Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА БИОМАССЫ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в процессе аэробной глубинной ферментации при выращивании культур микроорганизмов и продуцентов ферментов.

Известны способы производства биомассы аэробных микроорганизмов [Ферментационные аппараты для процессов микробиологического синтеза / А.Ю.Винаров, Л.С.Гордеев, А.А.Кухаренко, В.И.Панфилов // М.: ДеЛи принт, 2005. - 191 с.], включающие подготовку жидкой питательной среды, посевного материала и культивирование микроорганизмов.

Недостатком является то, что известные способы не предусматривают подготовку энергоносителей и их рациональное использование при выращивании культур микроорганизмов и не могут быть эффективно реализованы в условиях децентрализованных систем теплоснабжения, когда тепловая энергия генерируется непосредственно на объекте производства, что характерно для мини-производств и предприятий малой мощности. При этом исключается возможность использования теплоты низкотемпературного потенциала, в частности бросового тепла газотурбинных установок и котельных агрегатов, что не позволяет в полной мере решать задачи энергосбережения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ производства биомассы аэробных микроорганизмов [Пат. РФ №2322488 С2, C12N 1/00, С12М 1/00, Опубл. 20.04.2008. Бюл. №11, ч.III], предусматривающий насыщение культуральной жидкости аэрирующим агентом, в качестве которого используют воздух, с отводом отработанного воздуха и культуральной жидкости с накопленной биомассой.

Недостатком является то, что в данном способе отсутствует система подготовки энергоносителей, в частности «теплой» и «холодной» воды в замкнутом термодинамическом цикле с использованием пароэжекторной холодильной машины, работающей в режиме теплового насоса, для стабилизации температурных режимов при приготовлении жидкой посевной культуры в инокуляторе, при непосредственном выращивании культуры микроорганизмов в ферментере и охлаждении готовой культуры в приемных сборниках, что не позволяет рассматривать известный способ как энергетически эффективный, экологически безопасный и обеспечивающий высокий выход культуральной жидкости с накопленной биомассой.

Технической задачей изобретения является увеличение выхода культуральной жидкости с накопленной биомассой аэробных микроорганизмов, снижение удельных энергозатрат и обеспечение экологической безопасности на всех стадиях производства.

Для решения технической задачи изобретения предложен способ производства биомассы аэробных микроорганизмов, характеризующийся тем, что сначала осуществляют проверку на герметичность инокулятора с охлаждающей рубашкой, с устройствами аэрации и перемешивания, с линиями выхлопа отработанного стерильного воздуха и передавливания жидкого посевного материала в ферментер для аэробной глубинной ферментации, и затем стерилизуют инокулятор паром через устройство аэрации под давлением 0,20…0,25 МПа в течение 30…40 мин и заполняют питательной средой, которую подогревают паром до температуры 100°С, доводят температуру питательной среды до 121…123°С при давлении пара 0,10…0,15 МПа и выдерживают ее при этих параметрах в течение 15…60 мин, после чего снижают давление в инокуляторе до 0,03…0,05 МПа, а в его охлаждающую рубашку подают «холодную» воду с температурой 7…10°С и охлаждают питательную среду до температуры культивирования 31…32°С, после охлаждения питательной среды прекращают подачу стерильного воздуха в инокулятор, закрывают линию выхлопа отработанного стерильного воздуха, производят засев питательной среды посевным материалом и обеспечивают ее однородность посредством устройства перемешивания с аэрацией стерильным воздухом; полученную жидкую посевную культуру культивируют при рН 4,2…4,5 и температуре 31…32°С до достижения фазы экспоненциального роста в течение 12…14 час и затем ее направляют путем передавливания стерильным воздухом из инокулятора в предварительно проверенный на герметичность и стерилизованный ферментер с обогревающей рубашкой, с устройствами аэрации и перемешивания в количестве 3…10% от количества питательной среды, причем заполняют его на 7/10 от его объема и осуществляют выращивание культуры микроорганизма при температуре ферментации 28…40°С в течение 96…120 часов при непрерывной аэрации стерильным воздухом, механическом перемешивании и подаче «теплой» воды с температурой 27…47°С в обогревающую рубашку ферментера; после ферментации культуральную жидкость с накопленной биомассой подают в предварительно стерилизованные сборники готовой культуры, в которых поддерживают ее температуру на уровне 8…10°С посредством системы охлаждения; для подготовки «холодной» и «теплой» воды используют пароэжекторную холодильную машину, работающую в режиме теплового насоса и состоящую из эжектора, испарителя, холодоприемника, конденсатора, терморегулирующего вентиля, сборника отработанной воды, парогенератора с электронагревательными элементами и предохранительным клапаном, насоса подачи воды в парогенератор, насоса рециркуляции хладагента через холодоприемник, работающих по замкнутому термодинамическому циклу; при этом в парогенераторе получают рабочий пар и под давлением 0,05…0,06 МПа подают в сопло эжектора, вовлекая эжектируемые пары хладагента, в качестве которого используют воду, из испарителя и создают в нем пониженное давление 0,0009…0,001 МПа с температурой кипения хладагента 4…7°С; за счет рецируляции хладагента через холодоприемник получают «холодную» воду с температурой 7…10°С путем рекуперативного теплообмена между хладагентом и водой и подают ее в охлаждающую рубашку инокулятора и систему охлаждения сборников готовой культуры; теплоту конденсации, образовавшейся после эжектора смеси паров хладагента и рабочего пара в конденсаторе, используют для получения «теплой» воды, которую посредством рекуперативного теплообмена нагревают до температуры 27…47°С и подают в обогревающую рубашку ферментера; часть образовавшегося после конденсатора водяного конденсата направляют через терморегулирующий вентиль в испаритель для пополнения в нем убыли воды, а избыточную часть выводят из замкнутого цикла пароэжекторной холодильной машины и вместе с отработанной водой после инокулятора, ферментера и сборников готовой культуры подают в сборник отработанной воды, из которого одну часть воды направляют на пополнение убыли воды в парогенераторе, а другую ее часть по двум потокам подают в холодоприемник и конденсатор пароэжекторной холодильной машины с образованием замкнутого цикла.

