Результат интеллектуальной деятельности: ЭНТОМОПАТОГЕННЫЙ БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ВРЕДИТЕЛЕЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается производства средств защиты растений от вредителей, в частности способа получения грибных энтомопатогенных препаратов. Известны биопрепараты на основе энтомопатогенных грибов для защиты растений от вредителей и способы их получения путем поверхностного и глубинного культивирования микроскопического гриба Verticillium lecanii, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae на питательных средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим концентрированием и сушкой концентрата. Двухстадийным глубинно-поверхностным способом получают Вертициллин зерновой ТУ 10.01.28-89 [1], Вертициллин-К ТУ 10.01.29-89 [2], Боверин-концентрат Ж ТУ 10.01.26-88 [3]. Недостатками этих препаратов являются краткий срок хранения этих препаратов в жидком виде или дороговизна сухих препаратов. Недостатками способов их получения является необходимость длительного культивирования грибов (не менее 14 суток), многостадийность, снижение жизнеспособности спор в процессе сушки и хранения.

Наиболее близким техническим решением к изобретению, взятый за прототип (Патент РФ 2035144. Третьяков В.П. Способ получения энтомопатогенного препарата от 22.01.1993 [4]) является биопрепарат и способ получения энтомопатогенного биопрепарата в сухом виде путем глубинного культивирования микроскопических грибов (Verticillium lecanii, Beauveria bassiana или Metarhizium anisopliae) на питательной среде, содержащей глюкозу, глицерин, гидролизат белково-витаминного концентрата, мел и воду, концентрирование культуральной жидкости, добавления наполнителя цеолита типа NaX и монтмориллонита или палыгорскита и высушивания. Для улучшения качества бипрепаратов и неслеживаемости их после высушивания гранулируют. Препараты, полученные по описанному способу, имеют биологическую эффективность на оранжерейной белокрылке: на основе бластоспор Verticillium lecanii - 70%, титр жизнеспособных бластоспор 1,5·10¹⁰ спор/г, на основе Beauveria bassiana - 85%, титр жизнеспособных бластоспор 9·10⁹ спор/г, на основе Metarhizium anisopliae - 80%, титр жизнеспособных бластоспор 2·10⁹ спор/г.

Таким образом, недостатками биопрепаратов по прототипу и способов их получения являются сравнительно низкая биологическая эффективность биопрепаратов и снижение жизнеспособности инфекционных единиц за счет воздействия неблагоприятных факторов в процессе высушивания и хранения.

Задача изобретения - увеличение биологической эффективности биопрепарата, сохранение и повышение жизнеспособности инфекционных единиц в процессе высушивания и хранения.

Задача относительно предлагаемого биопрепарата решается за счет содержания в концентрате культуральной жидкости на основе инфекционных единиц энтомопатогенных грибов вида Verticillium lecanii, или Beauveria bassiana, или Metarhizium anisopliae добавки, защищающей инфекционные единицы от потерь жизнеспособности и биологической эффективности при высушивании и хранении, при следующем соотношении компонентов, мас.%: концентрат культуральной жидкости - 69,0-77,5; добавка - 10,8-13,8; аэросил - 11,6-17,2. В состав добавки входит спирт многоатомного ряда, углевод, растительное масло, глюконат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.%:

В качестве спирта многоатомного ряда добавка содержит один из следующих компонентов: глицерин, полиэтиленгликоль, дульцит или их смеси. В качестве углевода добавка содержит один из следующих компонентов: сахарозу, глюкозу, рамнозу, инозит, сорбит, кукурузный декстрин или их смеси. В качестве растительного масла добавка содержит один из видов масел: подсолнечное, кукурузное, оливковое, рапсовое, арахисовое, пальмовое или их смеси. В качестве наполнителя биопрепарат содержит аэросил.

