КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ВЕТЕРИНАРИИ, СОДЕРЖАЩАЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИНТЕРФЕРОН АЛЬФА-2b, ТОКОФЕРОЛА АЦЕТАТ И АСКОРБИНОВУЮ КИСЛОТУ, ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО МУЛЬТИФЕРОН ДЛЯ ВЕТЕРИНАРИИ НА ЕЕ ОСНОВЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА МУЛЬТИФЕРОН В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВОВИРУСНОГО И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО СРЕДСТВА В СХЕМАХ ВАКЦИНАЦИИ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Область техники

Изобретение относится к ветеринарии и представляет собой композицию человеческого рекомбинантного интерферона, токоферола ацетата (витамин Е) и аскорбиновой кислоты (витамин С), обладающую более высоким противовирусным и иммуномодулирующим действием по сравнению с композицией интерферона без витаминов. Созданный на основе указанной композиции препарат Мультиферон^® предназначен для лечения желудочно-кишечных и острых респираторных заболеваний вирусной и смешанной этиологии у крупного рогатого скота, свиней, лошадей, овец и их молодняка. Также к настоящему изобретению относится применение препарата Мультиферон^® при вакцинации молодняка сельскохозяйственных животных.

Предшествующий уровень техники

Использование в медицине человеческого рекомбинантного интерферона в качестве противовирусного и иммуномодулирующего средства в последние годы получило широкое распространение. Часто для проведения подобной терапии используют свечи или растворы местного применения (например, препарат Гриппферон).

Известен препарат в форме раствора для применения в качестве глазных капель, интраназально, интравагинально, интрауретально, для введения в гайморовы пазухи и для орошения слизистой оболочки респираторного тракта. Препарат обладает пролонгированным действием и содержит в мг на 1 мл: интерферон человеческий рекомбинантный (1-50)·10³ ME, лимонную кислоту 1-3, борную кислоту 8-11, натрия тетраборат 5-10, унитол 1-5, альбумин сывороточный человеческий 1-5, натрия хлорид 1-3, натрия карбоксиметилцеллюлозу или гидроксиэтилцеллюлозу 5-50, и воду, очищенную до 1 мл (патент РФ №2270692). В качестве антимикробных веществ используются борная кислота и тетраборат натрия. Данный препарат предназначен для местного применения и не рассматривается в качестве инъекционного препарата вследствие значительно меньших количеств интерферона, чем необходимо для проведения инъекционной терапии.

Известен препарат, содержащий в 1 г следующие компоненты: интерферон человеческий рекомбинантный (10⁴-3·10⁶) ME, полиэтиленгликоль 4000-6000 - 0,0001-0,5, полиглюкин 0,001-0,1, структурообразователь (мальтоза, манит, глюкоза, фруктоза) 0,01-0,8, набухающее и диспергирующее вещество (целлюлоза, метилцеллюлоза, ацетилфталилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и т.д.) 0,001-0,1 и целевая добавка - остальное. При этом препарат представляет собой смесь для формирования таблетки или содержимого капсулы. В качестве интерферона используют сухую субстанцию, сублимированную из раствора, содержащего полиглюкин, структурообразователь и рекомбинантный человеческий интерферон, адсорбированный полиэтиленгликолем (патент РФ №2292907). Однако данный препарат не является инъекционным, а указанная композиция должна была увеличить биодоступность рекомбинантного человеческого интерферона в таблетированном виде.

Известно противовирусное и антибактериальное средство «Интерлизин» (патент РФ №2188665), представляющее собой водный раствор интерферона и лизоцима при следующем соотношении компонентов: интерферон 2500-5000 МЕ/мл и лизоцим 2,5-5,0 мг/мл. Препарат является местным средством, содержит интерферон в концентрациях на три-четыре порядка ниже, чем необходимо для проведения инъекционной терапии животных.

