СПОСОБ ОЦЕНКИ КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИАГРЕГАНТНОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ КОРОНАРНЫМ СИНДРОМОМ

Изобретение относится к практической медицине и клинико-лабораторной диагностике. Способ предназначен для построения краткосрочного прогноза эффективности комбинированной антиагрегантной терапии у больных с острым коронарным синдромом (ОКС) и позволяет оценить индивидуальный риск развития повторных тромботических событий (инфаркта миокарда с подъемом и без подъема сегмента ST, нестабильной стенокардии) у больных, находящихся на антиагрегантной терапии по поводу острого коронарного синдрома.

Известен ряд способов оценки эффективности антиагрегантной терапии, основанных на оценке параметров прекращения тока крови в условиях высокого напряжения сдвига in vitro путем образования тромбоцитарной «пробки» (PFA-100); изучении адгезии тромбоцитов под влиянием напряжения сдвига (IMPACT cone and plate analyzer); изучении изменений на поверхности тромбоцита, связанных с его активацией (поточная цитометрия, иммунохимические маркеры, например Р-селектин); изучении реакции высвобождения тромбоцитов (определение тромбоксана В2 в сыворотке, продуктов его деградации в моче, косвенное определение индуцированного арахидоновой кислотой образования тромбоксана А2) [Hezard N, Tessier-Marteau A, Macchi L., Cardiovasc. Hematol. Disord. Drug Targets, 2010; 10 (3): 224-33; Gorlinger K, Jambor C, Dirkmann D, Dusse F, Hanke A, Adamzik M, Hartmann M, Philipp S, Weber AA, Rahe-Meyer N.Herz. 2008 Jun; 33 (4): 297-305.].

Однако описанные способы сложны и трудоемки в использовании, имеют высокую вариабельность оцениваемых параметров, невысокую чувствительность, требуют специальной подготовки исследуемого образца крови и опытного оператора и дорогостоящи в применении.

Известен способ прогнозирования течения острого инфаркта миокарда (см. патент РФ №2121691 по кл. МПК G01N 33/86, опубл. 10.11.1998), включающий исследование биохимических показателей крови больного в динамике с последующим прогнозированием неблагоприятного течения заболевания. В качестве исследуемого показателя используют протромбиновый индекс, а неблагоприятное течение заболевания прогнозируют при снижении индекса с третьих на четвертые сутки от начала заболевания.

Недостатком способа является малая чувствительность и малая специфичность для оценки риска повторных тромботических событий. Данный способ базируется на изучении протромбинового индекса, величина которого определяется функциональной активностью и количеством коагуляционных факторов - II, VII, V и X и чувствительностью использованного тромбопластина. То есть, с одной стороны, используется оценка исключительно коагуляционного звена системы свертывания крови и не учитывается тромбоцитарный механизм гемостаза, воздействие на который составляет сущность антиагрегантной терапии, направленной на предотвращение развития повторных тромботических событий. С другой стороны, указанный параметр обладает высокой вариабельностью и низкой воспроизводимостью в условиях различных лабораторий.

Известен также способ оценки риска повторных тромботических событий у больных острым коронарным синдромом (см. патент РФ №2419800 по кл. МПК G01N 33/86, опубл. 27.05.2011), заключающийся в определении уровня гематокрита, количества эритроцитов, тромбоцитов, определении времени аденозинфосфат-индуцированного-АДФ-индуцированного сввертывания крови, оценки значений в баллах.

Однако способ не учитывает ряд функциональных особенностей тромбоцитов, в частности характеристику реакции высвобождения тромбоцитов, их объемную долю в цельной крови. Описываемый метод является интегральной оценкой состояния системы гемостаза и не может адекватно оценивать риск повторных тромботических событий у пациентов с тромбоцитопатиями, в том числе с лекарственными.

