ЧЕЛОВЕЧЕСКОЕ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКОЕ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к новым опухолеспецифическим связывающим молекулам, в частности к человеческим антителам, а также их фрагментам, производным и вариантам, которые узнают опухолевые антигены и опухоль-ассоциированные антигены соответственно. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие связывающие молекулы, антителам и их мимикам для лечения различных опухолей, в частности меланомы, рака молочной железы и метастазов.

Уровень техники

Гуморальные иммунные ответы на опухоли встречаются относительно часто (1, 2). Это явление использовали для идентификации множества опухолеспецифических антигенов (taa) путем скрининга аутологичных экспрессионных библиотек с сывороткой, взятой у больного раком (1). Несколько из таких taa теперь используются в качестве T-клеточных антигенов для индукции у пациентов противоопухолевых CTL-ответов (3, 4). В настоящее время пересматривается такое предпочтительное отношение к клеточному ответу, в большинстве случаев цитотоксическому иммунному ответу, как к некой терапевтической стратегии, и разрабатываются новые вакцины с тем, чтобы индуцировать также и антительные ответы. В частности, такое изменение концепции, вероятно, произошло под влиянием недавних достижений в лечении опухоли различными моноклональными антителами, такими как трастузумаб (Герцептин) и бевацизумаб (Авастин) (5). Несмотря на то, что эти моноклональные антитела были специфически индуцированы против целевых молекул предполагаемого онкологического характера, антитела, вырабатываемые у больных раком либо спонтанно, либо путем вакцинации, относились к другому классу молекул, терапевтическое значение которых с трудом поддавалось оценке. Это происходило главным образом из-за отсутствия эффективных экспериментальных подходов для их выделения и последующей характеристики in vitro и на животных моделях человеческого рака.

Таким образом, существует потребность в преодолении вышеописанных ограничений и предоставлении терапевтического и диагностического антитела к антигенам, имеющим отношение к раку.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение использует опухолеспецифический иммунный ответ больных раком для выделения специфических человеческих моноклональных антител к опухолевым антигенам и опухоль-ассоциированным антигенам (taa). В частности, в экспериментах, выполненных по настоящему изобретению, специфические к taa NY-ESO-1 моноклональные антитела успешно выделены у страдающего меланомой пациента, в титре сыворотки которого были обнаружены NY-ESO-1, и получен частичный клинический ответ. Для выделения человеческого антитела, специфического к опухолевому антигену и taa соответственно, была применена иммуногистохимия (ИГХ) с использованием тканевых микрочипов (ТМЧ).

Таким образом, настоящее изобретение относится к человеческим антителам, антигенсвязывающим фрагментам и аналогичным связывающим антигены молекулам, которые способны узнавать опухоль-ассоциированный антиген NY-ESO-1. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, включающим указанные антитела, и к иммунотерапевтическим и иммунодиагностическим способам, использующим такие же антитела.

В особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент проявляет иммунологические характеристики связывания антитела, характеризуемого вариабельными участками V_H и/или V_L, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:2 и 4). В качестве альтернативы антитело представляет собой гуманизированное, ксеногенное или химерное человек-мышь антитело, последнее, в частности, является полезным для диагностических способов и исследований, проводимых на животных. Также включены терапевтические композиции, включающие антитело или его активные фрагменты или агонисты и родственные молекулы, или, наоборот, антагонисты того же антитела, и способы использования таких композиций для профилактики, диагностики или лечения опухоли при помощи таких композиций; причем нуждающемуся в таком лечении пациенту вводят эффективное количество этой композиции.

Антигенсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой одноцепочечный Fv фрагмент, F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент и F(ab')₂ фрагмент или любой другой антигенсвязывающий фрагмент. В специфическом варианте осуществления (см. ниже) антитело или его фрагмент представляет собой человеческое антитело IgG изотипа.

Естественно, настоящее изобретение охватывает и иммортализованный человеческий В-лимфоцит памяти и B-клетку соответственно, которые продуцируют антитело, имеющее отличительные и уникальные характеристики, как определено ниже.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим по меньшей мере вариабельный участок иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению. Предпочтительно указанный вариабельный участок содержит по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) вариабельного участка V_H и/или V_L, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:5-10).

Следовательно, настоящее изобретение также охватывает векторы, содержащие указанные полинуклеотиды и трансформированные ими клетки-хозяева, а также их использование для продуцирования антитела и эквивалентных связывающих молекул, которые являются специфическими к антигенам, характерным для опухоли и/или вызывающим развитие опухоли, в частности меланому или рак молочной железы.

Антитело, его иммуноглобулиновая цепь (цепи), связывающие фрагменты и антиген, связывающийся с указанным антителом, могут использоваться в фармацевтических и диагностических композициях для иммунотерапии и диагностики опухоли соответственно. Однако для приготовления лекарственного средства предпочтительно использовать вышеуказанные композиции.

Следовательно, конкретной задачей настоящего изобретения является предоставление способов лечения или профилактики раковых заболеваний, таких как первичная карцинома молочной железы и метастазы. Способы содержат введение пациенту эффективной концентрации антитела или производного антитела, причем данное антитело нацелено на ткань и клетки опухоли.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны из нижеприведенного описания и примеров. Кроме того, описание настоящего изобретения, в случае необходимости или с точки зрения целесообразности, может быть дополнено содержанием раскрытия более ранней заявки на европейский патент EP 07005180.0, поданной в Европейское патентное ведомство 13 марта 2007.

Краткое описание чертежей

Фиг.1: Лунка 12D7 с культурой B-клеток памяти содержит NY-ESO-1-специфические антитела. Среду, кондиционированную культурами B-клеток памяти, исследовали на наличие NY-ESO-1-специфических человеческих антител следующим образом: A) При помощи ELISA отображали рекомбинантный NY-ESO-1 полной длины. B) При помощи иммуногистохимии на NY-ESO-1-положительной карциноме молочной железы (mc) и на NY-ESO-1-отрицательной контрольной ткани (ct). Показано окрашивание двух лунок (9D1, 12D7) с ELISA-положительной культурой B-клеток памяти, полученное с помощью кондиционированной среды. C) NY-ESO-1-специфическое антитело, находящееся в лунке 12D7, представляет собой подкласс IgG1, как показано окрашиванием NY-ESO-1-положительной ткани кондиционированной B-клетками средой из лунки 12D7 с культурой, затем окрашиванием подклассов IgG1-4 вторичными антителами к IgG.

Фиг.2: 4-ый номер клона рекомбинантного человеческого антитела 12D7, полученный методом одноклеточной РТ-ПЦР из культуры B-клеток памяти, специфически узнает NY-ESO-1 в ELISA и на срезах ткани. Супернатантную жидкость (СН), собранную из 293T HEK клеток, трансфицированных векторами экспрессии иммуноглобулиновых легкой и тяжелой цепей, экспрессирующих четвертый номер клона 12D7, исследовали на специфичность к NY-ESO-1: A) ELISA отображает NY-ESO-1 полной длины. Значения ELISA указаны для неразбавленного СН (1:12D7.4 СН), разбавления 1/10 (2:12D7.4 СН) и разбавления 1/100 (3:12D7.4 СН). Для сравнения также показан сигнал ELISA, полученный из плазмы пациента, у которого были выделены культуры В-клеток памяти, использованные в виде разбавления 1/100 (4). В качестве контроля показано отсутствие связывания с покрытыми NY-ESO-1 пластинами ELISA для СН, полученного при трансфекции нерелевантного рекомбинантного антитела, продуцированного таким же способом, что и 12D7.4 (5), а также отсутствие связывания клона 12D7 № 4 с покрытыми нерелевантным антигеном пластинами ELISA. B) Иммуногистохимия на NY-ESO-1-положительной карциноме молочной железы (mc) и на NY-ESO-1-отрицательной контрольной ткани (ct) показывает специфическое связывание рекомбинантного клона 12D7 № 4 с карциномой молочной железы.

Фиг.3: Характеристика человеческого моноклонального антитела Manhattan. Картирование эпитопа выполняли, используя наложение пептидов, охватывающих весь белок NY-ESO-1, нанесенный на пластину ELISA. A) Manhattan специфически связывается с пептидом, покрывающим с 11 по 30 аминокислоты на N-конце белка NY-ESO-1. B) Сыворотка пациента С1 узнает различные пептидные фрагменты на N-конце и в средней области NY-ESO-1. C) В конкурентных ELISA экспериментах с пептидом NY-ESO-1_11-30 определена авидность Manhattan как равная K_D=10^-10. D) Иммунофлуоресцентное окрашивание NY-ESO-1-положительной клеточной линии SK-MEL-37 с помощью humAb Manhattan показывает колокализацию окраски NY-ESO-1 с ядерным маркером Hoechst. Контрольный рекомбинантный ген 8-15c5 человеческого антитела, специфический к MOG, не связывается.

Фиг.4: Аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельного участка, т.е. тяжелой цепи и легкой каппа цепи антитела 12D7. Определяющие комплементарность участки (CDR) подчеркнуты.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к антителам и его антигенсвязывающим фрагментам, которые проявляют иммунологические характеристики связывания и/или биологические свойства, как в общих чертах показано для продемонстрированного в примерах антитела. В местах упоминания термина "иммунологические характеристики связывания" или других характеристик связывания антитела с антигеном, во всех его грамматических формах, имеется в виду специфичность, аффинность, кросс-реактивность и другие характеристики связывания антитела. Естественно, настоящее изобретение охватывает антитело, продуцирующее клеточные линии, а также рекомбинантные клетки. Настоящее изобретение также относится к диагностическому анализу и наборам, которые содержат связывающую молекулу по настоящему изобретению, и к основанным на этом терапевтическим способам.

