СПОСОБ ДИНАМИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ РЕЦИПИЕНТА ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ТРУПНОЙ ПЕЧЕНИ

Изобретение относится к медицине, точнее, к органной трансплантации и может найти применение при пересадке посмертной печени.

Неуклонный рост числа пациентов с заболеваниями печени, в том числе приводящих к терминальной печеночной недостаточности, обуславливает повышение потребности в лечении методом трансплантации органа. Пересадка печени связана с возможностью посттрансплантационных осложнений, наиболее грозными из которых являются различной степени выраженности дисфункции и отторжение донорской печени, а также инфекции.

В настоящее время принято, что выживаемость трансплантата определяется в большей мере степенью иммунной реакции организма реципиента против чужеродной ткани. Поэтому для сохранения функции трансплантата применяют специальные препараты - иммунодепрессанты, которые постоянно совершенствуются в направлении повышения избирательности их действия от «неспецифического» к «специфическому».

Прогнозирование риска отторжения трансплантата, в том числе донорской печени, является нерешенной задачей. Поиск объективных предикторов возможности отторжения - актуальная проблема, решение которой может повысить эффективность посттрансплантационного лечения.

Известен способ прогнозирования риска посттрансплантационных осложнений по концентрации в крови реципиента Т-лимфоцитов. Авторы рекомендуют поддерживать концентрацию Т-лимфоцитов крови для предотвращения отторжения пересаженной печени в пределах 50/мкл и ниже [Muller Т. et al. Transplantation Proc. - 1999. - Vol.3B - P.12S-15S].

Высказывается связь выраженности иммунологических реакций с количеством циркулирующих лимфоцитов реципиента. Вызывает определенные сомнения рекомендация поддерживать уровень Т-лимфоцитов в периферической крови в пределах 50/мкл. В нашей практике успешным случаям трансплантации сопутствовали концентрации Т-лимфоцитов более 50/мкл и, наоборот, при уровне ниже этого значения были отмечены осложнения раннего посттрансплантационного периода. Более того, выполненная успешная ретрансплантация печени после неудавшейся первой сопровождалась постепенным подъемом концентрации Т-лимфоцитов и превысила 50/мкл.

Клинические наблюдения свидетельствуют об отсутствии жесткой зависимости количества Т-лимфоцитов в крови реципиента печени с характером течения раннего посттрансплантационного периода.

Имеющиеся литературные данные о том, что успех трансплантации трупной печени не определяется лишь степенью совместимости по лейкоцитарному комплексу антигенов человека (HLA) [Liver Transplantation. . P.80-90, P.1405-1413], привели к тому, что необходим поиск иных факторов, влияющих на функциональную состоятельность трансплантата печени.

Ранее мы провели мониторинг субпопуляционного состава фракции мононуклеаров крови у пациентов после трансплантации им трупной печени на протяжении 7 месяцев после операции [Медицинская иммунология. 2009. №4-5 (т.11). С.464] и отмечали колебания различных субпопуляций мононуклеаров и в разные сроки после оперативного вмешательства. На основании полученных данных прийти к единому выводу о диагностических преимуществах того или иного показателя не удалось.

Нами было выявлено благотворное влияние трансплантации аутологичного костного мозга на функциональную активность почки при гломерулонефрите [Рябов СИ., Ракитянская И.А., Шутко А.Н. В книге «Почки и система иммунитета». Л.: Наука. 1989. С.131]. На основании этих данных нами было высказано предположение о возможном участии клеток-предшественников костномозгового происхождения в поддержании жизнеспособности трансплантата печени [Гранов A.M., Шутко А.Н. Парадоксы злокачественного роста и тканевой несовместимости. Изд. «Гиппократ», 2002].

Позднее положительные результаты процедуры трансплантации клеток-предшественников из костного мозга зарегистрированы при циррозе печени [Медицинская иммунология. 2009. №4-5 (т.11). С.463].

Наряду с флуктуациями содержания разных фракций зрелых лимфоцитов в крови нами были обнаружены и существенные колебания количества как стволовых гемопоэтических клеток (СГК), так и клеток-предшественников лимфоцитопоэза во фракции мононуклеаров периферической крови реципиентов печени в различные периоды времени после трансплантации, т.е. состояние «турбулентного» кроветворения.