Задача относительно предлагаемого способа решается следующим путем: готовят жидкую стерильную питательную среду, засевают инокулюмом грибов Verticillium lecanii, или Beauveria bassiana, или Metarhizium anisopliae и культивируют глубинно, скорость перемешивания 200-220 оборотов/мин в течение 4-5 суток при 27°С до максимального спорообразования. Полученную культуральную жидкость концентрируют фильтрованием до остаточной влажности не более 85% и вводят добавку, защищающую инфекционные единицы от потерь жизнеспособности и биологической эффективности смеси при соотношении 5-7:1, затем в полученную смесь вносят наполнитель при соотношении 4,5-7,6:1. В качестве добавки используют спирт многоатомного ряда, углевод, растительное масло, глюконат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.%:

В отношении биопрепарата достигнут следующий результат: биопрепарат получен в форме сухого смачивающегося порошка, однородного, стабильного при хранении не менее 6 месяцев. Биологическая эффективность биопрепарата превышает прототип на 10-28%, более того он имеет более высокий исходный титр жизнеспособных инфекционных единиц.

В отношении способа получения биопрепарата: достигается сохранение жизнеспособности инфекционных единиц в процессе высушивания и дальнейшего хранения. Также происходит упрощение процесса получения биопрепарата за счет отсутствия стадии гранулирования.

Пример 1. Сухой биопрепарат представляет собой смачивающийся порошок, содержащий 60 г концентрата культуральной жидкости, 10 г добавки, 12 г аэросила. Концентрат культуральной жидкости с остаточной влажностью 73% получали в результате культивирования гриба Verticillium lecanii штамм Р-81 (Каталог государственных коллекций полезных и вредных организмов, М.-СПб., РАСХН, 2001, с.14 [5]), или Beauveria bassiana штамм Bb 2 (Митина и др., Энтомопатогенные грибы рода Lecanicillium: систематика, факторы вирулентности, токсинообразование. Биологические средства защиты растений, технологии их изготовления и применения, СПб., 2005, с.277 [6]), или Metarhizium anisopliae штамм МАК-1 (Крюков В.Ю. и др. Сравнительный анализ двух штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae с разными жизненными стратегиями. Микология и фитопатология, 2011, 45(2), с.164 [7]) на жидкой питательной среде, содержащей, мас.: 20 г глюкозы, 10 г пептона, 2 г дрожжевого экстракта, H₂O - до 1 л, рН 6,5 (Леднев и др. «Возбудители микозов насекомых», СПб., 2003, с.71 [8]). В качестве питательной среды могут быть использованы любые среды, применяемые для культивирования этих видов энтомопатогенных грибов. Добавка, защищающая инфекционные единицы от потерь жизнеспособности и биологической эффективности при высушивании и хранении, содержит: глицерин - 0,6 мл или 0,76 г 80%-ный сахарный сироп - 5,2 мл (4,16 г сахара в 1,04 мл горячей воды), подсолнечное масло - 4,2 мл или 3,9 г и глюконат натрия - 0,04 г. В качестве компонентов добавки могут использованы спирты многоатомного ряда, углеводы и растительные масла, указанные в таблице 3.

После внесения аэросила и высушивания на поддонах при температуре 35-37°С с принудительной вентиляцией до остаточной влажности 23%, биопрепарат представляет собой рыхлый смачивающийся порошок белого цвета, неслеживающийся при хранении и легко суспендируемый в воде при использовании. Титр жизнеспособных единиц образцов биопрепаратов составляет 8,5·10⁹-1,0·¹⁰ спор/мл (табл.1), что выше, чем по прототипу (табл.2). Биологическая эффективность препаратов на личинках оранжерейной белокрылки (Trialeuroides vaporariorum) в стандартных условиях в рабочей концентрации споровой суспензии 1·10⁷ пор/мл составляет от 95-100%, что выше, чем по прототипу (табл.1).

Пример 2. Сухой биопрепарат представляет собой смачивающийся порошок, содержащий 77 г концентрата культуральной жидкости, полученный, как в примере 1; 11,32 г добавки и 11,8 г аэросила. Добавка, защищающая инфекционные единицы от потерь жизнеспособности и биологической эффективности при высушивании и хранении, содержит: глицерин - 0,74 г, 80%-ный сахарный сироп - 5,9 мл (4,7 г сахара в 1,2 мл горячей воды), подсолнечное масло - 4,64 г и глюконат натрия - 0,04 г. Данный пример показывает, что при минимальных концентрациях компонентов добавки и аэросила свойства получаемого биопрепарата не изменяются по сравнению с примером 1, а количество жизнеспособных единиц на грамм препарата и биологическая эффективность выше, чем в прототипе (табл.1).