Известен также «Способ диагностики аспиринорезистентности у больных ишемической болезнью сердца» (см. патент РФ на изобретение №2348041 по кл. МПК G01N 33/68, опубл. 27.02.2009), для осуществления которого до начала лечения аспирином в тромбоцитах периферической крови больных определяют активность реакций НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ. Затем рассчитывают коэффициент кофакторного обмена тромбоцитов (ККОТ) по формуле ККОТ=ИОР/ИВН, где ИОР - отношение уровней активности НАДФ- и НАДФН-зависимых реакций глутаматдегидрогеназы, а ИВН - отношение уровня активности НАДН-зависимой реакции глутаматдегидрогеназы к уровню активности НАД-зависимой реакции лактатдегидрогеназы. И при значении ККОТ выше 0,3 диагностируют аспиринорезистентность, а при значении ККОТ, равном или меньше 0,3, - чувствительность к аспирину. Способ позволяет проводить диагностику аспиринорезистентности больных до начала лечения аспирином и обеспечивает высокую точность прогноза.

Однако осуществление данного способа требует значительных материальных затрат и чрезвычайно трудоемко.

Наиболее близким к заявляемому является способ оценки эффективности антиагрегантной терапии при лечении сердечно-сосудистых заболеваний (см. патент РФ №2379684 по кл. МПК G01N 33/48, опубл. 10.06.2009), заключающийся в определении агрегационной активности тромбоцитов в цельной крови импедансным методом, определении амплитуд процесса агрегации до и после инкубирования in vitro с ацетилсалициловой кислотой.

Однако данный способ оценки эффективности антигрегантной терапии недостаточно объективен, поскольку проводится оценка дезагрегационного действия ацетилсалициловой кислоты после ее инкубирования in vitro, что не учитывает влияния ее деацитилирования в желудочно-кишечном тракте.

С другой стороны, предложенный способ основан на анализе интегрального параметра агрегационной способности тромбоцитов и не учитывает вклад реакции высвобождения (состояния гранул тромбоцитов и его клеточной мембраны), а также агрегатно-суспензионного состояния крови, что в итоге может привести к неполному учету параметров, приводящих к риску возникновения повторных тромботических событий у больных, находящихся на антиагрегатной терапии.

Задачей заявляемого изобретения является повышение объективности оценки эффективности проводимой антиагрегантной терапии у больных острым коронарным синдромом за счет возможности комплексного учета параметров агрегатно-суспензионного состояния крови и агрегационной способности тромбоцитов, в том числе реакции высвобождения аденозинтрифосфата при технической простоте и снижении стоимости выполнения способа.

Для решения поставленной задачи в способе оценки клинической эффективности антиагрегантной терапии у больных острым коронарным синдромом, заключающемся в заборе венозной крови, стабилизации ее, определении агрегационной активности тромбоцитов импедансным методом, определении амплитуд агрегации тромбоцитов, согласно изобретению венозную кровь разделяют на два образца цельной крови, один из которых стабилизируют раствором цитрата натрия, а второй - этилендиаминтетраацетатом, в первый образец цельной крови вносят в качестве индуктора агрегации тромбоцитов аденозиндифосфат, определяют в нем максимальную амплитуду агрегации тромбоцитов и максимальную амплитуду кривой высвобождения аденозинтрифосфата, во втором образце определяют долю объема, занимаемую тромбоцитами, и долю объема крови, приходящуюся на форменные элементы, определяют индекс тромбоцитарного агрегационного потенциала крови и при значении индекса менее 0,5% судят о низкой эффективности антиагрегантной терапии, а при значении индекса 1,5-2,5% - о ее высокой эффективности, при этом индекс тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови определяют по формуле

где L_max - максимальная амплитуда кривой высвобождения аденозинтрифосфата,

Ω_max - максимальная амплитуда агрегации тромбоцитов,

РСТ - доля объема цельной крови, занимаемая тромбоцитами,

НТС - доля объема крови, приходящаяся на форменные элементы.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа оценки эффективности антиагрегантной терапии, позволяющего объективно и с высокой степенью вероятности оценить степень риска повторных тромботических событий у больных острым коронарным синдромом за счет возможности комплексной оценки параметров агрегатно-суспензионного состояния крови и агрегационной способности тромбоцитов, в том числе реакции высвобождения аденозинтрифосфата.