Технический результат изобретения заключается в увеличении выхода культуральной жидкости с накопленной биомассой аэробных микроорганизмов, повышении энергетической эффективности и экологической безопасности производства.

На фиг.1 представлена схема, реализующая предлагаемый способ.

На схеме показаны ферментер 1 с обогревающей рубашкой 2, устройствами перемешивания 3 и аэрации 4; инокулятор 5 с охлаждающей рубашкой 6, устройствами перемешивания 7 и аэрации 8; сборники готовой культуры 9 с системой охлаждения 10; сборник отработанной воды и конденсата 11; парогенератор 12 с электронагревательными элементами 13 и предохранительным клапаном 14; эжектор 15; конденсатор 16; терморегулирующий вентиль 17; испаритель 18; холодоприемник 19; насосы 20, 21, 22, 23, 24; линии материальных потоков: 0.1 - стерильного воздуха; 0.2 - выхлопа отработанного стерильного воздуха; 1.0 - холодной воды; 1.1 - отработанной воды; 1.2 - рециркуляции хладагента через холодоприемник; 1.3 - воды в холодоприемник; 1.4 - воды в конденсатор; 7.5 - теплой воды в ферментер; 2.0 - рабочего пара; 2.7 - пара в инокулятор и ферментер; 2.2 - эжектируемого пара хладагента; 2.3 - смеси рабочего и эжектируемого паров; 2.4 - конденсата; 2.5 - сброса давления; 3.1 - питательной среды; 3.2 - посевного материала; 3.3 - передавливания жидкой посевной культуры; 3.4 - культуральной жидкости с накопленной биомассой аэробных микроорганизмов.

Способ осуществляют следующим образом.

Технологический цикл производства биомассы аэробных микроорганизмов начинают с приготовления жидкой посевной культуры в инокуляторе 5 с охлаждающей рубашкой 6, устройствами перемешивания 7 (двух- или трехъярусной мешалкой) и аэрации 8 (форсунками или барботерами).

После проверки на герметичность стерильным воздухом, подаваемым по линии 0.1 под давлением 0,07 МПа, и мыльной пеной, нанесенной на места соединения (крышка, фланцы, сальники, вентили и т.д.), инокулятор проверяют на герметичность паром, подаваемым по линии 2.1 через устройство аэрации 8 при закрытой линии выхлопа отработанного стерильного воздуха 0.2. Если обнаружены пропуски воздуха или пара, а также снижение давления в инокуляторе, устраняют обнаруженные дефекты и снова выполняют проверку на герметичность.

После проверки на герметичность инокулятор 5 стерилизуют паром, подаваемым по лини 2.1 из парогенератора 12 через устройство аэрации 8 под давлением 0,20…0,25 МПа в течение 30…40 мин, а затем заполняют питательной средой по линии 3.1, которую подогревают паром до температуры 100°С при открытой выхлопной линии 0.2. После этого закрывают линию выхлопа отработанного стерильного воздуха 0.2 и доводят температуру питательной среды до 121…123°С при давлении пара 0,10…0,15 МПа и выдерживают ее в течение 15…60 мин, после чего снижают давление в инокуляторе до 0,03…0,05 МПа, а в его охлаждающую рубашку 6 по линии 1.0 подают «холодную» воду и охлаждают питательную среду до температуры культивирования 28…40°С.

