Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ САХАРНОГО ДИАБЕТА, СВЯЗАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ В НЕРВНОЙ ТКАНИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ НЕЙРОПРОТЕКТИВНОЙ ТЕРАПИИ ТАКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к медицине и касается способов и лекарственных средств, применяемых для профилактики и лечения осложнений сахарного диабета, связанных с развитием дегенеративных процессов в нервной ткани.

Сахарный диабет сопровождается развитием целого ряда осложнений, в том числе связанных с ухудшением функционирования центральной и периферической нервных систем. Одно из наиболее распространенных осложнений сахарного диабета и основная причина потери зрения у лиц среднего возраста - диабетическая ретинопатия (ДР). Она характеризуется специфическим поражением сосудов и нейрональных слоев сетчатки. Другим осложнением сахарного диабета, связанным с функционированием нервной системы, является диабетическая энцефалопатия (ДЭ). Она проявляется в развитии нарушений памяти и способности к обучению и особенно часто встречается у лиц пожилого возраста. Несмотря на некоторые существенные различия в патогенетических механизмах своего возникновения и течения, оба эти осложнения в равной степени характерны как для инсулинозависимого, так и для инсулиннезависимого диабета. В настоящее время, основным способом профилактики ДР является поддержание длительной и максимально стабильной компенсации сахарного диабета. Другие известные терапевтические средства для предотвращения или замедления развития ДР на ее ранних стадиях оказались мало эффективны. На поздних стадиях ДР наиболее эффективным признан метод лазерной фотокоагуляции, однако его применение сопряжено с риском кровоизлияний в сетчатку и стекловидное тело. Способы профилактики и лечения ДЭ в настоящее время не развиты и не имеют широкого применения в терапии сахарного диабета.

В литературе имеются сообщения о положительном влиянии на течение такого вида осложнения сахарного диабета, как диабетическая полинейропатия (ДП), препаратов на основе витаминов группы В, в частности нейромультивита (патент РФ №2262928 на изобретение). Известно также применение антиоксиданта эмоксипина (3-окси-6-метил-2-этил-пиридина гидрохлорида) в комплексной терапии диабетической ретинопатии (Козлов С.А. и др., 2003). Однако эмоксипин обладает рядом нежелательных побочных эффектов, свойственных группе антиоксидантов.

Задача, поставленная в основу создания заявленной группы изобретений, состоит в разработке эффективных способа и средства профилактики и лечения осложнений сахарного диабета, связанных с развитием дегенеративных процессов в нервной ткани, таких, в частности, как диабетическая ретинопатия (ДР), диабетическая энцефалопатия (ДЭ) и диабетическая нейропатия (ДН). Результат, достигаемый при решении поставленной задачи, состоит в возможности проведения профилактической и лечебной нейропротективной терапии, направленной на предотвращение или замедление нейродегенеративных процессов в сетчатке и головном мозге на всех стадиях развития осложнений сахарного диабета, связанных с развитием дегенеративных процессов в нервной ткани, таких, в частности, как диабетическая ретинопатия (ДР), диабетическая энцефалопатия (ДЭ) и диабетическая полиннейропатия (ДП).

Для достижения поставленного результата предлагается способ профилактики и лечения осложнений сахарного диабета, связанных с развитием дегенеративных процессов в нервной ткани, включающий прием лекарственного средства, содержащего пептид с нейропротективным действием в качестве активного вещества, в котором в качестве пептида использован пептид общей формулы Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемая соль в эффективных количествах.

