ПРОИЗВОДНЫЕ НАФТИРИДИНА В КАЧЕСТВЕ МОДУЛЯТОРОВ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новым соединениям, которые модулируют калиевые каналы. Соединения являются применимыми для лечения и профилактики заболеваний и нарушений, на которые влияют активности каналов ионов калия. Одним таким состоянием являются судорожные приступы.

Уровень техники

Обнаружено, что ретигабин (этиловый эфир N-[2-амино-4-(4-фторбензиламино)фенил]карбаминовой кислоты) (патент Соединенных Штатов №5384330) является эффективным при лечении нарушений типа судорожных приступов у детей. Bialer, M. et al., Epilepsy Research 1999, 34, 1-41. Обнаружено также, что ретигабин является применимым при лечении боли, включая невропатическую боль. Blackburn-Munro and Jensen, Eur. J. Pharmacol. 2003, 460, 109-116; Wickenden, A.D. et al., Expert Opin. Ther. Patents 2004 14(4).

Форма эпилепсии, известная как "незлокачественные наследственные неонатальные судороги", связана с мутациями в каналах KCNQ 2/3. Biervert, С. et al., Science 1998, 27, 403-06; Singh, N.A. et al., Nat. Genet. 1998, 18, 25-29; Charlier, С. et al., Nat. Genet. 1998, 18, 53-55, Rogawski, Trends in Neurosciences 2000, 23, 393-398. Последующие исследования установили, что основным местом действия ретигабина является канал KCNQ 2/3. Wickenden, A.D. et al., Mol. Pharmacol. 2000, 58, 591-600; Main, M.J. et al., Mol. Pharmcol. 2000, 58, 253-62. Показано, что ретигабин повышает проводимость каналов при мембранном потенциале покоя и связывает ворота активации канала KCNQ 2/3. Wuttke, T.V. et al., Mol. Pharmacol. 2005, 67, 1009-1017. С увеличением усовершенствований в исследованиях в данной области было обнаружено, что ретигабин увеличивает нейронные М-потоки и повышает вероятность открытия каналов KCNQ 2/3. Delmas, P. and Brown, D.A. Nat. Revs Neurosci., vol. 6, 2005, 850-62; Tatulian, L. and Brown, D.A., J. Physiol., (2003) 549, 57-63.

Признание ретигабина в качестве модулятора калиевых каналов вызвало многочисленные поиски других модуляторов калиевых каналов среди соединений с различными структурными характеристиками, общими с ретигабином.

Раскрытие изобретения

В одном варианте осуществления данное изобретение предлагает соединение формулы I

где W и Z независимо представляют собой СН или N; Y представляет собой CH₂, О или NH;