После охлаждения питательной среды производят ее засев посевным материалом через посевной лючок (на схеме не показан) по линии 3.2. Перед засевом прекращают подачу стерильного воздуха в инокулятор по линии 0.1 и одновременно закрывают линию выхлопа отработанного стерильного воздуха 0.2. После засева возобновляют подачу стерильного воздуха, открывают линию выхлопа отработанного стерильного воздуха 0.2 и осуществляют выращивание культуры микроорганизмов.

Образовавшуюся жидкую посевную культуру в инокуляторе 5 культивируют при рН 4,2…4,5 и температуре 31…32°С до достижения фазы экспоненциального роста в течение 12…14 час, обеспечивая ее однородность посредством перемешивающего устройства 7.

По истечении времени культивирования жидкую посевную культуру передавливают стерильным воздухом через линию передавливания 3.3 из инокулятора 5 в предварительно проверенный на герметичность и стерилизованный ферментер 1 в количестве 3…10% от количества питательной среды, которой заполняют 7/10 его объема.

Проверку на герметичность и стерилизацию ферментера осуществляют аналогично, как и инокулятора.

В ферментере 1 осуществляют выращивание культуры микроорганизма с температурой ферментации 28…40°С в течение 96…120 часов при непрерывной аэрации стерильным воздухом через устройство аэрации 3, механическом перемешивании с помощью перемешивающего устройства 4 и подаче «теплой» воды по линии 1.3 в обогревающую рубашку 2.

Культуральную жидкость с накопленной биомассой аэробных микроорганизмов из ферментера с помощью насоса 22 подают по линии 3.4 в предварительно стерилизованные сборники готовой культуры 9 с системой охлаждения 10, где поддерживают температуру культуры на уровне 8…10°С.

Для подготовки «холодной» и «теплой» воды используют пароэжекторную холодильную машину, работающую в режиме теплового насоса, состоящую из эжектора 15; испарителя 18; холодоприемника 19; конденсатора 16; терморегулирующего вентиля 17; сборника отработанной воды 11, парогенератора 12 с теплонагревательными элементами 13 и предохранительным клапаном 14; насоса подачи воды в парогенератор 23; насоса рециркуляции хладагента через холодоприемник 20, работающих по замкнутому термодинамическому циклу.

При этом в парогенераторе 12 посредством электронагревательных элементов 13 получают рабочий пар и под давлением 0,05…0,06 МПа по линии 2.0 подают в сопло эжектора 15, вовлекая по линии 2.2 эжектируемые пары хладагента, в качестве которого используют воду из испарителя 18, и создают в нем пониженное давление 0,0009…0,001 МПа с температурой кипения хладагента 4…7°С. За счет рецируляции хладагента по линии 1.2 через холодоприемник 19 получают «холодную» воду с температурой 7…10°С путем рекуперативного теплообмена между хладагентом и водой, подаваемой по линии 1.3 в холодоприемник 19 из сборника 11 с помощью насоса 24.

Полученную «холодную» воду из холодоприемника 19 по линии 1.0 подают в охлаждающую рубашку 6 инокулятора 5 и систему охлаждения 10 сборников готовой культуры 9.

Образовавшуюся после эжектора 15 смесь паров хладагента и рабочего пара по линии 2.3 направляют в конденсатор 16. Процесс конденсации сопровождается выделением теплоты, при этом теплоту конденсации в конденсаторе 16 используют для получения «теплой» воды посредством рекуперативного теплообмена между водой, подаваемой из сборника 11 насосом 24 по линии 1.4 в конденсатор 16, и конденсирующими парами смеси в конденсаторе 16. Нагретую до температуры 27…47°С воду подают по линии 7.5 в обогревающую рубашку 2 ферментера 1.

Часть образовавшегося после конденсатора 16 водяного конденсата направляют через терморегулирующий вентиль 17 по линии 2.4 в испаритель 18 для пополнения в нем убыли воды, а избыточную часть конденсата выводят из замкнутого цикла пароэжекторной холодильной машины и вместе с отработанной водой после инокулятора 5, ферментера 1 и сборников готовой культуры 9 подают по линиям 1.1 в сборник отработанной воды 11, из которого одну часть воды направляют по линии 7.2 на пополнение убыли воды в парогенераторе 12, а другую ее часть по двум потокам 1.3 и 1.4 с помощью насоса 24 подают в холодоприемник 19 и конденсатор 16 пароэжекторной холодильной машины с образованием замкнутого цикла. При увеличении давления пара в парогенераторе срабатывает предохранительный клапан, осуществляющий сброс давления.