Согласно настоящему изобретению человеческое антитело, специфическое к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1, клонировали от страдающего меланомой пациента, который имел сероположительную реакцию на NY-ESO-1 в способе ELISA и на аутологичных срезах опухоли, с помощью способов идентификации, проверки на достоверность и продуцирования диагностически и терапевтически полезных опухоль-ассоциированных молекул, по существу как раскрыто в совместно рассматриваемой международной заявке на патент PCT/EP2008/000053 "Method of providing disease-specific binding molecules and targets", поданной 7 января 2008, содержание которой включено в данное описание в виде ссылки. Скрининг антител-кандидатов выполняли на опухолевой ткани при помощи ELISA, используя адаптированный метод тканевых микрочипов. Было показано, что полученное реагирующее с тканью человеческое моноклональное антитело связывается с N-концом NY-ESO-1, который также присутствует в опухоль-ассоциированном антигене LAGE-1; см. пример 3.

Если не утверждается иное, термины "рак" и "опухоль" в настоящем описании являются взаимозаменяемыми.

Только с целью пояснения, но без ограничения объема настоящего изобретения, большинство из нижеприведенных вариантов осуществления описано относительно человеческих антител и антителоподобных молекул, которые представляют собой предпочтительные связывающие молекулы для разработки терапевтических и диагностических агентов по настоящему изобретению. Однако следует понимать, что в контексте настоящего изобретения термин "антитело" и его фрагмент также может относиться к другим, не являющимся антителами, связывающим молекулам, которые связываются с человеческим опухолевым (опухоль-ассоциированным) антигеном NY-ESO-1, включая без ограничений гормоны, рецепторы, лиганды, молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), шапероны, такие как белки теплового шока (HSP), а также молекулы адгезии клетка-клетка, такие как представители кадгерина, интегрина, лектина C-типа и суперсемейства иммуноглобулинов (Ig).

NY-ESO-1 первоначально был идентифицирован у пациента, страдающего раком пищевода, с помощью технологии, основанной на клонировании антител (SEREX, см. ниже). Недавно было показано, что NY-ESO-1 может представлять собой наиболее иммуногенный СТ антиген, поскольку спонтанные клеточный и гуморальный иммунные ответы можно наблюдать у высокого процента пациентов с опухолями, экспрессирующими NY-ESO-1, (Gnjatic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003), 8862-8867; Jager and Knuth, Breast 14 (2005), 631-635).

Поскольку CT антигены экспрессируются селективно в опухолевых клетках и в сперматогонии яичка человека, они являются перспективной группой целевых антигенов для иммуннотерапевтического метода лечения больных раком. Среди них NY-ESO-1, по-видимому, является очень иммуногенным, и известно, что он индуцирует эффективные гуморальный и клеточный иммунные ответы у пациентов с меланомой и раком яичника, молочной железы, легкого, а также раком мочевого пузыря, что делает его идеальной мишенью для активной иммунотерапии рака. Информацию относительно нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, а также их природы, первичных источников и т.д., опухолевых антигенов и опухоль-ассоциированных антигенов можно найти в соответствующих базах данных, таких как UniProtKB/Swiss-Prot, представленных EMBL, в которой NY-ESO-1 может быть найден под первичным инвентарным номером P78358.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с эпитопом, определенным аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:11, представляющей собой аминокислотные остатки 11-30 белка NY-ESO-1.

Средства и способы рекомбинантного продуцирования антител и их мимиков, а также способы скрининга для сравнения связывающих молекул, которые могут быть или могут не быть антителами, известны в данной области техники; см. также Примеры. Однако, как раскрыто в настоящем описании, в частности относительно терапевтических применений к человеку, антитело по настоящему изобретению представляет собой человеческое антитело в том смысле, что применение указанного антитела по существу не дает реакции на человеческое анти-мышиное антитело (HAMA), наблюдаемой в ином случае для химерных и даже гуманизированных антител.

Кроме того, как показано в нижеприведенном примере 3, было идентифицировано и клонировано антитело, которое, в частности, продемонстрировало высокую аффинность связывания при взаимодействии с его родственным антигеном с константой равновесия диссоциации (K_D), находящейся ниже наномолярного диапазона. Предпочтительно аффинность связывания связывающей молекулы по настоящему изобретению с его родственным антигеном составляет по меньшей мере 10^-7 M, более предпочтительно по меньшей мере 10^-8 M, особенно предпочтительно 10^-9 M и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10^-10 M.

В настоящем изобретении в качестве примера описано человеческое анти-NY-ESO-1 антитело и его связывающие фрагменты, которые могут быть охарактеризованы содержанием в их вариабельном участке, т.е. связывающем домене, по меньшей мере одного определяющего комплементарность участка (CDR) вариабельного участка V_H и/или V_L, содержащего аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.4 (V_H) (SEQ ID NO:2) и (V_L) (SEQ ID NO:4). Приведенный в качестве примера набор CDR вышеупомянутых аминокислотных последовательностей участка V_H и/или V_L, как изображено на фиг.4, дано в SEQ ID NO:5-10. Однако, как обсуждается ниже, специалист в данной области техники хорошо знает, что в качестве дополнения или альтернативы можно использовать CDR, аминокислотные последовательности которых отличаются от приведенных в SEQ ID NO:5-10 одной, двумя, тремя или даже большим количеством аминокислот в случае CDR2 и CDR3.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой любое одно из антител, содержащих аминокислотную последовательность участка V_H и/или V_L, как изображено на фиг.4. В качестве альтернативы антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который конкурирует за связывание с антигеном NY-ESO-1 с по меньшей мере одним из антител, имеющих участок V_H и/или V_L, как изображено на фиг.4. Такие антитела могут быть мышиными, а также, однако, гуманизированными, ксеногенными или предпочтительно химерными человек-мышь антителами, в частности для применения в терапии. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой, например, одноцепочечный Fv фрагмент (scFv), F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент или F(ab')₂ фрагмент.

Таким образом, для некоторых применений необходимы только вариабельные участки антител, которые могут быть получены обработкой антитела подходящими реагентами для получения Fab', Fab или F(ab")₂ частей. Такие фрагменты достаточны для использования, например, в иммуннодиагностических процедурах, включающих связывание иммунноспецифических частей иммуноглобулинов с детектирующими реагентами, такими как радиоизотопы.

В качестве альтернативы, для получения иммуноглобулинов непосредственно из культуры иммортализованных B-клеток или B-клеток памяти, иммортализованные клетки можно использовать в качестве источника реорганизации локусов тяжелой цепи и легкой цепи для последующей экспрессии и/или генетической манипуляции. Гены реорганизованного антитела можно подвергнуть обратной транскрипции от соответствующих мРНК, для того чтобы получить кДНК. При необходимости константный участок тяжелой цепи может быть заменен участком другого изотипа или полностью удален. Для кодирования одноцепочечных участков Fv вариабельные участки могут быть соединены. Для обеспечения способности связываться с более чем одной мишенью может быть соединено множество участков Fv или могут быть использованы химерные комбинации тяжелой и легкой цепей. После получения генетического материала несложно разработать аналоги, как описано выше, которые сохраняют обе способности связываться с желаемой мишенью. Способы клонирования вариабельных участков антитела и создания рекомбинантных антител известны специалисту в данной области техники и описаны, например, у Gilliland et al., Tissue Antigenes 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.

После получения соответствующего генетического материала и при необходимости модификации для кодирования аналога, кодирующие последовательности, включая те, которые кодируют как минимум вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, могут быть вставлены в системы экспрессии, включенные в векторы, которые могут быть трансфицированы в стандартные рекомбинантные клетки-хозяева. Можно использовать множество таких клеток-хозяев; однако, для эффективной обработки предпочтительны клетки млекопитающих. Для этой цели можно использовать обычные клеточные линии млекопитающих, включая клетки CHO, клетки HEK 293 или клетки NSO. Затем проводят продуцирование антитела или аналога путем культивирования измененного рекомбинантного хозяина в условиях культивирования, соответствующих росту клеток-хозяев и экспрессии кодирующих последовательностей. Затем антитела извлекают, выделяя их из культуры. Системы экспрессии предпочтительно разрабатывают таким образом, чтобы были включены сигнальные пептиды, для того чтобы полученные антитела секретировались в среду; однако также возможно внутриклеточное продуцирование.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антигену NY-ESO-1, который распознается описанным выше антителом по настоящему изобретению, как в виде пептида, так и в посттрансляционном модифицированном виде; причем антиген предпочтительно является пептидом, состоящим из по меньшей мере 6-50 и предпочтительно не более чем 10-100 аминокислот в длину, который содержит родственный эпитоп. Наиболее предпочтительно, антиген по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 и состоит примерно из 10-30 аминокислот и предпочтительно не более чем примерно 20 аминокислот в длину. Молекула является достаточно большой, чтобы быть аллергенной без какой-либо посттрансляционной модификации, и, следовательно, она полезна как иммуноген в комбинации с адъювантом (или без него) как в виде предшественника, так и в посттрансляционном модифицированном виде. Эти антигены и пептиды можно использовать для определения того, имеются или нет антитела в образце, таком как сыворотка или кровь. Предпочтительно антиген по настоящему изобретению способен вызвать у человека гуморальный ответ.

