ЛЕЧЕНИЕ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ РОТАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к применению одного или более веществ из конъюгированной линолевой кислоты (CLA), жира коровьего молока с высоким содержанием CLA, или к применению одной или более липидных композиций жира коровьего молока для лечения или предупреждения ротавирусной инфекции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Молоко представляет собой жидкость с высоким содержанием биологических веществ, которая предоставляет важный источник питания новорожденных. Кроме того, оно содержит вещества для развития, функционирования и поддержания иммунной системы, что необходимо для развития ребенка.

Ротавирусы представляют собой группу III (двухцепочечная РНК) вирусов семейства Reoviridae и являются причиной диареи у детей приблизительно в 138 миллионов случаев в год. 95% детей перенесут эпизод ротавирусной диареи к тому моменту, как им исполнится пять лет. Во всем мире ротавирусная инфекция является самым распространенным поводом для госпитализации в случае диареи (Parashar et al 2003). Приблизительно 1205 ребенок умирает от ротавирусного заболевания каждый день. Один ребенок с ротавирусной инфекцией из пяти посетит врача, одному ребенку из 65 потребуется госпитализация, и приблизительно один ребенок из 293 погибнет. Большинство смертей происходит в Индостане, странах Африки, расположенных южнее Сахары, и в Южной Америке (Parashar et al. 2003).

Ротавирусные частицы образованы тремя концентрическими слоями белков. Два белка в наружном слое вируса, VP4 и VP7, вовлекаются в начальное взаимодействие вируса с клеткой-хозяином. VP4 образует шипы, которые тянутся из поверхности вирусной частицы, и назван вирусным прикрепительным полипептидом, в то время, как VP7 представляет собой гликопротеин, связывающий кальций, который образует гладкую поверхность вириона и предположительно участвует в процессе, происходящем после прикрепления (Mendez et al. 1999 Isa et al. 2006). Внедрение внутрь клетки представляет собой комплексный процесс, охватывающий взаимодействие между белками наружного слоя вируса и молекулами клеточной поверхности. In vivo, ротавирусы проникают через зрелые энтероциты ворсинок тонкой кишки, в то время как in vitro ротавирусы прикрепляются к клеткам различных линий, но только некоторые из них становятся инфицированными. Isa et al. (2006) сообщают, что начальное прикрепление вируса к клеточной поверхности случайно, и что последующее взаимодействие вируса со специфическими постприкрепительными рецепторами ответственно за внедрение вируса в клетку.

Ротавирусы подразделяются на два типа, основываясь на их способности инфицировать клетки, которые подвергли воздействию нейраминидазы для удаления остатков сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты) на клетках-хозяевах. Ротавирусам, выделенным из некоторых животных, необходимы остатки сиаловой кислоты на поверхности клетки для того, чтобы прикрепиться, в тоже время многим другим ротавирусам, включая штаммы ротавируса, выделенные из человека, нет. Данное свойство описано как чувствительность штаммов к нейраминидазе (или зависимость от сиаловой кислоты) или устойчивость к нейраминидазе (или независимость от сиаловой кислоты), соответственно (Isa et al. 2006). Сообщается об ингибировании производными сиаловой кислоты прикрепления чувствительных ротавирусов животных к клеткам, но не ротавирусов человека (Guo et al., 1999). Сообщается, что ганглиозид GM1a на поверхности клетки-хозяина играет роль рецептора в ротавирусной инфекции человека (Guo et al., 1999). Сообщается, что штаммы, устойчивые к нейраминидазе, распознают ганглиозиды как внутренние сиаловые кислоты, которые устойчивы к воздействию нейраминидазы (Delorme et al, 2001), в отличие от вирусов, чувствительных к нейраминидазе, которые присоединяются к внешним остаткам ганглиозидов (Isa et al. 2006).

Сообщается о ряде соединений (теафлавины, ингибиторы протеаз, иммуноглобулин яичного желтка, искусственный сульфатированный сиалолипид NMSO₃, лактатгерин человеческого молока, MUC1 муцин и макромолекулярная белковая фракция коровьей сыворотки (MMWP)) для подавления ротавирусной инфекции in vivo и in vitro, но не сообщается об их успешном клиническом применении (Bojsen et al., 2007; Peterson et al., 2001; Takahashi et al., 2002; Isa et al., 2006). Большинство перечисленных работ выполнены со штаммами ротавирусов животных, а не со штаммами человека, например, MUC1 муцин и макромолекулярная белковая фракция коровьей сыворотки (Bojsen et al., 2007). Исследование выполнили, используя концентрат сывороточного белка, произведенный Fonterra Cooperative Group Limited, которое продемонстрировало уменьшение «раздевания» ротавируса в мышиной модели, используя мышиный штамм ротавируса EDIM (Wolber et al., 2005). Kvistgaard et al., 2004, сообщили, что бычий лактоферрин, бычий лактатгерин и бычий MUC1 муцин не могут предупреждать ротавирусную инфекцию Wa у человека.

Обычное лечение ротавирусной диареи представляло собой регидратационную терапию, но данная терапия лечит симптомы, а не причину инфекции. Лекарственное средство против диареи, в общем случае, не рекомендуется для применения детям (Yung et al., 2005).

Следовательно, существует необходимость в альтернативных лекарственных средствах для лечения или предупреждения ротавирусной инфекции или, по меньшей мере, необходимо предоставить населению приемлемый выбор.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к одному или более веществ, выбранных из:

(а) одного или более изомеров конъюгированной линолевой кислоты (CLA), вакценовой кислоты или их сочетания, или

(b) жира коровьего молока с высоким содержанием CLA, одной или более фракций жира коровьего молока с высоким содержанием CLA, их гидролизата или сочетания двух или более из них,

(с) одной или более композиций жира коровьего молока, выбранных из:

(i) жира коровьего молока, одной или более фракций жира коровьего молока, или их сочетания,

(ii) безводного жира коровьего молока (AMF), одной или более фракций AMF, или сочетания каких-либо двух или более из них,

(iii) одной или более фракций жира коровьего молока, обогащенных фосфолипидами,

(iv) одной или более фракций жира коровьего молока, обогащенных ганглиозидами,

(v) одного или более из гидролизатов любого одного или более веществ от (i) до (iv), и

(vi) сочетания любых двух или более веществ от (i) до (v), или

(d) сочетания любых двух или более веществ от (а) до (с),

для лечения или предупреждения ротавирусной инфекции.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к одному или более веществ, выбранных из:

(а) одного или более изомеров конъюгированной линолевой кислоты (CLA), вакценовой кислоты или их сочетания, или

(b) жира коровьего молока с высоким содержанием CLA, одной или более фракций жира коровьего молока с высоким содержанием CLA, их гидролизата или сочетания двух или более из них,

(с) сочетания (а) и (b),

для лечения или предупреждения ротавирусной инфекции.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к одному или более веществ, выбранных из:

(i) жира коровьего молока, одной или более фракций жира коровьего молока, или их сочетания,

(ii) безводного жира коровьего молока (AMF), одной или более фракций AMF, или их сочетания,

(iii) одной или более фракций жира коровьего молока, обогащенных фосфолипидами,

(iv) одной или более фракций жира коровьего молока, обогащенных ганглиозидами,

(v) одного или более из гидролизатов любого одного или более веществ от (i) до (iv), и

(vi) сочетания любых двух или более веществ от (i) до (v),

для лечения или предупреждения ротавирусной инфекции.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию одного или более веществ, описанных выше, в получении композиции для лечения или предупреждения ротавирусной инфекции.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения ротавирусной инфекции, включающему введение эффективного количества одного или более веществ, описанных выше, субъекту, который нуждается в данном введении.

Перечисленные далее варианты осуществления могут относиться к любому из описанных выше аспектов.

В одном варианте осуществления, ротавирус представляет собой ротавирус человека, то есть штамм ротавирусов, который заражает людей. В другом варианте осуществления, ротавирус представляет собой штамм ротавирусов, не относящийся к человеку, такой как птичий (такой как куриный, голубиный или индюшачий штамм ротавирусов), бычий, собачий, козий, лошадиный, кошачий, кроличий, мышиный, овечий, свиной или обезьяний штамм ротавирусов. В одном варианте осуществления ротавирус представляет собой ротавирус, чувствительный к нейраминидазе. В другом варианте осуществления, ротавирус представляет собой ротавирус, устойчивый к нейраминидазе. В еще одном варианте осуществления, ротавирус представляет собой устойчивый к нейраминидазе ротавирус человека. В еще одном варианте осуществления устойчивый к нейраминидазе ротавирус человека представляет собой штамм ротавируса человека Wa. В другом варианте осуществления, субъект представляет собой человека. В еще одном варианте осуществления субъект представляет собой взрослого, ребенка или новорожденного, или взрослого, ребенка или новорожденного с ослабленной иммунной системой. В еще одном варианте осуществления субъект представляет собой ребенка, новорожденного, ребенка с ослабленной иммунной системой, новорожденного с ослабленной иммунной системой. В другом варианте осуществления субъект представляет собой взрослого, взрослого старше 55 лет, взрослого с ослабленной иммунной системой или взрослого с ослабленной иммунной системой старше 55 лет.

В одном варианте осуществления, средство лечит или предупреждает ротавирусную инфекцию уменьшением адгезии вируса к клеткам. В другом варианте осуществления, средство лечит или предупреждает ротавирусную инфекцию уменьшением проникновения вируса в клетки. В еще одном варианте осуществления, средство лечит или предупреждает ротавирусную инфекцию уменьшением репликации вирусов в клетках. В еще одном варианте осуществления, средство лечит или предупреждает ротавирусную инфекцию уменьшением упаковывания вирусов в клетках. В еще одном варианте осуществления, средство лечит или предупреждает ротавирусную инфекцию уменьшением лизиса вирусной клетки. В еще одном варианте осуществления, средство лечит или предупреждает ротавирусную инфекцию, связанную с диареей. В еще одном варианте осуществления, средство лечит или предупреждает диарею, вызванную ротавирусной инфекцией.

В одном варианте осуществления, фракция обогащенная ганглиозидами, содержит GD3 или GM3 или их сочетание.

В еще одном варианте осуществления, фракция, обогащенная фосфолипидами, содержит один или более фосфатидилэтаноламинов, один или более фосфатидилинозитолов, один или более фосфатидилсеринов, один или более фосфатидилхолинов, один или более сфинголипидов (включая один или более сфингомиелинов, один или более дигидросфингомиелинов, один или более керамидов, один или более цереброзидов, или один или более ганглиозидов, или какое-либо сочетание двух или более из них), один или более лизофосфолипидов (фосфолипиды с одной утраченной жирной кислотой), или какое-либо сочетание каких-либо двух или более из них.

В еще одном варианте осуществления, средство содержит один или более глицеридов (включая один или более моноглицеридов, один или более диглицеридов, или один или более триглицеридов, или какое-либо сочетание каких-либо двух или более из них, один или более из фосфолипидов (включая один или более фосфатидилэтаноламинов, один или более фосфатидилинозитолов, один или более фосфатидилсеринов, один или более фосфатидилхолинов, или один или более сфинголипидов (как описано выше), или какое-либо сочетание каких-либо двух или более из них), один или более лизофосфолипидов (фосфолипиды с одной утраченной жирной кислотой), один или более керамидов, один или более простых эфиров глицерофосфолипидов, один или более цереброзидов (включая один или более из глюкозилкерамидов или один или более лактозилкерамидов или их сочетание), один или более сульфатидов, или один или более ганглиозидов (включая один или более из моносиалоганглиозидов, один или более из дисиалоганглиозидов, или один или более из полисиалоганглиозидов, или их сочетание), или какое-либо сочетание каких-либо двух или более из них.

В одном варианте осуществления средство вводят в виде компонента жировой композиции. Предпочтительные жировые композиции включают животные, растительные масла и жир морских млекопитающих, и жиры и липиды, полученные ферментированием микроорганизмами. Предпочтительные животные жиры включают, но не ограничиваются перечисленным, молочные жиры, в частности, жир коровьего молока, включая сливки.

В одном варианте осуществления, средство выбрано из сливок, масла, топленого масла, безводного жира коровьего молока (AMF) (обычно получаемого инверсией фазы сливок или дегидратацией масла), пахты, сыворотки масла, бета-сыворотки, фракций твердых молочных жиров с одной или более стадий фракционирования (включая Н, SH и SSH фракции), фракций мягких молочных жиров с одной или более стадий фракционирования (включая S, SS и SSS фракции), сочетаний фракций твердых молочных жиров, сочетаний фракций мягких молочных жиров, сочетаний фракций твердых молочных жиров и фракций мягких молочных жиров, фракций сфинголипидов, обогащенных липидами глобулярных мембранных фракций жира коровьего молока (включая, например, сфинголипиды, керамиды и цереброзиды), фракций фосфолипидов, и комплексных липидных фракций, жира коровьего молока, обогащенного CLA, фракций жира коровьего молока, обогащенных CLA, или каких-либо сочетаний каких-либо двух или более из них, и их гидролизатов, и фракций гидролизатов, и сочетания гидролизованных и/или не гидролизованных фракций. Указанные фракции могут быть получены из цельного молока или молозива, и каких-либо производных цельного молока или молозива, включая сливки, культивированные сливки, и сывороточные сливки (жир коровьего молока, полученный из сыворотки, включая кислую сыворотку или сырную сыворотку, предпочтительно сырную сыворотку). Культивированные сливки представляют собой сливки из цельного молока или молозива, которые ферментировали микроорганизмами, продуцирующими кислоту, предпочтительно молочнокислыми бактериями.