Согласно ряду исследований, СГК способны мигрировать в различные ткани и органы, в печень, легкие, желудочно-кишечный тракт, сосуды и сердце, поддерживая в них пролиферативные процессы [Nat.Med. 2000. Vol.6. P.1229-1234, Stem Cells. 2001. Vol.19. P.304-312]. Важно отметить, что определенная часть циркулирующих СГК несет маркеры предшественников эндотелиальных клеток и может таким образом влиять на состояние капиллярной сети как критической мишени при ишемическом повреждении или отторжении трансплантированного органа. Так как СГК являются родоначальными для всех разновидностей циркулирующих клеток, колебания содержания стволовых клеток в крови предопределяют колебания остальных субпопуляций. Нами было показано [European Radiation Research. (University of Leicester UK). 2005. P.166], что концентрации основных субпопуляций лимфоцитов крови условно здоровых людей находятся в количественной и временной зависимостях от СГК, содержание которых тоже весьма переменно в условиях турбулентного кроветворения. Отсюда следует, что СГК являются основополагающим эталонным маркером всей системы лимфопродукции, что делает их приоритетными при интерпретации получаемых иммуно-гематологических результатов.

Анализируя порой разноречивые литературные данные и результаты собственных наблюдений, мы пришли к необходимости провести исследование по выяснению динамики количества циркулирующих СГК в раннем посттрансплантационном периоде у реципиентов трупной печени (в течение первого месяца после операции).

В исследование были включены 36 больных после трансплантации печени (основная группа) и 23 человека (контрольная группа) без заболеваний печени, в том числе после обширных оперативных вмешательств, выполненных на других органах и системах. Выполнено более 200 анализов. У всех входящих в контрольную и основную группы, со средней частотой 1 раз в неделю, проводили определение различных клеточных маркеров мононуклеаров крови, таких как CD3+, CD4+, CD8+, CD11b+, CD34+ и других. Число клеток, имеющих тот или иной маркер, оценивали в процентах к общему количеству мононуклеаров.

Полученные результаты были проанализированы нами на предмет выявления специфических особенностей динамики каждого из показателей на протяжении первого месяца после трансплантации. Месячный период был разделен на 2 интервала: до 10 и после 10 суток. Для этих временных интервалов были вычислены величины средних концентраций анализируемых субпопуляций. На основании рассмотрения средних значений концентраций, учитывающих флуктуации отдельных их значений, не было обнаружено единого типа кинетики показателей за исключением СГК (CD34+). Только на основании этого параметра удавалось разделить основную группу больных статистически.

Эта возможность легла в основу разработанного способа прогнозирования риска осложнений у реципиентов после трансплантации трупной печени, который взят нами в качестве прототипа настоящего изобретения [Патент РФ 2424529].

Способ заключается в том, что реципиенту 2 раза в неделю в течение первого месяца после трансплантации трупной печени измеряют в крови концентрацию циркулирующих СГК (CD34+), находят средние значения ее за первые 10 и последующие 20 дней. Если величина этих значений составляет 0.1% или более в обоих временных интервалах, реципиента относят к группе больных с благоприятным исходом трансплантации. Если же эти значения ниже 0.1% во втором или обоих временных интервалах, у реципиента прогнозируют риск осложнений в послеоперационном периоде.

Однако использование этого метода усредненного критерия в дальнейшем показало, что в ряде случаев он не позволяет правильно оценить состояние конкретного реципиента. Это вызвано тем, что индивидуальное состояние само по себе может периодически меняться. На наш взгляд, такие колебания степени «здоровья» реципиентов обусловлены периодическим изменением не только СГК, но и общего числа циркулирующих в крови лимфоцитов, являющихся производными СГК и имеющих отношение к процессам приживления/отторжения трансплантата, сдерживания инфекционных процессов и т.д. Этот факт не был учтен нами в предыдущей работе, в результате чего метод оказался недостаточно точным именно для персонального, а не группового прогноза, особенно в условиях турбулентного кроветворения, типичного для раннего посттрансплантационного периода.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности оценки состояния реципиента в посттрансплантационном периоде за счет дополнительного определения в его периферической крови содержания циркулирующих лимфоцитов.

Этот результат достигается тем, что в известном способе оценки состояния реципиента после трансплантации трупной печени путем определения в его периферической крови процентного содержания циркулирующих стволовых гемопоэтических клеток CD34+ (СГК) согласно изобретению предварительно в периферической крови не менее 20 реципиентов ретроспективной группы еженедельно в течение 1-2 мес после трансплантации им трупной печени одновременно определяют процентное содержание СГК и объемное содержание циркулирующих лимфоцитов (ЛФ) в млн/мл, находят их индивидуальные отношения R по формуле R=ЛФ/СГК и строят кривую степенной зависимости R (ось ординат) от СГК (ось абсцисс), используя ее затем в качестве калибровочной кривой в системе двойных логарифмических координат, а для оценки состояния реципиента в текущий момент в его периферической крови определяют одновременно значения ЛФ и СГК, находят их отношение Rp, положение его в калибровочной системе координат и при расположении Rp на или над калибровочной кривой текущее состояние реципиента оценивают как благоприятное, ниже кривой - неблагоприятное.