Для достижения поставленного результата предлагается фармацевтическая композиция для нейропротективной терапии осложнений сахарного диабета, включающая пептид с нейропротективным действием в качестве активного вещества и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в которой в качестве пептида использован пептид общей формулы Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемая соль. При этом содержание пептида или его фармацевтически приемлемой соли может быть выбрано в пределах 0,01-80 вес.%; композиция может быть выполнена приемлемой для перорального введения, например в виде таблетки или капсулы или суспензии или раствора, при этом в случае выполнения в форме таблетки ее выполняют в форме таблетки весом 150 мг, следующего состава: пептид или его фармацевтически приемлемая соль - 10 мг, кремния диоксид коллоидный - 6 мг, крахмал кукурузный - 54 мг, целлюлоза микрокристаллическая - 80 мг.Фармацевтическая композиция также может содержать пептид общей формулы Pro-Gly-Pro в виде ацетатной или хлористоводородной соли, или в виде смеси пептида общей формулы Pro-Gly-Pro и указанных солей.

Для достижения поставленного результата предлагается также способ получения фармацевтической композиции для нейропротективной терапии осложнений сахарного диабета, включающий смешивание активного и вспомогательных веществ, в котором в качестве активного вещества используют пептид общей формулы Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемую соль. При этом содержание пептида или его фармацевтически приемлемой соли может быть выбрано в пределах 0,01-80 вес.%: композиции могут получать в форме, приемлемой для перорального введения, например в форме таблетки весом 150 мг, следующего состава: пептид или его фармацевтически приемлемая соль - 10 мг, кремния диоксид коллоидный - 6 мг, крахмал кукурузный -54 мг, целлюлоза микрокристаллическая - 80 мг.

Изобретение иллюстрируется рис.1, на котором представлены результаты анализа глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) с помощью имунноблоттинга в растворимой и нерастворимой фракциях белковых экстрактов из сетчатки глаз здоровых (V) и диабетических крыс без лечения (I), и после 11-недельного внутрижелудочного введения пептида Pro-Gly-Pro в дозе 7 мг/кг (III), и рис.2 с результатами выборочного анализа содержания различных форм ГФКБ в растворимой фракции экстракта из префронтальной коры головного мозга диабетических крыс методом иммуноблоттинга.

Пептид Pro-Gly-Pro (пролил-глицил-пролин) состоит из природных аминокислот, имеет брутто формулу C₁₂H₁₉N₃O₄ и молекулярную массу 269,3. Природный пептид Pro-Gly-Pro присутствует в следовых количествах в крови и тканях как продукт деградации коллагена и коллагено-подобных белков в пищеварительном тракте и в тканях организма (Samonina et al., 2002). Пептид Pro-Gly-Pro также образуется в организме как один из продуктов деградации пептидов, входящих в состав лекарственных препаратов семакса (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) и селанка (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) (Золотарев и др., 2006). Полученные данные свидетельствуют о хорошем всасывании пептида через желудочно-кишечный тракт, о его высокой биодоступности, низкой скорости выведения из организма и высокой устойчивости к действию протеаз.

Известно, что пептид Pro-Gly-Pro предохраняет клетки поджелудочной железы, вырабатывающие инсулин, от токсического действия аллоксана на модели экспериментального инсулин-зависимого диабета у животных (Ашмарин и др., 2005; Ашмарин и др., 2008). Однако не было известно, проявляет ли такой пептид прямое противодиабетическое действие, то есть способность снижать концентрацию глюкозы в крови, на фоне уже развившегося инсулин-зависимого диабета. Также не описано применение пептида Pro-Gly-Pro как средства профилактики и лечения диабетической ретинопатии (ДР) и диабетической энцефалопатии (ДЭ).