В одном варианте осуществления, жир коровьего молока или его фракции выбраны из сливок, масла, топленого масла, безводного жира коровьего молока (AMF) (обычно получаемого инверсией фазы сливок или дегидратацией масла), пахты, сыворотки масла, бета-сыворотки, фракций твердых молочных жиров с одной или более стадий фракционирования (включая Н, SH и SSH фракции), фракций мягких молочных жиров с одной или более стадий фракционирования (включая S, SS и SSS фракции), сочетаний фракций твердых молочных жиров, сочетаний фракций мягких молочных жиров, сочетаний фракций твердых молочных жиров и фракций мягких молочных жиров, и какого-либо сочетания любых двух или более из них.

В одном варианте осуществления, фракция AMF выбрана из одной или более фракций твердых молочных жиров (таких как H, SH и SSH), одной или более фракций мягких молочных жиров (таких как S, SS и SSS), сочетаний фракций твердых молочных жиров, сочетаний фракций мягких молочных жиров, сочетаний фракций твердых молочных жиров и фракций мягких молочных жиров, и какого-либо сочетания любых двух или более из них.

В одном варианте осуществления, фракция, обогащенная фосфолипидами, выбрана из пахты, одной или более фракций пахты, сыворотки масла, одной или более фракций сыворотки масла, бета-сыворотки, одной или более фракций бета-сыворотки, одной или более фракций сфинголипидов, одной или более липидных глобулярных мембранных фракций жира коровьего молока, одной или более фракций фосфолипидов, одной или более фракций комплексного липида, и каких-либо сочетаний любых двух или более из них.

В одном варианте осуществления, фракция, обогащенная ганглиозидами, выбрана из пахты, одной или более фракций пахты, сыворотки масла, одной или более фракций сыворотки масла, бета-сыворотки, одной или более фракций бета-сыворотки, одной или более фракций бета-сыворотки с высоким содержанием GD3, одной или более фракций бета-сыворотки с высоким содержанием GM3, одной или более фракций бета-сыворотки с высоким содержанием GM3 и GD3, и каких-либо сочетаний любых двух или более из них.

В некоторых вариантах осуществления фракция содержит

(а) приблизительно от 5 до приблизительно 100% масс./масс. липида, или

(b) приблизительно от 40 до приблизительно 100% масс./масс. липида, или

(с) приблизительно от 5 до приблизительно 95% масс./масс. липида и приблизительно от 0 до приблизительно 75% масс./масс. белка, или

(d) приблизительно от 15 до приблизительно 95% масс./масс. липида и приблизительно от 0 до приблизительно 75% масс./масс. белка, или

(е) приблизительно от 5 до приблизительно 95% масс./масс. липида и приблизительно от 0 до приблизительно 75% масс./масс. белка, приблизительно от 5 до приблизительно 85% масс./масс. фосфолипидов и приблизительно от 0 до приблизительно 5% масс./масс. ганглиозида, или

(f) приблизительно от 15 до приблизительно 95% масс./масс. липида и приблизительно от 0 до приблизительно 65% масс./масс. белка, приблизительно от 5 до приблизительно 70% масс./масс. фосфолипидов и приблизительно от 0 до приблизительно 2,5% масс./масс. ганглиозида.

В некоторых вариантах осуществления, фракция содержит, по меньшей мере, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% масс./масс. фосфолипидов, и приемлемые диапазоны могут быть выбраны между какими-либо из перечисленных величин (например, приблизительно от 5 до приблизительно 95%, приблизительно от 10 до приблизительно 95%, приблизительно от 15 до приблизительно 95%, приблизительно от 20 до приблизительно 95%, приблизительно от 25 до приблизительно 95%, приблизительно от 30 до приблизительно 95%, приблизительно от 35 до приблизительно 95%, приблизительно от 40 до приблизительно 95%, приблизительно от 45 до приблизительно 95%, приблизительно от 50 до приблизительно 95%, приблизительно от 10 до приблизительно 70%, приблизительно от 15 до приблизительно 70%, приблизительно от 20 до приблизительно 70%, приблизительно от 25 до приблизительно 70%, приблизительно от 30 до приблизительно 70%, приблизительно от 35 до приблизительно 70%, приблизительно от 40 до приблизительно 70%, приблизительно от 45 до приблизительно 70%, и приблизительно от 50 до приблизительно 70% масс./масс. фосфолипидов).

В некоторых вариантах осуществления, фракция содержит, по меньшей мере, приблизительно 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30% масс./масс. одного или более фосфолипидов, независимо выбранных из фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина, фосфатидилсерина и фосфатидилинозитола, и приемлемые диапазоны могут быть выбраны между какими-либо из перечисленных величин (например, приблизительно от 0,1 до приблизительно 30%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 30%, приблизительно от 1 до приблизительно 30%, приблизительно от 2 до приблизительно 30%, приблизительно от 3 до приблизительно 30%, приблизительно от 4 до приблизительно 30%, приблизительно от 5 до приблизительно 30%, приблизительно от 10 до приблизительно 30%, приблизительно от 15 до приблизительно 30%, приблизительно от 20 до приблизительно 30%, приблизительно от 0,1 до приблизительно 5%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 5%, приблизительно от 1 до приблизительно 5%, приблизительно от 2 до приблизительно 5%, приблизительно от 3 до приблизительно 5%, приблизительно от 0,1 до приблизительно 10%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 10%, приблизительно от 1 до приблизительно 10%, приблизительно от 2 до приблизительно 10%, приблизительно от 3 до приблизительно 10%, приблизительно от 4 до приблизительно 10%, приблизительно от 5 до приблизительно 10%, приблизительно от 6 до приблизительно 10%, приблизительно от 0,1 до приблизительно 20%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 20%, приблизительно от 1 до приблизительно 20%, приблизительно от 2 до приблизительно 20%, приблизительно от 3 до приблизительно 20%, приблизительно от 4 до приблизительно 20%, приблизительно от 5 до приблизительно 20%, приблизительно от 10 до приблизительно 20%, приблизительно от 15 до приблизительно 20% масс./масс.% одного или более фосфолипидов, независимо выбранных из фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина, фосфатидилсерина и фосфатидилинозитола).

В некоторых вариантах осуществления, фракция содержит

(а) приблизительно от 25 до приблизительно 35% масс./масс. белка, приблизительно от 15 до приблизительно 25% масс./масс. липида и приблизительно от 5 до приблизительно 12% масс./масс. фосфолипида, или

(b) приблизительно от 25 до приблизительно 35% масс./масс. белка, приблизительно от 15 до приблизительно 25% масс./масс. липида и приблизительно от 5 до приблизительно 12% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 5 до приблизительно 10% масс./масс. белка MFGM, и приблизительно от 0,2 до приблизительно 0,9% масс./масс. ганглиозида, или

(с) приблизительно от 25 до приблизительно 35% масс./масс. белка, приблизительно от 15 до приблизительно 25% масс./масс. липида и приблизительно от 5 до приблизительно 12% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 1 до приблизительно 5% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 1,5 до приблизительно 6% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 1 до приблизительно 5% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 0,5 до приблизительно 2% масс./масс. фосфатидилсерина, приблизительно от 0,1 до приблизительно 2% масс./масс. фосфатидилинозитола, приблизительно от 5 до приблизительно 10% масс./масс. белка MFGM, и приблизительно от 0,2 до приблизительно 0,9% масс./масс. ганглиозида, или

(d) приблизительно от 40 до приблизительно 60% масс./масс. белка, приблизительно от 25 до приблизительно 45% масс./масс. липида и приблизительно от 10 до приблизительно 25% масс./масс. фосфолипида, или

(е) приблизительно от 40 до приблизительно 60% масс./масс. белка, приблизительно от 25 до приблизительно 45% масс./масс. липида и приблизительно от 10 до приблизительно 25% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 5 до приблизительно 20% масс./масс. белка MFGM, и приблизительно от 0,5 до приблизительно 2,0% масс./масс. ганглиозида, или

(f) приблизительно от 46 до приблизительно 52% масс./масс. белка, приблизительно от 28 до приблизительно 40% масс./масс. липида, приблизительно от 11 до приблизительно 16% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 2 до приблизительно 6% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 3 до приблизительно 8% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 2,5 до приблизительно 7% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 0,5 до приблизительно 3% масс./масс. фосфатидилсерина, приблизительно от 0,5 до приблизительно 2% масс./масс. фосфатидилинозитола, приблизительно от 5 до приблизительно 15% масс./масс. белка MFGM, и приблизительно от 0,5 до приблизительно 0,9% масс./масс. ганглиозида, или

(g) приблизительно от 50 до приблизительно 70% масс./масс. белка, приблизительно от 12 до приблизительно 32% масс./масс. липида и приблизительно от 5 до приблизительно 25% масс./масс. фосфолипида, или

(h) приблизительно от 50 до приблизительно 70% масс./масс. белка, приблизительно от 12 до приблизительно 32% масс./масс. липида и приблизительно от 5 до приблизительно 25% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 2 до приблизительно 8% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 2 до приблизительно 10% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 2 до приблизительно 8% масс./масс. сфингомиелина, и приблизительно от 1 до приблизительно 3% масс./масс. фосфатидилсерина, приблизительно от 10 до приблизительно 20% масс./масс. белка MFGM, и приблизительно от 0,5 до приблизительно 2,5% масс./масс. ганглиозида, или

(i) приблизительно от 56 до приблизительно 65% масс./масс. белка, приблизительно от 18 до приблизительно 28% масс./масс. липида, приблизительно от 8 до приблизительно 20% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 2 до приблизительно 8% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 2 до приблизительно 10% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 2 до приблизительно 8% масс./масс. сфингомиелина, и приблизительно от 1 до приблизительно 3% масс./масс. фосфатидилсерина, и приблизительно от 0,5 до приблизительно 3% масс./масс. фосфатидилинозитола, приблизительно от 10 до приблизительно 20% масс./масс. белка MFGM, и приблизительно от 0,5 до приблизительно 2,5% масс./масс. ганглиозида, или

(j) приблизительно от 0 до 10% масс./масс. белка, приблизительно от 85 до приблизительно 97% масс./масс. липида, и приблизительно от 25 до приблизительно 35% масс./масс. фосфолипида, или

(k) приблизительно от 0 до 10% масс./масс. белка, приблизительно от 85 до приблизительно 97% масс./масс. липида, и приблизительно от 25 до приблизительно 35% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 5 до приблизительно 10% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 7 до приблизительно 13% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 4 до приблизительно 9% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 2 до приблизительно 5% масс./масс. фосфатидилсерина, приблизительно от 1 до приблизительно 3% масс./масс. фосфатидилинозитола, приблизительно от 0 до приблизительно 5% масс./масс. белка MFGM, и приблизительно от 1 до приблизительно 3% масс./масс. ганглиозида, или

(l) приблизительно от 10 до 15% масс./масс. белка, приблизительно от 80 до приблизительно 95% масс./масс. липида, и приблизительно от 60 до приблизительно 80% масс./масс. фосфолипида, или

(m) приблизительно от 10 до 15% масс./масс. белка, приблизительно от 80 до приблизительно 95% масс./масс. липида, и приблизительно от 60 до приблизительно 80% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 10 до приблизительно 20% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 18 до приблизительно 28% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 10 до приблизительно 20% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 4 до приблизительно 12% масс./масс. фосфатидилсерина, приблизительно от 2 до приблизительно 10% масс./масс. фосфатидилинозитола, приблизительно от 0 до приблизительно 5% масс./масс. белка MFGM, и приблизительно от 1 до приблизительно 5% масс./масс. ганглиозида, или

(n) приблизительно от 75 до приблизительно 99% масс./масс. липида и приблизительно от 15 до 35% масс./масс. фосфолипида, или

(о) приблизительно от 80 до приблизительно 90% масс./масс. липида, приблизительно от 5 до приблизительно 15% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 5 до приблизительно 15% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 4 до приблизительно 10% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 0,1 до приблизительно 2% масс./масс. фосфатидилсерина, или

(р) приблизительно от 80 до приблизительно 90% масс./масс. липида, приблизительно от 20 до 30% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 5 до приблизительно 15% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 5 до приблизительно 15% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 5 до приблизительно 10% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 0,5 до приблизительно 1,5% масс./масс. фосфатидилсерина, и приблизительно от 0,1 до приблизительно 1,2% масс./масс. фосфатидилинозитола, или

(q) приблизительно от 75 до приблизительно 95% масс./масс. липида и приблизительно от 50 до 90% масс./масс. фосфолипида, или

(r) приблизительно от 80 до приблизительно 90% масс./масс. липида, приблизительно от 10 до приблизительно 30% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 12 до приблизительно 22% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 12 до приблизительно 22% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 1 до приблизительно 3% масс./масс. фосфатидилсерина, или

(s) приблизительно от 75 до приблизительно 95% масс./масс. липида, приблизительно от 50 до 90% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 10 до приблизительно 45% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 12 до приблизительно 25% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 12 до приблизительно 25% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 1 до приблизительно 6% масс./масс. фосфатидилсерина, и приблизительно от 0,5 до приблизительно 4% масс./масс. фосфатидилинозитола, или

(t) приблизительно от 80 до приблизительно 90% масс./масс. липида, приблизительно от 65 до приблизительно 75% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 10 до приблизительно 30% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 12 до приблизительно 22% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 12 до приблизительно 22% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 1 до приблизительно 3% масс./масс. фосфатидилсерина, и приблизительно от 0,5 до 3% масс./масс. фосфатидилинозитола, или

(u) приблизительно от 25 до приблизительно 45% масс./масс. липида и приблизительно от 0,2 до приблизительно 1% масс./масс. ганглиозида GD3, или

(v) приблизительно от 25 до приблизительно 45% масс./масс. липида, приблизительно от 10 до приблизительно 30% масс./масс. фосфолипида, и приблизительно от 0,2 до приблизительно 1% масс./масс. ганглиозида, или

(w) приблизительно от 25 до приблизительно 45% масс./масс. липида, приблизительно от 10 до приблизительно 30% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 2 до приблизительно 5% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 3 до приблизительно 7% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 2 до приблизительно 5% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 2 до приблизительно 12% масс./масс. фосфатидилсерина, приблизительно от 1 до приблизительно 5% масс./масс. фосфатидилинозитола, и приблизительно 0,2 до приблизительно 1% масс./масс. ганглиозида, или

(х) приблизительно от 20 до приблизительно 40% масс./масс. липида и приблизительно от 0,8 до приблизительно 2% масс./масс. ганглиозида GD3, или

(y) приблизительно от 20 до приблизительно 40% масс./масс. липида, приблизительно от 5 до приблизительно 30% масс./масс. фосфолипида, и приблизительно от 0,8 до приблизительно 3,5% масс./масс. ганглиозида, или

(z) приблизительно от 20 до приблизительно 40% масс./масс. липида, приблизительно от 5 до приблизительно 30% масс./масс. фосфолипида, приблизительно от 1 до приблизительно 5% масс./масс. фосфатидилхолина, приблизительно от 2 до приблизительно 8% масс./масс. фосфатидилэтаноламина, приблизительно от 0,5 до приблизительно 5% масс./масс. сфингомиелина, приблизительно от 1 до приблизительно 10% масс./масс. фосфатидилсерина, приблизительно от 1 до приблизительно 6% масс./масс. фосфатидилинозитола, и приблизительно 0,8 до приблизительно 3,5% масс./масс. ганглиозида.