Длительные наблюдения за состоянием реципиентов после трансплантации им трупной печени показали, что изменения их состояния во времени не случайны. Убедившись в реальных информационных возможностях показателей Лф и СГК в отдельности, мы решили выяснить характер взаимозависимости между этими величинами. Поскольку их изменения во времени оказались противоположными по направленности, т.е. максимум одного показателя соответствовал минимуму другого, и, наоборот, их взаимосвязь мы решили охарактеризовать наиболее простым образом, а именно, отношением R - числа объемного содержания лимфоцитов в крови к процентному содержанию СГК: R=Лф/СГК. Регистрируя параметр R, объединяющий реальные возможности каждого показателя, мы рассчитывали получить более полную оценку состояния пациента в различные сроки его лечения.

Так, еще в 2002 году мы сообщали о возможности ухудшения состояния реципиентов печени, вплоть до смерти, при слишком низком содержании ряда циркулирующих лимфоидных клеток [Гранов A.M., Шутко А.Н. Парадоксы злокачественного роста и тканевой несовместимости. Изд. «Гиппократ», 2002 г.]. Показатель R с учетом этих данных представляется как более перспективный, объединяющий прогностические возможности как СГК, так и собственно ЛФ. Выяснилось, что отношение двух показателей R=Лф/СГК оказывается более вариабельным, чем вариабельность каждого из них в отдельности. Нами показано, что прогностический смысл индивидуального значения величины R можно надежно оценивать, если предварительно исследовать разнообразие в большой ретроспективной группе типичных реципиентов на протяжении интересующего срока.

С этой целью для исследования нами была взята группа реципиентов печени в количестве 20 человек. Для каждого из этих 20 реципиентов ретроспективной группы в течение 2-месячного периода после трансплантации мы измеряли 6-7 раз значения (более 140) СГК,%, и Лф, млн/мл, после чего рассчитывали их индивидуальные отношения: R=Лф/СГК. Полученные данные приведены в таблице 1. Далее был построен график зависимости значений R (по оси ординат-y) от значений СГК (по оси абсцисс-х). Полученную зависимость аппроксимировали в программе «Ехсеl», подбирая аппроксимирующую функцию по критерию ее максимального статистического соответствия расположению точек, следя за тем, чтобы коэффициент корреляции зависимости был достоверен с максимальной вероятностью (не менее р≤0,01). Это условие обеспечивает надежность дальнейшего использования зависимости в качестве референтной. В нашем случае максимально достоверной функцией оказалась показательная функция: y=ах^-b, где а и b - постоянные величины. Для удобства практического использования полученной референтной зависимости R=f (СГК) она представлена в двойных логарифмических координатах, в которых она приобретает вид практически прямой линии (рис.1). На рисунке видно, что конкретные точки в окрестности аппроксимирующей прямой расположены так, что часть их находится на ней или сверху нее, а другая часть - снизу. Для оценки состояния реципиента в текущий момент времени необходимо определить положение его значения R, вычисленного по данным одновременных измерений Лф и СГК, относительно референтной линии на рисунке. Положение значения R на или над линией соответствует, как показали наши предварительные исследования, компенсированному состоянию реципиента. Положение R под линией требует повышенного внимания к состоянию реципиента вплоть до принятия решения об ослаблении интенсивности иммуносупрессивной терапии.

Сущность способа поясняется примером.

Пример 1. Больная М., 1956 г.р. (и/б №474), поступила в клинику РНЦРХТ 04.04.2008 для выполнения ортотопической трансплантации печени (ОТП).

Диагноз: Хронический вирусный гепатит В, цирротическая стадия, декомпенсация.

Диагноз был установлен по данным предварительного обследования, выполненного на базе РНЦРХТ.

Ультразвуковое исследование брюшной полости (УЗИ) 08.02.2008: Атрофический цирроз печени. Портальная гипертензия. Асцит. Эхо-кардиография 08.02.2008: Признаки умеренной соединительно-тканной дисплазии сердечных структур. Пролапс митрального клапана 1 ст.

Фиброгастродуоденоскопия 01.02.2008: Варикозное расширение вен пищевода III ст.