где R₁ и R₂ независимо представляют собой Н, галоген, CH₂F, CHF₂, CF₃, CF₂CF₃, C₁-C₆алкил, С(=O)C₁-C₆алкил, СН₂С(=O)C₁-C₆алкил, NH-C₁-C₆алкил, NHC(=O)C₁-C₆алкил, С(=O)N(СН₃)₂, C(=O)N(Et)₂, С(=O)NH-C₁-C₆алкил, С(=O)OC₁-C₆алкил, OC(=O)C₁-C₆алкил, OC₁-C₆алкил, SC₁-C₆алкил, C₃-C₆циклоалкил, (СН₂)_mC₃-C₆циклоалкил, C₃-C₆циклоалкенил, (СН₂)_mC₃-C₆циклоалкенил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, Ar₁, (CH₂)_mAr₁, фенил, пиридил, пирролил, (CH₂)_mимидазолил, (СН₂)_mпиразил, фурил, тиенил, (СН₂)_mоксазолил, (СН₂)_mизоксазолил, (СН₂)_mтиазолил, (СН₂)_mизотиазолил, (СН₂)_mфенил, (СН₂)_mпирролил, (СН₂)_mпиридил или (СН₂)_mпиримидил, где указанные циклоалкильные и циклоалкенильные группы необязательно содержат один или два гетероатома, независимо выбранные из О, N и S, и алкильные, циклоалкильные, циклоалкенильные, алкенильные, алкинильные, имидазолильные, пиразильные, оксазолильные, изоксазолильные, тиазолильные, изотиазолильные, фенильные, пирролильные, пиридильные или пиримидильные группы необязательно замещены одной или двумя группами, независимо выбранными из ОН, галогена, циано, метила, этила или трифторметила, где m равно нулю, 1 или 2; или R₁ и R₂ вместе с атомами углерода кольца, к которым они присоединены, образуют 5- или 6-членное конденсированное кольцо, которое может быть насыщенным, ненасыщенным или ароматическим, которое необязательно содержит один или два гетероатома, независимо выбранные из О, N и S, и которое необязательно замещено галогеном, CF₃ или C₁-C₃алкилом; R' представляет собой Н, галоген, CF₃ или C₁-C₃алкил; R₃ и R₄ независимо представляют собой Н, NH₂, (C₁-C₃алкил)NH, CN, галоген, CF₃, OCF₃, OC₁-C₃алкил или C₁-C₃алкил, все указанные C₁-C₃алкильные группы и указанные C₁-C₆алкильные группы необязательно замещены одной или двумя группами, независимо выбранными из ОН, галогена, C₁-C₃алкила, OC₁-C₃алкила или трифторметила; q=1 или 0; R₅ представляет собой C₁-C₆алкил, (CHR₆)_wC₃-С₆циклоалкил, (CHR₆)_wCH₂C₃-C₆циклоалкил, CH₂(CHR₆)_wC₃-C₆циклоалкил, CR₆=СН-С₃-С₆циклоалкил, СН=CR₆-C₃-C₆циклоалкил, (CHR₆)_wC₅-C₆циклоалкенил, CH₂(CHR₆)_wC₅-С₆циклоалкенил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, Ar₁, (CHR₆)_wAr₁, СН₂(CHR₆)_wAr₁ или (CHR₆)_wCH₂Ar₁, где w=0-3, Ar₁ представляет собой фенил, пиридил, фурил, тиенил, пирролил, оксазолил, тиазолил или имидазолил, где C₁-C₆алкильная группа необязательно замещена гидрокси, метокси, метилтио или галогеном и где циклоалкильная и циклоалкенильная группы необязательно замещены одной или двумя группами, независимо выбранными из ОН, галогена, циано, метила, этила или трифторметила; R₆ представляет собой водород, метил, галоген или метокси, и его фармацевтически приемлемые соли. Такие соединения являются модуляторами калиевых каналов.

В другом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель и по меньшей мере один из следующих компонентов: i) фармацевтически эффективное количество соединения формулы I; ii) его фармацевтически приемлемой соли; iii) его фармацевтически приемлемого сложного эфира и iv) его фармацевтически приемлемого сольвата.

В другом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает способ лечения или профилактики заболевания или нарушения, на которое воздействуют увеличением нейронных M-потоков, содержащий введение пациенту, нуждающемуся в этом, одного или нескольких из следующих компонентов: i) фармацевтически эффективного количества соединения формулы I; ii) его фармацевтически приемлемой соли; iii) его фармацевтически приемлемого сложного эфира и iv) его фармацевтически приемлемого сольвата.

Еще в одном варианте осуществления данное изобретение предоставляет способ профилактики или лечения заболевания или нарушения, на которое воздействуют активацией потенциально-открываемых калиевых каналов, содержащий введение пациенту, нуждающемуся в этом, одного или нескольких из следующих компонентов: i) фармацевтически эффективного количества соединения формулы I; ii) его фармацевтически приемлемой соли; iii) его фармацевтически приемлемого сложного эфира и iv) его фармацевтически приемлемого сольвата.

Еще в одном варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает способ лечения или профилактики судорожного приступа у человека, содержащий введение пациенту, который поражен или имеет потенциал поражения таким нарушением, одного или нескольких из следующих компонентов: i) фармацевтически эффективного количества соединения формулы I; ii) его фармацевтически приемлемой соли; iii) его фармацевтически приемлемого сложного эфира и iv) его фармацевтически приемлемого сольвата.

В другом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает фармацевтический препарат для перорального введения, содержащий терапевтически эффективное количество соединения формулы I и либо подходящий таблетирующий агент, либо подходящий сироп для педиатрического применения.

В другом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает таблетку для перорального введения, содержащую терапевтически эффективное количество соединения формулы I и подходящий таблетирующий агент.

В другом подходящем варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает сироп для педиатрического применения, содержащий раствор, или дисперсию, или суспензию соединения формулы I и подходящий сироп.

В другом варианте осуществления данное изобретение рассматривает фармацевтический препарат для введения животным, в том числе животным-компаньонам (собакам и кошкам) и домашнему скоту, содержащий терапевтически эффективное количество соединения формулы I и ветеринарно приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления данное изобретение рассматривает способ профилактики или лечения заболевания или нарушения, на которое воздействуют активацией потенциально-открываемых калиевых каналов, содержащий введение животному, которое поражено или имеет потенциал поражения таким нарушением, одного или нескольких из следующих компонентов: i) фармацевтически эффективного количества соединения формулы I; ii) его фармацевтически приемлемой соли; iii) его фармацевтически приемлемого сложного эфира и iv) его фармацевтически приемлемого сольвата.