Согласно вышесказанному, настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антиген или связывающую молекулу по настоящему изобретению, в случае антитела, предпочтительно по меньшей мере к вариабельному участку иммуноглобулиновой цепи описанного выше антитела. Как правило, указанный кодируемый полинуклеотидом вариабельный участок содержит по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) вариабельного участка V_H и/или V_L упомянутого антитела. Специалист в данной области техники знает, что каждый вариабельный домен (тяжелой цепи V_H и легкой цепи V_L) антитела содержит три гипервариабельных участка, иногда называемых определяющими комплементарность участками или "CDR", фланкированными четырьмя относительно консервативными каркасными участками или "FR", и относящихся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельные участки или CDR IgG подтипа человеческих антител содержат следующие аминокислотные остатки: 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) остатки вариабельного домена легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) остатки вариабельного домена тяжелой цепи, как описано у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991), и/или аминокислотные остатки гипервариабельной петли, т.е. 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) остатки вариабельного участка легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) остатки вариабельного участка тяжелой цепи, как описано у Chothia et al., J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917. Каркас или FR остатки представляют собой аминокислотные остатки вариабельного участка, которые отличаются от разделяющих их гипервариабельных участков. Термин "специфическое связывание" относится к связыванию антитела с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с константой диссоциации (K_D), равной 10^-7 или меньше, и связывается с заданным антигеном с K_D, значение которой по меньшей мере в два раза ниже значения его K_D связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином или любым другим определенным полипептидом), отличающимся от заданного антигена. Фразы "антитело, которое узнает антиген" и "антитело, специфическое к антигену", в настоящем описании используются наряду с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном". "Высокоспецифическое" связывание в настоящем описании означает, что относительная K_D антитела для специфического целевого эпитопа, т.е. taa NY-ESO-1, по меньшей мере в 10 раз ниже K_D связывания этого антитела с другими лигандами. Предпочтительно антитело связывается со своим родственным антигеном NY-ESO-1 с константой диссоциации (K_D), равной 10^-9 M или меньше.

Аффинность или авидность антитела к антигену может быть определена экспериментально с помощью любого из подходящих способов, см., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company New York, NY (1992), и способов, описанных в настоящем описании. Измеренная аффинность конкретного антитело-антиген взаимодействия может меняться при измерении в различных условиях, например, концентрации соли, pH. Таким образом, измерение аффинности и других антигенсвязывающих параметров, например, K_D, IC₅₀, предпочтительно проводят в стандартизованных растворах антитела и антигена и стандартизованном буфере.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что вариабельный домен антитела с вышеописанным вариабельным участком можно использовать для создания других полипептидов или антител с нужной специфичностью и биологической функцией. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает полипептиды и антитела, содержащие по меньшей мере один CDR вышеописанного вариабельного домена, который преимущественно имеет по существу такие же или аналогичные связывающие свойства, что и описанное в прилагаемых примерах антитело. Для специалиста в данной области техники очевидно, что раскрытые в настоящем описании антитела могут быть сконструированы с помощью вариабельных доменов или CDR согласно известным в данной области способам, например, как описано в европейских заявках на патент EP 0451216 А1 и EP 0549581 А1. Более того, специалисту в данной области техники известно, что аффинность связывания может быть увеличена с помощью аминокислотных замен внутри CDR или гипервариабельных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917), которые частично перекрываются с CDR, как определено у Kabat. Таким образом, настоящее изобретение также относится к антителам, у которых один или несколько упомянутых CDR имеют одну или несколько, предпочтительно не более двух, аминокислотных замен. Предпочтительно антитело по изобретению содержит в одной или обеих иммуноглобулиновых цепях два или все три CDR вариабельных участка, как приведено в SEQ ID NO:5-10.

Полинуклеотид по изобретению, кодирующий вышеуказанное антитело, может представлять собой, например, ДНК, кДНК, РНК или искусственно продуцированную ДНК или РНК, или рекомбинантно продуцированную химерную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую любой из таких полинуклеотидов, либо отдельно, либо в комбинации. Предпочтительно указанный полинуклеотид представляет собой часть вектора. Такие векторы могут содержать дополнительные гены, такие как маркерные гены, которые позволяют выбрать указанный вектор в подходящей клетке-хозяине и в подходящих условиях.

Предпочтительно полинуклеотид по изобретению необязательно соединен с управляющими экспрессией последовательностями, обеспечивающими экспрессию в прокариотических или эукариотических клетках. Экспрессия указанного полинуклеотида включает транскрипцию полинуклеотида в транслируемой мРНК. Регуляторные элементы, гарантирующие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно клетках млекопитающих, известны специалистам в данной области техники. Они обычно включают регуляторные последовательности, гарантирующие инициацию транскрипции, и необязательно поли-A сигналы, гарантирующие терминацию транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы могут включать транскрипционные, а также трансляционные энхансеры и/или естественно ассоциированные или гетерологичные участки промотора.

В связи с этим, для специалиста в данной области техники очевидно, что полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере вариабельный домен легкой и/или тяжелой цепи, могут кодировать вариабельные домены обеих или только одной иммуноглобулиновой цепи. Аналогично, для осуществления экспрессии указанные полинуклеотиды могут находиться под контролем одного и того же промотора или могут управляться отдельно. Возможные регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, содержат, например, P_L, lac, trp или tac промотор для E. coli, а примерами регуляторных элементов, обеспечивающих экспрессию в эукариотических клетках-хозяевах, являются AOX1 или GAL1 промотор для дрожжей или CMV-, SV40-, RSV-промотор, CMV-энхансер, SV40-энхансер или глобиновый интрон для клеток млекопитающих и других животных.

Помимо элементов, которые ответственны за инициацию транскрипции, такие регуляторные элементы также могут содержать сигналы терминации транскрипции, такие как SV40-поли-A участок или tk-поли-A участок, по ходу транскрипции полинуклеотида. Кроме того, в зависимости от используемой экспрессионной системы к кодирующей последовательности полинуклеотида по изобретению могут быть добавлены лидерные последовательности, которые способны направлять полипептид к клеточному компартменту или его секрецию в среде и хорошо известны в данной области техники. Лидерная последовательность (последовательности) собирается в соответствующую фазу с помощью последовательностей трансляции, инициации и терминации, и предпочтительно лидерная последовательность способна направлять секрецию транслируемого белка или его части в периплазматическое пространство или внеклеточную среду. Гетерологичная последовательность необязательно может кодировать слитый белок, содержащий C- или N-терминальный сигнальный пептид, обеспечивающий желательные характеристики, например, стабилизацию или упрощенную очистку экспрессированного рекомбинантного продукта. В этом контексте в данной области техники известны подходящие векторы экспрессии, например вектор экспрессии кДНК Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) или pSPORT1 (GIBCO BRL).

Предпочтительно управляющие экспрессией последовательности могут представлять собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотической клетки-хозяина, но также могут использоваться управляющие последовательности для прокариотических хозяев. После введения вектора в соответствующего хозяина хозяин содержится в условиях, подходящих для обеспечения высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, и при желании затем возможны сбор и очистка иммуноглобулиновых легких цепей, тяжелых цепей, димеров легкая/тяжелая цепь или интактных антител, связывающих фрагментов или других форм иммуноглобулина; см. Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).

Кроме того, настоящее изобретение относится к обычно используемым в генной инженерии векторам, в частности плазмидам, космидам, вирусам и бактериофагам, которые содержат полинуклеотид, кодирующий антиген или предпочтительно вариабельный домен иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению; необязательно в комбинации с полинуклеотидом по изобретению, который кодирует вариабельный домен другой иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению. Предпочтительно указанный вектор представляет собой вектор экспрессии и/или вектор для переноса генов или целевой вектор. Для доставки полинуклеотидов или вектора по изобретению в целевую клеточную популяцию можно использовать векторы экспрессии, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус осповакцины, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса или вирус бычьей папилломы. Для создания рекомбинантных вирусных векторов можно использовать способы, известные специалистам в данной области техники; см., например, методы, описанные у Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и у Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). В качестве альтернативы полинуклеотиды и векторы по изобретению могут быть реконструированы в липосомы для доставки в целевые клетки. Векторы, содержащие полинуклеотиды по изобретению (например, последовательности, кодирующие тяжелый и/или легкий вариабельный домен (домены) иммуноглобулиновых цепей, и управляющие экспрессией последовательности), могут быть трансфицированы в клетку-хозяина известными способами, которые меняются в зависимости от типа клеточного хозяина. Например, для прокариотических клеток обычно используется трансфекция с использованием хлорида кальция, тогда как для других клеточных хозяев можно использовать обработку фосфатом кальция или электропорацию; см. Sambrook, выше.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным полинуклеотидом или вектором по изобретению. Указанная клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической клеткой. Полинуклеотид или вектор по изобретению, находящийся в клетке-хозяине, либо может быть интегрирован в геном клетки-хозяина, либо может поддерживаться экстрахромосомно. Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой, такой как бактериальная клетка, клетка насекомого, грибка, растения, животного или человека. Предпочтительные грибковые клетки представляют собой, например, клетки из рода Saccharomyces, в частности клетки вида S. cerevisiae. Термин "прокариотический" означает, что включены все бактерии, которые могут быть трансформированы или трансфицированы с помощью молекул ДНК или РНК для экспрессии антитела по изобретению или соответствующих иммуноглобулиновых цепей. Прокариотические хозяева могут включать грамотрицательные, а также грамположительные бактерии, такие как, например, E.coli, S.typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Термин "эукариотический" означает, что включены клетки дрожжей, высших растений, насекомых и, предпочтительно, млекопитающих, наиболее предпочтительно клетки HEK 293, NSO и CHO. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантного продуцирования, антитела или иммуноглобулиновые цепи, кодируемые полинуклеотидом по настоящему изобретению, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Антитела по изобретению или соответствующие иммуноглобулиновые цепи также могут включать исходный аминокислотный остаток метионина. Полинуклеотид по изобретению можно использовать для трансформации или трансфекции хозяина с помощью любого способа, хорошо известного специалистам в данной области техники. Кроме того, способы получения слитых, необязательно соединенных генов и их экспрессии, например, в клетках млекопитающих и бактерий, известны в данной области техники (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Описанные там генетические конструкции и способы можно использовать для экспрессии антитела по изобретению или соответствующих иммуноглобулиновых цепей в эукариотических или прокариотических хозяевах. В общем случае в отношении хозяина используются векторы экспрессии, содержащие промоторные последовательности, которые облегчают эффективную транскрипцию введенного полинуклеотида. Вектор экспрессии обычно содержит точку начала репликации, промотор и терминатор, а также специфические гены, которые способны обеспечить фенотипическую селекцию трансформированных клеток. Подходящие исходные клетки для последовательностей ДНК и клетки-хозяева для экспрессии и секреции иммуноглобулина можно получить из многих источников, таких как американская коллекция типов культур (American Type Culture Collection) ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, USA, включенный в настоящее описание в виде ссылки). Кроме того, для крупномасштабного продуцирования антитела по изобретению можно использовать трансгенных животных, предпочтительно млекопитающих, содержащих клетки по изобретению.

Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу продуцирования антигена по настоящему изобретению, или антитела или его связывающего фрагмента или иммуноглобулиновой цепи (цепей), где указанный способ включает:

(а) культивирование клетки, как описано выше; и

(b) выделение из культуры указанного антигена, антитела или его связывающего фрагмента или иммуноглобулиновой цепи (цепей).

Трансформированные хозяева могут быть выращены в ферментаторах и культивированы согласно известным в данной области способам для достижения оптимального клеточного роста. После экспрессии целые антитела, их димеры, отдельно легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулина по настоящему изобретению могут быть очищены согласно стандартным процедурам, описанным в данной области техники, включая осаждение сульфатом аммония, аффинную хроматографию, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т.п.; см. Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, NY (1982). Затем антитело или его соответствующая иммуноглобулиновая цепь (цепи) по изобретению может быть выделено из среды роста, клеточных лизатов или фракций клеточных мембран. Выделение и очистка, например, рекомбинантно экспрессированных антител или иммуноглобулиновых цепей по изобретению, могут представлять собой любые обычные средства, такие как, например, разделение при помощи препаративной хроматографии и иммунологическое разделение, такое как разделение с использованием моноклональных или поликлональных антител, направленных, например, против константного участка антитела по изобретению. Для специалиста в данной области техники очевидно, что антитела по изобретению могут быть дополнительно сцеплены с другими агентами, например, для нацеливания лекарственного вещества и применения визуализации. Такое сцепление с участком прикрепления можно выполнить химическим способом после экспрессии антитела или антигена, или продукт сцепления может быть создан в антителе или антигене по изобретению на уровне ДНК. Затем ДНК экспрессируют в подходящей системе хозяина и экспрессированные белки собирают и при необходимости восстанавливают их нативную форму.

Для фармацевтического использования предпочтительными являются по существу чистые иммуноглобулины с по меньшей мере примерно 90%-95% гомогенностью, и наиболее предпочтительными - с 98-99% гомогенностью. Затем, после очистки, частично или до гомогенности, по желанию, антитела можно использовать для терапии (включая экстрокорпоральной) или при разработке и выполнении процедур анализа.

Настоящее изобретение также включает способ получения клеток, способных к экспрессии антитела по изобретению или его иммуноглобулиновую цепь (цепи), включающий получение клеток с полинуклеотидом или вектором по изобретению при помощи генной инженерии. Полученные способом по изобретению клетки можно использовать, например, для оценки взаимодействия антитела по изобретению с его антигеном.

Как упомянуто выше, иммуноглобулин или кодирующие его кДНК могут быть дополнительно модифицированы. Таким образом, в другом варианте осуществления способ по настоящему изобретению включает любой один из этапа (этапов) продуцирования химерного антитела, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, Fab-фрагмента, биспецифического антитела, слитого антитела, меченого антитела или аналог любого из них. Соответствующие способы известны специалисту в данной области и описаны, например, у Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. При получении производных указанных антител методом фагового дисплея можно использовать поверхностный плазмонный резонанс, используемый в системе BIAcore, для увеличения эффективности фаговых антител, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое одно из раскрытых в настоящем описании антител (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Продуцирование химерных антител описано, например, в международной заявке на патент WO89/09622. Способы продуцирования гуманизированных антител описаны, например, в европейской заявке на патент EP-A1 0239400 и международной заявке WO90/07861. Дополнительные источники антител, предназначенных для использования по настоящему изобретению, представляют собой так называемые ксеногенные антитела. Общий принцип продуцирования ксеногенных антител, таких как человеческие антитела в мышах, описан, например, в международных заявках на патент WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 и WO 96/33735. Как обсуждалось выше, антитело по изобретению может существовать во множестве форм помимо полных антител, включая, например, Fv, Fab и F(ab)₂, а также единичные цепи; см., например, международную заявку на патент WO88/09344.

Антитела по настоящему изобретению или их соответствующая иммуноглобулиновая цепь (цепи) могут быть дополнительно модифицированы с помощью обычных способов, известных в данной области техники, например, при помощи известных в данной области делеции (делеций), инсерции (инсерций), замены (замен), добавления (добавлений) и/или перекомбинации (перекомбинаций) и/или любой другой модификации (модификаций) аминокислот, либо по отдельности, либо в комбинации. Способы введения таких модификаций в последовательность ДНК, лежащей в основе аминокислотной последовательности иммуноглобулиновой цепи, известны специалисту в данной области техники; см., например, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1994). Модификации антитела по изобретению включают химическую и/или ферментативную дериватизацию одной или нескольких составляющих аминокислот, включая модификации побочных цепей, модификации главной цепи и N- и C-терминальные модификации, в том числе ацилирование, гидроксилирование, метилирование, амидирование и прикрепление углеводородных или липидных фрагментов, кофакторов и т.п. Аналогично настоящее изобретение охватывает продуцирование химерных белков, которые содержат описанное антитело или какой-либо его фрагмент на аминоконце, слитый на карбоксильном конце с гетерологичной молекулой, такой как иммунностимуляторный лиганд; см., например, международную заявку на патент WO00/30680 для уточнения соответствующих технических деталей.

Более того, настоящее изобретение охватывает небольшие пептиды, включая те пептиды, которые содержат связывающую молекулу, как описано выше, например, содержащие участок CDR3 вариабельного участка любого одного из упомянутых антител, в частности CDR3 тяжелой цепи, поскольку часто отмечалось, что тяжелая цепь CDR3 (HCDR3) является участком с большей степенью изменчивости и имеет преобладающее участие в антиген-антитело взаимодействии. Такие пептиды могут быть легко синтезированы или продуцированы с помощью рекомбинантных средств для получения связывающего агента, используемого согласно изобретению. Специалистам в данной области техники известны такие способы. Пептиды могут быть синтезированы, например, с помощью автоматизированных синтезаторов пептидов, которые являются коммерчески доступными. Пептиды могут быть продуцированы рекомбинантными методами путем введения экспрессирующей пептид ДНК в вектор экспрессии и трансформации клетки с помощью этого вектора экспрессии для продуцирования пептида.

Следовательно, настоящее изобретение относится к любой связывающей молекуле, антителу или связывающему фрагменту, которые можно получить согласно вышеописанным средствам и которые проявляют упомянутые свойства, т.е. которые специфично узнают NY-ESO-1, и у которых с целью терапевтического использования предпочтительно сохранена по существу свойственная человеку структура с тем, чтобы исключить иммуногенную реакцию у пациента.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело, его иммуноглобулиновая цепь или связывающий фрагмент или антиген является детектируемо меченным. Метящие агенты могут быть сцеплены либо непосредственно, либо опосредованно с антителами или антигенами по изобретению. Одним из примеров опосредованного сцепления является сцепление с помощью спейсера. Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать дополнительный домен, причем указанный домен соединен ковалентными или нековалентными связями. Связывание может быть основано на генетическом слиянии согласно способам, известным в данной области техники и описанным выше, или может быть выполнено, например, с помощью химического поперечного связывания, как описано, например, в международной заявке на патент WO94/04686. Дополнительный домен, находящийся в слитом белке, содержащем антитело по изобретению, предпочтительно может быть связан с помощью гибкого линкера, преимущественно полипептидного линкера, причем указанный полипептидный линкер содержит в длину большое количество гидрофильных связанных в пептид аминокислот, достаточное для того, чтобы охватить расстояние от C-терминального конца указанного дополнительного домена до N-терминального конца антитела по изобретению и наоборот. Терапевтически или диагностически активный агент может быть сцеплен с антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом с помощью различных средств. Такое сцепление включает, например, одноцепочечные слитые белки, содержащие вариабельные участки антитела по изобретению, сцепленные с помощью способов образования ковалентных связей, таких как пептидные связи, с терапевтически или диагностически активным агентом. Дополнительные примеры включают молекулы, которые содержат по меньшей мере антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно или нековалентно связанный с дополнительными молекулами, такие молекулы даны в нижеприведенном неограничивающем иллюстративном списке. Traunecker, Int. J. Cancer. SuDP 7 (1992), 51-52, описывает биспецифический реагент Janusin, у которого участок Fv, направленный на CD3, сцеплен с растворимым CD4 или с другими лигандами, такими как OVCA и IL-7. Аналогично вариабельные участки антитела по изобретению могут быть сконструированы в молекулах Fv и сцеплены с альтернативными лигандами, такими как проиллюстрировано в приведенной статье. Higgins, J.Infect Disease 166 (1992), 198-202, описал гетероконъюгированное антитело, составленное из OKT3, поперечно-связанного с антителом, направленным на специфическую последовательность на участке V3 у GP120. Такие гетероконъюгированные антитела также могут быть сконструированы с помощью способов по изобретению с использованием по меньшей мере вариабельных участков, содержащихся в антителе. Дополнительные примеры специфических антител включают антитела, описанные у Fanger, Cancer Treat. Res. 68 (1993), 181-194 и Fanger, Crit. Rev. Immunol. 12 (1992), 101-124. Конъюгаты, которые являются иммунотоксинами, в том числе обычные антитела, широко описаны в данной области техники. Токсины могут быть сцеплены с антителами с помощью обычных способов сцепления, либо иммунотоксины, содержащие части белкового токсина, могут быть продуцированы в виде слитых белков. Для получения таких иммунотоксинов можно соответствующим образом использовать антитела по настоящему изобретению. Иллюстративные примеры таких иммунотоксинов описаны у Byers, Seminars Crll. Biol. 2 (1991), 59-70 и у Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.

