Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЖИВЫХ ПРЕПАРАТОВ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ РОДА COCCIDIOIDES ДЛЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к способам приготовления живых препаратов микроскопических грибов рода Coccidioides для световой микроскопии, может быть использовано для идентификации, установления специфики строения и развития клеток в различных физиологических состояниях.

В медицинской микологической практике при идентификации возбудителей микотической природы наиболее часто используют методы, направленные на изучение особенностей морфологии структур, обеспечивающих вегетативное размножение микромицетов. Данная концепция диагностики получила название морфологической или фенотипической, когда для определения единицы вида проводится определение морфологических характеристик изучаемого штамма и сравнительный анализ путем установления различий с родственными видами. Этот методологический подход реализуется в результате культивирования микроскопических грибов в условиях, способствующих получению культуры с характерной морфологией. В литературе описаны способы приготовления препаратов живых неокрашенных микроорганизмов для исследования методом световой микроскопии.

Для определения формы клеток и подвижности микроорганизмы исследуют в препаратах «раздавленная» или «висячая» капля. Препараты грибов для исследования, как правило, готовят из культур, выращенных на плотных агаровых питательных средах. Для этого на предметное стекло наносят каплю водопроводной воды или изотонического (0,15 М) раствора хлорида натрия. Бактериологической петлей суспендируют небольшое количество материала, взятого из колонии, подозрительной по культуральным признакам на колонию возбудителя заболевания. Покровное стекло устанавливают на ребро у края капли и медленно опускают, выдавливая воздух между предметным и покровным стеклами. Также используют способ приготовления микробной взвеси в пробирке, после чего капли взвеси наносят на предметные стекла. В случае приготовления препарата «висячая» капля, взвесь наносят на стекла с углублением (лункой) [«Руководство по медицинской микробиологии» в 3-х книгах под ред. А.С. Лабинской, Е.В. Волиной. - Москва: БИНОМ-2008 г. - кн.I с.160-161]. Общим недостатком таких препаратов является то, что они не позволяют оценить динамику развития культуры. Кроме того, для их приготовления во всех случаях необходима подготовка суспензии изучаемой культуры, сопровождающаяся механическим воздействием на культуру, что неизбежно приводит к разрушению характерной структуры гриба, являющейся неотъемлемой частью его морфологической идентификации.

Известен способ исследования живых неокрашенных микроорганизмов в микрокамерах с агаровыми питательными средами (агаровых камерах) [«Медицинская микробиология» под ред. В.И.Покровского, О.К.Поздеева. - Москва: ГЭОТАР Медицина. - 1998. - с.114]. Описан способ приготовления агаровых камер из агаровых или желатино-агаровых пластинок. Для этого чистые предметные стекла дважды (или большее число раз) погружают в расплавленную агаровую питательную среду соответствующего состава, которая находится в чашке Петри. С нижней стороны стекол агаровую питательную среду вытирают увлажненной тканью. Используя бинокулярную лупу, культуру вносят в выбранную на верхней стороне стекла область с помощью вытянутого из пастеровской пипетки стеклянного волокна или стеклянной палочки. Кончик волокна смачивают в водном растворе пептона, слегка прикасаются им к нужной колонии, переносят приставшие микроорганизмы в каплю водного раствора пептона на свежей поверхности агаровой питательной среды и распределяют каплю по поверхности. Обрезают агаровую среду вокруг выбранной области, кладут сверху покровное стекло и по его краям заливают воск. [«Методы общей бактериологии» в 3-х томах под ред. Ф. Герхардта и др. Москва: Мир. - 1983. - Т.1. - с.46-47]. К недостаткам данного метода следует отнести высокую вероятность загрязнения препарата посторонней микрофлорой, а также заражения персонала при работе с патогенными возбудителями, так как при формировании агаровой камеры, а именно при закрывании ее покровным стеклом, возможно выдавливание жидкой культуры за пределы покровного стекла. Кроме того, описанная методика позволяет приготовлять камеры, содержащие тонкий слой агаровой питательной среды, что ограничивает использование метода при работе с микромицетами, отличающимися замедленной скоростью роста.