Данное изобретение включает в себя все таутомеры, соли и стереоизомерные формы соединений формулы I. Данное изобретение включает в себя также все соединения данного изобретения, у которых один или несколько атомов заменены их радиоактивными изотопами.

В более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IA

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IB

Еще в одном более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IA, в которой W и Z, оба, представляют собой N.

В другом еще более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IA, в которой W представляет собой N и Z представляет собой СН.

В другом еще более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IA, в которой W представляет собой СН и Z представляет собой N.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IA, в которой R' представляет собой Н, галоген, CF₃ или метил.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IA, в которой W и Z, оба, представляют собой N и R' представляет собой Н, F или метил.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IB, в которой W и Z, оба, представляют собой N.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IB, в которой W представляет собой N и Z представляет собой СН.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IB, в которой W представляет собой СН и Z представляет собой N.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IB, в которой R' представляет собой Н, галоген, CF₃ или метил.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет соединение формулы IB, в которой W и Z, оба, представляют собой N и R' представляет собой Н, F или метил.

В более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы IA, в которой R₅ представляет собой C₁-C₆алкил, (CHR₆)_wC₃-C₆циклоалкил, (CHR₆)_wCH₂C₃-C₆циклоалкил или СН₂(CHR₆)_wC₃-C₆циклоалкил.

В более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы IB, в которой R₅ представляет собой C₁-С₆алкил, (CHR₆)_wC₃-C₆циклоалкил, (CHR₆)_wCH₂C₃-C₆циклоалкил или СН₂(CHR₆)_wC₃-C₆циклоалкил.

В еще более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы IA, в которой R₅ представляет собой C₁-C₆алкил, (CHR₆)_wC3-C₆циклоалкил, (CHR₆)_wCH₂C₃-C₆циклоалкил или СН₂(CHR₆)_wC₃-C₆циклоалкил и R₁ представляет собой Н, CF₃ или галоген.

В еще более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы IA, в которой R₅ представляет собой C₁-С₆алкил, замещенный метокси, метилтио или галогеном; R' представляет собой метил или Н и R₁ представляет собой Н, CF₃ или галоген.

В другом подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы I, в которой R₅ представляет собой CR₆=СН-С₃-С₆циклоалкил, СН=CR₆-C₃-С₆циклоалкил, (CHR₆)_wC₅-С₆циклоалкенил, CH₂(CHR₆)_wC₅-С₆циклоалкенил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил; R' представляет собой метил или Н и R₁ представляет собой Н, CF₃ или галоген.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы IA, в которой R' представляет собой метил или Н; R₁ представляет собой Н, CF₃ или галоген; R₃ и R₄ представляют собой метил, аминометил или хлор и R₅ представляет собой Ar₁, (CHR₆)_wAr₁, CH₂(CHR₆)_wAr₁ или (CHR₆)_wCH₂Ar₁.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы IA, в которой R' представляет собой метил или Н; R₁ представляет собой Н, CF₃ или галоген; R₃ и R₄ представляют собой метил и R₅ представляет собой C₁-С₆алкил, (CHR_6)wC₃-С₆циклоалкил, (CHR₆)CH₂C₃-C₆циклоалкил или СН₂(CHR₆)C₃-C₆циклоалкил.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение либо формулы IA, либо формулы IB, в которой R₂ представляет собой Н или F; R' представляет собой Н или галоген; R₃ и R₄ представляют собой метил и R₅ представляет собой C₁-С₆алкил, (CHR₆)_wC₃-C₆циклоалкил, (CHR₆)_wCH₂C₃-C₆циклоалкил или СН₂(CHR₆)_wC₃-C₆циклоалкил.

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы IA или формулы IB, в которой R₅ представляет собой CHZCHZ-циклопентил или одну из указанных ниже групп:

В другом более конкретном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы IA или IB, в которой R₁ представляет собой галоген или галогенметил; R₂ представляет собой Н или галоген и R₅ представляет собой одну из указанных выше групп.

В другом более определенном подродовом варианте осуществления данное изобретение предоставляет или рассматривает соединение формулы IA или IB, в которой R₁ представляет собой фенил, пиридил, пирролил, (CH₂)_mимидазолил, (CH₂)_mпиразил, (CH₂)_mоксазолил, (CH₂)_mизоксазолил, (CH₂)_mтиазолил, (CH₂)_mизотиазолил, (CH₂)_mфенил, (CH₂)_mпирролил, (CH₂)_mпиридил или (CH₂)_mпиримидил и R₅ представляет собой C₅-С₆алкил или СН₂-С₃-С₆циклоалкил.