Вышеописанный слитый белок также может содержать расщепляемый линкер или расщепляемый протеиназами участок. Эти спейсерные фрагменты, в свою очередь, могут быть либо нерастворимыми, либо растворимыми (Diener et al., Science 231 (1986), 148) и могут быть выбраны для получения возможности освобождения лекарственного вещества от антигена в целевом участке. Примерами используемых в иммунотерапии терапевтических агентов, которые могут быть сцеплены с антителами и антигенами по настоящему изобретению, являются лекарственные вещества, радиоизотопы, лектины и токсины. Лекарственные вещества, с которыми могут быть конъюгированы антитела и антигены по настоящему изобретению, включают соединения, которые относятся к классическим лекарственным веществам, таким как митоцин C, даунорубицин и винбластин. При использовании конъюгированных с радиоизотопами антител или антигенов по изобретению для, например, иммунотерапии опухоли, некоторые изотопы могут быть более предпочтительны по сравнению с другими в зависимости от таких факторов как распределение лейкоцитов, а также стабильность и излучение. В зависимости от аутоиммунного ответа некоторые источники излучения могут быть предпочтительнее других. В общем, в иммунотерапии предпочтительными являются радиоизотопы, испускающие α- и β-частицы. Предпочтительными являются короткий диапазон, высокоэнергетические источники излучения, такие как ²¹²Bi. Примерами радиоизотопов, которые могут быть связаны с антителами или антигенами по изобретению для терапевтических целей, являются ¹²⁵I,¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹²At, ²¹¹Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd и ¹⁸⁸Re. Другие терапевтические агенты, которые могут быть связаны с антителом или антигеном по изобретению, а также ex vivo и in vivo терапевтические протоколы, известны или могут быть легко определены специалистами в данной области техники. Везде, где является уместным, специалист в данной области техники может использовать полинуклеотид по изобретению, кодирующий любое одно из вышеописанных антител, антигенов или соответствующих векторов вместо белкового вещества как такового.

Следовательно, относительно биологической активности антитела и связывающего домена, идентифицированных в настоящем описании, предполагается, что они обладают достаточной аффинностью, чтобы быть потенциальными кандидатами для локализации лекарственного вещества в клетках, экспрессирующих соответствующие поверхностные структуры больных клеток и тканей соответственно. Такое нацеливание и связывание с клетками могло бы быть полезным для доставки терапевтически или диагностически активных агентов и генотерапии/доставки генов. Молекулы/частицы с антителом по изобретению могут быть специфически связаны с клетками/тканями, экспрессирующими антиген NY-ESO-1, и, следовательно, могут использоваться для терапии или диагностики. Таким образом, антитело или антиген по настоящему изобретению может быть меченым (например, флуоресцентно, радиоактивно, ферментативно, с помощью ядерно-магнитного резонанса, тяжелого металла) и использоваться для детектирования специфических мишеней in vivo или in vitro, включая "иммунохимию", как анализ in vitro. Их можно использовать in vivo способом, аналогичным методам визуализации в ядерной медицине, для детектирования тканей, клеток или другого материала, экспрессирующего антиген NY-ESO-1. Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию антитела по настоящему изобретению или его связывающему фрагменту для приготовления композиции для детектирования или нацеливания на опухоль in vivo терапевтического и/или диагностического агента.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим вышеуказанное антитело или его связывающий фрагмент или антиген по настоящему изобретению или химические производные, или полинуклеотид, вектор или клетку по изобретению. Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "химическое производное" описывает молекулу, которая содержит дополнительные химические группы, которые обычно не являются частью основной молекулы. Такие группы могут улучшать растворимость, период полураспада, абсорбцию и т.д. основной молекулы. В качестве альтернативы группы могут уменьшать нежелательные побочные эффекты основной молекулы или снижать токсичность основной молекулы. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать противоопухолевые агенты, такие как интерлейкины или интерфероны, в зависимости от назначения фармацевтической композиции. Следовательно, в конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к использованию антитела или связывающего фрагмента по настоящему изобретению или связывающей молекулы с по существу такой же связывающей специфичностью, антигена, полинуклеотида, вектора или клетки по настоящему изобретению с целью изготовления фармацевтической или диагностической композиции для лечения или профилактики прогрессирования опухоли; для ослабления симптомов, ассоциированных с опухолью; для диагностики или скрининга пациента на наличие опухоли или для определения у пациента риска развития опухоли. Указанная фармацевтическая композиция может быть разработана для введения внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраперитонеально, интраназально, парентерально или в виде аэрозоля; см. также ниже.

Следовательно, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики прогрессирования опухоли у пациента, для ослабления симптомов, ассоциированных с опухолью, для диагностики или скрининга субъекта на наличие опухоли или для определения у пациента риска развития опухоли, причем способ включает введение указанному пациенту эффективного количества любого из вышеописанных антител, антигенов, полинуклеотидов, векторов или клеток по настоящему изобретению. В частности, терапевтические и диагностические применения по настоящему изобретению включают меланому и рак молочной железы и являются наиболее подходящими для нацеливания на опухоль, содержащую первичную карциному молочной железы и/или метастазы. Если не указано иное, термины "опухоль", "рак", "карцинома" и т.п. в настоящем описании являются взаимозаменяемыми.

Следовательно, настоящее изобретение охватывает любое использование опухолевой антигенсвязывающей молекулы, содержащей по меньшей мере один CDR вышеописанного человеческого антитела, в частности, для диагностирования и/или лечения связанного с опухолью нарушения. Предпочтительно указанная связывающая молекула представляет собой антитело по настоящему изобретению или его иммуноглобулиновую цепь. Кроме того, настоящее изобретение относится к анти-идиотипическим антителам любого из вышеописанных антител. Они представляют собой антитела или другие связывающие молекулы, которые связываются с уникальной антигенной пептидной последовательностью, расположенной в вариабельном участке антитела рядом с антигенсвязывающим участком.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к диагностической композиции, содержащей любое одно из вышеописанных антител, антигенсвязывающих фрагментов, полинуклеотидов, векторов или клеток по изобретению и необязательно подходящих средств детектирования, таких как реагенты, обычно используемые в способах иммуннодиагностики или диагностики на основе нуклеиновых кислот. Антитела по изобретению являются подходящими, например, для использования в иммуноанализе, при котором они могут быть использованы в жидкой фазе или могут быть связаны с твердофазным носителем. Примерами иммуноанализа, в которых можно использовать антитело по изобретению, являются либо прямой, либо опосредованный, конкурентный и неконкурентный иммуноанализ. Примеры такого иммуноанализа представляют собой радиоиммуноанализ (RIA), сэндвич-анализ (количественный иммуноанализ), поточную цитометрию и вестерн-блот анализ. Антигены и антитела по изобретению могут быть связаны со многими различными носителями и могут использоваться для выделения специфически связанных с ними клеток. Примеры хорошо известных носителей включают стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, природную и модифицированную целлюлозу, полиакриламид, агарозу и магнетит. Для целей, предусмотренных изобретением, носители могут быть либо растворимыми, либо нерастворимыми. Существует множество различных меток и способов мечения, известных специалистам в данной области техники. Примеры типов меток, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают ферменты, радиоизотопы, коллоидные металлы, флуоресцентные вещества, хемилюминесцентные вещества и биолюминисцентные вещества; см. также вышеописанные варианты осуществления.

В другом варианте осуществления связывающие антитела по настоящему изобретению также можно использовать в способе диагностики опухоли у пациента путем получения от тестируемого пациента образца жидкости тела, который может представлять собой образец крови, образец лимфы или образец любой другой жидкости тела, и приведения образца жидкости тела в контакт с антителом по настоящему изобретению в условиях, дающих возможность для образования комплексов антитело-антиген. Затем известными в данной области способами определяют уровень образования таких комплексов, причем уровень, значительно превышающий уровень в контрольном образце, указывает на наличие опухоли у тестируемого пациента. Таким же образом также можно использовать специфический антиген, связанный с антителами по изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуноанализу in vitro, содержащему антитело или антиген по изобретению. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к определению рака, меланомы и, в частности, рака молочной железы. Способы включают анализ на NY-ESO-1.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу определения статуса ракового состояния, например регрессии, прогрессирования развития рака у пациента с опухолью, экспрессирующей опухолевый (ассоциированный) антиген NY-ESO-1, при этом способ включает анализ образца, взятого у указанного пациента, на антитела, которые специфически связываются с указанным антигеном, и сравнение полученного значения с предшествующим значением, полученным после анализа предшествующего образца, взятого у указанного пациента; причем любое различие между этими значениями является показателем изменения статуса указанного ракового состояния. Соответствующий способ, который можно использовать по настоящему изобретению, раскрыт в международной заявке на патент WO01/07917. В качестве альтернативы такой способ может быть выполнен с антителом по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу определения раковых клеток, например клеток рака молочной железы в образце, при этом способ содержит анализ указанного образца относительно экспрессии NY-ESO-1 путем анализа на наличие белка NY-ESO-1 с помощью антитела по настоящему изобретению, при этом экспрессия NY-ESO-1 является показателем наличия раковых клеток в указанном образце. Подобный способ, который может быть адаптирован согласно настоящему изобретению, описан в патенте США № 6338947 для SCP-1, NY-ESO-1 и SSX-2.

В этом контексте настоящее изобретение также относится к специально разработанным для этой цели средствам. Например, можно использовать белковые или антительные чипы, в которых находятся, например, либо антигены по настоящему изобретению для детектирования аутоантител, которые могут быть у пациентов с опухолью, в частности метастазами, либо антитела или эквивалентные антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению. Разработка иммуноанализа на основе микрочипов кратко описана у Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Следовательно, настоящее изобретение также относится к микрочипам, загруженным антителом или антигеном по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также предоставляет соответственно фармацевтический и диагностический комплект или набор, содержащий один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими вышеописанными компонентами, т.е. антителом или его связывающим фрагментом, антигеном, полинуклеотидом, вектором или клеткой по настоящему изобретению. Вместе с таким контейнером (контейнерами) может находиться уведомление, имеющее форму, установленную правительственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, причем в данном уведомлении отражено одобрение по производству, использованию или продаже для применения человеком. Дополнительно или в качестве альтернативы набор содержит реагенты и/или инструкции по использованию в соответствующем диагностическом анализе. Композиция, т.е. набор по настоящему изобретению, естественно, является особенно подходящим для диагностики, профилактики и лечения нарушения, которое связано с наличием опухоль-ассоциированного антигена NY-ESO, в частности, данный набор применим для лечения опухолей, как упомянуто выше.