В рамках настоящей заявки термин «фармацевтически приемлемые соли» означает соли, которые являются фармацевтически приемлемыми, то есть являются безопасными, нетоксичными, и которые обладают фармакологической активностью, свойственной исходному соединению. Фармацевтически приемлемые соли по данному изобретению получают посредством взаимодействия между исходным соединением общей формулы Pro-Gly-Pro и фармацевтически приемлемой кислотой, с образованием соли присоединения кислоты, или фармацевтически приемлемого основания, с образованием соли присоединения основания, используя методы, хорошо известные в химии. Фармацевтически приемлемые кислоты, которые образуют аммониевые соли со свободными аминогруппами пептидов и функциональными эквивалентами, включают в себя органические кислоты, такие как уксусная, молочная, яблочная, аскорбиновая, янтарная, бензойная, лимонная, метансульфоновая или толуолсульфоновая кислоты, или неорганические кислоты, такие как хлористоводородная, бромистоводородная, йодистоводородная, серная или фосфорная кислоты. Фармацевтически приемлемые основания, которые образуют карбоксилатные соли со свободными карбоксильными группами пептидов и функциональными эквивалентами, включают в себя метиламин, этиламин, диметиламин, триэтиламин, изопропиламин, диизопропиламин и другие моно-, ди- и триалкиламины, а также ариламины. Следует также понимать, что все ссылки на фармацевтически приемлемые соли включают и фармацевтически приемлемые сольваты, комплексы или соединения присоединения, такие как гидраты или этураты.

В рамках настоящей заявки, в экспериментах на половозрелых белых крысах (190-230) проводили изучение острой и хронической токсичности, а также местно-раздражающего действия фармацевтической композиции (ФК) на основе пептида Pro-Gly-Pro. В острых экспериментах было показано, что при внутрижелудочном введении дозы ФК, вызывающей гибель животных, превышали величину 5000 мг/кг. В хроническом эксперименте ежедневное внутрижелудочное введение ФК в течение 30 дней белым крысам в дозах 120 мг/кг и 480 мг/кг, превышающих с учетом пересчета по поверхности тела в 3 и 12 раз дозу, эквивалентную наиболее предпочтительной суточной терапевтической дозировке для человека (30 мг), не оказало какого-либо нежелательного токсического действия. При макроскопическом и патогистологическом изучении тканей желудочно-кишечного тракта у животных после 30-дневного курса введения ФК на основе пептида Pro-Gly-Pro в указанных дозах не было обнаружено признаков местно-раздражающего действия.

Исследования проводились на зрелых крысах линии Вистар массой 250-300г. Животные содержались при свободном доступе к пище и воде, при 12-часовом световом режиме освещения. Инсулинзависимый сахарный диабет вызывали однократным внутрибрюшинным введением раствора стрептозотоцина (STZ) в цитратном буфере в дозе 60 мг/кг. В эксперимент отбирали только тех животных, у которых через шесть дней после введения STZ концентрация глюкозы в крови превышала значение 15 ммоль/л. Пептид Pro-Gly-Pro в виде водных растворов заданной концентрации в питьевой слабоминерализованной воде вводили катетером внутрижелудочно один раз в день в течение 11 недель.

Известно, что хроническая гипергликемия, вызываемая введением стрептозотоцина, приводит к развитию ряда осложнений, включая ДР и ДЭ. Специфическое нейропротективное действие пептида Pro-Gly-Pro оценивали по его способности нормализовать содержание глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) в сетчатке и в префронтальной области коры головного мозга. ГФКБ является показателем реактивности глии и признанным маркером нейродегенерации (Rungger-Brändle et al., 2000; Zeng et al., 2009). Количество ГФКБ в пробе определяли методом иммуноблоттинга в растворимой (цитозольной) и в нерастворимой (промежуточные филаменты; экстракция 4М мочевиной) фракции, нормировали на содержание в образце ламина - ядерного конститутивного белка и приводили к содержанию основной формы ГФКБ с молекулярной массой 49кДа в растворимой фракции экстракта.

Все взятые в эксперимент животные были разбиты на пять групп: I - животные со STZ-индуцированным диабетом, которым в течение 11 нед внутрижелудочно вводили питьевую воду (n=7); II-IV - животные со STZ-индуцированным диабетом, которым в течение 11 недель внутрижелудочно вводили растворы пептида исследуемый препарат Про-Гли-Про в дозах 3; 7 и 15 мг/кг/сутки (n=5, 4, 7); V - контрольные животные без диабета, которым в течение 11 недель внутрижелудочно вводили питьевую воду (n=9). Уже через 72 ч после введения STZ концентрация глюкозы в крови у большинства крыс превышала значение 20 ммоль/л и практически не изменялась в течение всего эксперимента. Индуцированная STZ гипергликемия вызывала также целый ряд других, характерных для сахарного диабета изменений физиологических и биохимических показателей у крыс после 12-недельной гипергликемии (таблица 1).