Близкими к предложенному лекарственному средству являются композиции, обладающие противовирусным, противобактериальным и противовоспалительным действиями (патент РФ №2187332). Лечебное средство представлено в виде мази, геля, суппозитория, пасты, крема, линимента, таблеток на основе интерферона и, дополнительно, иммуномодуляторов, витаминов, антибиотиков широкого спектра, антисептиков, противопаразитарных и противовоспалительных средств. В примерах патента РФ №2187332 группа витаминов представлена витаминами Е, С, Д3, РР в диапазоне концентраций 0,005-0,12 г на 1 г препарата, при этом в качестве интерферона представлены интерфероны альфа, бета и гамма. Также указанные в примерах композиции содержат в качестве активных веществ интерлейкин-2, фактор некроза опухоли альфа или бета, метронидазол, ацикловир, лидокаин и диклофенак. В примерах патента не указаны терапевтические достоинства указанных композиций (только декларированы их безопасность и отсутствие аллергических реакций у добровольцев 18-20 лет), не указано, что средство является инъекционным и предназначено для внутримышечного или подкожного введения (основные примеры приведены для мазей, гелей, суппозиториев, линиментов). К тому же данные композиции будут очень дорогостоящими при использовании их в ветеринарии при вакцинации сельскохозяйственных животных.

Наиболее близким к предложенному лекарственному средству является препарат Миксоферон^®, производства ЗАО «Мосагроген», Москва. Препарат Миксоферон^® представляет собой лиофилизат для приготовления раствора для инъекций или готовый раствор для инъекций, который содержит 0,5 или 1,0 млн ME интерферона в 1 мл раствора. Миксоферон^® применяют с профилактической и лечебной целями при желудочно-кишечных и острых респираторных заболеваниях вирусной и смешанной этиологии (вирусной на фоне бактериальной) у крупного рогатого скота, свиней, лошадей, овец и их молодняка (парагрипп-3, инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея КРС, трансмиссивный гастроэнтерит свиней, ринопневмония, грипп лошадей и другие заболевания).

Предлагаемая композиция человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2b, токоферола ацетата (витамин Е) и аскорбиновой кислоты (витамин С) и препарат Мультиферон^® на ее основе обладают более высоким противовирусным и иммуномодулирующим действием по сравнению с препаратом Миксоферон^®, который не содержит указанных витаминов.

Подробное описание изобретения

В области ветеринарной сельскохозяйственной медицины использование свечей, растворов местного применения или таблеток является трудоемким и неудобным процессом. При этом для подобных препаратов необходимо использовать более высокие концентрации интерферона, что связано с большей по сравнению с людьми массой животных. В этой области наиболее удобной формой препарата являются инъекционные растворы.

Целью настоящего изобретения является создание композиции для ветеринарии на основе человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2b, обладающей противовирусным и иммуномодулирующим действием, в виде стабильного раствора для инъекций, а также лекарственного средства на основе указанной композиции. Данная композиция и лекарственное средство на ее основе, за счет введения дополнительных активных веществ как обладающих собственным противовирусным и иммуномодулирующим действием, так и усиливающим противовирусное и иммуномодулирующее действие интерферона, должны иметь преимущество в контексте терапевтической эффективности противовирусного ветеринарного препарата по сравнению с препаратом интерферона без подобных добавок.

Известно, что аскорбиновая кислота обладает противовирусным и иммуномодулирующим действием как сама по себе, так и в комплексах с другими веществами (Jariwalla RJ, Harakeh S. «Antiviral and immunomodulatory activities of ascorbic acid», Subcell Biochem. 1996; 25:213-31. Furuya A, Uozaki M, Yamasaki H et al., «Antiviral effects of ascorbic and dehydroascorbic acids in vitro», Int J Mol Med. 2008 Oct; 22(4):541-5). Аскорбиновая кислота участвует в иммуномодулировании, стимулируя синтез экзогенного интерферона. Витамин С переводит двухвалентное железо в трехвалентное, тем самым способствует его всасыванию. Являясь сильнейшим антиоксидантом, защищает липопротеины от окисления.

Токоферол ацетат (витамин Е) также является антиоксидантом, обладает противовирусной и иммуномодулирующей активностью, является стабилизатором клеточных мембран (United States Patent 5114957, «Tocopherol-based antiviral agents and method of using same», 05/19/1992. Bailin Liang, Ronald R Watson, «Monthly Updates Biologicals & Immunologicals: Vitamin E and immunomodulation for cancer and Aids resistance», 1996, Vol.5, No.9, P.1221-1225). Витамин Е увеличивает пролиферацию лимфоцитов, уменьшает продукцию иммуносупрессивного простагландина Е2 и уменьшает уровни иммуносупрессивных сывороточных жировых пероксидов. (Das SK, Gupta G, Rao DN, et al. Effect of lecithin with vitamin-B complex and tocopheryl acetate on long-term effect of ethanol induced immunomodulatory activities. Indian JExp Biol. Aug 2007; 45(8):683-8.)