В одном варианте осуществления, фракция содержит, по меньшей мере, 70% липидов в совокупности, по меньшей мере, приблизительно 12% фосфатидилхолина, по меньшей мере, приблизительно, 6% фосфатидилэтаноламина, по меньшей мере, приблизительно, 6% сфингомиелина и, по меньшей мере, приблизительно, 1% фосфатидилсерина. В предпочтительной фракции данного варианта осуществления, фракция содержит, приблизительно, 1,8% масляной кислоты (4:0), приблизительно 0,3% каприловой кислоты (10:0), приблизительно 0,5% лауриловой кислоты (12:0), приблизительно 7,4% миристиновой кислоты (14:0), приблизительно 14,1% миристоленовой кислоты (14:1), приблизительно 1,0% пентадекановой кислоты (15:0), приблизительно 26,0% пальмитиновой кислоты (16:0), приблизительно 1,7% пальмитоленовой кислоты (16:1), приблизительно 0,6% маргариновой кислоты (17:0), приблизительно 0,3% гептадекановой кислоты (17:1), приблизительно 11,9% стеариновой кислоты (18:0), приблизительно 39,0% олеиновой кислоты (18:1), приблизительно 5,0% линолевой кислоты (18:2), приблизительно 2,0% линоленовой кислоты (18:3), приблизительно 0,3% арахидоновой кислоты (20:0), и приблизительно 0,8% холестерина. В предпочтительном варианте осуществления, композиция жирных кислот данной фракции по существу представляет собой фракцию фосфолипидов, описанную в примерах, приведенных ниже, для Phospholipid Concentrate PC500^TM. В качестве альтернативы, фракция представляет собой гидролизат фракции данного варианта осуществления.

В другом варианте осуществления, фракция содержит, по меньшей мере, 80% липидов в совокупности, по меньшей мере, приблизительно 30% фосфатидилхолина, по меньшей мере, приблизительно, 6% фосфатидилэтаноламина, по меньшей мере, приблизительно, 15% сфингомиелина и, по меньшей мере, приблизительно, 2% фосфатидилсерина. В предпочтительной фракции данного варианта осуществления, фракция содержит, приблизительно, 6,6% миристиновой кислоты (14:0), приблизительно 27,0% пальмитиновой кислоты (16:0), приблизительно 1,3% пальмитоленовой кислоты (16:1), приблизительно 2,3% маргариновой кислоты (17:0), приблизительно 14% стеариновой кислоты (18:0), приблизительно 38,0% олеиновой кислоты (18:1), приблизительно 6,5% линолевой кислоты (18:2), приблизительно 2,0% линоленовой кислоты (18:3) и приблизительно 0,1% холестерина. В предпочтительном варианте осуществления, композиция жирных кислот данной фракции по существу представляет собой фракцию фосфолипидов, описанную в примерах, приведенных ниже, для Phospholipid Concentrate PC600™ или PC700™. В качестве альтернативы, фракция представляет собой гидролизат фракции данного варианта осуществления.

В одном варианте осуществления, фракция содержит, по меньшей мере, приблизительно 30% липидов в совокупности, по меньшей мере, приблизительно 0,5% ганглиозида GD3 и, по меньшей мере, приблизительно 0,4% ганглиозида GM3. В предпочтительном варианте осуществления, композиция жирных кислот данной фракции по существу представляет сбой фракцию ганглиозидов, описанную в примерах, приведенных ниже, для G500™. В качестве альтернативы, фракция представляет собой гидролизат.

В другом варианте осуществления, фракция содержит, по меньшей мере, приблизительно 30% липидов в совокупности, по меньшей мере, приблизительно 1,2% ганглиозида GD3 и, по меньшей мере, приблизительно 0,2% ганглиозида GM3. В предпочтительном варианте осуществления, композиция жирных кислот данной фракции по существу представляет сбой фракцию ганглиозидов, описанную в примерах, приведенных ниже, для Ganglioside G600™. В качестве альтернативы, фракция представляет собой гидролизат фракции описанного варианта осуществления.

В одном варианте осуществления композиция, используемая в настоящем изобретении, содержит, состоит в основном, или состоит из, по меньшей мере, приблизительно 0,1, 0,2, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 99,5, 99,8 или 99,9% масс. одного или более веществ, описанных в данном документе ранее, и приемлемые интервалы могут быть выбраны из интервалов между любыми перечисленными значениями (например, приблизительно от 0,1 до приблизительно 50%, приблизительно от 0,2 до приблизительно 50%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 50%, приблизительно от 1 до приблизительно 50%, приблизительно от 5 до приблизительно 50%, приблизительно от 10 до приблизительно 50%, приблизительно от 15 до приблизительно 50%, приблизительно от 20 до приблизительно 50%, приблизительно от 25 до приблизительно 50%, приблизительно от 30 до приблизительно 50%, приблизительно от 35 до приблизительно 50%, приблизительно от 40 до приблизительно 50%, приблизительно от 45 до приблизительно 50%, приблизительно от 0,1 до приблизительно 60%, приблизительно от 0,2 до приблизительно 60%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 60%, приблизительно от 1 до приблизительно 60%, приблизительно от 5 до приблизительно 60%, приблизительно от 10 до приблизительно 60%, приблизительно от 15 до приблизительно 60%, приблизительно от 20 до приблизительно 60%, приблизительно от 25 до приблизительно 60%, приблизительно от 30 до приблизительно 60%, приблизительно от 35 до приблизительно 60%, приблизительно от 40 до приблизительно 60%, приблизительно от 45 до приблизительно 60%, приблизительно от 0,1 до приблизительно 70%, приблизительно от 0,2 до приблизительно 70%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 70%, приблизительно от 1 до приблизительно 70%, приблизительно от 5 до приблизительно 70%, приблизительно от 10 до приблизительно 70%, приблизительно от 15 до приблизительно 70%, приблизительно от 20 до приблизительно 70%, приблизительно от 25 до приблизительно 70%, приблизительно от 30 до приблизительно 70%, приблизительно от 35 до приблизительно 70%, приблизительно от 40 до приблизительно 70%, приблизительно от 45 до приблизительно 70%, приблизительно от 0,1 до приблизительно 80%, приблизительно от 0,2 до приблизительно 80%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 80%, приблизительно от 1 до приблизительно 80%, приблизительно от 5 до приблизительно 80%, приблизительно от 10 до приблизительно 80%, приблизительно от 15 до приблизительно 80%, приблизительно от 20 до приблизительно 80%, приблизительно от 25 до приблизительно 80%, приблизительно от 30 до приблизительно 80%, приблизительно от 35 до приблизительно 80%, приблизительно от 40 до приблизительно 80%, приблизительно от 45 до приблизительно 80%, приблизительно от 0,1 до приблизительно 90%, приблизительно от 0,2 до приблизительно 90%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 90%, приблизительно от 1 до приблизительно 90%, приблизительно от 5 до приблизительно 90%, приблизительно от 10 до приблизительно 90%, приблизительно от 15 до приблизительно 90%, приблизительно от 20 до приблизительно 90%, приблизительно от 25 до приблизительно 90%, приблизительно от 30 до приблизительно 90%, приблизительно от 35 до приблизительно 90%, приблизительно от 40 до приблизительно 90%, приблизительно от 45 до приблизительно 90%, приблизительно от 0,1 до приблизительно 99%, приблизительно от 0,2 до приблизительно 99%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 99%, приблизительно от 1 до приблизительно 99%, приблизительно от 5 до приблизительно 99%, приблизительно от 10 до приблизительно 99%, приблизительно от 15 до приблизительно 99%, приблизительно от 20 до приблизительно 99%, приблизительно от 25 до приблизительно 99%, приблизительно от 30 до приблизительно 99%, приблизительно от 35 до приблизительно 99%, приблизительно от 40 до приблизительно 99%, приблизительно от 45 до приблизительно 99%).

В одном варианте осуществления композиция, используемая в настоящем изобретении, содержит, состоит в основном, или состоит из, по меньшей мере, приблизительно 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 граммов одного или более описанных выше веществ, и приемлемые интервалы могут быть выбраны из интервалов между любыми перечисленными значениями (например, приблизительно от 0,01 до приблизительно 1 грамма, приблизительно от 0,01 до приблизительно 10 граммов, приблизительно от 0,01 до приблизительно 19 граммов, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 грамма, приблизительно от 0,1 до приблизительно 10 граммов, приблизительно от 0,1 до приблизительно 19 граммов, от приблизительно 1 до приблизительно 5 граммов, от приблизительно 1 до приблизительно 10 граммов, приблизительно от 1 до приблизительно 19 граммов, от приблизительно 5 до приблизительно 10 граммов, приблизительно от 5 до приблизительно 19 граммов).

В одном варианте осуществления композиция, используемая в настоящем изобретении, содержит, состоит в основном, или состоит из, по меньшей мере, приблизительно 0,1, 0,2, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, или 99,9% масс. свежего цельного молока или производного молока, и приемлемые интервалы могут быть выбраны из интервалов между любыми перечисленными значениями (например, приблизительно от 0,1 до приблизительно 50%, приблизительно от 0,2 до приблизительно 50%, приблизительно от 0,5 до приблизительно 50%, приблизительно от 1 до приблизительно 50%, приблизительно от 5 до приблизительно 50%, приблизительно от 10 до приблизительно 50%, приблизительно от 15 до приблизительно 50%, приблизительно от 20 до приблизительно 50%, приблизительно от 25 до приблизительно 50%, приблизительно от 30 до приблизительно 50%, приблизительно от 35 до приблизительно 50%, приблизительно от 40 до приблизительно 50%, приблизительно от 45 до приблизительно 50%). Производное молока предпочтительно выбрано из рекомбинированного, порошкового или свежего обезжиренного молока, рекомбинированного или восстановленного цельного или обезжиренного сухого молока, концентрата обезжиренного молока, ультраконцентрата обезжиренного молока, концентрированного молока, концентрата молочного белка (MPC), изолята молочного белка (MPI), обедненного кальцием концентрата молочного белка (MPC), молока пониженной жирности, концентрата молочного белка (MPC) пониженной жирности, казеина, казеината, жира коровьего молока, сливок, масла, топленого масла, безводного жира коровьего молока (AMF), пахты, сыворотки масла, бета-сыворотки, фракций твердых молочных жиров, фракций мягких молочных жиров, фракций сфингомиелина, глобулярных мембранных фракций жира коровьего молока, глобулярных мембранных липидных фракций жира коровьего молока, фракций фосфолипидов, комплексных липидных фракций, молозива, фракции молозива, белкового концентрата молозива (СРС), сыворотки молозива, фракции иммуноглобулина из молозива, молочной сыворотки (включая сладкую сыворотку, молочнокислую сыворотку или восстановленную сухую молочную сыворотку), изолята белков молочной сыворотки (WPI), концентрата белков молочной сыворотки (WPC), композиции, полученной из какого-либо молока или молозива в процессе обработки, композиции, полученной из ультраконцентрата или фильтрата, полученного ультрафильтрацией или микрофильтрацией в процессе обработки какого-либо молока или молозива, композиции, полученные из вещества, не связавшегося с колоночным сорбентом, или из адсорбированной фракции, полученной хроматографическим разделением (включая, но не ограничиваясь, ионной и гель-проникающей хроматографией) какого-либо молока или молозива, экстрактов каких-либо производных молока, включая экстракты, полученные многостадийным фракционированием, фракционной кристаллизацией, сольвентным фракционированием, надкритическим фракционированием, околокритическим фракционированием, дистилляцией, центрифужным фракционированием или фракционированием модификатором (например, мылами или эмульгаторами), гидролизатов любых перечисленных производных, фракций гидролизатов, и любых сочетаний каких-либо двух или более производных, включая сочетания гидролизованных и/или не гидролизованных фракций. Должно быть понятно, что источником указанных производных может быть молоко или молозиво или их сочетание.