Термины "лечение", "лечащий" и т.п., используемые в настоящем описании, в общем означают получение желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим в терминах предотвращения заболевания или проявления его симптомов полностью или частично и/или может быть терапевтическим в терминах частичного или полного излечения болезни и/или подавления отрицательного воздействия, свойственного заболеванию. В настоящем описании термин "лечение" охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности человека, и включает: (a) предупреждение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к данному заболеванию, но еще не диагностирован, как имеющий данное заболевание; (b) подавление развития заболевания, т.е. задержка его развития; или (c) ослабление заболевания, т.е. регрессия заболевания. Кроме того, термин "субъект" или "пациент" относится к млекопитающему, предпочтительно человеку, нуждающемуся в лечении состояния, нарушения или заболевания.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены согласно способам, известным в данной области техники; см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472. Примеры подходящих фармацевтических носителей известны в данной области техники и включают забуференные фосфатом солевые растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы увлажняющих агентов, стерильные растворы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, могут быть составлены обычными хорошо известными способами. Пациенту можно вводить подходящую дозу этих фармацевтических композиций. Введение подходящих композиций можно выполнять различными способами, например внутривенно, интраперитонеально, подкожно, внутримышечно, локально или внутрикожно. Составы аэрозоля, такие как составы назального спрея, включают очищенные водные или другие растворы активного агента с консервантами и изотоническими агентами. В таких составах предпочтительно регулируют pH и изотоническое состояние таким образом, чтобы оно было совместимо со слизистой носа. Составы для ректального или вагинального введения могут быть представлены в виде свечи с подходящим носителем.

Режим дозирования определяется лечащим врачом и клиническими факторами. Как известно в области медицины, подбор дозы для любого пациента зависит от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и одновременно вводимые другие лекарственные вещества. Обычная доза может находиться, например, в диапазоне от 0,001 до 1000 мкг (либо нуклеиновой кислоты для осуществления экспрессии, либо для подавления экспрессии в данном диапазоне); однако предполагаются дозы ниже или выше приведенного в качестве примера данного диапазона, особенно учитывая вышеупомянутые факторы. Как правило, при регулярном введении фармацевтической композиции режим дозирования должен находиться в диапазоне от 1 мкг до 10 мг в сутки. При непрерывной инфузии режим дозирования также должен находиться в диапазоне от 1 мкг до 10 мг на килограмм веса тела в минуту соответственно. Улучшение можно отслеживать с помощью проведения периодических тестов. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примеры неводных растворителей представляют собой пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые сложные органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, растворы спирт/вода, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и забуференные среды. Носители для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактированный раствор Рингера или фиксированные масла. Носители для внутривенного введения включают жидкость и питательные добавки, электролитные растворы (такие как раствор на основе декстрозы Рингера) и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например антимикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и т.п. Кроме того, фармацевтическая композиция по изобретению может содержать дополнительные агенты, такие как противоопухолевые агенты и цитостатические средства, в зависимости от назначения фармацевтической композиции. Кроме того, фармацевтическая композиция также может быть составлена в виде вакцины, например, если фармацевтическая композиция по изобретению содержит антитело по настоящему изобретению для пассивной иммунизации или родственный антиген для активной иммунизации. Составы вакцины для лечения рака, использующие опухоль-ассоциированные антигены, такие как NY-ESO-1, описаны, например, в международной заявке на патент WO2005/105139. Кроме того, может быть желательным совместное или последовательное введение других агентов.

Терапевтически эффективная доза или количество относится к количеству активного компонента, достаточному для ослабления симптомов или улучшения состояния. Терапевтическая эффективность и токсичность таких соединений может быть определена с помощью стандартных фармацевтических процедур в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, ED50 (терапевтически эффективная доза для 50% населения) и LD50 (смертельная доза для 50% населения). Отношение терапевтически эффективной дозы к дозе с токсическим эффектом представляет собой терапевтический индекс и может быть выражен в виде отношения LD50/ED50.

Предпочтительно терапевтический агент в композиции присутствует в количестве, достаточном для предупреждения метастазов и роста неопластических клеток.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать для лечения опухолей и рака, включая, без ограничения, меланому, первичный рак молочной железы, гепатоцеллюлярную карциному и метастазы.

Эти и другие варианты осуществления раскрыты и охвачены описанием и примерами настоящего изобретения. Дополнительную литературу относительно любого одного из материалов, способов, применений и соединений, предназначенных для использования по настоящему изобретению, можно найти в публичных библиотеках и базах данных, используя, например, электронные устройства. Например, может быть использована находящаяся в общем доступе база данных "Medline", которая предоставлена национальным информационным центром по биотехнологии (National Center for Biotechnology Information) и/или национальной библиотекой по медицине при национальных институтах здоровья (National Library of Medicine at the National Institutes of Health). Другие базы данных и веб-адреса, такие как европейский институт биоинформатики (European Bioinformatics Institute) (EBI), который является частью европейской лаборатории по молекулярной биологии (European Molecular Biology Laboratory) (EMBL), известны специалистам в данной области и также могут быть получены с помощью поисковых систем Интернета. Обзор патентной информации по биотехнологии и оценка соответствующих источников патентной информации, полезных для ретроспективного поиска и понимания текущего состояния, приведен у Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Вышеупомянутое раскрытие, в общем, описывает настоящее изобретение. Если не указано иное, для термина, как он используется в настоящем описании, приведено определение, предусмотренное Оксфордским Словарем по Биохимии и Молекулярной Биологии (Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology), Oxford University Press, 1997, revised 2000 and reprinted 2003, ISBN 0 19 850673 2. В тексте настоящего описания приведены ссылки на некоторые из документов. Полные библиографические данные можно найти в конце описания, сразу перед формулой изобретения. Содержание всех приведенных источников (включая литературные ссылки, изданные патенты, опубликованные заявки на патент, приведенные в виде ссылки в данной заявке, и описания, инструкции изготовителя и т.д.) включены в данное описание в виде ссылки; однако это не следует рассматривать как признание того, что любой приведенный в виде ссылки документ действительно является предшествующим уровнем техники по отношению к настоящему изобретению.

Более полное понимание можно получить благодаря нижеприведенным примерам, которые включены в настоящее описание только с целью иллюстрации, а не ограничения объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Изобретение проиллюстрировано в нижеприведенных примерах, которые не следует рассматривать как ограничивающие каким-либо образом объем изобретения. Подробное описание обычных способов, используемых в настоящем описании, могут быть найдены в приведенной в ссылках литературе; см. также "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. ed by Beers and Berkow (Merck & Co., 2003 Inc.).

При применении настоящего изобретения на практике были использованы, если не указано иное, обычные методы клеточной биологии, культуры клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые хорошо известны специалисту в данной области. Для дальнейшей разработки общих методов, используемых при применении настоящего изобретения на практике, можно обратиться к стандартным учебникам и обзорам по клеточной биологии и культуре тканей; см. также ссылки, приведенные в примерах. Общие способы, применяемые в молекулярной и клеточной биохимии, могут быть найдены в таких стандартных учебниках как: Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); and Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986). Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Реагенты, векторы клонирования и наборы для генетической манипуляции, указанные в настоящем описании, можно приобрести у поставщиков, таких как BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich и ClonTech. Обычные методы по сбору клеточных культур и сред приведены в Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); and Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11 (2001), 98-107.

Дополнительные способы

Материал пациента

Опухолевый материал, а также нормальную ткань замораживали в жидком азоте без проведения обычного гистологического анализа. Сыворотку и кровь для выделения B-клеток памяти получали от пациента С1 в соответствии с согласием, основанным на полученной информации, которое одобрено местным комитетом по этике и подписано пациентом.

Культура B-клеток памяти

B-клетки памяти выделяли из человеческих лимфоцитов периферической крови с помощью двухстадийной процедуры селекции. Для положительной селекции B-клеток с помощью метода MACS (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany) использовали маркер CD22 для пан-B-клеток. PBL метили, используя MACS-конъюгированные mAb против человеческого CD22, фикоэритрин-конъюгированные mAb против человеческого IgD и APC-конъюгированные антитела против человеческих IgM, IgA, CD3, CD8, CD56 (Becton Dickinson, Basel, Switzerland). Пан-B-клетки выделяли с помощью положительной селекции CD22-положительной клетки, используя устройство midi MACS и колонки LS (Miltenyi), затем проводили селекцию фикоэритрин- и APC-отрицательных клеток, используя сортер клеток MoFlo (DakoCytomation, Fort Collins, USA). После этого CD22-положительные IgM-, IgD-, IgA-отрицательные B-клетки инкубировали с EBV, содержащим супернатант, полученный из клеток B95-8 в присутствии CpG 2006 (6, 15), в B-клеточной среде, содержащей RPMI 1640, дополненную 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Клетки высевали по 50 клеток на лунку в B-клеточной среде на 30000 облученных фидерных PBL, полученных от добровольных доноров.

Через 2 недели культивирования кондиционированную среду культуры B-клеток памяти сканировали на наличие NY-ESO-1-специфических антител методом ELISA и на срезах NY-ESO-1-положительных аутологичных и неаутологичных тканей.