Совместное использование интерферона и витамина Е в контексте усиления противовирусной активности интерферона также было описано в литературе (Перцева Н.Г., Ананенко А.А., Малиновская В.В. и др. «Влияние реаферона и альфа токоферола на процессы перекисного окисления липидов при экспериментальной гриппозной инфекции». Вопр. вирусол. - 1995. - №2 - 59-62).

Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению, содержащая человеческий рекомбинантный интерферон, токоферола ацетат (витамин Е) и аскорбиновую кислоту (витамин С), может обладать более высоким противовирусным и иммуномодулирующим действием по сравнению с композицией интерферона без витаминов. При этом ветеринарный инъекционный препарат Мультиферон^®, в котором соотношения этих трех активных компонентов обоснованы, будет более эффективным препаратом по сравнению с другими препаратами интерферона для лечения желудочно-кишечных и острых респираторных заболеваниях вирусной и смешанной этиологии у крупного рогатого скота, свиней, лошадей, овец и их молодняка.

Кроме того, композиция согласно настоящему изобретению, содержащая человеческий рекомбинантный интерферон, токоферола ацетат (витамин Е) и аскорбиновую кислоту (витамин С), представляет собой масляно-водную эмульсию, способную пролонгировать всасывание и выведение интерферона, т.е. композицию пролонгированного действия. В состав масляной фазы, помимо токоферола ацетата, входит гидрогенизированное касторовое масло и поверхностно-активное вещество, стабилизирующее эмульсию. В данной системе аскорбиновая кислота дополнительно выступает как антиоксидант и стабилизатор интерферона.

Препарат Мультиферон^®, созданный на основе вышеописанной композиции, может применяться как противовирусное средство, с профилактической и лечебной целью при желудочно-кишечных и острых респираторных заболеваниях вирусной и смешанной этиологии (вирусной на фоне бактериальной) у крупного рогатого скота, свиней, лошадей, овец и их молодняка (парагрипп-3, инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея КРС, трансмиссивный гастроэнтерит свиней, ринопневмония, грипп лошадей и другие заболевания). Препарат рекомендован для профилактики и смягчения действия комбинированных стрессов, для уменьшения вероятности возникновения послеродовых осложнений, а также в ходе проведения массовых ветеринарных мероприятий: вакцинации и дегельминтизации.

Нарушение функции иммунной системы рассматривается как один из патогенетических механизмов любого патологического процесса. Первичные (или врожденные) иммунодефициты (ИД) являются следствием наличия в организме генетического дефекта. Вторичные ИД, которые встречаются чаще, носят приобретенный характер и обусловлены воздействием на организм вирусов, бактерий, паразитов, нарушением обмена веществ.

Наиболее распространенной формой вторичной иммунологической недостаточности животных являются нарушения в передаче материнских антител потомству, обуславливающие высокую заболеваемость и смертность новорожденных животных.

Вторичные ИД являются результатом воздействия неблагоприятных факторов, сопровождают хронические вирусные и бактериальные инфекции. Они характеризуются нарушением гуморального и клеточного иммунитета, отсутствием или снижением активности цитотоксических лимфоцитов и макрофагов. Вторичные ИД могут быть обусловлены нарушением функциональной активности лимфоцитов и макрофагов, а также NK-клеток. Хронические, часто рецидивирующие, вялотекущие, трудно поддающиеся лечению традиционными средствами воспалительные процессы любой локализации, повышенная частота возникновения аллергических и аутоиммунных заболеваний рассматриваются как клинические проявления вторичного ИД.

При этом, например, выраженный у поросят ИД устанавливается при обнаружении иммуноглобулинов (Ig) в сыворотке их крови в концентрации менее 8,0 мг/мл.

При оценке В-системы иммунитета важнейшими показателями являются: % и абсолютное количество В-лимфоцитов (CD19, CD20) и уровень продуцируемых иммуноглобулинов G-, М- и А-классов. Определение количества Ig - важнейший критерий при диагностике ИД, связанных с биосинтезом антител.