В одном варианте осуществления, композиция, использованная в настоящем изобретении, дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления, композиция представляет собой или разработана в виде пищи, напитка, пищевой добавки, питьевой добавки, диетической добавки, пищевого продукта, лечебного питания, продукта для энтерального питания, продукта для парентерального питания, заменителя пищи, лечебно-косметического средства, питательного, лечебного или фармацевтического средства. В одном варианте осуществления, композиция представлена в форме таблетки, таблетки в форме капсулы, пилюли, твердой или мягкой капсулы или пастилки. В одном варианте осуществления, композиция представлена в форме крахмальной капсулы, порошка, диспергируемого порошка, гранул, эликсира, жидкости или в любой другой форме, которая может быть добавлена к пище или напитку, включая, например, молоко или фруктовый сок. В одном варианте осуществления, композиция дополнительно содержит один или более компонентов (таких как антиоксиданты), которые предупреждают или уменьшают разрушение композиции во время хранения или после введения. Данные композиции могут включать любой съедобный продукт, способный переносить липид. Примеры годных в пищу продуктов включают водные продукты, хлебобулочные изделия, кондитерские продукты, включая шоколад, гель, мороженое, восстановленные фруктовые продукты, закуски, пищевые продукты, мюсли, пищевые продукты пастообразной консистенции, соусы, подливки, молочные продукты, включая йогурты и сыры, напитки, включая молочные и немолочные напитки, молоко, сухое молоко, добавки для спортивного питания, включая молочные и немолочные добавки для спортивного питания, фруктовый сок, пищевые добавки, такие как белковые обсыпки, добавки для диетического питания, такие как добавки в виде таблеток для ежедневного употребления, заменители грудного молока и йогурты, и детские молочные смеси, такие как молочная смесь для новорожденных, молочная смесь для детей старше 6 месяцев, или молочная смесь для детей старше 12 месяцев, в порошке или в форме жидкости. Подходящие пищевые композиции, использованные в данном изобретении, могут быть предоставлены в похожих формах.

В одном варианте осуществления, композиция может дополнительно содержать противовирусное средство, или вещество может быть в сочетании с противовирусным средством, таким как одно или более противовирусных средств, выбранных из теафлавинов, ингибиторов протеаз, иммуноглобулина яичного желтка, искусственного сульфатированного сиалиллипида NMSO₃, лактатгерин человеческого молока (гликопротеин глобулярной мембраны жира коровьего молока), MUC1 муцин, макроглобулярная белковая фракция сыворотки коровьего молока или их сочетания. В одном варианте осуществления, композиция, используемая в настоящем изобретении, включает или вводится одновременно или последовательно с компонентами молока, такими как сывороточный белок, фракции сывороточных белков (включая кислые или основные фракции сывороточных белков или их сочетания), гликомакропептид, лактоферрин, железо-лактоферрин, функциональный лактоферрин или вариант железо-лактоферрина, функциональный лактоферрин или фрагмент железо-лактоферрин, витамин D, или кальций, или любое сочетание двух или более из них. Предпочтительно, композиция может дополнительно содержать или средство может быть в сочетании с лактоферрином, железо-лактоферрином, функциональным лактоферрином или вариантом железо-лактоферрина, функциональным лактоферрином или фрагментом железо-лактоферрин, или любым сочетанием двух или более из них.

Имеется в виду, что ссылка на интервал чисел, раскрытых в настоящем описании (например, от 1 до 10), также включает ссылку на все рациональные числа в указанном интервале (например, 1, 1,1, 2, 3, 3,9, 4, 5, 6, 6,5, 7, 8, 9 и 10), а также любой диапазон рациональных чисел в указанном интервале (например, от 2 до 8, от 1,5 до 5,5 и от 3,1 до 4,7) и, следовательно, все поддиапазоны всех интервалов, определенно раскрытых в настоящем документе, таким образом, раскрыты недвусмысленным образом. Они являются лишь примерами определенных чисел и интервалов, и специально оговорено в настоящей заявке, что все возможные сочетания числовых значений между перечисленными наименьшими и наибольшими значениями находятся в рамках настоящего изобретения.

В настоящем описании сделаны ссылки на патентные спецификации, другие внешние документы, или другие источники информации, в общем случае, в контексте обсуждения признаков изобретения. Если специально не оговорено иначе, ссылка на подобные внешние документы не интерпретируется как признание указанных документов, или источников информации, в какой-либо компетенции, предшествующим уровнем техники, или не формирует часть общих сведений в области техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой два графика, демонстрирующие процент неинфицированных клеток у животных, подвергнутых лечению в соответствии с Примером 2 (А) молочным жиром, обогащенным CLA или (В) фракцией ганглиозида G600™ жира коровьего молока из Fonterra Co-operative Group Limited.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Примеры, помещенные далее, демонстрируют предупреждение адгезии ротавируса к клетке in vitro различными фракциями жира коровьего молока и способность фракций жира коровьего молока лечить или предупреждать диарею в животной модели, инфицированной штаммом Wa ротавируса человека.

1. Определения

Термины «безводный жир коровьего молока» и «AMF» применяются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к фракции молочного жира, полученной почти полным удалением воды и веществ, не относящихся к жирам, инверсией фазы сливок или обезвоживанием масла. AMF (также известное как «безводный жир коровьего молока», если представлены добавки) обычно получают из сливок или масла из цельного молока, но также его можно получить из молозива. Способы, обычно используемые для получения AMF, раскрыты в Bylund (изд. 1995), включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Предпочтительный AMF представляет собой, в общем случае, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,5% или 100% жир, более предпочтителен AMF с содержанием жира от 98% до приблизительно 100%, в частности 99% липида, 99,5% липида или более. Санитарные правила производства пищевых продуктов предписывают влажность <0,2% для AMF или безводного жира коровьего молока и влажность <0,7% для безводного жира коровьего молока. AMF часто дополнительно фракционируют на «твердые» (H) и «мягкие» (S) фракции, дополнительно его можно фракционировать далее на «мягкие твердые» (SH) и «мягкие мягкие» (SS) фракции, и дополнительно их можно в дальнейшем фракционировать на «мягкие мягкие твердые» (SSH) и «мягкие мягкие мягкие» (SSS) фракции. Следует понимать, что фракции отличаются по композициям жирных кислот. Не ограничивающие примерные композиции жирных кислот для AMF и производных фракций указаны в Таблицах с 1 по 5, приведенных далее.

Термин «бета-сыворотка» означает молочный ингредиент, выделенный из потоков молока, содержащий более, чем 60% жира, который получают посредством инверсии фазы из эмульсии масло-в-воде в эмульсию вода-в-масле, как описано далее. Сливки представляют собой предпочтительный исходный материал для получения бета-сыворотки. Например, бета-сыворотку получают во время производства оттопки масла (также известного как безводный жир коровьего молока или AMF) из сливок, как показано на фиг.2 WO 2006/041316. Предпочтительно, бета-сыворотку сушат; предпочтительно, высушенная бета-сыворотка представляет собой порошок.

Термин «жир коровьего молока с высоким содержанием CLA» используют взаимозаменяемо с термином «жир коровьего молока, обогащенный CLA» и он обозначает жир коровьего молока, который содержит более высокий уровень с-9, t-11 CLA или их соли, сложного эфира или предшественника, чем обычный жир коровьего молока, и, необязательно, более высокий уровень одного или более других изомеров CLA. Жир коровьего молока, обогащенный CLA, получают известными способами, включая, но не ограничиваясь, дополнительное кормление свободными жирными кислотами пастбищных коров, например, кормление коров рыбьим жиром и подсолнечным маслом в соответствии с известными способами. Жир коровьего молока, обогащенный CLA, обычно получают из цельного молока, но можно получать также из молозива. Типичная композиция жира коровьего молока, обогащенного CLA, описана в опубликованной международной заявке PCT WO 2005/107736, которая включена в настоящее описание ссылкой. Жир коровьего молока, обогащенный CLA, может быть также получен дополнением жира коровьего молока CLA, в соответствии с описанным далее. В одном варианте осуществления, жир коровьего молока, обогащенный CLA, содержит по меньшей мере, приблизительно 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% масс. CLA, предпочтительно с-9, t-11 CLA или его соли, сложного эфира или предшественника и используемые интервалы могут быть выбраны из интервалов между любыми перечисленными выше значениями (например, от приблизительно 4% до приблизительно 7%).

Предпочтительно, жир коровьего молока, обогащенный CLA, содержит, по меньшей мере, приблизительно 2% масс. с-9, t-11 CLA, предпочтительно, приблизительно от 2% до 10% масс. с-9, t-11 CLA, более предпочтительно, приблизительно от 4% до 7% масс. с-9, t-11 CLA, и наиболее предпочтительно, приблизительно 5% масс. с-9, t-11 CLA. В одном варианте осуществления, жир коровьего молока, обогащенный CLA, содержит CLA изомеры, которые включают в себя, по меньшей мере, приблизительно 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% масс. CLA, предпочтительно с-9, t-11 CLA или его соли, сложного эфира или предшественника, и используемые интервалы могут быть выбраны из интервалов между любыми перечисленными выше значениями (например, от приблизительно 80% до приблизительно 95%). Предпочтительно, жир коровьего молока, обогащенный CLA, содержит CLA изомеры, содержащие, по меньшей мере, приблизительно 50% масс. с-9, t-11 CLA, предпочтительно, приблизительно от 70 до 80% масс. с-9, t-11 CLA.

Термин «содержащий», как используется в настоящем описании, означает «состоит, по меньшей мере, частично». При интерпретации объяснений в настоящем описании, которые включают указанный термин, все особенности, предваряемые данным термином в каждом объяснении или в формуле изобретения, представлены обязательно, но также могут быть представлены и другие особенности. Сходные термины, такие как «содержит» и «содержал» интерпретируются аналогичным образом.

Термин «конъюгированная линолевая кислота» (CLA) означает один или более изомеров CLA, выбранных из изомеров 9,11-октадекадиеновой кислоты и 10,12-октадекадиеновой кислоты, в свободной или этерифицированной форме, или их солей, или их смесей, включая цис-9, цис-11, цис-9, транс-11, транс-9, цис-11, транс-9, транс-11, цис-10, цис-12, цис-10, транс-12, транс-10, цис-12 и транс-10, транс-12 изомеры, предпочтительно цис-9, цис-11, цис-9, транс-11, транс-10, цис-12 и цис-10, цис-12 изомеры, в соответствии с опубликованным в Патенте США 5585400, включенным в настоящее описание в качестве ссылки. Естественные источники CLA, такие как цис-9, транс-11 CLA, описаны Chin et al (1992) и включают животные, бактериальные и растительные источники. Линолевая кислота может быть превращена в CLA бактериальным ферментированием, например, Clostridium sporogenes, Clostridium bifermentans, Clostridium sordellii и Bacteroides sp. (Verhulst, et al. 1985). Другие используемые микроорганизмы для бактериального ферментирования включают Butyrivibrio fibrisolvens, Eubacterium lentum, Propionibacterium freudenreichi, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Megasphera elsdenii и Bifidobacterium breve. Подсолнечное и сафлоровое масла, содержащие приблизительно 65% и 76% линолевой кислоты соответственно, могут быть использованы для получения CLA.

«Эффективное количество» представляет количество, необходимое для предоставления лечебного эффекта. Соответствие дозировок для животных и людей (из расчета миллиграмм на метр поверхности тела) описано Freireich et al. (1966). Площадь поверхности тела может быть приблизительно определена из роста и массы субъекта. См., например, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, Нью-Йорк 1970, 537. Эффективные дозы также различаются, как признано специалистами в области техники, в зависимости от пути введения, применения носителя и т.д.

Термины «обогащать» и «обогащенный» означают, что фракция или композиция имеет более высокую концентрацию означенного компонента, чем представлено в цельном молоке, сливках, масле, безводном жире коровьего молока, пахте, сыворотке масла или бета-сыворотке, или в исходной фракции, из которой получена фракция или композиция. Например, фракция, обогащенная ганглиозидом, представляет собой фракцию, которая имеет более высокую концентрацию ганглиозида, чем цельное молоко, сливки, масло, безводный жир коровьего молока, пахта, сыворотка масла или бета-сыворотка. Равным образом, фракция, обогащенная фосфолипидом, представляет собой фракцию, которая имеет более высокую концентрацию фосфолипида, чем цельное молоко, сливки, масло, безводный жир коровьего молока, пахта, сыворотка масла или бета-сыворотка.

Термин «фракция» означает композицию, которая выделена из исходного вещества, и которая композиционно отличается от исходного вещества, из которого выделена фракция. Например, фракция молочного жира млекопитающих, не относящихся к человеку, такая как фракция молочного жира овцы, козы, свиньи, мыши, буйвола, верблюда, яка, лошади, осла, ламы или коровы, предпочтительно, фракция коровьего молока, композиционно отличается от естественного молочного жира в цельном молоке. В альтернативных вариантах осуществления, концентрация во фракции выше, чем концентрация в цельном молоке, или в цельном молозиве, или в сливках из молока, или в сливках из молозива, или в AMF из молока или AMF из молозива. Предпочтительное исходное вещество, использованное в настоящем изобретении, включает цельное молоко, сливки, масло, безводный жир коровьего молока, пахту, сыворотку масла или бета-сыворотку или подсырные сливки из коровьего молока. Предпочтительные фракции представляют собой липидные фракции, как описывается в данном документе.

Соответственно, термин «фракция молочного жира, обогащенная фосфолипидами» означает выделенную фракцию молочного жира млекопитающего, не относящегося к человеку, в которой концентрация фосфолипида выше, чем концентрация фосфолипида естественного молочного жира млекопитающего, не относящегося к человеку. Предпочтительно, концентрация, по меньшей мере, одного фосфолипида или, по меньшей мере, одного фосфолипида и, по меньшей мере, одного ганглиозида во фракции, использованной в настоящем изобретении, по меньшей мере, приблизительно на 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% выше, чем концентрация в естественном молочном жире млекопитающего, не относящегося к человеку, и приемлемые интервалы могут быть выбраны из интервалов между перечисленными величинами. В альтернативных вариантах осуществления, концентрации во фракции выше, чем концентрации цельного молока, или цельного молозива, или в сливках из молока или в сливках из молозива, или в AMF из молока, или AMF из молозива.