Пример 3. Сухой биопрепарат представляет собой смачивающийся порошок, содержащий 100 г концентрата культуральной жидкости, полученный как в примере 1, а также 15,5 г добавки и 20,5 г аэросила. Добавка, защищающая инфекционные единицы от потерь жизнеспособности и биологической эффективности при высушивании и хранении, содержит: ПЭГ - 2,3 г, 6,6 мл сиропа (6,5 г рамнозы в 1,1 г горячей воды), оливковое масло - 6,5 г и глюконат натрия - 0,1 г. Данный пример показывает возможность использования различных компонентов добавки, приведенных в таблице 3.

Пример 4. Сухой биопрепарат представляет собой смачивающийся порошок, содержащий 100 г концентрата культуральной жидкости, полученный, как в примере 1, а также 17,2 г добавки и 22 г аэросила. Добавка, защищающая инфекционные единицы от потерь жизнеспособности и биологической эффективности при высушивании и хранении, содержит: дульцит - 2,45 г, 6,6 мл сиропа (6,96 г инозита в 0,45 г горячей воды), рапсовое масло - 7,08 г и глюконат натрия - 0,07 г. Данный пример показывает возможность использования различных компонентов добавки, приведенных в таблице 3.

Пример 5. Сухой биопрепарат представляет собой смачивающийся порошок, содержащий 100 г концентрата культуральной жидкости, полученный, как в примере 1, а также 15,7 г добавки и 21 г аэросила. Добавка, защищающая инфекционные единицы от потерь жизнеспособности и биологической эффективности при высушивании и хранении, содержит: смесь, а именно глицерин - 1,17 г, ПЭГ - 1,1 г, 6,81 мл сиропа (6,44 г глюкозы в 0,37 г горячей воды), рапсовое масло - 3,56 г, пальмовое - 3 г и глюконат натрия - 0,06 г). Данный пример показывает возможность использования смесей спиртов многоатомного ряда в качестве компонентов добавки, приведенных в таблице 3.

Пример 6. Сухой биопрепарат представляет собой смачивающийся порошок, содержащий 100 г концентрата культуральной жидкости, полученный, как в примере 1, а также 14,37 г добавки и 17 г аэросила. Добавка, защищающая инфекционные единицы от потерь жизнеспособности и биологической эффективности при высушивании и хранении, содержит: ПЭГ - 2,08 г, 6,6 мл сиропа (смесь углеводов, а именно 2,9 г кукурузного декстрина и 3,02 г сорбита в 0,28 г горячей воды), арахисовое масло - 6,03 г и глюконат натрия - 0,06 г. Данный пример показывает возможность использования смесей углеводов в качестве компонентов добавки, приведенных в таблице 3.

Пример 7. Так же, как в примерах 1-2, но сухой биопрепарат получают при максимально допустимых количествах компонентов добавки и наполнителя: на 69 г концентрата культуральной жидкости вносят 13,36 г добавки, 17,34 г аэросила. Добавка, защищающая инфекционные единицы от потерь жизнеспособности и биологической эффективности при высушивании и хранении, содержит: глицерин - 1,8 г, 80%-ный сахарный сироп - 6,25 мл (5 г сахара в 1,25 мл горячей воды), подсолнечное масло - 5,2 г и глюконат натрия - 0,07 г. Данный пример показывает, что при максимальных концентрациях компонентов добавки и аэросила свойства получаемого биопрепарата не изменяются по сравнению с примером 1, а количество жизнеспособных единиц на грамм препарата и биологическая эффективность выше, чем в прототипе (табл.1).

Пример 8. Так же, как в примерах 1-3, но сухой биопрепарат получают из 100 г концентрата культуральной жидкости и при запредельных количествах компонентов добавки и наполнителя. При этом заявленные свойства биопрепарата не достигаются (табл.3).

Пример 9. То же, что в примере 1, получают препарат на основе культуральной жидкости гриба V.lecanii с различным титром (табл.2). При этом титр концентрата культуральной жидкости составляет (1,3-8,5)·10⁸ КОЕ/г. При сушке с защитной смесью титр препарата достигает до (0,35-5,5)·10¹⁰ КОЕ/г за счет дальнейшего концентрирования без потери жизнеспособности спор. В прототипе титр препарата практически не изменяется (1,5·10¹⁰ спор/г) по сравнению с исходным титром концентрата (1,3·10¹⁰ спор/г), что свидетельствует о потерях жизнеспособных спор при сушке препарата.