В качестве прототипа выбран способ приготовления живых препаратов грибов по методу Н.М. Пидопличко. Для этого стерильное предметное стекло прокаливают над пламенем горелки, быстро наносят раскаленной петлей небольшую каплю расплавленной агаровой питательной среды и дают ей слегка остыть. Тут же у горелки иглой наносят предварительно выращенную на плотной питательной среде культуру, стараясь, чтобы она попала в центр капли. Покровное стекло, также как и предметное, прокаливают над горелкой, чуть отводят от пламени, чтобы оно слегка остыло, и накладывают на каплю агаровой питательной среды с засеянной культурой, находящейся на предметном стекле. Для формирования агаровой камеры покровное стекло осторожно придавливают до тех пор, пока агаровая питательная среда не распределится равномерно сужающимся тонким слоем, и располагают его под углом 10-15° к предметному стеклу. Во избежание высыхания и загрязнения препарата покровное стекло, за исключением приподнятой стороны, заливают парафином. Подготовленный препарат кладут в чашку Петри так, чтобы, поверхность предметного стекла, на которой находится препарат, была направлена вверх, и инкубируют во влажной камере. [«Методы экспериментальной микологии» под ред. В.И. Билай. - Киев: Наукова думка. - 1982. - с.81]. Существенным недостатком прототипа является высев культуры в недозируемом количестве, что не позволяет получить рост гриба в виде изолированных колоний. Кроме того, запас питательных веществ в тонком слое агаровой камеры ограничен, что делает невозможным длительное культивирование медленно растущих грибов, например, в течение 3-х недель в случае изучения мицелиальной формы грибов рода Coccidioides и некоторых других патогенных микромицетов. К недостаткам прототипа относится также и то, что метод предполагает субъективную оценку температуры агаровой питательной среды, в которую производится посев культуры. В том случае, если среда охлаждена недостаточно, исследуемая культура может погибнуть, или, напротив, при излишнем охлаждении среда преждевременно застывает на предметном стекле, что препятствует приготовлению препарата.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа приготовления живых препаратов микроскопических грибов рода Coccidioides для исследования методом световой микроскопии, позволяющего упростить методику приготовления препаратов и расширить область их использования.

Техническим результатом является упрощение способа, получение прогнозируемого результата, а также возможность исследования в динамике микроморфологии грибных культур.

Поставленный технический результат достигается в способе приготовления живых препаратов микроскопических грибов рода Coccidioides для световой микроскопии, заключающемся в предварительном выращивании культуры на плотной питательной среде, высеве культуры из взвеси артроконидий 10⁴ КОЕ/мл, в количестве 0,5 мл в 4,5 мл расплавленной и охлажденной до 45°C агаровой питательной среды, которую перемешивают и выливают в чашку Петри для образования засеянной пластинки агаровой питательной среды, из которой вырезают блок для формирования агаровой камеры, и инкубируют полученный препарат во влажной камере при 28°C в течение 3-х недель.

Техническое решение позволяет прогнозировать результат за счет высева культуры с известной концентрацией КОЕ (КОЕ - колониеобразующая единица) и в результате получить ее рост в виде изолированных колоний. Исключается субъективная оценка температуры агаровой питательной среды, в которую производится высев культуры, так как заданная температура среды обеспечивается прибором, это упрощает способ и гарантирует получение пригодных препаратов. Агаровая камера в препарате имеет известный объем, содержит достаточное количество питательных веществ, что позволяет исключить этап заливки камеры парафином во избежание ее высыхания. Кроме того, становится возможным выращивать культуру в препарате на протяжении длительного времени и исследовать динамику развития медленно растущих грибов от стадии прорастания спор до стадии формирования органов вегетативного размножения. В зависимости от целей исследования доступно приготовление большого количества препаратов из одной пробы.

Пример 1 (оптимальный). Культуру микроскопического гриба, Coccidioides immitis C-5 выращивают на агаровой питательной среде Сабуро при 28°C в течение 3 недель. Затем культуру смывают 0,15 М раствором хлорида натрия, pH 6,8 и фильтруют через тканевой фильтр. Из фильтрата с помощью образца мутности ГИСК им. Тарасевича (ОСО) готовят стандартную взвесь, содержащую 10⁴ КОЕ/мл (КОЕ - колониеобразующая единица) для Coccidioides immitis C-5. Взвесь в количестве 0,5 мл засевают в пробирку с 4,5 мл расплавленной и охлажденной на водяной бане до 45°C агаровой питательной среды Сабуро, содержащей 2% агар-агара, перемешивают и выливают в стерильную чашку Петри. Площадь чашки Петри диаметром 10 см составляет 78,5 см². Толщина агаровой пластинки при нанесении 5 мл (см³) среды в чашке Петри - 0,064 мм. После застывания засеянную пластинку агаровой питательной среды разрезают на блоки размером 1×1 см, которые с соблюдением правил асептики помещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом для формирования агаровой камеры. Количество КОЕ в агаровом блоке площадью 1 см² составляет 64 единицы. Готовые препараты помещают в чашки Петри и инкубируют в термостате при температуре 28°C в течение 3-х недель.