Известен импедансный и люми-метод агрегатометрии цельной крови (см., например, W.Heptner, et. al. Thromb. Haemostas. 58, 1676 (1987); P.Sathiropas, et. al. Thromb. Res. 51, 55 (1988)), который позволяет оценить агрегационную активность тромбоцитов в образце разбавленной цельной крови в ответ на внесение индукторов агрегации, в том числе по количественным параметрам реакции высвобождения адениловых нуклеотидов (АТФ, нмоль). Однако определяемые данным методом параметры обладают высокой вариабельностью, определяемой особенностями забора образца крови, его вида (венозная или артериальная), возрастом пациента, наличием того или иного вида тромбофилии и/или тромбоцитопатии, фоновой и/или сопутствующей патологией, спектром используемой медикаментозной терапии, в том числе антитромботической, концентрацией, временем и способом внесения индуктора агрегации и т.д.

Для них отсутствуют стандартизованные параметры оценки, практически не изучена их предсказывающая сила.

В заявляемом способе за счет изучения искусственно смоделированной ситуации образования тромба в коронарных артериях in vitro авторам удалось подобрать параметр оценки риска повторных тромботических событий (индекс тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови), который, по мнению Заявителя, до настоящего времени не был известен.

Индекс тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови с последующим его ранжированием для прогноза эффективности антиагрегантной терапии также ранее не использовался, поскольку не были известны и не были выявлены (до настоящей заявки на изобретение) интервалы значений, характерных для больных с острым коронарным синдромом показателей, отражающих соотношение агрегатно-суспензионного состояния крови и состояния реакции высвобождения тромбоцитов, положенные в основу выводов об оценке риска повторных тромботических событий в данном изобретении.

Кроме этого, использование образцов цельной крови, аденозиндифосфата в качестве индуктора агрегации тромбоцитов, отсутствие этапа преданалитической подготовки образцов позволяет оптимизировать затраты на реализацию способа, что в целом повышает его технологичность и позволяет произвести оценку эффективности антиагрегантной терапии для большего числа пациентов.

Заявляемый авторами способ техничен и технологичен с первой манипуляции до, практически, последней операции - обработки полученных данных, поскольку все манипуляции: забор крови, выбор и приготовление проб, воздействие реактивами на пробы, время инкубации, порядок действий в заявляемом способе - признаки технически осуществляемого действия.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».

Способ осуществляется следующим образом.

Осуществляют забор венозной крови, делят ее на два образца, один из которых стабилизируют 3,8% раствором трехзамещенного цитрата натрия в стандартном соотношении 9:1 и незамедлительно проводят оценку агрегационной активности тромбоцитов в цельной разбавленной крови методом импедансометрии с параллельным определением динамики реакции высвобождения АТФ методом люмиагрегации следующим образом.

1. Включают и прогревают агрегометр до состояния поддержания стабильной температуры в ячейках 37ºС в соответствии с инструкцией по его применению.

2. Приготавливают и прогревают используемые реактивы до 37ºС в соответствующих ячейках агрегометра.

3. При использовании многоканального агрегометра возможно проведение исследования в дублях для повышения точности исследования.

4. Вносят в каждую измерительную кювету по 0,45 мл физраствора и магнитную мешалку, прогревают в течение 5 минут.

5. Вносят в кювету по 0,45 мл цельной крови пациента с последующим прогреванием в течение 5 минут, после чего болюсом вносится 0,1 мл люминофора (CHRONOLOG LUME).

6. После юстирования прибора по стандартному раствору АТФ и уровню базового импеданса, согласно с инструкции по применению агрегометра, болюсным способом вносят рабочий раствор АДФ с конечной концентрацией 10 µL.