Длительное введение Pro-Gly-Pro (7 мг/кг/сутки) приводило к значительному снижению как растворимой, так и нерастворимой форм ГФКБ в сетчатке (рис.1, таблица 2). Исследование дозовой зависимости показало, что наиболее эффективное снижение ГФКБ достигалось при применении Pro-Gly-Pro в дозах 7 и 15 мг/кг/сутки (таблица 3). В этих дозах содержание как основной (49 кДа), так и дополнительных форм (<49 кДа) ГФКБ в сетчатке снижалось практически до уровней, наблюдаемых у здоровых крыс.

Хроническая STZ-индуцированная гипергликемия вызывала значительное увеличение содержания ГФКБ в сетчатке (рис.1). Количественная оценка ГФКБ в растворимой и нерастворимой фракциях сетчатки методом иммуноблоттинга показала, что содержание ГФКБ у диабетических крыс возрастало в 2-3 раза (р<0,05) по сравнению с контрольными животными (таблица 2). При этом наряду со значительным увеличением содержания основной формы ГФКБ с молекулярной массой 49 кДа наблюдали накопление дополнительных форм, характеризующихся меньшей молекулярной массой (рис.1). Оба эти факта свидетельствуют об интенсивных цитоскелетных перестройках в астроцитах и Мюллеровских клетках, характерных для патологической активации глии.

Как показали результаты количественного анализа с использованием иммуноблоттинга в префронтальной области коры головного мозга, хроническая STZ-индуцированная гипергликемия практически не влияла на содержание ГФКБ в нерастворимой фракции, но вызывала значительное увеличение ГФКБ в растворимой фракции (рис.2). При этом, как и в случае сетчатки, помимо основной формы ГФКБ (49 кДа) наблюдали появление дополнительных форм ГФКБ, характеризующихся меньшей молекулярной массой. Количественный анализ с использованием иммуноблоттинга показал, что общее содержание ГФКБ в растворимой фракции из префронтальной области коры мозга диабетических крыс примерно в 2 раза выше, чем у здоровых крыс (таблица 4). При 11-недельном внутрижелудочном введении крысам пептида Pro-Gly-Pro достоверное снижение содержания основной формы ГФКБ (49 кДа) в растворимой фракции наблюдали только при использовании дозы 15 мг/кг/сутки (таблица 4). При этом содержание основной формы ГФКБ достигало значений, наблюдаемых у здоровых крыс. Из каждой экспериментальной группы был выбран образец с наиболее характерным содержанием ГФКБ.

Таким образом, полученные в этих исследованиях данные свидетельствуют о нейропротективном действии длительного систематического введения пептида Pro-Gly-Рго на сетчатку и головной мозг крыс с экспериментально вызванными ДР и ДЭ. Протективное действие пептида выражалось в снижении содержания маркерного белка - ГФКБ. Установлено, что для предотвращения/замедления развития нейродегенеративных процессов в сетчатке и мозге крыс со STZ-индуцированным диабетом необходимо ежедневное внутрижелудочное применение пептида в дозах от 7 до 15 мг/кг.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют возможность применения Рго-Gly-Pro в качестве лекарственного средства для нейропротективной терапии осложнений сахарного диабета.