Равным образом, термин «фракция молочного жира, обогащенная ганглиозидами» означает выделенную фракцию молочного жира млекопитающего, не относящегося к человеку, в которой концентрация ганглиозида выше, чем концентрация ганглиозида естественного молочного жира млекопитающего, не относящегося к человеку. Предпочтительно, концентрация, по меньшей мере, одного ганглиозида или, по меньшей мере, одного ганглиозида и, по меньшей мере, одного фосфолипида во фракции, использованной в настоящем изобретении, по меньшей мере, приблизительно на 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% выше, чем концентрация в естественном молочном жире млекопитающего, не относящегося к человеку, и пригодные интервалы могут быть выбраны из интервалов между перечисленными величинами. В альтернативных вариантах осуществления, концентрации во фракции выше, чем концентрации цельного молока, или цельного молозива, или в сливках из молока, или в сливках из молозива, или в AMF из молока, или AMF из молозива.

Термин «функциональный фрагмент лактоферрина» предназначен обозначать часть натурального или искусственного полипептида лактоферрина, который имеет активность, оцененную в соответствии с примерами, приведенными далее, и включает функциональные фрагменты с ионами металла. Пригодные фрагменты лактоферрина включают процессированные полипептиды лактоферрина, гидролизаты лактоферрина, связывающие ионы металла, фрагменты, которые содержат N-концевой карман, связывающий ионы металла, фрагменты, которые содержат С-концевой карман, связывающий ионы металла, и фрагменты, связывающие ионы металлаобразуются (искусственно или в естественных условиях) и определяются известными способами, обсуждаемыми далее. Опубликованные международные патентные заявки WO 2006/054908 и WO 2007/043900 сообщают о получении и использовании фрагментов лактоферрина, каждая включена в настоящее описание ссылкой.

Термин «функциональный вариант лактоферрина» предназначается обозначать вариант полипептида лактоферрина, который обладает активностью при исследовании в соответствии с примерами, приведенными далее, и включает функциональные разновидности, связывающие ион металла.

Термин «полипептид лактоферрина» относится к негликозилированной или гликозилированной аминокислотной последовательности дикого типа лактоферрина или к гомологичной последовательности лактоферрина из видов, таких как виды описанные далее. Полипептид лактоферрина имеет два кармана, связывающих ионы металла, и, таким образом, может связывать ионы металла в стехиометрическом соотношении 2 иона металла на молекулу лактоферрина. Один карман, связывающий ион металла, представлен на N-концевом участке (N-конец) лактоферрина и другой карман представлен на С-концевом участке (С-конец) лактоферрина. Подтвержденные последовательности коровьего и человеческого лактотрансферринов (предшественники лактоферрина), лактоферринов и пептидов могут быть найдены в Swiss-Prot (http://au.expasy.org/cgi-bin/sprot-search-ful). Показательные полипептиды лактоферрина включают предшественник коровьего лактоферрина (входящий номер Р24627), коровий лактоферрин, предшественник человеческого лактоферрина (входящий номер Р02788) и человеческий лактоферрин. Опубликованные международные патентные заявки WO 2006/054908 и WO 2007/043900 сообщают получение (включая выделение из молока) и использование полипептидов лактоферрина, фрагментов, гидролизатов и аминокислотных последовательностей лактоферрина, и каждая включена в настоящее описание ссылкой. Полипептиды лактоферрина могут связывать ионы металла, обычно ионы железа, при их «естественном» уровне. Например, коровий лактоферрин в естественных условиях насыщен железом приблизительно от 10% до 20%. В настоящем изобретении используют апо-лактоферрин и лактоферрин, насыщенные, по меньшей мере, на 1%.

Термины «металло-ионный лактоферрин», «лактоферрин, насыщенный ионами металла», «металло-ионный фрагмент лактоферрина» и «фрагмент лактоферрина, насыщенный ионами металла» относятся к популяции пептидов лактоферрина или фрагментам, которые предоставляют совокупность карманов, связывающих ионы металла, в которой, по меньшей мере, приблизительно 25% карманов, связывающих ионы металла, представленных в популяции, имеют связанный ион металла. Нужно понимать, что популяция может содержать полипептиды различных видов, например, у некоторых связывающих молекул отсутствует ион, а другие связывают один или два каждая. В случае использования различных ионов металла, некоторые молекулы могут связывать ион металла, выбранный, например, из группы, содержащей ионы алюминия, висмута, меди, хрома, кобальта, золота, железа, марганца, осмия, платины, рутения, цинка или другие ионы, которые будут определенным образом координированы в кармане лактоферрина, связывающем ионы металла, а другие молекулы могут связывать отличный ион. В некоторых случаях, популяция может содержать полипептиды, вовлеченные в неспецифическое ионное связывание, в котором один или более ионов, предпочтительно ионов металла, связаны с пептидом неспецифическим образом, т.е. не связаны в ион-связывающем кармане. Неограничивающие примеры ионов, которые могут быть связаны с пептидами лактоферрина неспецифическим образом, представляют собой кальций и селен. Можно достичь различных степеней насыщения и степень насыщения может быть определена спектрофотометрическим анализом известными способами (см., например, опубликованную международную патентную заявку WO 2007/043900, включенную в настоящее описание ссылкой). В одном варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 и 100% карманов, связывающих ион металла, представленных в популяции молекул лактоферрина, имеют связанный ион металла, и подходящие интервалы могут быть выбраны между любыми из вышеуказанных величин (например, от приблизительно 5 до приблизительно 100%, от приблизительно 10 до приблизительно 100%, от приблизительно 15 до приблизительно 100%, от приблизительно 20 до приблизительно 100%, от приблизительно 25 до приблизительно 100%, от приблизительно 30 до приблизительно 100%, от приблизительно 35 до приблизительно 100%, от приблизительно 40 до приблизительно 100%, от приблизительно 45 до приблизительно 100%, от приблизительно 50 до приблизительно 100%, от приблизительно 55 до приблизительно 100%, от приблизительно 60 до приблизительно 100%, от приблизительно 65 до приблизительно 100%, от приблизительно 70 до приблизительно 100%, от приблизительно 75 до приблизительно 100%, от приблизительно 80 до приблизительно 100%, от приблизительно 85 до приблизительно 100%, от приблизительно 90 до приблизительно 100%, от приблизительно 95 до приблизительно 100%, и от приблизительно 99 до приблизительно 100%).

Термин «молочный жир» включает липиды молока млекопитающего и фракции липидов, гидролизаты липидов и липидные фракции гидрализатов. В некоторых вариантах осуществления, молочный жир может быть жиром молока любых млекопитающих, включая, но не ограничиваясь перечисленным, жир молока овцы, козы, свиньи, мыши, буйвола, верблюда, яка, лошади, осла, ламы или коровы, жир коровьего молока является предпочтительным. Предпочтительные молочные жиры представляют собой молочные жиры, в частности, жиры коровьего молока. Предпочтительный жир коровьего молока содержит одну или более из пальмитиновой кислоты, олеиновой кислоты, стеариновой кислоты, или миристиновой кислоты, как наиболее распространенных жирных кислот, предпочтительно наиболее часто встречаются пальмитиновая, олеиновая и миристиновая кислоты. В отдельных предпочтительных вариантах осуществления, жир коровьего молока, такой как сливки или AMF, например, имеют а) в основном такое же процентное соотношение масс. пальмитиновой кислоты, как в обычном коровьем молочном жире (приблизительно от 23% (масс./масс.) и до приблизительно 32% (масс./масс.), как правило приблизительно 28% (масс./масс.) см. таблицу 1.2, PF Fox и PLH McSweeney eds, Advanced Dairy Chemistry Volum 2-Lipids, 3rd Ed, Springer NY, NY (2006) ISBN-10:0-387-26364-0); b) в основном такое же процентное соотношение масс. олеиновой кислоты, как в обычном коровьем молочном жире (приблизительно от 15% (масс./масс.) и до приблизительно 22% (масс./масс.), как правило приблизительно 17% (масс./масс.) см. там же в Fox и McSweeney; с) в основном такое же процентное соотношение масс. стеариновой кислоты, как в обычном коровьем молочном жире (приблизительно от 10% (масс./масс.) и до приблизительно 15% (масс./масс.), обычно приблизительно 12% (масс./масс.) см. там же в Fox и McSweeney; d) в основном такое же процентное соотношение масс. миристиновой кислоты, как в обычном коровьем молочном жире (приблизительно от 9% (масс./масс.) и до приблизительно 12% (масс./масс.), обычно приблизительно 11% (масс./масс.) см. там же в Fox и McSweeney; е) любые два из указанных выше а), b), с) или d); f) любые три из перечисленных выше а), b), с) или d); g)каждую из указанных выше а), b), с) или d). Предпочтителен безводный жир коровьего молока (AMF), в частности, AMF, имеющий по существу тот же процент масс. композиции пальмитиновой, олеиновой и стеариновой кислоты, как и в обычном жире коровьего молока, более предпочтительна по существу такая же композиция жирных кислот, как и в обычном жире коровьего молока (см. там же в Fox и McSweeney). Предпочтительные фракции жира коровьего молока также включают сливки, масло, безводный жир коровьего молока (AMF) (обычно получают инверсией фазы сливок или дегидратацией масла), пахту, сыворотку масла, бета-сыворотку, фракции твердых молочных жиров с одной или более стадий фракционирования (включая Н, SH и SSH фракции), фракции мягких молочных жиров с одной или более стадий фракционирования (включая S, SS и SSS фракции), сочетания фракций твердых молочных жиров, сочетания фракций мягких молочных жиров, сочетания фракций твердых молочных жиров и фракций мягких молочных жиров, фракции сфинголипидов, обогащенных липидами глобулярных мембранных фракций жира коровьего молока (включая например сфинголипиды, керамиды и цереброзиды), фракции фосфолипидов, и комплексные липидные фракции или какие-либо сочетания каких-либо двух или более из них, и их гидролизаты, и фракции гидролизатов, и сочетания гидролизованных и/или негидролизованных фракций. Предпочтительно, жир коровьего молока содержит, по меньшей мере, приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% липидов, и приемлемые интервалы могут быть выбраны из интервалов между любыми из перечисленных значений (например, от приблизительно 60 до приблизительно 100%, от приблизительно 70 до приблизительно 100%, от приблизительно от приблизительно 80 до приблизительно 100%, от приблизительно 85 до приблизительно 100%, от приблизительно 90 до приблизительно 100%, от приблизительно 95 до приблизительно 100%, от приблизительно 96 до приблизительно 100%, от приблизительно 97 до приблизительно 100%, от приблизительно 98 до приблизительно 100%, и от приблизительно 99 до приблизительно 100%, предпочтительно от приблизительно 40% или более до приблизительно 100%).

Термин «пероральное введение» включает оральное, буккальное, энтеральное и внутрижелудочное введение.

Термин «парентеральное введение» включает, но не ограничивается перечисленным, местное (включая введение через кожную, эпидермальную или слизистую поверхность), подкожное, внутривенное, внутрибрюшинное и внутримышечное введение.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» предназначен относиться к носителю, включая, но не ограничиваясь перечисленным, эксципиент, разбавитель или вспомогательное вещество, или их сочетание, который может быть введен субъекту в качестве компонента композиции, описываемой в настоящей заявке, который не уменьшает активность композиции и не токсичен при введении в дозах, достаточных для доставки эффективного количества соединения или композиции, применяемой в настоящем изобретении. Композиции могут быть введены перорально, назально или парентерально (включая местно, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно и внутривенно).

«Субъект» представляет собой животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно, млекопитающее домашнее животное или человека. Предпочтительные домашние животные включают кошек, собак и лошадей. В одном варианте осуществления, человек представляет собой взрослого, ребенка или новорожденного или взрослого, ребенка или новорожденного с ослабленной иммунной системой.

Термин «лечить» и его производные должен быть интерпретирован в наиболее широком смысле. Термин не должен подразумевать, что субъект подвергается лечению до полного выздоровления. Соответственно, «лечить» в широком смысле включает смягчение и/или предупреждение появления симптомов или тяжести отдельного состояния.

2. Молочный жир молока и фракционирование молочного жира

Молочный жир всесторонне обсуждается Fox и McSweeney (2006), таким образом, включенной ссылкой в настоящее описание. В добавление к липидам, молочный жир содержит витамины, стерины и второстепенные компоненты. См., Chapter 1, Composition and Structure of Bovine Milk Lipids, Fox и McSweeney, в отношении описания жира натурального коровьего молока. Фракционирование молочного жира обсуждается в Dairy Processing Handbook, 1995, и Illingworth, 2002, и Rombaut et al., 2006(b), все перечисленные документы включены в настоящее описание ссылкой. Сезонные различия молочного жира обсуждаются Fox и McSweeney (2006).

Примеры фракций молочного жира, соответствующих изобретению, включают сливки (обычно приблизительно от 20 до приблизительно 40% масс. жира, предпочтительно приблизительно 40% масс. жира), масло, топленое масло, безводный жир коровьего молока (AMF) (обычно полученный инверсией фазы сливок или дегидратацией масла), пахту, сыворотку масла, бета-сыворотку, фракции твердого молочного жира, фракции мягкого молочного жира, фракции сфинголипидов, глобулярные мембранные фракции молочного жира, глобулярные мембранные липидные фракции молочного жира, фракции фосфолипидов, и комплексных липидных фракций (липиды, выход продукта гидролиза которых 3 или больше типов на молекулу), и их сочетания, и их гидролизаты.