Примеры реализации способа.

Способ производства биомассы аэробных микроорганизмов осуществляют в следующей последовательности. Сначала готовят жидкую посевную культуру в инокуляторе в соответствии с производственным циклом (в ч):

Процесс выращивания культур микроорганизмов в ферментере аэробной глубинной ферментации осуществляют с аэрацией стерильным воздухом с помощью барботера и перемешиванием с помощью механической мешалки, который заключался в дозированной подаче потоков питательной среды, инокулята (посевного материала), стерильного воздуха, «теплой» воды в обогревающую рубашку для обеспечения высокой интенсивности массо- и энергообмена микробных клеток инокулята с питательной средой за счет стабилизации параметров процесса на уровне, требуемом для оптимального развития продуцента и образования целевого продукта. Из ферментера отводят отработанный воздух, отработанную воду и культуральную жидкость с накопленной биомассой.

Производственный цикл ферментера составлял (в ч):

Процесс ферментации осуществляют в вертикальном ферментере фирмы «Sartorius Stedim Biotech» серии BIOSTATc рабочим объемом 100 л, предназначенным для выращивания микроорганизмов или культур клеток. Контроль над параметрами процесса обеспечивается микропроцессорной системой управления DCU (Digital Control Unit). Для стабилизации температурных режимов при приготовлении жидкой посевной культуры в инокуляторе, непосредственном выращивании культуры микроорганизмов в ферментере и охлаждении готовой культуры в приемных сборниках осуществляют подготовку «теплой» и «холодной» воды с использованием пароэжекторной холодильной машины, работающей в режиме теплового насоса, с технической характеристикой:

Конструкция пароэжекторной холодильной машины не содержит движущихся быстроизнашивающихся элементов, благодаря чему обеспечивается безотказная работа машины длительными циклами без непосредственного обслуживания, при этом минимизированы объемы текущего ремонта, стоимость и потребность в запасных частях и вспомогательных материалах.

Пример №1

В качестве объекта производства использован ферментный препарат инулиназы, полученный глубинным способом с использованием продуцента микромицета Aspergillus awamori 2250.

Инокулятор с охлаждающей рубашкой, с устройствами аэрации и перемешивания, с линиями выхлопа отработанного стерильного воздуха и передавливания жидкого посевного материала в ферментер для аэробного глубинного культивирования проверяют на герметичность, затем стерилизуют инокулятор паром под давлением 0,25 МПа в течение 40 мин. Заполняют питательной средой, которую подогревают паром до температуры 100°С, доводят температуру питательной среды до 123°С при давлении пара 0,15 МПа и выдерживают ее при этих параметрах в течение 40 мин, после чего снижают давление в инокуляторе до 0,05 МПа и охлаждают питательную среду до температуры культивирования 31±0,5°С и производят засев питательной среды посевным материалом. Жидкую посевную культуру культивируют при рН 4,2 и температуре 31±0,5°С до достижения фазы экспоненциального роста в течение 12 часов. Затем ее направляют из инокулятора в предварительно проверенный на герметичность и стерилизованный ферментер в количестве 4% от количества питательной среды, причем заполняют его на 7/10 от его объема и осуществляют выращивание культуры микроорганизма при температуре ферментации 31±0,5°С в течение 96 часов при непрерывной аэрации стерильным воздухом, механическом перемешивании. После ферментации культуральную жидкость с накопленной биомассой подают в предварительно стерилизованные сборники готовой культуры, в которых поддерживают ее температуру на уровне 8°С.

Максимальный выход целевого продукта по активности достигался при следующем режиме культивирования:

состав питательной среды, %:

Пример №2

Способ осуществляли аналогично примеру 1, но аэробное глубинное культивирование проводили микромицета Trichoderma harzianum F114 продуцента фермента β-маннаназы, который гидролизует маннаны растительного углеводсодержащего сырья до маннозы.