Пример 1

Крысе-самцу с массой тела 216 г, у которого предварительно вызывали стрептозотоцин-индуцированный диабет, вводят в течение 11 недель внутрижелудочно с помощью зонда 0,9 мл раствора пептида Pro-Gly-Pro в питьевой воде в дозе 7 мг/кг/день. Затем через 3 дня после последнего введения пептида крысе делают эвтаназию и методом белкового иммуноблоттинга определяют в сетчатке глаза и префронтальной области коры головного мозга крысы содержание маркерного белка нейродегенерации - ГФКБ. Измеренное значение содержания основной формы ГФКБ (49 кДа) в сетчатке равнялось 1,65 отн.ед., что в 2,0 раз ниже, чем в среднем у диабетических крыс, не подвергавшихся лечению пептидом (см. таблицу 3). В префронтальной области коры (растворимая фракция экстракта) содержание основной формы ГФКБ (49 кДа) составило 1,36 отн.ед., что в 1,2 раз ниже, чем в среднем у диабетических крыс, не подвергавшихся лечению пептидом (см. таблицу 4). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что длительное введение пептида Pro-Gly-Pro в дозе 7 мг/кг/день приводит к подавлению нейродегенеративных процессов, вызванных хронической гипергликемией, в сетчатке и, в несколько меньшей степени, в коре головного мозга.

Пример 2

Крысе-самцу с массой тела 215 г, у которого предварительно вызывали стрептозотоцин-индуцированный диабет, вводят в течение 11 недель внутрижелудочно с помощью зонда 0,9 мл раствора ацетатной соли пептида Pro-Gly-Pro в питьевой воде в дозе 7 мг/кг/день. Затем через 3 дня после последнего введения пептида крысе делают эвтаназию и методом белкового иммуноблоттинга определяют в сетчатке глаза и префронтальной области коры головного мозга крысы содержание маркерного белка нейродегенерации - ГФКБ. Измеренное значение содержания основной формы ГФКБ (49 кДа) в сетчатке равнялось 1,57 отн.ед., что в 2,1 раз ниже, чем в среднем у диабетических крыс, не подвергавшихся лечению пептидом (см. таблицу 3). В префронтальной области коры (растворимая фракция экстракта) содержание основной формы ГФКБ (49 кДа) составило 1,51 отн.ед., что в 1,1 раз ниже, чем в среднем у диабетических крыс, не подвергавшихся лечению пептидом (см. таблицу 4). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что длительное введение ацетатной соли Pro-Gly-Pro в дозе 7 мг/кг/день приводит к подавлению нейродегенеративных процессов, вызванных хронической гипергликемией, в сетчатке и, в несколько меньшей степени, в коре головного мозга.

Пример 3

Крысе-самцу с массой тела 233 г, у которого предварительно вызывали стрептозотоцин-индуцированный диабет, вводят в течение 11 недель внутрижелудочно с помощью зонда 0,9 мл раствора ацетатной соли пептида Pro-Gly-Pro в питьевой воде в дозе 15 мг/кг/день. Затем через 3 дня после последнего введения пептида крысе делают эвтаназию и методом белкового иммуноблоттинга определяют в сетчатке глаза и префронтальной области коры головного мозга крысы содержание ГФКБ. Измеренное значение содержания основной формы ГФКБ (49 кДа) в сетчатке равнялось 1,50 отн.ед., что в 2,3 раза ниже, чем в среднем у диабетических крыс, не подвергавшихся лечению пептидом (см. таблицу 3), и практически не отличалось от показателей у здоровых крыс. В префронтальной области коры (растворимая фракция экстракта) содержание основной формы ГФКБ (49 кДа) составило 0,59 отн.ед., что в 2,7 раза ниже, чем в среднем у диабетических крыс, не подвергавшихся лечению пептидом (см. таблицу 4), и в 1,7 раз ниже показателей у здоровых крыс. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что длительное введение ацетатной соли Pro-Gly-Pro в дозе 15 мг/кг/день приводит к сильному подавлению нейродегенеративных процессов, вызванных хронической гипергликемией, в сетчатке и в коре головного мозга.