Пахта, сыворотка масла и бета-сыворотка обсуждаются, например, Bylund, 1995, Rombaut et al, 2005, Rombaut et al, 2006(а), Rombaut et al, 2006(b), и опубликованы международной заявкой WO 2006/041316, все перечисленные документы включены в настоящее описание ссылкой. Пахта является термином, используемым для описания водной липидной фазы, полученной общепринятым производством масла, используя способ изготовления масла, который может быть периодическим (сбивание масла) способом или непрерывным способом (Fritz). Пахта является также термином, используемым для описания водного побочного продукта, получаемого на стадии концентрирования сливок общепринятого способа получения AMF из сливок. Данный общепринятый способ включает концентрирование при инверсии фазы сливок для получения масла, которое дополнительно концентрируют и рафинируют для получения AMF. Наконец, пахта также является термином, используемым для описания сочетания обрата и бета-сыворотки, побочных продуктов двух-сывороточного способа для получения AMF, см., например, Bylund (изд.1995) и опубликованную международную заявку WO 2006/041316 (см. фиг.2), которые подробно описывают указанный способ. В данном двух-сывороточном способе, побочный продукт со стадии концентрирования сливок дополнительно выделяют для получения вторичного обрата, а побочный продукт со стадии концентрирования масла дополнительно выделяют для производства бета-сыворотки. В первых двух примерах, пахту получают после любой инверсии фазы. В третьем примере, пахта представляет собой сочетание вторичного обрата после инверсии фазы и бета-сыворотки, полученной после инверсии фазы. Концентрирование и рафинирование в приведенных способах обычно достигают центрифугированием. Инверсию фазы обычно достигают гомогенизацией. Очевидно, что источником перечисленных липидных фракций может быть молоко, или молозиво, или их сочетание.

Подходящие исходные материалы для фракционирования включают сливки, AMF, пахту, сыворотку масла или бета-сыворотку, из молока или молозива, или их сочетание.

Многостадийное фракционирование молочного жира можно осуществить дифференциальной кристаллизацией. Фракции молочного жира нагревают до установленной температуры и кристаллизованную или твердую («стеарин» является твердой фракцией) и жидкую («олеин» является мягкой фракцией) фракции разделяют. Многостадийное фракционирование относится к повторному фракционированию на последующей стадии продукта, полученного на предыдущей стадии фракционирования. Промежуточные мягкие фракции могут быть получены фракционированием исходных мягких фракций в мягкие и твердые суб-фракции.

Другие способы фракционирования включают инверсию фазы, переэтерификацию, глицеролиз, сольвентное фракционирование (такое как этаноловое, водное или ацетоновое, используемые по отдельности или последовательно), надкритическое фракционирование (см. например, Astaire et al, 2003), околокритическое фракционирование (см. например WO 2004/066744), дистилляцию, центрифужное фракционирование, прерывистую кристаллизацию, сухую кристаллизацию, фракционирование с модификатором (например, мылами или эмульгаторами), ультрафильтрацию, микрофильтрацию и любой способ фракционирования жира, известный в области техники, и их сочетания, известные в области техники.

В одном варианте осуществления, способ фракционирования выбран из сольвентного фракционирования сливок, AMF, пахты или бета-сыворотки, используя этанол, воду или ацетон последовательно или по отдельности.

Жиры, представленные в композиции изобретения, могут быть полностью или частично модифицированы, или естественно, химически, ферментативно, или какими-либо другими способами, известными в области техники, включая, например, способы гликозилирования, сиалилирования, этерификации, фосфолирирования или гидролиза. Жировые гидролизаты могут быть получены, используя известные методики, включая, но не ограничиваясь перечисленным, кислый гидролиз, щелочной гидролиз, ферментативный гидролиз, используя липазу, например, как описано в Fox и McSweeney ((2006), Chapter 15 HC Deeth and Fitz-Gerald), и микробный гидролиз. Один способ основного гидролиза включает добавление 1% KOH (в этаноле) и нагревание в течение 10 минут. Гидролизованный материал может быть нейтрализован уксусной кислотой или соляной кислотой.

Глобулярный мембранный материал жира коровьего молока может быть выделен способом ацидификации Kanno&Dong-Hyun, 1990, и дополнительно разделен на липидные и белковые фракции добавлением метанола, как описано Kanno et al., 1975. Фосфолипидные фракции могут быть выделены экстрагированием липидной смеси ацетоном в соответствии с методикой Purthi et al., 1970. Липидный остаток может быть дополнительно обогащен глобулярными мембранными липидами жира коровьего молока селективным экстрагированием неполярных липидов пентаном.

Способы фракционирования, успешные для получения фракций жира коровьего молока, использованные в настоящем изобретении, также описаны в опубликованных патентных заявках WO 2006/041316, WO 2007/123424 и WO 2007/123425.

Отдельные предпочтительные фракции молочного жира, использованные в настоящем изобретении, описаны в примерах, приведенных далее, и суммированы в таблицах. Указанные фракции могут быть эмульсиями или сухими, и могут быть порошками, для улучшения текучести могут быть добавлены необязательные компоненты, включающие текучие вспомогательные вещества, такие как лактоза.

3. Композиции, используемые в соответствии с изобретением

Композиции, применяющиеся в настоящем изобретении, могут быть разработаны в виде пищи, напитка, пищевой добавки, питьевой добавки, добавки к рациону, пищевого продукта, лечебного питания, продукта для энтерального или парентерального питания, заместительного питания, косметического или фармацевтического. Соответствующие композиции могут быть получены специалистами в области техники с соблюдением практических навыков и теоретических основ настоящего описания.

В одном варианте осуществления, композиции, использующиеся в настоящем изобретении, включают любой съедобный продукт, способный переносить липид. Примеры годных в пищу продуктов включают порошки, жидкости, кондитерские продукты, включая шоколад, гель, мороженое, восстановленные фруктовые продукты, закуски, пищевые продукты, мюсли, пищевые продукты пастообразной консистенции, соусы, подливки, молочные продукты, включая йогурты и сыры, напитки, включая молочные и безмолочные напитки (такие как молочные напитки и питьевые йогурты), сухое молоко, добавки для спортивного питания, включая молочные и безмолочные добавки для спортивного питания, фруктовый сок, пищевые добавки, такие как белковые обсыпки, добавки для диетического питания, такие как добавки в виде таблеток для ежедневного употребления, заменители грудного молока и йогурты, и детские смеси, такие как молочная смесь для новорожденных, молочная смесь для детей старше или молочная смесь для детей еще старше, в порошке или в форме жидкости. В рамках данного варианта осуществления, предпочтительной композицией, использованной в настоящем изобретении, может быть, молочная смесь для новорожденных, молочная смесь для детей старше или молочная смесь для детей еще старше, в порошке или в форме жидкости. Подходящие питательные композиции, использованные в данном изобретении, могут быть предоставлены в похожих формах.

Примеры детских молочных смесей, таких как молочная смесь для новорожденных, молочная смесь для детей старше или молочная смесь для детей еще старше, в порошке или в форме жидкости, включают приведенные далее примеры. Один пример молочной смеси для новорожденных, молочной смеси для детей старше или молочной смеси для детей еще старше, использованный в настоящем изобретении, содержит (масс./масс.)

(а) 30-60% лактозы

(b) 15-35% растительных масел

(с) 0-40% сухого снятого молока

(d) 0-40% белка молочной сыворотки, такого как WPC или WPI, предпочтительно 80% WPC (WPC 80)

(е) 1-50% вещества, используемого в настоящем изобретении.

Другой пример молочной смеси для новорожденных, молочной смеси для детей старше или молочной смеси для детей еще старше, использованный в настоящем изобретении, содержит (масс./масс.)

(а) 40-60% лактозы

(b) 20-30% растительных масел

(с) 10-15% сухого снятого молока

(d) 6-8% белка молочной сыворотки, предпочтительно WPC 80

(е) 1-10% вещества, используемого в настоящем изобретении.

Другой пример молочной смеси для новорожденных, молочной смеси для детей старше или молочной смеси для детей еще старше, использованный в настоящем изобретении, содержит (масс./масс.)

(а) 40-60% лактозы

(b) 20-30% растительных масел

(с) 10-15% сухого снятого молока

(d) 6-8% белка молочной сыворотки, предпочтительно WPC 80

(е) 1-5% вещества, используемого в настоящем изобретении.

Другой пример молочной смеси для новорожденных, молочной смеси для детей старше или молочной смеси для детей еще старше, использованный в настоящем изобретении, содержит (масс./масс.)

(а) 40-60% лактозы

(b) 20-30% растительных масел

(с) 10-15% сухого снятого молока

(d) 6-8% белка молочной сыворотки, предпочтительно WPC 80

(е) 2-5% вещества, используемого в настоящем изобретении.

Другой пример молочной смеси для новорожденных, молочной смеси для детей старше или молочной смеси для детей еще старше, использованный в настоящем изобретении, содержит (масс./масс.)

(а) 30-60% лактозы

(b) 15-35% растительных масел

(с) 0-40% сухого снятого молока

(d) 0-40% белка молочной сыворотки, предпочтительно WPC 80

(е) 1-5% вещества, используемого в настоящем изобретении, такого как сухая бета-сыворотка или ее фракции, такие как фракция, полученная из бета-сыворотки, обогащенная полярными липидами или обедненная нейтральными липидами, или и та, и другая.

Другой пример молочной смеси для новорожденных, молочной смеси для детей старше, или молочной смеси для детей еще старше, использованный в настоящем изобретении, содержит (масс./масс.)

(а) 40-60% лактозы

(b) 20-30% растительных масел

(с) 10-15% сухого снятого молока

(d) 6-8% белка молочной сыворотки, предпочтительно WPC 80

(е) 1-5% вещества, используемого в настоящем изобретении, такого как сухая бета-сыворотка или ее фракции, такие как фракция, полученная из бета-сыворотки, обогащенная полярными липидами или обедненная нейтральными липидами, или и та, и другая.

Любая из перечисленных детских молочных смесей также содержит от 0,1 до 4% масс./масс., предпочтительно от 2 до 4% масс./масс., одного или более витаминных премиксов, минеральных премиксов, лецитина, одного или более антиоксидантов, одного или более стабилизаторов, или одного или более нуклеотидов, или сочетания любых двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления, указанные детские молочные смеси могут быть разработаны так, чтобы предоставлять от 2700 до 3000 кДж/л.

В альтернативных вариантах осуществления, композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть разработаны для того, чтобы допускать введение субъекту каким-либо выбранным путем, включая, но не ограничиваясь перечисленным, пероральное или парентеральное (включая местное, подкожное, внутримышечное и внутривенное) введение.

Таким образом, фармацевтическая композиция, используемая в соответствии с изобретением, может быть сформована с соответствующим фармацевтически приемлемым носителем (включая эксципиенты, разбавители, вспомогательные вещества и их сочетания), выбранным с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практикой. Например, композиция, применяемая в соответствии с изобретением, может быть введена перорально в виде порошка, жидкости, таблетки или капсулы, или местно в виде мази, крема или лосьона. Приемлемые композиции могут содержать дополнительные вещества, при необходимости, включая эмульгаторы, антиоксиданты, отдушки и красители, и могут быть приспособлены для немедленного, отсроченного, модифицированного, непрерывного, импульсного или контролированного высвобождения.

Капсулы могут содержать любые стандартные фармацевтически приемлемые вещества, такие как желатин или целлюлозу. Таблетки могут быть сформованы в соответствии с общепринятыми способами прессованием смесей активных ингредиентов с твердым носителем и лубрикантом. Примеры твердых носителей включают крахмал и сахарный бентонит. Активные ингредиенты могут быть также введены в форме твердой таблетки в оболочке или капсулы, содержащей связывающее вещество, например, лактозу или маннит, общепринятый наполнитель и таблетирующее вещество. Фармацевтические композиции могут быть также введены парентеральным путем. Примеры парентеральных лекарственных форм включают водные растворы, физиологический раствор или 5% глюкозу или другие хорошо известные фармацевтически приемлемые эксципиенты. Циклодекстрины или другие растворяющие вещества, хорошо известные в области техники, могут быть использованы в качестве фармацевтических эксципиентов для доставки лекарственного средства.

Эффективность композиции, используемой в соответствии с изобретением, может быть оценена и in vivo и in vitro. См., например, примеры, помещенные далее. Кратко, композиция может быть протестирована в отношении ее способности подавлять ротавирусную инфекцию in vitro. Для исследований in vivo композицию можно скормить или ввести инъекцией животному (например, мыши) и затем оценить ее влияние на вирусную инфекцию. Исходя из результатов, может быть определен соответствующий диапазон доз и путь введения.

Композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть использованы по отдельности или в сочетании с одним или более другими лечебными средствами. Лечебное средство может быть пищей, напитком, пищевой добавкой, питьевой добавкой, пищевым компонентом, питьевым компонентом, диетической добавкой, питательным продуктом, лечебным питанием, питательным, лечебным или фармацевтическим средством. Лечебное средство предпочтительно эффективно для ослабления одного или более симптомов ротавирусной инфекции.

При использовании композиции в сочетании с другим лекарственным средством, введение композиции, используемой в настоящем изобретении, и другого лекарственного средства может быть одновременным или последовательным. Одновременное введение включает введение монолитной лекарственной формы, которая содержит все компоненты, или введение отдельных лекарственных форм, по существу, в одно и то же время. Последовательное введение включает введение в соответствии с различными схемами, предпочтительно так, чтобы частично совпадали периоды, во время которых предоставлены композиция, используемая в настоящем изобретении, и другое лекарственное средство.

Подходящие вещества, с которыми композиция, используемая в настоящем изобретении, может быть введена совместно, включают противовирусные средства, теафлавины, ингибиторы протеаз, иммуноглобулин яичного желтка, синтетический сульфатированный сиалиллипид NMSO₃, лактатгерин человеческого молока (гликопротеин молочно-жировой глобулярной мембраны), MUC1 муцин, макроглобулярную белковую фракцию сыворотки коровьего молока, и их сочетания, и другие подходящие вещества, известные в области техники.