Наиболее значимыми являются отличия в содержании иммуноглобулинов G- и М-изотипов. При этом важным фактором, обуславливающим концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке крови поросят, является время потребления молозива, количество молозива, попавшее в пищеварительный тракт поросенка, содержание в нем иммуноглобулинов и эффективность их абсорбции в кишечнике. Очевидно, что эти параметры могут отличаться у поросят, не только содержащихся в различных условиях, но даже и у поросят одного помета.

Согласно полученным данным, большое значение для практики имеют индивидуальные различия в количественном содержании IgG и IgM у животных одного хозяйства. Так, в любой популяции обследованных животных одного хозяйства, фермы и даже одного помета могут присутствовать поросята с выраженным иммунодефицитом, объективным показателем которого является низкий уровень IgG.

Эти животные впоследствии не могут адекватно отвечать на введение вакцины формированием выраженного иммунитета, поэтому, оставаясь в стаде и будучи неиммунными, они могут быть восприимчивы к заражению вирулентным возбудителем. Было установлено, что у поросят с выраженным иммунодефицитом (IgG<6 мг/мл) после проведения плановой вакцинопрофилактики не были обнаружены (или были на крайне низком уровне) антитела к вирусу классической чумы свиней (КЧС), в то время как у животных с нормативным содержанием IgG они достигли протективного значения.

Также анализ полученных данных по обнаружению антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) и цирковируса свиней (ЦВС-2) показал следующее: у 70% иммунодефицитных поросят в сыворотке крови антитела не были выявлены, в то время как у всех серопозитивных животных уровень IgG превышал 8 мг/мл.

В подобных ситуациях для иммунодифицитного молодняка применение препаратов интерферона и препарата Мультиферон^®, в частности, способно повысить иммунный статус животного до получения устойчивого иммунного ответа на вакцинирование.

Таким образом, к настоящему изобретению относится применение препарата Мультиферон^® в качестве противовирусного и иммуномодулирующего средства, повышающего иммунитет молодняка сельскохозяйственных животных в период доращивания, увеличивающего сохранность молодняка и усиливающего иммунный ответ молодняка в процессе вакцинации.

Сущность изобретения поясняется в следующих примерах.

Пример 1. Получение лекарственных форм в виде раствора для инъекций с разными

соотношениями интерферона и витаминов

Для приготовления масляной части эмульсии помещают навески гидрогенизированного касторового масла (Кремофор EL, BASF), твина-80 и токоферола ацетата в реактор. Смесь перемешивают, нагревают до 50°С и инкубируют при данной температуре в течение 10 минут. В отдельную емкость заливают воду для инъекций и добавляют при постоянном перемешивании цитрат натрия 5,5 водный и аскорбиновую кислоту. При постоянном перемешивании в реактор медленно вливают водный раствор. Охлаждают смесь до комнатной температуры при постоянном перемешивании и вносят необходимое количество субстанции человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2b с удельной активностью 2,2·10⁸ МЕ/мг.

Доводят объем полученного раствора до расчетного водой для инъекций. Полученный раствор представляет собой прозрачную бесцветную жидкость без посторонних включений. Далее проводят стерилизующую фильтрацию раствора в стерильную емкость и разливают стерильно по 10 мл в стерильные 10-мл флаконы, укупоривают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками.

Полученные препараты, после измерения содержания действующих веществ, имели состав, представленный в таблице 1.

Пример 2. Исследование стабильности опытных препаратов

Опытные серии из предыдущего примера хранили в течение 18 месяцев при температурах 4±2°С, 20±2°С, 30±1°С, 40±1°С. Результаты измерения содержания действующих веществ (в 10⁵ МЕ/мл - для интерферона и в мг/мл - для витаминов) представлены в таблице 2. В качестве контроля приведена субстанция интерферона, разведенная 50 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 4,5 до активности 10,0-10⁵ МЕ/мл, стерилизованная аналогично опытным сериям препарата.

Из таблицы видно, что выбранные композиции значительно стабилизируют интерферон по сравнению с контролем на всех температурах. При хранении препарата от 4 до 22°С опытные серии показывают незначительное падение действующих веществ, вплоть до 1 года хранения.

Пример 3. Исследование иммуномодулирующего действия опытных серий препарата

Исследование проводилось в условиях предприятия, находящегося, на момент проведения исследования, в сложном финансово-экономическом положении: сокращение рационов, нехватка химиотерапевтических и профилактических лекарственных средств, что, с одной стороны, повлияло на полученные результаты, но в то же время достигнутые результаты являются особенно показательными.