7. Осуществляют запись агрегатограммы и кривой высвобождения АТФ в течение 5 минут (максимально, в зависимости от времени выхода определяемых параметров на плато).

8. Определяют максимальную амплитуду агрегатограммы и кривую реакции высвобождения (с использованием стандартного программного обеспечения).

Вторую часть образца цельной крови стабилизируют этиленаминтетраацетатом (калий ЭДТА) в стандартном соотношении 1,2-2 мг на 1 мл цельной крови и используют для проведения гематологического исследования с использованием гематологических анализаторов - счетчиков проточного типа (в нашем случае ABXMicros). Определяют тромбокрит (РСТ) - долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами, и гематокрит (НСТ) - долю объема крови, приходящуюся на форменные элементы.

При этом использование стабилизаторов цельной крови в таком варианте принципиально. Цитрат натрия является самым щадящим стабилизатором в отношении клеточных мембран. Он связывает ионы кальция плазмы крови, тем самым разрывая каскад ее свертывания, которые во многом определяют кинетику и выраженность тромбообразования, а также минимально комплексирует с коагуляционными белками, поэтому является стабилизатором выбора при коагулологических исследованиях крови.

Использование ЭДТА принципиально важно для цитоморфометрии и гематологических анализов. Именно для использования крови, стабилизированной ЭДТА, калиброваны практически все используемые в клинических лабораториях гематологические счетчики.

Оценку эффективности и прогноза антиагрегантной терапии проводят по индексу тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови с использованием следующих параметров: Ω_max - максимальной амплитуды агрегации тромбоцитов, определяемой методом импедансометрии, L_max - максимальной амплитуды кривой высвобождения АТФ, показателей РСТ-тромбокрита и НТС-гематокрита (в долях).

При этом расчет индекса тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови осуществляют по следующей формуле:

Данная формула была получена в ходе анализа результатов исследования динамики агрегационной активности тромбоцитов методом импедансной и люмиагрегатометрии у пациентов с ОКС (n=174), находящихся на стандартной антиагрегантной терапии. Период наблюдения составил 12 месяцев. Исходя из сил информационных и корреляционных связей всех оцениваемых параметров агрегатограмм и клинических исходов на конец периода наблюдения, а также патофизиологической сущности процесса свертывания крови, был выведен индекс тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови, который представляет собой отношение общего количества высвобождаемого в процессе начальных стадий агрегации АТФ к «распространенности» агрегации тромбоцитов в условном объеме цельной крови, выраженное в процентах.

Затем осуществляется ранжирование и оценка указанного индекса по следующей схеме, приведенной для наглядности в таблице.

Риск развития повторного тромботического события на фоне проводимой антиагрегантной терапии оценивался как количественная характеристика «опасности» наступления повторных тромботических событий (это отношение числа неблагоприятных последствий (сумма смертельных случаев, развития повторных несмертельных тромботических событий (n) к их возможному числу за определенный период (N) R=N(t)/Q(f), где N(t) - количественный показатель частоты нежелательных событий в единицу времени t; Q(f) - число объектов риска (пациентов, включенных в исследование), подверженных определенному фактору риска f).