В одном варианте осуществления, композиция, используемая в настоящем изобретении, включает или вводится одновременно или последовательно с компонентами молока, такими как сывороточный белок, фракции сывороточного белка (включая фракции кислых или основных сывороточных белков или их сочетания), гликомакропептид, лактоферрин, железо-лактоферрин, функциональный вариант лактоферрина, функциональный фрагмент лактоферрина, витамин D или кальций, или их сочетания. Успешные композиции, содержащие молоко в качестве компонента, включают композиции, такие как пища, напиток, пищевая добавка, питьевая добавка, питательный продукт, лечебное питание или нутрицевтик. Могут также применяться фракции молока, обогащенные перечисленными компонентами. Успешные лактоферрины, фрагменты и композиции описаны в международных патентных заявках WO 03/082921 и WO 2007/043900, обе включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Должно быть понятно, что дополнительные лекарственные средства, перечисленные выше (и пищевые и фармацевтические средства), также могут применяться в способе, соответствующем изобретению, в котором их вводят раздельно, одновременно или последовательно с композицией, используемой в настоящем изобретении.

Необходимо принять во внимание, что доза вводимой композиции, период введения и общий режим введения могут различаться среди субъектов, в зависимости от таких показателей, как тяжесть симптомов у субъекта, тип расстройства, которое подвергают терапии, выбранный способ введения, и возраст, пол и/или состояние здоровья субъекта. Однако, в виде общего примера, авторы изобретения рассматривают введение приблизительно от 1 мг до приблизительно 1000 мг на кг массы тела композиции, используемой в настоящем изобретении, вводимой в сутки, предпочтительно, от приблизительно 50 до 500 мг на кг в сутки, альтернативно от приблизительно 150 до 410 мг/кг/сутки или от приблизительно 110 до приблизительно 310 мг/кг/сутки. В еще одном варианте осуществления, авторы изобретения рассматривают введение приблизительно от 0,05 мг до приблизительно 250 мг на кг массы тела композиции, используемой в настоящем изобретении.

Следует обратить внимание, что введение может включать однократную суточную дозировку или введение ряда отдельных доз, как может подходить.

Различные аспекты изобретения будут иллюстрированы не ограничивающим образом ссылками на нижеприведенные примеры.

ПРИМЕРЫ

Исследование образца

Уровни белка определяют умножением общего азота на 6,38. Уровни фосфолипидов определяют ³¹P ЯМР. Уровни ганглиозидов определяют как указано далее. В трех повторностях приблизительно 0,1 г порошка взвешивают в 16-мл кимаксовых пробирках и массу регистрируют. 6 мл метанола добавляют и смешивают при интенсивном перемешивании в течение 1 минуты. Раствор инкубируют при 50ºС в течение 10 мин, затем добавляют 6 мл воды и интенсивно перемешивают. Раствору дают отстояться в течение 2 часов при 4ºС и образец берут и пропускают через 0,45 мкм фильтр. Образец подвергают анализу ВЭЖХ. Используют колонку Cosmosil™ 5NH2-MS waters (Nacalai Tesque, Inc., США) с NH₂ защитой (Phenomenex ™ AJO-4302 в держателе Phenomenex ™ KJO-4282). Защитный картридж заменяют каждый день исследования. Инъекции образца вводят в колонку инъекционно и элюируют при скорости потока 2 мл/мин, используя растворитель А (90% ацетонитрила, 5% воды и 5% 5 мМ фосфатного буфера рН 5,6) и растворитель В (50% ацетонитрила, 45% воды и 5% 200 мМ фосфатного буфера рН 5,6). Используют следующий ингредиент: 100% А в течение 3,5 мин, затем от 100% А до 55% А на протяжении 26,5 мин, затем от 55% А до 100% А на протяжении 1 мин и затем 100% А в течение 5 мин (Wagener et al (1996), Journal of Lipid Research 37, 1823-1829). Внешнюю калибровочную кривую 0-2 мкг GD3 создают, используя пахту GD3 (Matreya # 1504). Элюирование мониторировали при 203 нм.

Композиции липидов и других молочных материалов

Фракции молочного жира (включая бета-сыворотку), лактоферрин, молочный экстракт Sialyl Oligolac™ и глобулярные мембранные вещества молочного жира (MFGM) предоставлены Fonterra Co-operative Group Limited (Новая Зеландия). Молочный экстракт Sialyl Oligolac™ представляет собой высушенный распылением порошок, полученный из молозива, содержащий высокие уровни природных молочных олигосахаридов, минералов и свободных и связанных с углеводородами сиаловых кислот (белок (как есть) 8,7%, лактоза 61,7%, влажность 3,9%, жир 0,08%, зольный остаток 18,9%, свободная сиаловая кислота 2,5 мг/г, связанная сиаловая кислота 9,3 мг/г). Sialyl Oligolac™ содержит 3'сиалиллактозу и дисиалиллактозу, которая представляет собой свободную форму гликана из ганглиозидов GM3 и GD3, соответственно. Белковые фракции MFGM и MFGM в таблице 9 получают в соответствии с известными способами из новозеландского молочного жира.

AMF и фракции AMF

AMF, твердые фракции AMF (SH и SSH) и мягкие фракции AMF (SSS) предоставлены Fonterra Co-operative Group Limited, как описано выше.

Жир коровьего молока с высоким содержанием CLA содержит 5,4% CLA, получают кормлением коров рыбьим жиром и подсолнечным маслом в соответствии с известными способами, и затем получают безводный жир коровьего молока из полученного молока. Типичная композиция жира коровьего молока, обогащенного CLA, описана в опубликованной международной PCT заявке WO 2005/107736, которая включена в настоящее описание ссылкой.

Фракции фосфолипидов

Фракции с 7 по 11, описанные в таблице 7, помещенной выше, и использованные в примерах, приведенных далее, получают в соответствии со способами, описанными в опубликованной международной патентной заявке WO 2006/041316 (см. примеры с 3 до 6). Фракцию 12 получают надкритической углекислотной экстракцией фракции фосфолипидов 10 в таблице 7. Фракцию 15 получают этаноловой экстракцией сухой бета-сыворотки.

Фракцию фосфолипидов Phospholipid Concentrate РС500^тм (продаваемый Fonterra Co-operative Group Limited, Новая Зеландия) получают этаноловой экстракцией сухой бета-сыворотки. Бета-сыворотка представляет собой жидкую фазу, полученную во время производства AMF. Фракция фосфолипидов PC500™ представляет собой высушенный распылением концентрат молочного фосфолипида с типичной композицией 77-95% липидов в совокупности, из них приблизительно 50% нейтральных липидов и приблизительно 30% полярных липидов; и типичная липидная композиция 1,5%-5% фосфатидилсерина, 12-18% фосфатидилхолина, 6-9% фосфатидилэтаноламина и 6,7-9% сфингомиелина; и типичная композиция жирных кислот: масляная кислота (4:0) 1,8%, каприловая кислота (10:0) 0,3%, лауриновая кислота (12:0) 0,5%, миристиновая кислота (14:0) 7,4%, миристолеиновая кислота (14:1) 14,1%, пентадекановая кислота (15:0) 1,0%, пальмитиновая кислота (16:0) 26,0%, пальмитолеиновая кислота (16:1) 1,7%, маргариновая кислота (17:0) 0,6%, гептадеценовая кислота (17:1) 0,3%, стеариновая кислота (18:0) 11,9%, олеиновая кислота (18:1) 39,0%, линолевая кислота (18:2) 5,0%, линоленовая (18:3) 2,0%, арахидоновая кислота (20:0)0,3% и холестерин 0,8%.

Фракцию фосфолипидов Phospholipid Concentrate РС600™ (продаваемый Fonterra Co-operative Group Limited, Новая Зеландия) получают ацетоновой экстракцией из фракции фосфолипидов PC500™. Фракция фосфолипидов PC600™ представляет собой высушенный замораживанием молочный фосфолипидный концентрат с типичной композицией 75% полярных липидов и 8,0% нейтральных липидов, <12% зольного остатка и <4% влажность; и типичная липидная композиция 3-4% фосфатидилсерина, >36% фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина >9% и сфингомиелина >18%; и типичная композиция жирных кислот: миристиновая кислота (14:0) 6,6%, пальмитиновая кислота (16:0) 27,1%, пальмитолеиновая кислота (16:1) 1,3%, маргариновая кислота (17:0) 2,3%, стеариновая кислота (18:0) 14%, олеиновая кислота (18:1) 38,2%, линолевая кислота (18:2) 6,5%, линоленовая (18:3) 2%, холестерин 0,1% и другие 2%.

Фракцию фосфолипидов Phospholipid Concentrate РС700™ (продаваемый Fonterra Co-operative Group Limited, Новая Зеландия) получают водной экстракцией (рафинирование гидратацией) из фракции фосфолипидов PC500™. Фракция фосфолипидов PC700™ представляет собой высушенный замораживанием молочный фосфолипидный концентрат с типичной композицией 85% липидов, 10% зольного остатка, 2% лактозы и 2,5% влажности; и типичная липидная композиция 3% фосфатидилсерина, фосфатидилхолина 31%, фосфатидилэтаноламина 8,7% и сфингомиелина 16,5%; и типичная композиция жирных кислот: миристиновая кислота (14:0) 5,4%, пальмитиновая кислота (16:0) 20,9%, пальмитолеиновая кислота (16:1) 1,3%, маргариновая кислота (17:0) 0,5%, стеариновая кислота (18:0) 10,5%, олеиновая кислота (18:1) 30,5%, линолевая кислота (18:2) 4,3%, линоленовая кислота (18:3) 1,8% и арахидоновая кислота 0,5%.

Фракции ганглиозидов

Фракции с 7 по 11, описанные в таблице 7, помещенной выше, и использованные в примерах, приведенных далее, получают в соответствии со способами, описанными в опубликованной международной патентной заявке WO 2006/041316 (см. примеры с 3 до 6). Фракцию 12 получают надкритической углекислотной экстракцией фракции фосфолипидов 10 в таблице 7. Фракцию 15 получают этаноловой экстракцией сухой бета-сыворотки.

Фракции ганглиозидов G500™ и G600™ (продаваемые Fonterra Co-operative Group Limited, Новая Зеландия) получают этаноловой экстракцией сухой бета-сыворотки. Бета-сыворотка представляет собой жидкую фазу, полученную во время производства AMF.

Фракция ганглиозидов G500™ представляет собой высушенный распылением концентрат ганглиозидов молока, к которому добавляют лактозу и WPC (концентрат сывороточных белков) для улучшения текучести порошка. Фракция ганглиозидов G500™ имеет типичную композицию липидов 34,0%, влажность 3,2%, зольный остаток 5,0% и лактозу 56,0%; типичная липидная композиция ганглиозид GD3 0,6% и ганглиозид GM3 0,5%; и типичная композиция жирных кислот: миристиновая кислота (14:0) 5,6%, пальмитиновая кислота (16:0) 18,4%, пальмитолеиновая кислота (16:1) 1,2%, маргариновая кислота (17:0) 0,5%, стеариновая кислота (18:0) 14,9%, олеиновая кислота (18:1) 31,0%, линолевая кислота (18:2) 3,8%, линоленовая кислота (18:3) 1,5% и арахидоновая кислота (20:4) 0,5%.

Фракция ганглиозидов G600™ представляет собой высушенный распылением концентрат ганглиозидов молока, к которому добавляют лактозу для улучшения текучести порошка. Фракция ганглиозидов G600™ имеет типичную композицию липидов 30,0%, влажность 3,5%, зольный остаток 8,3% и лактозу 58,0%; типичная липидная композиция: ганглиозид GD3 1,4% и ганглиозид GM3 0,3%, фосфатидилсерин 4,5%, фосфатидилхолин 5,1%, фосфатидилэтаноламин 2,0% и сфингомиелин 1,7%; и типичная композиция жирных кислот: миристиновая кислота (14:0) 4,7%, пальмитиновая кислота (16:0) 16,4%, пальмитолеиновая кислота (16:1) 1,2%, маргариновая кислота (17:0) 0,5%, стеариновая кислота (18:0) 17,0%, олеиновая кислота (18:1) 33,4%, линолевая кислота (18:2) 4,2%, линоленовая кислота (18:3) 1,4% и арахидоновая кислота (20:4) 0,6%.

Гидролизаты липидов

Частичную сапонификацию достигают добавлением 800 мкл гидроксида калия (1,5% в этаноле) к 200 мг образца липидной композиции. Полученный раствор смешивают в течение 10 минут и нейтрализуют до рН 7 соляной кислотой (10%). Затем раствор продувают и сушат газообразным азотом.

Клеточные культуры, репродукция вирусов и исследуемые материалы

Все материалы клеточной культуры приобретают из Invitrogen. Штамм ротавируса Wa (человека) подарен John Taylor, Университет Окленда. HT29 клетки приобретают из ATCC (НВТ-38). Моносиалоганглиозид GM3 cat#1503 и ганглиозид GD3 cat#1504 приобретают из Matreya (Pleasant Gap, РА, США).

Репродукция вирусов

Для репродукции штамма ротавируса Wa человека (устойчивый к нейраминидазе) используют клеточную линию HT29 в присутствии 1 мкг/мл трипсина в минимальной поддерживающей среде Dulbecco (DMEM), дополненной 10% фетальной сывороткой и пенициллином/стрептомицином (100 мкг/мл/100 единиц/мл). Ротавирус получают способом замораживая-оттаивания дважды, центрифугируют при 750 G для удаления клеточного дебриса и хранят при -80ºС. Исследуют ротавирус и находят для содержимого 1×106 бляшкообразующие единицы (БОЕ)/мл.