Примеры, приведенные ниже, предоставлены для того, чтобы показать - но никоим образом не ограничить - различные возможные варианты осуществления данного изобретения.

Осуществление изобретения

При разработке соединений с терапевтическими свойствами, превосходящими терапевтические свойства ретигабина

авторы настоящего изобретения обнаружили, что пара-N-1,2,3,4-тетрагидроизохинолиланилиды и карбаматы формулы I

обладают неожиданной и необычной активностью по отношению к калиевым каналам, доказываемой их высокими активностями, измеряемыми в описанном ниже анализе оттока рубидия.

Применяемый в контексте термин "модулятор калиевых каналов" относится к соединению, способному вызывать увеличение потоков калиевых каналов. Он относится также к соединению, способному повышать вероятность открытия канала KCNQ 2/3. Для предварительного испытания соединений на их способность модулировать калиевые каналы авторы изобретения применяли описанный ниже тест на отток ионов рубидия.

Рассматриваемые данным изобретением соединения формулы I разработаны для перорального или внутривенного введения дозы до приблизительно 1200 мг в день. Так, в данном изобретении рассматриваются растворы и суспензии соединений формулы I, приготовленных для внутривенного введения. Аналогично этому, среди многих других примеров рассматриваются также растворы и суспензии, содержащие помимо соединений формулы I сироп, такой как сорбита или пропиленгликоля, подходящие для перорального введения больному ребенку. Кроме того, рассматриваются также как таблетки, принимаемые с пережевыванием, так и таблетки, принимаемые без пережевывания, содержащие соединения формулы I вместе с фармацевтически приемлемыми таблетирующими агентами и другими фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. Применяемый в контексте термин фармацевтически приемлемый носитель содержит такие эксципиенты, связывающие вещества, смазывающие вещества, таблетирующие агенты и дезинтегрирующие агенты, которые обычно применяют в области изготовления фармацевтических препаратов. Примеры таких агентов включают в себя - но не ограничиваются перечисленным - микрокристаллическую целлюлозу, лактозу, крахмал и дикальцийфосфат и провидон. Кроме того, рассматриваются дезинтегрирующие агенты, такие как натриевая соль гликолята крахмала, смазывающие вещества, такие как стеариновая кислота и SiO₂, и средства повышения растворимости, такие как циклодекстрины, среди многих других примеров для каждой группы. Такие вещества и способы их применения хорошо известны в фармацевтической области. Дополнительные примеры предоставлены в Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, London, Pharmaceutical Press, 2000.

В изобретении рассматриваются также фармацевтические препараты, включающие в себя вакцинные препараты для введения животным, в том числе животным-компаньонам (собакам и кошкам) и домашнему скоту, такому как коровы, свиньи, овцы и лошади, содержащие терапевтически эффективное количество соединения формулы I и ветеринарно приемлемый носитель. Однако любое животное, которое восприимчиво к судорожным приступам, включено в объем данного изобретения. Типичным способом введения может быть внутримышечное, пероральное введение или подкожная инъекция от приблизительно 0,05 мл до 25 мл вакцинного препарата. Однако, как указано выше, соединения формулы I разработаны для введения дозы до приблизительно 1200 мг в день. Вакцинацию можно выполнить одной инокуляцией или посредством нескольких инокуляций. Рассматриваемые вакцинные композиции, применяемые в способах настоящего изобретения, могут включать в себя один или несколько ветеринарно приемлемых носителей. "Ветеринарно приемлемый носитель" включает в себя любой и все растворители, дисперсные среды, оболочки, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, эксципиенты, консерванты, изотонические агенты. Разбавители могут включать в себя воду, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать в себя, например, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Адъюванты, рассматриваемые настоящим изобретением, включают в себя сапонин, холестерин, гель гидроксида алюминия, полный и неполный адъюванты Фрейнда. В настоящем изобретении рассматриваются также вакцинные препараты, содержащие от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 2000 мг адъюванта на дозу вакцинной композиции.

Общие схемы

Часть I. Получение соединений формулы V показано на схеме 1.

Часть II. Получение соединений формулы VII показано на схеме 2.

DMF - ДМФА

Часть III. Получение соединений формулы IX показано на схеме 3.

base - основание

Часть IV. Получение соединений формулы Х показано на схеме 4 Схема 4:

Lawesson's reagent - реагент Лоуссона

Часть V. Получение соединений формулы XI показано на схеме 5.