ELISA

96-луночные микропланшеты (Corning, NY, USA) покрывали 1 мкг/мл рекомбинантным белком NY-ESO-1 в PBS в количестве 25 мкл на лунку в течение ночи при 4°C. Планшеты промывали PBS-T и блокировали в течение ночи при 4°C с помощью PBS, содержащим 5% молочный порошок (Rapilait, Migros, Switzerland). Кондиционированную B-клеточную среду, сыворотку пациента и препараты рекомбинантных антител инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Связывание человеческих антител с NY-ESO-1 определяли с помощью вторичных ослиных анти-человеческих IgG-HRP антител (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Cambridgeshire, UK) с последующим измерением активности HRP, используя раствор TMB субстрата (TMB, Sigma, Buchs, Switzerland).

ELISA эпитопное картирование

20-мерные пептиды, охватывающие весь белок NY-ESO-1 с перекрытиями 10aa, общими для смежных пептидов (Peptides & Elephants, Nuthetal, Germany), использовали для покрытия планшет Maxisorp ELISA (Nunc, Rochester, NY). Человеческое рекомбинантное антитело Manhattan или сыворотку пациента (растворенную в PBS 1:500) детектировали, используя конъюгированный с пероксидазой хрена козлиный анти-человеческий IgG+IgM (Jackson ImmunoResearch).

Конкурентный ELISA

В экспериментах по насыщению была установлена полумаксимальная концентрация, характерная для связывания человеческого моноклонального антитела Manhattan с пептидом NY-ESO-111-30, равная 1x10^-9 М или 0,15 мкг/мл. В экспериментах по конкуренции увеличивающиеся концентрации пептида NY-ESO-111-30 смешивали с Manhattan с концентрацией 0,15 мкг/мл и затем смесь переносили на покрытые NY-ESO-111-30 планшеты ELISA.

Иммуногистохимия

Цилиндры опухолевых тканей, имеющих размеры 0,6 мм в диаметре, получали выдавливанием из залитой парафином NY-ESO-1-положительной опухолевой ткани и здоровой контрольной ткани. Пары, образованные из цилиндров опухолевой ткани и здоровой контрольной ткани, помещали в каждую позицию сетки 2x4, размеры которой были совместимы с форматом микротитровальных планшетов с B-клеточной культурой и обычных многоканальных пипеток.

Иммуногистохимию выполняли на фиксированной формалином, залитой парафином ткани. Антиген на всех предметных стеклах выявляли путем нагревания. Неспецифическую флуоресценцию блокировали с помощью многоклональных кроличьих анти-человеческих IgG (Dako, Baar, Switzerland) в течение 30 минут при комнатной температуре, затем второй раз блокировали 1% обезжиренным молоком в течение 10 мин (Rapilait, Migros, Switzerland). Первичное антитело или кондиционированную B-клеточную среду инкубировали в течение ночи при 4°C. Связывание человеческих антител с NY-ESO-1 выявляли с помощью Cy3-конъюгированных вторичных антител к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Soham, UK). Окрашивание биотинилированного рекомбинантного человеческого антитела Manhattan выявляли с помощью Cy3- или HRP-конъюгированного стрептавидина (Sigma, Buchs, Switzerland). В качестве положительного контроля на наличие антигена NY-ESO-1 использовали мышиное моноклональное антитело к NY-ESO-1 (Zymed, South, San Francisco, USA).

Анализ иммунофлуоресценции выполняли на инвертированном флюоресцентном микроскопе (Leica, Heerbrugg, Switzerland).

Одноклеточная РТ-ПЦР

Единичные клетки, полученные из культуры B-клеток памяти, помещали в ПЦР трубки. Подготовили кДНК, используя праймеры, специфичные для константных участков тяжелой, κ-легкой и γ-легкой цепей иммуноглобулина G. ПЦР амплификацию вариабельных участков иммуноглобулиновых тяжелой и легкой цепей выполняли согласно стандартным протокам (7, 16). Вариабельные участки иммуноглобулиновых тяжелой и легкой цепей амплифицировали, используя метод полугнездовой ПЦР. Первый раунд ПЦР выполняли с праймерами, специфичными для константного участка IgG и пулами праймеров, специфичных для участков консервативной структуры 1 семейства вариабельных участков тяжелой и легкой цепей Ig (7). Затем использовали полугнездовую ПЦР с гнездовыми праймерами, специфичными для константного участка IgG, и праймерами, специфичными для структуры 1 семейства вариабельных участков тяжелой и легкой цепей Ig, которые содержали сайты рестрикции, как описано (8). Продукты ПЦР тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина клонировали в векторы, содержащие константные участки IgG1, IgKappa или IgLambda.

Получение и очистка антител

Человеческие эмбриональные почечные клетки 293-T культивировали в DMEM с добавлением 10% FCS со сверхнизким содержанием IgG, 1% раствора пенициллин-стрептомицина и 1% раствора L-глутамина (Invitrogen, Basel, Switzerland). Котрансфекцию тяжелой и легкой цепями иммуноглобулина, кодирующими плазмидную ДНК, выполняли стандартным способом преципитации фосфатом кальция. Затем клетки культивировали в D-МЕМ (без сыворотки) с добавлением 1% Nutridoma SP (Roche, Rotkreuz, Switzerland). Супернатанты собирали через 8 дней культивирования и IgG очищали на колонке G протеина (Amersham Biosciences, Upsala, Sweden) с помощью быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) (Amersham Biosciences, Upsala, Sweden). Очищенное антитело Manhatten биотинилировали, следуя указаниям инструкции изготовителя (SIGMA, Buchs, Switzerland).

Иммунофлуоресцентный анализ опухолевых клеток SK-MEL-37

Клетки SK-MEL-37 выращивали на предметном стекле микроскопа, фиксировали формальдегидом и пермеабилизовали 1% Тритоном X-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. После блокирования 10% козьей сывороткой в течение 1 ч при комнатной температуре клетки инкубировали с Manhatten с концентрацией 1 мкг/мл или отрицательными контрольными антителами (hu8-18c5 (17) экспрессировали в виде рекомбинантов с человеческой Fc областью) в PBS с добавлением 1% козьей сыворотки и 0,2% Тритон X-100 в течение ночи при 4°С. Связанные антитела визуализировали окрашиванием, используя козьи анти-человеческие IgG Alexa Fluor® 546 (1:300, Molecular Probes, Leiden, Netherland) в течение 1 ч при комнатной температуре. Микроскопический анализ выполняли с помощью микроскопа Leica SP 5.

Пример 1: Идентификация NY-ESO-1-специфических B-клеток из PBL меланомы пациента

Меланому пациента отбирали с помощью титра сывороточных антител к taa NY-ESO-1 в ELISA и на срезах аутологичных лимфоузлов, полученных при биопсии. После вакцинации рекомбинантным вакцинным вирусом, экспрессирующим NY-ESO-1 полной длины, наблюдали частичный клинический ответ, продемонстрированный регрессией двух NY-ESO-1-положительных метастазов в печени. У пациента брали 50 мл периферической крови, выделяли и культивировали поверхностные B-клетки, отрицательные как в отношении IgM, так и IgD, представляющие собой Ig-переключенные B-клетки памяти после иммортализации с помощью модифицированного протокола трансформации вируса Epstein Bar (6). 100000 B-клеток памяти получали и засевали в 96-луночные микротитровальные планшеты по 50 клеток на лунку. Через 3 недели культивирования в лунках с культурой наблюдали выращенные клоны. Кондиционированную B-клеточными культурами среду исследовали на наличие антител, специфических к NY-ESO-1. В качестве первого скрининга выполняли ELISA с использованием рекомбинантного NY-ESO-1 полной длины в качестве антигена. Сигналы ELISA считали положительными, если они превышали фоновый сигнал в три раза. Из 2000 лунок идентифицировали 9 лунок с ELISA-положительными культурами B-клеток памяти. Пример отношения сигнала к шуму, полученный с помощью ELISA, изображен на фиг.1A. Затем ELISA-положительные культуры анализировали с помощью иммуногистохимии, используя NY-ESO-1-положительную опухолевую ткань. Установка для скрининга тканей состояла из 8 пар палочек тканей NY-ESO-1-положительных опухолей молочной железы и здоровой ткани молочной железы в качестве контроля, расположенных на предметных стеклах. Благодаря значительно уменьшенным размерам, используемым в этом анализе, для его проведения было достаточно 15 мкл кондиционированной B-клеточной среды. Возможность сравнивать кондиционированную среду нескольких культур B-клеток памяти с отрицательными контролями на одном предметном стекле облегчала проведение оценки флуоресцентного окрашивания.

В результате оценки 9-ти ELISA-положительных B-клеточных культур в данном анализе тканей идентифицировали одну культуру, которая имела более высокую интенсивность окраски по сравнению с окраской других 8 культур. Это показано на фиг.1B, где дается сравнение иммунофлуоресценции, полученной для реагирующей с тканью культуры 12D7, с иммунофлуоресценцией, полученной для лунки 9D1, которая была отнесена к нереагирующей с тканью.

Поскольку информация о реакции IgG-подкласса на NY-ESO-1-специфическое антитело была потеряна на этапе молекулярного клонирования, она была определена на данном этапе с помощью иммуногистохимии с использованием срезов NY-ESO-1-положительной ткани в комбинации с подкласс-специфическими вторичными антителами к человеческим IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Как показано на фиг.1C, окрашивание ткани для NY-ESO-1 наблюдается только со вторичным антителом к IgG1.

Пример 2: Молекулярное клонирование NY-ESO-1-специфического антитела, секретируемого культивированными B-клетками памяти

Предыдущие попытки клеточного клонирования идентифицированных антиген-специфических EBV-трансформированных человеческих B-клеток памяти не были успешными. Поэтому согласно настоящему изобретению была использована стратегия молекулярного клонирования, основанная на РТ-ПЦР единичных отсортированных клеток, взятых из лунки 12D7, для выделения клона антител, обуславливающего вышеописанный паттерн окраски. Были взяты 32 клетки и помещены в виде единичных клеток непосредственно в ПЦР трубки.