Использованный анализ инфекционности основан на ряде опубликованных исследований (Scott et al. 1979; Smith et al. 1979, Guariano et al. 1996; Supetti et al. 2001). Конфлюэнтные НТ29 клетки, выращенные в DMEM (посев производят 3×105/мл в 96 ячейковой планшете), промывают дважды в стерильном PBS. Отобранные двойные разведения каждого из продуктов (минимальная концентрация 5 мг/мл) выполняют в планшете в объемах DMEM 50 мкл. Добавляют вирус (104 БОЕ/ячейка) ко всем ячейкам за исключением контрольных клеток, и затем планшеты инкубируют в течение двух часов в 5% СО₂ при 37ºС. Другие контрольные материалы включают вирус плюс клетки, только липиды, беспримесный GM3 и беспримесный GD3. После двухчасового инкубирования добавляют трипсин ко всем ячейкам, содержащим вирус, в концентрации 2 мкг/мл; на данном этапе расщепляют VP4 до полипептидов VP8 и VP5, что необходимо для проникновения вириона во внутрь клеток. Планшеты инкубируют при 37ºС в 5% СО₂ в течение семи дней и ежедневно проверяют в отношении цитопатического действия вируса только контрольные ячейки. Среду удаляют и планшеты промывают стерильным PBS, сушат воздухом и фиксируют этанолом в течение 1 минуты. Планшеты сушат воздухом, затем окрашивают 1% кристаллическим фиолетовым (351884W, BDH, Англия) 100 мкл/ячейка в течение 5 минут. Планшеты промывают четыре раза стерильной водой для удаления излишков красителя. Добавляют 100 мкл уксусной кислоты на ячейку для растворения красителя и считывают показатели абсорбции при длине волн 595 нм в планшете-ридере Biorad ELISA. Каждый образец исследуют, минимум, в трех раздельных пробах и подсчитывают процент инфицированных клеток.

Статистика

Статистический анализ выполняют, используя критерий Стьюдента, для одной выборки (InStat for MacIntosh) для сравнения влияния липидных продуктов, полученных из коровьего молока, с вирус - только контролем, при самом низком разведении продукта.

ПРИМЕР 1: Молочные липиды подавляют ротавирусную инфекцию in vitro

Шестнадцать липидных тестируемых веществ исследуют в отношении их способности предупреждать ротавирусную инфекцию клеток. Липидные тестируемые вещества или сравнительные вещества не токсичны для НТ29 клеток. Ганглиозиды GD3 и GM3 оба продемонстрировали активность на протяжении диапазонов концентраций (таблица 8). Из шестнадцати липидных тестируемых веществ, четырнадцать продемонстрировали активность в предупреждении ротавирусной инфекции клеток на протяжении диапазонов концентраций (таблица 9).

Пять тестовых веществ достоверно уменьшают процент заражения в концентрации 0,3125 мг/мл при р<0,001 (таблица 9). Данные тестовые вещества представляют собой жир коровьего молока, обогащенный CLA, бета-сыворотку, фосфолипидную фракцию РС700™ и фракции ганглиозидов. Четыре тестовых вещества достоверно уменьшают процент заражения в концентрации 0,3125 мг/мл при р<0,005. Данные тестовые вещества представляют собой AMF, фракцию мягкого молочных жира (SSS) и фракции фосфолипидов РС500™ и РС600™. Три тестовых веществ достоверно уменьшают процент заражения в концентрации 0,3125 мг/мл при р<0,01. Данные тестовые вещества представляют собой другие фракции молочного жира SH и SSH и гидролизированную фракцию ганглиозидов. Оставшиеся продукты недостоверно отличаются от вирус-контроля. Беспримесные образцы GM3 и GD3 защищают клетки от вирусной инфекции в концентрациях низких, как 31,25 мкг/мл(43+/-10% и 40+/-3% соответственно, р<0,005). Исходя из концентрации ганглиозидов, фракция G600™ в десять раз более эффективна, чем беспримесный GD3, при самой низкой концентрации G600™.

ПРИМЕР 2: Молочные липиды могут лечить или предупреждать диарею, вызванную ротавирусной инфекцией

Животная модель детеныша крысы для ротавирусной инфекции человека может быть использована для определения эффективности продуктов in vivo (см. например Ciarlet et al 2006).

Пятидневных детенышей крыс в группах по десять кормят четырьмя различными липидными тестовыми веществами в концентрации 3 г/кг массы тела, доставляя в ротовую полость в объеме 100 мкл. Всю другую пищу они получают с материнским крысиным молоком. На 1 и 2 дни, детенышам крыс дают две дозы по 100 мкл (утром и вечером) штамм ротавирусов человека Wa. Крыс группы негативного контроля прививают 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS), но не вводят вирус. Крыс группы позитивного контроля прививают 100 мкл PBS и затем инъекцией вводят вирус. Эксперимент длится 10 дней, следующие за прививкой ротавирусом. Эксперимент выполняют дважды.

Крыс взвешивают ежедневно для определения процента заражения. Один раз в день собирают отдельные фекальные образцы в предварительно взвешенные контейнеры и определяют диарею. Диарею оценивают ежедневно с 1 по 4, исходя из цвета, консистенции и количества стула, как описано далее.

1. Нормальный стул - нормальный цвет (коричневый) и консистенция.

2. Легкая диарея - цвет не нормальный (зеленый или желто-зеленый), но нормальная консистенция.

3. Умеренная диарея - нормальный цвет (коричневый), но водянистая консистенция.

4. Тяжелая диарея - патологический цвет и водянистая консистенция.

Образцы фекалий обрабатывают в виде 10% раствора в холодном (4ºС) PBS, содержащем пенициллин (200 ед/мл), стрептомицин (200 мкл/мл) и гентамицин (2 мг/мл), и 10 мкл аликвот исследуют в двух экземплярах в клеточной культуре, как описано выше, для определения уровней зараженности ротавирусом. Указанные уровни выражают в виде процента неинфицированных клеток в исследовании in vitro: % неинфицированных клеток=(ОП исследуемого образца)*100/ОП негативного контроля), в котором ОП представляет собой оптическую плотность раствора в ячейке.

Фекальные образцы исследовали в in vitro исследовании ротавирусов для определения процента инфицированных клеток. Различия между подвергнутыми лечению и инфицированным контролем для крыс, получавших питание жиром коровьего молока с высоким содержанием CLA (фиг.1А), достоверны на дни 1 (р<0,001), 3 (р<0,025), 7 (р<0,05) и 8 (р<0,025). Различия между подвергнутыми лечению и инфицированным контролем для крыс, получавших питание фракцией G600™ (фиг.1В), достоверны на дни 3 (р<0,001), 4 (р<0,001), 6 (р=0,001), 7 (р<0,001) и 8 (р=0,001).

ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Настоящее изобретение применяется в лечении и предупреждении ротавирусной инфекции. Описанные композиции могут применяться в качестве пищевых продуктов, напитков, пищевых добавок, питьевых добавок, диетических добавок, диетических продуктов, лечебного питания, нутритивных, лекарственных и фармацевтических средств.

Специалистам в области техники будет понятно, что вышеизложенное описание предоставлено только для иллюстрации и что описание не ограничено им.

ССЫЛКИ

Ainscough, EW, Brodie A, M.; Plowman J E. The chromium, manganese, cobalt and copper complexes of human lactoferrin. Inorganica Chimica Acta 1979, 33 (2) 149-53.

Astaire J. C, Ward R., German J. B., and Jimenez-Flores R. (2003) Concentration of Polar MFGM Lipids from Buttermilk by Microfiltration and Supercritical Fluid Extraction J. Dairy Sd. 86, 2297-2307.

Bojsen A, J Buesa, R Montava, A S Kvistgaard, M B Kongsbak, T E Peterson, C W Heegaard and J T Rasmussen 2007 Inhibitory Activities of Bovine macromolecular Whey proteins on Rotavirus Infections In Vitro and In Vivo J Dairy Sci 90:66-74.

Bylund, G. (Ed.) Dairy processing handbook. 1995 Tetra Pak Processing Systems AB, S-221 86 Lund, Sweden.

Chin, S.F., Liu, W., Storkson, J.M., Ha, Y.L. and Pariza, M.W. Dietary sources of conjugated dienoic isomers of linoleic acid, a newly recognised class of anticarcinogens, Journal of Food composition and Analysis, 5, 185-197, 1992.

Max Ciarlet, Margaret E Conner, Milton J Finegold and Mary IC Estes 2002. Group A Rotavirus Infection and age-Dependent Diarrheal Disease in Rats: a New Animal Model to Study the Pathophysiology of Rotavirus Infection. Journal of Virology 76 (1): 41-57.

Scott M. Clark, Bill B. Barnett and Rex S. Spendlove 1979. Production of high-titer bovine rotavirus with trypsin. Journal of Clinical Microbiology Mar: 413-417.

Delorme C, Brϋssow H, Sidoti J, Roche N, Karlsson KA, Neeser JR, Teneberg S., Glycosphingolipid binding specificities of rotavirus: identification of a sialic acid-binding epitope. J Virol. 2001 Mar; 75(5):2276-87.

Fox PF, McSweeney PLH (eds), Advanced Dairy Chemistry, Volume 2 - Lipids, 3rd Ed, Springer Science + Business Media, Inc., 2006.

Freireich EJ, Gehan EA, Rail DP, Schmidt LH, Skipper HE (1966) Quantitative comparison of toxicity to anticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey and man. Cancer Chemother Rep 50: 219-244.

Guarino A, Casola A, Bruzzese E, Saini M, Nitsch L, Rubino A. 1996. Human serum immunoglobulin counteracts rotaviral infection in Caco-2 cells. Pediatric Research 40(6): 887-7.

Guo CT, Nakagomi O, Mochizuki M, Ishida H, Kiso M, Ohta Y, Suzuki T, Miyamoto D, Hidari KI, Suzuki Y., Ganglioside GM(1a) on the cell surface is involved in the infection by human rotavirus KUN and MO strains. J Biochem (Tokyo). 1999 Oct;126(4):683-8.

Illingworth, D., Fractionation of fats. In Physical Properties of Lipids (Marangoni A G & Narine S S, Eds), pp. 411-448. Marcel Dekker, New York (2002).

Kanno C & Dong-Hyun K (1990). A simple procedure for the preparation of bovine milk fat globule membrane and a comparison of its composition, enzymatic activity, and electrophoretic properties with these prepared by other methods. Agric. Biol. Chem., 54(11):2845-2854.

Kanno C, Shimizu M & Yamachi K (1975). Isolation and physiochemical properties of a soluble glycoprotein fraction of milk fat globule membrane. Agric. Biol. Chem., 39(9):1835-1842.

Takahashi Kazuo, Katzutaka Ohashi, Yurika Abe, Shuichi Mori, Koki Taniguchi, Takusaburo Ebina, Osamu Nakagomi, Masaki Terada and Shiro Shigeta 2002. Protective Efficacy of a Sulfated Sialyl Lipid (NMSO3) against Human Rotavirus-Induced Diarrhea in a Mouse Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46: 420-424.

Kvistgaard AS, Pallesen LT, Arias CF, Lopez S, Petersen TE, Heegaard CW, Rasmussen JT., Inhibitory effects of human and bovine milk constituents on rotavirus infections. J Dairy Sci. (2004) 87(12):4088-96.

Mendez E, Lopez S, Cuadras MA, Romero P, Arias CF., Entry of rotaviruses is a multistep process. Virology. 1999 Oct 25; 263(2):450-9.

Parashar, UD, EG Hummelman, JS Bresee, MA Miller and RI Glass 2003. Global illness and deaths caused by rotavirus disease in children Emerg Infect Dis 9:565-572 Isa Pavel, Carlos F Arias, Susana Lopez 2006. Role of sialic acids in rotavirus infection. Glycoconj J 23:27-37.

Peterson JA, Scallan CD, Ceriaii RL, Hamosh M 2001. Structural and functional aspects of three major glycoproteins of the human milk fat globular membrane. Adv Exp Med Biol 501:179-87.

Pruthi T D, Narayanan K M & Bhaleerao V R (1970). The role of milk phospholipids in the autoxidation of butterfat - I. Indian Journal of Dairy Science, 23:248-251.

Rombaut R, Camp JV, Dewettinck K., Analysis of phospho- and sphingolipids in dairy products by a new HPLC method. J Dairy Sci. (2005) 88(2):482-8.

Rombaut R, Dejonckheere V, Dewettinck K., Microfiltration of butter serum upon casein micelle destabilization. J Dairy Sci. (2006)(a) 89(6):1915-25.

Rombaut R., Van Camp J. & Dewettinck K., Phospho- and sphingolipid distribution during processing of milk, butter and whey, International Journal of Food Science & Technology, (2006)(b) 41(4):435-443.

Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Lab Press, Cold Spring Harbour, New York.

Eric M. Smith, Mary KoIb Estes, David Y. Graham and Charles P. Gerba 1979. A plaque assay for the simian rotavirus SAIl. Journal of General Virology 43: 513-519.

Fabiana Superti, Rosa Siciliano, Barbara Rega, Francesco Giansanti, Piera Valenti, Giovanni Antonini 2001. Involvement of bovine lactoferrin metal saturation, sialic acid and protein fragments in the inhibition of rotavirus infection. Biochimica et Biophysica Acta 1528:107-115.

van Veen HA, Geerts ME, van Berkel PH, Nuijens JH. The role of N-linked glycosylation in the protection of human and bovine lactoferrin against tryptic proteolysis. Eur. J. Biochem. (2004) 271(4): 678-684.

Wolber FM, A M Broomfield, L Fray, M L Cross and D Dey 2005. Supplemental dietary Whey Protein Concentrate Reduces Rotavirus-Induced Symptoms in Suckling Mice. Journal of Nutrition 135: 1470-1474.

Yung A, McDonald M, Spelman D, Street A, Johnson P, Sorrell T, McCormack J, "Infectious Diseases: A Clinical Approach", Second edition 2005. Ed. (IP Communications PTY Ltd., Victoria, Australia). See page 129, Chapter 11, "Diarrhoea and Vomiting".