Целью исследования явилась подготовка иммунной системы поросят к вакцинации протии болезни Ауески и болезни классической чумы свиней (КЧС). Оба заболевания имеют вирусную природу. Также целью исследования являлась профилактика технологического стресса поросят, возникающего вследствие перевода животных на доращивание.

Схема эксперимента представлена на Фигуре 1 и заключалась в следующем.

Было сформировано 5 групп животных в возрасте 18-20 дней, по 30 голов в каждой группе, подобранных по принципу парных аналогов. В 1-й группе - Миксоферон серии оп-020110, внутримышечно в дозе 1 мл/гол.; во 2-й группе - Мультиферон серии-01 внутримышечно в дозе 1 мл/гол.; в 3-й группе - Мультиферон серии-02 внутримышечно в дозе 1 мл/гол.; в 4-й группе - Мультиферон серии-03 внутримышечно в дозе 1 мл/гол. Пятая группа - контроль. Поросята всех групп в возрасте 28 дней вакцинированы и в 50-дневном возрасте ревакцинированы против болезни Ауески. В 40-дневном возрасте поросята вакцинированы против классической чумы свиней. Пробы крови получены до введения препаратов и вакцинации, в 50-дневном возрасте и через 20 дней после ревакцинации.

При формировании групп вес животных составил 4,0-5,5 кг. Показатели продуктивности в группах показаны в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, препараты интерферона, вводимые по указанной схеме в период вакцинации и перевода животных на доращивание, приводят к увеличению сохранности на 10-15% и увеличивают среднесуточный прирост.

По результатам биохимии крови в начале опыта отмечалось понижение кальция в крови и повышение фосфора, что было связано с нарушением баланса минерального питания животных. В конце опыта в контрольной группе наблюдали дисбаланс кальция к фосфору. Во всех опытных группах баланс между кальцием и фосфором находился в норме.

Результаты исследования сывороток крови на содержание иммуноглобулинов отдельных классов (мг/мл) приведены в таблице 4.

где М - среднее значение, STD - стандартное отклонение

Количественное определение уровня иммуноглобулинов отдельных классов проведено методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием моноспецифических антисывороток и моноклональных антител к отдельным классам иммуноглобулинов и стандартной сыворотки крови свиней с известным содержанием иммуноглобулинов отдельных классов.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что в целом изменения в количественной характеристике уровня иммуноглобулинов отдельных классов в сыворотке крови поросят носят возрастной характер. При этом следует отметить, что в возрасте 20 дней (начало эксперимента) 25,0% поросят имеют выраженное иммунодефицитное состояние, связанное с элиминацией пассивно приобретенных колостральных иммуноглобулинов. Введение поросятам Миксоферона^® и Мультиферона^® в сочетании с вакцинацией оказывает определенное стимулирующее влияние на синтез иммуноглобулинов в сравнении с контрольной группой, где изменения в количестве иммуноглобулинов связаны с собственным их синтезом. Более высокие показатели на заключительном этапе исследований отмечены во 2-й и 3-й группах поросят, вакцинация которых осуществлялась с применением препаратов Мультиферона^® серий 01 и 02. Введение Мультиферона^® серии 03 оказывало определенное иммунодепрессивное влияние, уровень иммуноглобулинов отдельных классов на заключительном этапе исследований был ниже такового в контрольной группе поросят, которая подвергалась вакцинации без применения препаратов интерферона. Отсутствие выраженного вторичного иммунного ответа на ревакцинацию можно объяснить, во-первых, тем, что вакцинация проводилась на фоне колострального иммунитета (интерференция между колостральными специфическими антителами и антигеном) и, во-вторых, незрелостью иммунной системы поросят на период иммунизации вакцинами против болезни Ауески и классической чумы свиней.

Таким образом, для ветеринарного инъекционного препарата в виде стабильной эмульсии интерферона и витаминов С и Е более предпочтительны соотношения интерферона, аскорбиновой кислоты и токоферола ацетата, равные 10⁶ МЕ/мл интерферона к 10-30 мг/мл аскорбиновой кислоты и 10-30 мг/мл токоферола ацетата.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.