ЦСЖ цитоз ставил 159 кл/мл (нейтрофилов - 140, лимфоцитов - 19), белок - 0,5 г/л, что можно расценить как гнойный менингит.

При исследовании ферментов ЦСЖ получены результаты: миелопероксидаза - 0,06 усл.ед. (норма - 0,1 19-0,121 усл.ед.), цитохромоксидаза - 0,17 усл.ед. (норма - 0,049-0,051 усл.ед.), кислая фосфатаза - 0,07 усл.ед. (норма - 0,098-0,102 усл.ед.), что позволило установить серозный менингит, который в дальнейшем был подтвержден результатами вирусологического исследования (изолирован вирус Коксаки B₄ из ЦСЖ). Клинический диагноз: Энтеровирусная инфекция, серозный вирусный менингит, средняя степень тяжести.

Определение активности ферментов в ЦСЖ позволило своевременно диагностировать серозный менингит и избежать необоснованного назначения антибактериальной терапии.