Исследования препаратов проводят ежедневно с помощью световой микроскопии с сухим объективом при увеличении ×100, ×400, что позволяет получить данные о динамике развития культуры. Размеры клеток определяют с помощью окулярного винтового микрометра МОВ-1-15^x при линейном увеличении β_ср.=46,375.

Через 24 ч культивирования артроспоры приобретают округлую форму. Наблюдаются явно выраженные извитые ростовые трубочки. Спустя 2 сут в ростовых трубочках образуются септы (2-3), просматриваются ядра. Изредка отмечается образование вторичных ветвей, отходящих от первичных ростовых трубочек. Через 3 сут начинается образование септ во вторичных ветвях. В течение 4-6 сут формируются ветви мицелия следующих порядков (фиг.1). На 7-е сутки выращивания начинается дифференцировка клеток мицелия. Отчетливо выделяются клетки, переходящие в артроспоры. В их цитоплазме просматриваются уплотнения серо-голубого цвета, напоминающие клеточное ядро. Клетки, переходящие в артроспроры, перемежаются клетками-разделителями, имеющими несколько меньшие размеры. К 14-м суткам начинают формироваться артроспоры, типичные органы вегетативного размножения Coccidioides immitis (фиг.2). Артроконидии имеют прямоугольную форму. Для штамма Coccidioides immitis С-5 размеры артроконидии составляют 9,0±0,34×3,6±0,64 мкм. Через 3 недели культивирования в препарате наблюдаются нити мицелия в виде «цепочек», образованных зрелыми артроконидиями, перемежающимися пустыми клетками-разделителями (фиг.3).

Пример 2 (оптимальный). Культуру микроскопического гриба, Coccidioides posadasii 442 выращивают на агаровой питательной среде Сабуро при 28°C в течение 3 недель. Затем культуру смывают 0,15 М раствором хлорида натрия, pH 6,8 и фильтруют через тканевой фильтр. Из фильтрата с помощью образца мутности ГИСК им. Тарасевича готовят взвесь артроконидии 10⁴ КОЕ/мл. Взвесь в количестве 0,5 мл засевают в пробирку с 4,5 мл расплавленной и охлажденной на водяной бане до 45°C агаровой питательной среды Сабуро, содержащей 2% агар-агара, которую перемешивают и выливают в стерильную чашку Петри. Площадь чашки Петри диаметром 10 см составляет 78,5 см². Толщина агаровой пластинки при нанесении 5 мл (см³) среды в чашке Петри - 0,064 мм. После застывания засеянную пластинку агаровой питательной среды разрезают на блоки размером 1×1 см, которые с соблюдением правил асептики помещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом для формирования агаровой камеры. Количество КОЕ в агаровом блоке площадью 1 см² составляет 64 единицы. Готовые препараты помещают в чашки Петри и инкубируют в термостате при температуре 28°C в течение 3-х недель.

Исследования препаратов проводят ежедневно с помощью световой микроскопии с сухим объективом при увеличении ×100, ×400, что позволяет получить данные о динамике развития культуры. Размеры клеток определяют с помощью окулярного винтового микрометра МОВ-1-15^x при линейном увеличении β_ср.=46,375.

Через 24 ч культивирования артроспоры приобретают округлую форму. Наблюдаются явно выраженные извитые ростовые трубочки. Спустя 2 сут в ростовых трубочках образуются септы (2-3), просматриваются ядра. Изредка отмечается образование вторичных ветвей, отходящих от первичных ростовых трубочек. Через 3 сут начинается образование септ во вторичных ветвях. В течение 4-6 сут формируются ветви мицелия следующих порядков (фиг.4). На 7-е сутки выращивания начинается дифференцировка клеток мицелия. Отчетливо выделяются клетки, переходящие в артроспоры. В их цитоплазме просматриваются уплотнения серо-голубого цвета, напоминающие клеточное ядро. Клетки, переходящие в артроспроры, перемежаются клетками-разделителями, имеющими несколько меньшие размеры. К 14-м суткам начинают формироваться артроспоры, типичные органы вегетативного размножения Coccidioides posadasii (фиг.5). Артроконидии имеют прямоугольную форму. Для штамма Coccidioides posadasii 442 размеры артроконидии составляют 12,0±0,71×3,6±0,29 мкм. Через 3 недели культивирования в препарате наблюдаются нити мицелия в виде «цепочек», образованных зрелыми артроконидиями, перемежающимися пустыми клетками-разделителями (фиг.6).