Пример 4

В контрольном эксперименте крысе-самцу с массой тела 240 г, у которого предварительно вызывали стрептозотоцин-индуцированный диабет, вводят в течение 11 недель внутрижелудочно с помощью зонда 0,9 мл питьевой воды. Затем через 3 дня после последнего введения пептида крысе делают эвтаназию и методом белкового иммунноблоттинга определяют в сетчатке глаза и префронтальной области коры головного мозга крысы содержание ГФКБ. Измеренное значение общего содержания ГФКБ равнялось 4,24 отн.ед., что в 2,7 раза выше, чем в среднем у здоровых крыс (см. таблицу 3). В префронтальной области коры (растворимая фракция экстракта) содержание основной формы ГФКБ (49 кДа) составило 1,48 отн.ед., что в 1,5 раз выше, чем в среднем у здоровых крыс (см. таблицу 4). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в отсутствие лечения пептидом общей формулы Pro-Gly-Pro или его фармацевтически приемлемой соли наблюдается развитие нейродегенеративных процессов в сетчатке и коре головного мозга крыс, вызванных длительной гипергликемией.

Пример 5

Была приготовлена фармацевтическая композиция для лечения осложнений сахарного диабета, выполненная в форме таблетки следующего состава (в миллиграммах):

- пептид Pro-Gly-Pro - 10 мг;

- кремния диоксид коллоидный - 6 мг;

- крахмал кукурузный - 54 мг;

- целлюлоза микрокристаллическая - 80 мг.

В технологическую емкость смесителя-гомогенизатора последовательно вносили пептид Pro-Gly-Pro, кремния диоксид коллоидный, целлюлозу микрокристаллическую и кукурузный крахмал, периодически подвергая смесь перемешиванию до получения однородной массы. Затем к полученной смеси постепенно, при постоянном перемешивании, добавляли 10% крахмальный клейстер. Полученную пасту протирали через сито, высушивали в условиях вакуума и измельчали до гранул размером не более 1 мм. Полученную после обработки стеаратом магния и крахмалом массу прессовали в таблетки массой 150 мг с использованием подходящего штампа.

Пример 6

Была приготовлена фармацевтическая композиция для лечения осложнений сахарного диабета, выполненная в форме таблетки следующего состава (в миллиграммах):

- ацетатная соль пептида Pro-Gly-Pro - 10 мг;

- кремния диоксид коллоидный - 6 мг;

- крахмал кукурузный - 54 мг;

- целлюлоза микрокристаллическая - 80 мг.

В технологическую емкость смесителя-гомогенизатора последовательно вносили ацетатную соль пептида Pro-Gly-Pro, кремния диоксид коллоидный, целлюлозу микрокристаллическую и кукурузный крахмал, периодически подвергая смесь перемешиванию до получения однородной массы. Затем к полученной смеси постепенно, при постоянном перемешивании, добавляли 10% крахмальный клейстер. Полученную пасту протирали через сито, высушивали в условиях вакуума и измельчали до гранул размером не более 1 мм. Полученную после обработки стеаратом магния и крахмалом массу прессовали в таблетки массой 150 мг с использованием подходящего штампа.

Пример 7

Была приготовлена фармацевтическая композиция для лечения осложнений сахарного диабета, выполненная в форме таблетки следующего состава (в миллиграммах):

- хлористоводородная соль пептида Pro-Gly-Pro - 10 мг;

- кремния диоксид коллоидный - 6 мг;

- крахмал кукурузный - 54 мг;

- целлюлоза микрокристаллическая - 80 мг.

В технологическую емкость смесителя-гомогенизатора последовательно вносили хлористоводородную соль пептида Pro-Gly-Pro, кремния диоксид коллоидный, целлюлозу микрокристаллическую и кукурузный крахмал, периодически подвергая смесь перемешиванию до получения однородной массы. Затем к полученной смеси постепенно, при постоянном перемешивании, добавляли 10% крахмальный клейстер. Полученную пасту протирали через сито, высушивали в условиях вакуума и измельчали до гранул размером не более 1 мм. Полученную после обработки стеаратом магния и крахмалом массу прессовали в таблетки массой 150 мг с использованием подходящего штампа.