Биологическая эффективность препарата на основе культуральной жидкости гриба V.lecanii на белокрылке 100% (табл.1), в прототипе ниже на 28%.

Пример 10. То же, что в примере 1-9, получают препарат. Для видов B.bassiana штамм Bb 2 или M.anisopliae штамм МАК-1 также происходит повышение титров препаратов за счет концентрирования без потери жизнеспособности спор при сушке с защитной смесью. Биологическая эффективность препаратов на основе культуральной жидкости гриба B.bassiana и M.anisopliae на белокрылке 95% (табл.1), в прототипе ниже на 10 и 15% соответственно.

Пример 11. Способ получения биопрепарата заключается в следующем: готовят жидкую стерильную питательную среду следующего состава, масс: 20 г глюкозы, 10 г пептона, 2 г дрожжевого экстракта, H₂O - до 1 л, рН 6,5 (Леднев и др. «Возбудители микозов насекомых», СПб., 2003, с.71 [8]), засевают грибом Verticillium lecanii штамм Р-81 (Каталог государственных коллекций полезных и вредных организмов, М. - СПб., РАСХН, 2001, с.14 [5]), или Beanveria bassiana штамм Bb 2 (Митина и др., Энтомопатогенные грибы рода Lecanicillium: систематика, факторы вирулентности, токсинообразование. Биологические средства защиты растений, технологии их изготовления и применения, СПб., 2005, с.277 [6]), или Metarhizium anisopliae штамм МАК-1 (Крюков В.Ю. и др. Сравнительный анализ двух штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae с разными жизненными стратегиями. Микология и фитопатология, 2011, 45 (2), с.164 [7]), и культивируют глубинно, скорость перемешивания 200-220 оборотов/мин. В качестве питательной среды могут быть использованы любые среды, применяемые для культивирования этих видов энтомопатогенных грибов.

Культивирование осуществляют в течение 4-5 суток при 27°С до максимального спорообразования. Полученную культуральную жидкость концентрируют до остаточной влажности 73% фильтрованием. Для получения сухого энтомопатогенного препарата в 100 г концентрата культуральной жидкости вводят 14,3 г (7:1) защищающей добавки при следующем содержании каждого компонента: глицерин - 1,9 г; сахароза - 5,4 г; кукурузное масло 5,5; глюконат натрия 0,07; вода - 0,2 и затем 15 г аэросила (7,6:1) и высушивают.

В результате внесения добавки инфекционные единицы были защищены от отрицательного воздействия процесса высушивания, их титр составил 8,5·10⁹-1,0·10¹⁰ спор/мл (табл.1), что выше, чем по прототипу (табл.2). Биологическую эффективность препаратов определяли на личинках оранжерейной белокрылки (Trialeuroides vaporariorum) в стандартных условиях, рабочая концентрация споровой суспензии 1-10 спор/мл. Она составляла, в зависимости от вида гриба 95-100%, что выше, чем по прототипу (табл.1).

Достигнуто сохранение жизнеспособности инфекционных единиц в процессе дальнейшего хранения. Данный способ не требует гранулирования, что упрощает процесс получения биопрепарата.

Пример 12. То же, что в примере 7, получают препарат на основе культуральной жидкости Verticillium lecanii штамм Р-81, или Beauveria bassiana штамм Bb 2, или Metarhizium anisopliae штамм МАК-1. Но используют концентрат культуральной жидкости с влажностью 80% и другие компоненты защищающей добавки (табл.3). Для получения сухого энтомопатогенного препарата в 100 г концентрата культуральной жидкости вводят 17,2 г (5,8:1) защищающей добавки при следующем содержании каждого компонента: дульцит - 2,45 г; инозит - 6,96 г; рапсовое масло - 7,08 г; глюконат натрия 0,07; вода - 0,45 г и затем 22 г аэросила (5,3:1) и высушивают.