Мультиспиральная компьютерная томография 08.02.2008: Цирроз печени с явлениями атрофии, портальная гипертензия. Спленомегалия. Асцит. ОТП выполнена 04.04.2008.

Пациентка получала трехкомпонентную иммуносупрессию: такролимус 5 мг в сутки под контролем концентрации препарата в крови, целевой концентрацией в первый месяц считали 10-15 нг/мл, в отдаленном периоде 3-5 нг/мл, азатиоприн 50-100 мг, преднизолон по нисходящей схеме от начальной дозы 200 мг в сутки внутривенно до 10 мг в сутки перорально к выписке. Иммуносупрессивная терапия проводится, начиная с первых суток после трансплантации, далее пожизненно.

Исследование СГК крови выполнялось в первый месяц на 5, 12,19, 26, 32 и 40 сутки после ОТП.

На рис.2 прослежена динамика соотношения объемной концентрации циркулирующих лимфоцитов к процентному содержанию лимфоцитов во фракции мононуклеаров крови. Цифровые значения показателей представлены в табл.2. Значения R, выделенные жирным шрифтом, соответствуют точкам, расположенным выше кривой.

Эти изменения СГК в периферической крови соответствовали периоду восстановления, при котором функция печени восстановилась через 1 мес. Содержание билирубина на 30 сутки после ОТП 20, 5 мкмоль/л, АЛТ - 24 Ед., ACT - 15 Ед. Больная была выписана на амбулаторное лечение на 32 сутки после ОТП (06.05.12). Постоянно принимала иммуносупрессивные препараты: програф 3 мг в сутки, преднизолон 10 мг в сутки, через 3 мес преднизолон был отменен, азатиоприн 100 мг в сутки. В июле 2008 г. отмечены признаки холангита, по данным УЗИ 22.07.2008: в обеих долях печени определяется незначительное до 1-2 мм расширение субсегментарных и сегментарных желчных протоков. Долевые протоки не расширены, вокруг них зоны фиброза.

Заключение: Холангит.В анализе крови 22.07.08 Гемоглобин 117 г/л, эритроциты 3,8×10¹²/л, лейкоциты 4,3×10⁹/л, СОЭ 28 мм/ч, билирубин 32 мкмоль/л, АЛТ 56 Ед./л, ACT 45 Ед./л, ГГТП 129 Ед./л, креатинин 100 мкмоль/л, общий белок 62 г/л, альбумин 30 г/л, глюкоза 5,2 ммоль/л. Учитывая инфекцию, количество ЛФ, равное 0,36 млн/мл, СГК 0,27%, отсюда R=1,33 (точка расположен ниже кривой на рис.3), уменьшили объем иммуносупрессии: програф 2 мг в сутки, азатиоприн отменили, преднизолон отменили.

Для лечения холангита больная была госпитализирована в клинику РНЦРХТ 01.08.08 (и/б №2402). На фоне уменьшения объема иммуносупрессии и антибактериальной терапии ципрофлоксацином 1 г в сутки, затем меронемом 2 г в сутки состояние стабилизировалось. Этому соответствовали значения показателей R=6,6, 32,6 из табл.3, соответствующие точки на рис.3 расположены выше кривой. Через 5 мес у больной отмечены признаки отторжения в виде увеличения показателей цитолиза (АЛТ 134 Ед., ACT 89 Ед.), роста концентрации билирубина до 47 мкмоль/л от 05.09.08. Показатели в эти сроки Лф 0,53 млн/мл, СГК 0,15%, R=3,5 (точка на рис.3 расположена ниже кривой). Все это требовало изменения тактики лечения больной. Проведена пульс-терапия солумедролом 500 мг, увеличены дозы иммунодепрессантов, возобновили прием преднизолона по 10 мг в сутки. На этом фоне развился рецидив тяжелого холангита, что привело к ухудшению функционирования трансплантата, резкому нарастанию холестаза. Больная получала большие дозы антибиотиков (меронем, доксициклин), противогибковые препараты (кансидас).

По данным УЗИ в динамике (13.08.08, 10.09.08): Сохраняются расширенными сегментарные и субсегментарные желчные протоки. В области вокруг воротной вены инфильтрация, протоки не визуализируются. Очаговых образований не лоцируется. В анализе крови 11.09.08: Гемоглобин 119 г/л, эритроциты 3,2×10¹²/л, лейкоциты 6,5×10⁹/л, СОЭ 95 мм/ч, билирубин 230 мкмоль/л, прямой 167,2 мкмоль/л, АЛТ 108 Ед./л, ACT 326 Ед./л, ГГШ 1076 Ед./л, креатинин 65 мкмоль/л, общий белок 51 г/л, альбумин 34 г/л, глюкоза 4,8 ммоль/л, ЛДГ 519 Ед./л.