Инокулятор с охлаждающей рубашкой, с устройствами аэрации и перемешивания, с линиями выхлопа отработанного стерильного воздуха и передавливания жидкого посевного материала в ферментер для аэробного глубинного культивирования проверяют на герметичность, затем стерилизуют инокулятор паром под давлением 0,20 МПа в течение 30 мин. Заполняют питательной средой, которую подогревают паром до температуры 100°С, доводят температуру питательной среды до 121°С при давлении пара 0,10 МПа и выдерживают ее при этих параметрах в течение 40 мин, после чего снижают давление в инокуляторе до 0,03 МПа и охлаждают питательную среду до температуры культивирования 35±0,5°С и производят засев питательной среды посевным материалом. Жидкую посевную культуру культивируют при рН 4,5 и температуре 35±0,5°С до достижения фазы экспоненциального роста в течение 14 часов. Затем ее направляют из инокулятора в предварительно проверенный на герметичность и стерилизованный ферментер в количестве 2% от количества питательной среды, причем заполняют его на 7/10 от его объема и осуществляют выращивание культуры микроорганизма при температуре ферментации 35±0,5°С в течение 72 часов при непрерывной аэрации стерильным воздухом, механическом перемешивании. После ферментации культуральную жидкость с накопленной биомассой подают в предварительно стерилизованные сборники готовой культуры, в которых поддерживают ее температуру на уровне 10°С.

Максимальный выход целевого продукта по активности достигался при следующем режиме культивирования:

состав питательной среды, %:

Рациональное использование тепловой и электрической энергии в системе холодо- и теплоснабжения с применением пароэжекторной холодильной машины, работающей в режиме теплового насоса, рассматривалось с точки зрения увеличения выхода культуральной жидкости с накопленной биомассой аэробных микроорганизмов и снижения себестоимости получаемого целевого продукта.

Стабилизация температурных режимов процессов подготовки жидкой посевной культуры и аэробной глубинной ферментации посредством уменьшения разброса температур энергоносителей, в качестве которых использовалась «теплая» и «холодная» вода в замкнутом термодинамическом цикле с применением пароэжекторной холодильной машины, позволяет увеличить выход культуральной жидкости с накопленной биомассой аэробных микроорганизмов.

Основным принципиальным решением по снижению энергозатрат в предлагаемом способе производства биомассы аэробных микроорганизмов является оптимальный выбор перепадов температур в испарителе и конденсаторе пароэжекторной холодильной машины при получении «холодной» и «теплой» воды. Отклонение от этих значений неизбежно приведет к увеличению потребляемой энергии: понижение температуры кипения хладагента в испарителе на 1°С приведет к необходимости увеличения расхода рабочего пара в эжектор, а следовательно, к перерасходу энергии на 5…7%, а повышение температуры конденсации на 1°С приведет к увеличению расхода энергии на 2,0…2,5% [Тепловые и конструктивные расчеты холодильных машин / Е.М.Бамбушек, Н.Н.Бухарин, Е.Д.Герасимов и др.; Под общ. ред. И.А.Сакуна. - Л.: Машиностроение. Ленинградское отделение, 1987. - 423 с.].

Предлагаемый способ производства биомассы аэробных микроорганизмов с применением пароэжекторной холодильной машины расширяет границы энергоэффективного сопряжения объектов различных температурных потенциалов на основе утилизации и рекуперации вторичных энергоресурсов. При этом в полной мере реализован универсальный подход в создании конкурентоспособной технологии, обеспечивающей выработку тепла и холода для совместно протекающих процессов подготовки жидкой посевной культуры в инокуляторе, непосредственном выращивании культуры микроорганизмов в ферментере и охлаждении готовой культуры в приемных сборниках.

Таким образом, предлагаемый способ производства биомассы аэробных микроорганизмов позволяет:

- увеличить выход культуральной жидкости с накопленной биомассой аэробных микроорганизмов;

- обеспечить экологическую безопасность на всех стадиях производства культуральной жидкости с накопленной биомассой аэробных микроорганизмов;

- позволяет снизить удельные энергозатраты на 5…7% путем рационального включения инокулятора, ферментера и сборников готовой культуры в тепловую схему производства с использованием пароэжекторной холодильной машины, работающей в режиме теплового насоса;

- обеспечить повышение энергетической эффективности процессов ферментации за счет использования теплоты конденсации хладагента в конденсаторе холодильной машины при нагревании воды с последующей ее подачей в греющую рубашку ферментера и потенциала хладагента в холодоприемнике при охлаждении воды с последующей подачей в охлаждающую рубашку инокулятора и систему охлаждения приемных сборников готовой культуры;

- создать реальные условия утилизации пара низкого давления;

- в качестве энергоносителя используется водяной пар с давлением 0,05…0,06 МПа, благодаря чему достигается экономия электроэнергии, которая расходуется только на работу органов управления, насосов хладагента и воды, теплонагревательных элементов парогенератора.