В отделении интенсивной терапии Саратовского НИИ кардиологии обследованы в соответствии с вышеописанной методикой группа клинически здоровых лиц и группа пациентов с острым коронарным синдромом, включающим в себя нестабильную стенокардию, инфаркт миокарда с подъемом и без подъема сегмента ST. У больных с ОКС результаты теста сопоставляли с клиническим исходом заболевания - смертью, развитием осложнений, рецидивов заболевания. Максимальная амплитуда импедансометрии для клинически здоровых пациентов находилась в диапазоне от 6 до 18 Ом при максимальном количестве высвобожденной АТФ от 0,38 до 1,1 нмоль, что соответствовало заявленным референсным интервалам при использовании в качестве индуктора агрегации АДФ в конечной концентрации 10 мкмоль. Максимальная степень АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов колебалась от 0 до 21 Ом у больных НС и от 0 до 17 Ом у больных ИМ, все пациенты находились на стандартной антиагрегантной терапии при максимальном количестве высвобожденной АТФ от 0,0 до 1,71 нмоль. Различия по данным параметрам среди пациентов без и с повторными тромботическими событиями на достигали степени статистической значимости, что обусловлено высокой степенью дисперсии данных и неравновесной долей пациентов в исследуемых группах. Предлагаемый авторами индекс тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови обнаруживал статистически значимые различия в группе пациентов с повторными тромботическими событиями и без таковых (ManWhitney p level = 0.041), а также выявлена отрицательная умеренной силы корреляционная взаимосвязь между рангом исхода и используемым индексом тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови (Kendall τ 0.69, plevel 0.002), при этом вариабельность индекса внутри каждой группы не превышала 17,2%. Применение заявляемого способа прогнозирования эффективности антиагрегантной терапии приводит (на основании изученной выборки больных ОКС) к правильной классификации пациентов в 83,5% случаев.

Клинический пример 1. Пациент С., 65 лет, поступил в клинику с диагнозом: ИБС, Q-инфаркт миокарда задней стенки левого желудочка, артериальная гипертония III стадии, осложнение: острая сердечная недостаточность 1 класса по Killip. Проводилась стандартная терапия согласно рекомендациям Комитета экспертов Всероссийского научного общества кардиологов - двойная антитромбоцитарная терапия, ингибиторы Ха фактора, статины, ингибиторы АПФ, бета-блокаторы. По данным допплерЭХОКГ, выявлены зоны гипокинеза, фракция выброса сохранена (61%), признаков застоя в покое нет, выявлена диастолическая дисфункция. Биохимические показатели и показатели общего анализа крови - в пределах нормы. Ω_max - 7 Ом, L_max - 0,01 нмоль, РСТ - 0,180 и НТС - 0,456. Индекс тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови пациента составил 0,056 (высокий риск). По данным коронарографии выявлена окклюзия правой коронарной артерии, гемодинамически незначимый стеноз передней нисходящей артерии. Проведено стентирование правой коронарной артерии стентом с лекарственным покрытием с хорошим ангиографическим эффектом - полное восстановление кровотока в инфаркт-связанной артерии. Через 3-е суток после стентирования на фоне продолжавшегося в соответствии с рекомендациями антитромботического лечения внезапно наступило ухудшение состояния - развился повторный ангинозный приступ, на фоне которого было зафиксирована элевация сегмента ST в передне-боковых отведениях. Пациент скончался через 1,5 часа от начала болевого приступа при клинической картине кардиогенного шока.

Клинический пример 2. Пациент А., 63 лет. Поступил в клинику с Q-инфарктом миокарда передней стенки левого желудочка. В анамнезе артериальная гипертония, перенесенный инфаркт миокарда, стенокардия напряжения III ФК, хроническая сердечная недостаточность 3 ст., III ФК, сахарный диабет II типа. Течение заболевания осложнилось развитием острой сердечной недостаточности III класса по Killip, пневмонией, левосторонним гидротораксом. Получал стандартную терапию согласно рекомендациям Комитета экспертов Всероссийского научного общества кардиологов - двойная антитромбоцитарная терапия, ингибиторы Ха фактора, статины, ингибиторы АПФ, бета-блокаторы, мочегонные внутрь и внутривенно, инотропные препараты, инсулин. При допплерэхогардиографии выявлялись зоны гипо- и акинезии, аневризма верхушки левого желудочка, признаки декомпенсации кровообращения по обоим кругам, фракция выброса левого желудочка 40%. Общий анализ крови без патологии. При поступлении биохимические признаки декомпенсации сахарного диабета. Коронарография не проводилась. Биохимические показатели и показатели общего анализа крови - в пределах нормы. Ω_max - 5 Ом, L_max - 0,16 нмоль, РСТ - 0,201 и НТС - 0,455. Индекс тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови пациента составил 1,413 (средний риск).