Представленная клиническая картина и соответствующие данные R (см. табл.3, показатели R 3,5, 3,66, 0,6) требовали необходимости оперативного вмешательства.

12.09.2008 проведена релапаротомия, ревизия органов брюшной полости, холедохотомия, холангиография. Резекция гепатохоледоха, раздельное наружное дренирование долевых желчных протоков, дренирование брюшной полости.

23.09.2008 релапаротомия, санация и дренирование брюшной полости. Проводилась антибактериальная терапия с учетом чувствительности высеваемой бактериальной флоры (меронем, зивокс, дифлюкан).

30.09.08 в анализе крови гемоглобин 78 г/л, эритроциты 1,3×10¹²/л лейкоциты 4,8×10%, тромоциты 32×10⁹/л, СОЭ 155 мм/ч, билирубин 249,8 мкмоль/л, прямой 182,2 мкмоль/л, АЛТ 17 Ед./л, ACT 23 Ед./л, ГГТП 798 Ед./л, креатинин 166 мкмоль/л, общий белок 51 г/л, альбумин 38 г/л, глюкоза 4,8 ммоль/л, ЛДГ 163 Ед./л, Лф 0,3 млн/мл, СГК 0,5%, R=0,6 (ниже кривой см. рис.3, табл.3). Эти данные соответствовали тяжелой необратимой дисфункции трансплантата печени, что определило необходимость выполнения повторной трансплантации печени.

Повторная ОТП выполнена 13.10.08 (6 месяцев после первой операции). В течение 5 мес больная находилась в условиях стационара. Длительность пребывания была обусловлена рецидивирующим холангитом, повторными дренированиями желчных путей. Несмотря на проводимую антибактериальную терапию, минимизацию иммуносупрессии у больной сформировался хрониосепсис, она постоянно получала антибактериальную терапию. Развилась стриктура общего желчного протока и множественные неанастомотические стриктуры желчных протоков.

По данным из табл.4 и рис.4 все показатели R были низкими, что предопределяло неблагоприятный прогноз для пациентки.

В анализах крови сохранялись анемия, воспалительные изменения умеренный холестаз.

Анализ крови 13.11.08 (30 дней после повторной ОТП): Гемоглобин 81 г/л эритроциты 2,4×10¹²/л, лейкоциты 4,1×10⁹/л, СОЭ 50 мм/ч, билирубин 36,2 мкмоль/л, прямой 6,7 мкмоль/л, АЛТ 143 Ед./л, ACT 61 Ед./л, ГГТП 609 Ед./л креатинин 56 мкмоль/л, общий белок 53 г/л, альбумин 28 г/л, глюкоза 6,: ммоль/л, ЛДГ 149 Ед./л.

Иммуносупрессия: програф 1 мг в сутки, майфортик 360 мг в сутки преднизолон не назначали.

Несмотря на проводимое антибактериальное лечение, сохранялись явления холангита с нарушением оттока желчи. Стентирование желчного протока выполнено 06.12.2008. При дальнейшем наблюдении состояние больной оставалось тяжелым несмотря на умеренное увеличение концентрации билирубина в сыворотке крови, сохранялись явления хрониосепсиса.

В дальнейшем выполняли многократные чрескожные дренирования и баллонную дилятацию желчных протоков (07.05.2009. 19.05.2009, 10.09.2009, 27.01.2010, 27.02.2010 (и/б №2402, №2644). Функция пересаженной печени прогрессивно ухудшалась. В дальнейшем больная погибла от арозивного кровотечения из язвы кардиального отдела желудка на фоне тяжелого сепсиса.

К настоящему времени с использованием предлагаемого метода проведено мониторирование более 20 больных после трансплантации печени. Во всех случаях значения показателей R соответствовал клиническому состоянию пациентов и с учетом их при необходимости изменялась тактика лечения.

Предлагаемый способ по сравнению с известными имеет ряд преимуществ, основным из которых является повышение точности определения текущего состояния реципиента, обеспечивающее своевременное выявление отклонений в его общесоматическом статусе переносимости иммуносупрессивной терапии.

Способ разработан в группе клинической трансплантологии совместной лабораторией методов иммунологических исследований и прошел клиническую апробацию у 20 реципиентов трансплантата трупной печени с положительным результатом.