Пример 13. То же, что в примере 7, получают препарат на основе культуральной жидкости Verticiuium lecanii штамм Р-81, или Beauveria bassiana штамм Bb 2, или Metarhizium anisopliae штамм МАК-1. Но используют концентрат культуральной жидкости с влажностью 78% и смесь компонентов защищающей добавки (табл.3). Для получения сухого энтомопатогенного препарата в 100 г концентрата культуральной жидкости вводят 15,7 г (6,3:1) защищающей добавки, в состав которой входят смеси многоатомных спиртов и растительных масел, при следующем содержании каждого компонента: глицерин - 1,17 г; ПЭГ - 1,1 г; глюкоза - 6,44 г; рапсовое масло - 3,56 г; пальмовое - 3 г; глюконат натрия - 0,06 г; вода - 0,37 г и затем 21 г аэросила (5,5:1) и высушивают.

Пример 14. То же, что в примере 7, получают препарат на основе культуральной жидкости Verticillwn lecanii штамм Р-81, или Beauveria bassiana штамм Bb 2, или Meiarhizmm anisopliae штамм МАК-1. Но используют концентрат культуральной жидкости с влажностью 85%. Для получения сухого энтомопатогенного препарата к 100 г концентрата культуральной жидкости вводят 20 г (5:1) защищающей добавки при следующем содержании каждого компонента: глицерин - 2,7 г; сахароза - 7,6 г; кукурузное масло 7,7; глюконат натрия 0,1; вода - 1,9 и затем 26,7 г аэросила (4,5:1) и высушивают.

Данный пример показывает, что при максимальных концентрациях компонента добавки и аэросила свойства получаемого биопрепарата не изменяются по сравнению с примером 1, а количество жизнеспособных единиц на грамм препарата и биологическая эффективность выше, чем в прототипе (табл.1, 3).

Пример 15. Так же, как в примерах 7-8, но сухой биопрепарат получают из 100 г концентрата культуральной жидкости и при запредельных значениях соотношений ККЖ к защищающей добавке и наполнителю (аэросилу). При этом заявленные свойства биопрепарата не достигаются (табл.3). Количества компонентоз в рекомендуемом диапазоне обеспечивают увеличение биологической эффективности биопрепарата, сохранение и повышение жизнеспособности инфекционных единиц в процессе высушивания и хранения.

Предлагаемый энтомопатогенный биопрепарат и способ его получения в форме смачивающегося порошка путем глубинного культивирования грибов (Verticillivm lecanii или Beauveria bassiana, или Metarhizium anisopliae) при внесении защитной добавки, состоящей из спиртов глицеринового ряда, углеводов, воды, растительного масла и глюконата натрия, и наполнителя - аэросила (по сравнению с внесением только наполнителей цеолита типа NaX и монтморрилонита или палыгорскита по прототипу) обладают преимуществами: более высокая биологическая эффективность биопрепарат, более высокий исходный титр жизнеспоспособных единиц при длительном хранении. Данный способ обеспечивает сохранение жизнеспособности инфекционных единиц в процессе высушивания и дальнейшего хранения, а также упрощение процесса получения биопрепарата, т.к. не требует дополнительного гранулирования для предотвращения слеживания, что является более экономичным. Данный способ универсален и применим при промышленном получении биопрепаратов и показал эффективность в производственных масштабах.

Источники информации

1. Вертициллин зерновой ТУ 10.01.28-89.

2. Вертициллин-К ТУ 10.0L29-89.

3. Боверин-концентрат Ж ТУ 10.01.26-88.

4. Патент РФ 2035144. Третьяков В.П. Способ получения энтомопатогенного препарата от 22.01.1993.

5. Каталог государственных коллекций полезных и вредных организмов, Москва - С.Петербург, РАСХН отд. защиты растений. 2001.

6. Митина Г.В., Сокорнова С.В, Павлюшин В.А. Энтомопатогенные грибы рода Lecanicillium: систематика, факторы вирулентности, токсинообразование. Биологические средства защиты растений, технологии их изготовления и применения. С-Петербург, 2005, с.273-281.

7. Крюков В.Ю., Дубовский И.М., Ярославцева О.Н., Левченко М.В., Слямова Н.Д., Белгибаева А.Б., Ходырев В.П., Леднев Г.Р., Глупов В.В.. Сравнительный анализ двух штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae с разными жизненными стратегиями. Микология и фитопатология, 2011, 45 (2), с.164-176.

8. Леднев Г.Р., Борисов Б.А., Митина Г.В. Возбудители микозов насекомых, СПб. 2003.