На фоне проводимого лечения уменьшились проявления хронической сердечной недостаточности - возросла толерантность к нагрузке (при выписке на уровне II ФК), исчезли отеки нижних конечностей, признаки застоя в малом круге и гидроторакс (по данным повторного рентгенологического обследования), не возникало приступов стенокардии, по данным биохимического анализа достигнута компенсация обменных процессов. Пациент выписан под наблюдение кардиолога по месту жительства, в течение 11 месяцев - отсутствие повторных тромботических событий.

Клинический пример 3. Больной В., 31 года. Поступил в клинику с Q инфарктом миокарда передней стенки левого желудочка, осложнение: острая сердечная недостаточность 1 класса по Killip. Ранее заболеваний сердечно-сосудистой системы не было. Проводилась стандартная терапия согласно рекомендациям Комитета экспертов Всероссийского научного общества кардиологов - тромболитическая терапия, двойная антитромбоцитарная терапия, ингибиторы Ха фактора, статины, ингибиторы АПФ, бета-блокаторы. По данным допплерЭХОКГ, выявлены зоны гипо- и акинеза, фракция выброса левого желудочка 48%, признаков застоя в покое нет. Биохимические показатели и показатели общего анализа крови - в пределах нормы. Ω_max - 14 Ом, L_max - 0,65 нмоль, РСТ - 0,175 и НТС - 0,371. Индекс тромбоцитарного агрегационного потенциала цельной крови пациента составил 2,19 (низкий риск). По данным коронарографии, выявлена окклюзия передней нисходящей коронарной артерии в проксимальном сегменте. Проведено стентирование передней нисходящей коронарной артерии стентом с лекарственным покрытием с хорошим ангиографическим эффектом - полное восстановление кровотока в инфаркт-связанной артерии. Течение заболевания без осложнений. Выписан под наблюдение кардиолога по месту жительства.

Вышеизложенное свидетельствует об адекватности, достаточной чувствительности и пользе заявляемого способа для прогнозирования клинической эффективности антиагрегантной терапии у больных с ОКС.

Медико-социальный эффект предлагаемого способа заключается в патогенетически обоснованной высокочувствительной оценке риска повторных тромботических событий, т.е. клинической эффективности антиагрегантной терапии у больных с ОКС.

Впервые предложен основанный на комплексной оценке параметров агрегатно-суспензионного состояния крови и агрегационной способности тромбоцитов, в том числе реакции высвобождения, способ прогнозирования клинической эффективности антиагрегантной терапии у пациентов с ОКС. Кроме того, новизной заявленного способа является и использование конкретных четырех названных показателей одновременно в одном способе прогнозирования клинической эффективности антиагрегантной терапии у пациентов с ОКС.

Экономический эффект предлагаемого способа по сравнению с используемыми в настоящее время заключается с одной стороны в сокращении расходов на исследование. Например, средняя цена картриджа PFA COLLAGEN/ADP CARTRIG для способов-аналогов на 20 измерений (два пациента) составляет 10817,3 рублей, то есть стоимость только картриджа для исследования одного пациента составляет порядка 1081,73 рублей. В то время как стоимость реактивов для проведения исследования 1 пациента составляет порядка 270,75 руб., что в разы дешевле за счет расходных материалов. При сравнении с агрегатометрией цельной крови импедансным и люмиметодом преимущество заключается в получении дополнительной информации о состояния больных ОКС при сходной кадровой, временной и ресурсной затратностей.

Способ дает возможность прогнозирования течения заболевания уже в первые часы поступления больного в любое медицинское учреждение, где имеется лаборатория, оснащенная агрегометром (импеданс- и люмиагрегация) и гематологическим счетчиком, и врач-лаборант, которой может обработать данные общего анализа крови и исследования агрегационной активности тромбоцитов.

Разработанная технология по заявляемому способу расширяет арсенал средств объективного контроля состояния больных с ОКС.