После синтеза кДНК вариабельные участки тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина амплифицировали, используя гнездовую ПЦР (7). С помощью 16 из 32 отсортированных клеток были получены последовательности тяжелой и каппа-легкой цепей. Для последовательностей вариабельных участков лямбда легкой цепи не был получен продукт ПЦР ни с одной из клеток. В результате анализа последовательностей было идентифицировано 4 разных клона антител, которые были пронумерованы согласно их относительной численности. Клон 1 был обнаружен в восьми из 16 клеток, клон 2 - в четырех клетках, и каждый из клонов 3 и 4 - в двух клетках.

Затем определяли, дал ли один из этих четырех клонов, при экспрессии в виде рекомбинантного антитела, аналогичное NY-ESO-1 окрашивание, которое наблюдалось в кондиционированной среде из лунки 12D7 с B-клеточной культурой. Для этого последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей клонировали в векторы экспрессии антитела, которые обеспечивали константные участки тяжелой цепи и каппа легкой цепи человеческого IgG1 (8). Использовали константные участки IgG1, поскольку было определено, что NY-ESO-1-специфическое антитело, идентифицированное в кондиционированной среде лунки 12D7, относится к этому подклассу (фиг.1C).

Функциональный анализ четырех клонов выполняли с помощью повторного скрининга рекомбинантных антител методом ELISA и на срезах NY-ESO-1-положительной ткани. Для этого векторы экспрессии тяжелой цепи и соответствующей легкой цепи четырех клонов были трансфицированы в клетки 293 HEK, и супернатантную жидкость трансфицированных клеток анализировали непосредственно с помощью ELISA и иммуногистохимии. Все четыре супернатантные жидкости продуцировали функциональный IgG1, как показано с помощью анти-человеческого-IgG-ELISA. Хотя в ELISA клоны 1-3 не показали никакого связывания с NY-ESO-1, клон номер 4 был положительным вплоть до последнего тестового разбавления (1/100) (фиг.2A). Этот клон также показал специфическое окрашивание на иммуногистохимии с использованием срезов NY-ESO-1-положительной ткани (фиг.2B).

Этот факт послужил основой для подтверждения того, что была выделена последовательность вариабельных участков иммуноглобулина исходного NY-ESO-1-специфического антитела в том виде, в каком он встречается у пациента. Для простоты клон 12D7 № 4 был назван "Manhattan" и использован для дальнейшей характеристики с помощью очищенного материала G белка, полученного из временно трансфицированных клеток HEK.

Пример 3: NY-ESO-1-специфическое моноклональное человеческое антитело Manhattan связывается с пептидом NY-ESO-1_11-30 с K_D, равным 10^-10

Для идентификации эпитопа узнаваемого Manhattan выполняли NY-ESO-1 ELISA, используя перекрывающиеся пептиды, полностью охватывающие белок NY-ESO-1. Как показано на фиг.3A, Manhattan связывается с пептидом, представляющим 11-30 аминокислоты белка NY-ESO-1, но не с двумя смежными пептидами, которые охватывают 1-20 или 21-40 аминокислоты. Предполагается, что эпитоп, узнаваемый Manhattan, находится в месте соединении этих двух пептидов около 20-ой аминокислоты NY-ESO-1. Антитела, находящиеся в сыворотке пациента С1, также узнавали этот эпитоп среди прочих (фиг.3B).

Авидность Manhattan определяли конкурентным ELISA, используя увеличивающиеся концентрации растворимого пептида NY-ESO-1_11-30 для получения конкуренции за связанный с пластиной пептид. Как показано на фиг.3C, константа равновесной диссоциации связывания антигена (K_D) для взаимодействия Manhattan с его родственным пептидом была ниже наномолярного диапазона.

В качестве заключительного теста, использованного при характеристике человеческого моноклонального антитела Manhattan, выполняли иммунофлуоресцентный анализ NY-ESO-1-положительной клеточной линии SK-MEL-37 (9). Окрашивание этой клеточной линии с помощью Manhattan привело к ядерному сигналу, который был локализован совместно с окрашиванием, полученным с помощью ядерного красителя Hoechst.

Заключение

Вышеописанные эксперименты предоставляют общий способ идентификации и молекулярного клонирования антител непосредственно из лимфоцитов периферической крови (PBL) человека. Способ по настоящему изобретению может быть подтвержден выделением из страдающего меланомой пациента человеческого моноклонального антитела к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Начиная со скрининга антител, секретируемых культурами иммортализованных человеческих B-клеток памяти с непродолжительным сроком жизни, были идентифицированы культуры, которые были положительны в ELISA и в иммуногистохимии на срезах NY-ESO-1-положительной ткани. После такого первичного скрининга следовал этап молекулярного клонирования, целью которого была идентификация и выделение одного клона B-клеток, который секретировал антитело, детектированное в первичном скрининге. Наличие только 4 различных клонов в лунке 12D7, как было обнаружено в результате анализа последовательности после одноклеточной РТ ПЦР, предполагает, что изначально из 50 засеянных клеток только немногие были иммортализованы и выжили.

В результате последующего вторичного сканирования рекомбинантных антител-кандидатов было идентифицировано единственное моноклональное антитело с идентичным исходному антителу паттерном окрашивания, которое было продуцировано культивированными B-клетками памяти, полученными от PBL пациента. Таким образом, можно успешно выделить антитело в том исходном виде, как оно встречается у пациента. Это антитело, названное "Manhattan", узнает N-терминальный эпитоп в районе 20-ой аминокислоты, которая является общей для NY-ESO-1 и taa LAGE-1 (9). Этот эпитоп также узнается сывороткой пациента С1, подтверждающей название Manhattan, как являющегося подлинной копией антитела, которое встречается у пациента.

Поскольку на сегодняшний день Manhattan является первым человеческим моноклональным антителом к NY-ESO-1, он также может быть первым выделенным у пациента антителом с зрелой аффинностью к опухолевому антигену и taa соответственно.

Этот новый способ по настоящему изобретению обходит некоторые трудности, свойственные EBV-трансформации B-клеток, такие как генетическая нестабильность и плохая эффективность клонирования (6, 10). Хотя в предыдущем исследовании (6) было успешно осуществлено выделение человеческих моноклональных антител из EBV-иммортализованных B-клеток памяти, следует упомянуть о том, что и ранее до вышеописанного способа по настоящему изобретению неудачно предпринимались попытки по выделению NY-ESO-1-специфических антител от такого же пациента с использованием EBV-трансформации и метода клеточного клонирования, несмотря на значительное количество культур B-клеток памяти, идентифицированных с помощью клеточного скрининга.

Вторым объектом настоящего изобретения является выделение антитела к реагирующему с тканью опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Это было мотивировано обнаружением того, что сыворотка пациента содержала антитела, которые реагировали с NY-ESO-1-положительной аутологичной тканью, взятой при биопсии. Для этой цели метод микрочипов был адаптирован для скрининга культур B-клеток памяти. Это имело несколько преимуществ по сравнению с классическими способами иммуногистохимии. Во-первых, доступность на одном предметном стекле нескольких реплик-позиций, что позволяет произвести оценку и сравнение нескольких образцов. Во-вторых, возможность размещения положительной ткани рядом с отрицательной тканью значительно улучшает чувствительность анализа, признак которого является крайне важным, поскольку инкубация с кондиционированной средой культуры B-клеток памяти часто давала очень слабое окрашивание. В-третьих, при таком значительно уменьшенном формате анализа необходимо намного меньшее количество кондиционированной среды, что также является важным фактором, поскольку общий культуральный объем культур B-клеток памяти был меньше 200 мкл.

Обнаружение того, что сыворотка пациента и человеческое моноклональное антитело Manhattan узнает срезы фиксированной ткани, может не соответствовать ситуации in vivo по меньшей мере относительно непосредственной терапевтической роли посредством индукции антитела, индуцируемого механизмом иммунного эффектора, действующим на клеточном уровне, для очистки NY-ESO-1-положительных клеток. NY-ESO-1 был описан как внутриклеточный антиген (11), и в этом исследовании было показано, что он локализован в ядре, по меньшей мере для клеточной линии SK-Me-37. В этом контексте поверхностное окрашивание живых SK-Me-37 с помощью биотинилированных Manhattan было отрицательным.

Выделение Manhattan является основным этапом для оценки терапевтического значения опухолеспецифических антител, полученных от пациента. Имеется несколько возможных сценариев, согласно которым такое антитело могло бы опосредовать терапевтические эффекты. Во-первых, оно может служить в качестве адъюванта для будущих протоколов производства вакцины. Иммунные комплексы, образуемые при совместном введении Manhattan и NY-ESO-1, могут привести к увеличенной индукции клеточного иммунного ответа (12).

Вторая возможность относится к патофизиологической роли этого класса антител у пациентов с опухолью. NY-ESO-1 часто индуцирует гуморальный ответ, который коррелирует с плохим прогнозом для пациента (13). Хотя это может быть простой корреляцией из-за увеличенного количества антигена в результате роста опухоли, также может быть вероятной толерогенная роль такого B-клеточного ответа. Согласно этому сценарию свободный антиген, секретируемый некротическими или апоптическими клетками опухоли, может индуцировать сильный B-клеточный ответ, затем B-клетки могут представить антиген как результат Fc-рецептор-опосредованного захвата иммунных комплексов (14). Поскольку B-клетки могут быть бедны APC, это представление может привести к индукции толерантности NY-ESO-1-реактивных T-клеток и таким образом предотвратить отторжение опухоли. Введение рекомбинантных Manhattan F(ab) на ранней стадии прогрессирования опухоли может нарушить захват антигена B-клетками, так как F(ab) не связаны Fc-рецепторами, которые все еще могут захватывать антиген. Это, в свою очередь, может предотвратить индукцию толерантности в отношении NY-ESO-1-специфических T-клеток.

ССЫЛКИ