Lawesson's reagent - реагент Лоуссона

Часть VI. Получение соединений формулы XIII показано на схеме 6.

Получение конкретных соединений

Синтез N-[2,6-диметил-4-(2-трифторметил-7,8-дигидро-5Н-[1,6]нафтиридин-6-ил)фенил]-3,3-диметилбутирамида (11)

1-Бензил-4-пирролидин-1-ил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (3)

Раствор, содержащий N-бензилпиперидон 1 (5 г, 26,4 ммоль) и пирролидин 2 (2,82 г, 39,6 ммоль) в толуоле (60 мл), нагревали для кипячения с обратным холодильником с азеотропным удалением воды. Реакционную смесь затем охлаждали и концентрировали при пониженном давлении. Образовавшееся масло растворяли в эфире, сушили над сульфатом магния и концентрировали при пониженном давлении. Сырой енамин 3 применяли в следующей стадии.

6-Бензил-2-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-[1,6]нафтиридин (5)

К раствору сырого енамина 3 (500 мг, 2,1 ммоль) в диоксане (5 мл) добавляли соединение 4 (0,3 мл, 2,1 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре на протяжении ночи. Затем добавляли ацетат аммония (20 мг) и смесь нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 18 час. Реакционную смесь затем охлаждали до комнатной температуры, подкисляли 10% HCl, экстрагировали дихлорметаном и концентрировали. Очистка препаративной тонкослойной хроматографией (5% раствор DCM/MeOH) давала соединение 5.

2-Трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-[1,6]нафтиридин (7)

К раствору 5 (500 мг, 1,7 ммоль) в дихлорметане (8 мл) добавляли соединение 6, 3-хлорпропионилхлорид (0,22 мл, 2,1 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 18 час. Реакционную смесь затем охлаждали до комнатной температуры и концентрировали. Образовавшийся остаток растворяли в метаноле (16 мл) и перемешивали при 40°С в течение 3 час. Смесь затем охлаждали до комнатной температуры и концентрировали.

N-(4-Бром-2,6-диметилфенил)-3,3-диметилбутирамид (8)

3,3-Диметилбутаноилхлорид (3,37 г, 3,5 мл, 25 ммоль) и триэтиламин (2,53 г, 3,5 мл, 25 ммоль) добавляли к раствору 4-бром-2-хлор-6-(трифторметил)анилина (5,0 г, 25 ммоль) в ацетонитриле (30 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. К смеси добавляли воду и образованный осадок собирали, получая при этом указанное в заголовке соединение в виде порошка (7,46 г, выход 100%).

N-[2,6-Диметил-4-(2-трифторметил-7,8-дигидро-5Н-[1,6]нафтиридин-6-ил)фенил]-3,3-диметилбутирамид (11)

Бис(дибензилиденацетон)палладий (15 мг, 0,026 ммоль) и (2'-дициклогексилфосфанилбифенил-2-ил)диметиламин (40 мг, 0,1 ммоль) добавляли к сухому толуолу (5 мл, продут аргоном в течение 30 мин) и смесь перемешивали в течение дополнительных 30 минут при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем добавляли трет-бутоксид калия (188 г, 71 ммоль), соединение 7 (191 мг, 0,8 ммоль) и соединение 8 (200 мг, 0,67 ммоль); реакционную смесь перемешивали при 80°С на протяжении ночи. Реакционную смесь затем охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через подушку силикагеля и очищали препаративной ТСХ (5% раствор DCM/MeOH), получая при этом соединение 11.

N-(2,6-диметил-4-(3-(трифторметил)-7,8-дигидро-1,6-нафтиридин-6(5Н)-ил)фенил)-3,3-диметилбутанамид

Бис(дибензилидинацетон)палладий (4 мг, 0.069 ммоль) и (2'-дициклогексилфосфанилбифенил-2-ил)диметиламин (7 мг, 0.015 ммоль) добавляли к сухому толуолу (1 мл, продут аргоном) и перемешивали в течение 15 минут в атмосфере аргона. Затем добавляли трет-бутоксид калия (36 мг, 0,32 ммоль), N-(4-бром-2,6-диметилфенил)-3,3-диметилбутанамид (52 мг, 0,17 ммоль) и 3-(трифторметил)-5,6,7,8-тетрагидро-1,6-нафтиридин (WO/04069162) (40 мг, 0,15 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 80°С на протяжении ночи. Реакционную смесь затем охлаждали до комнатной температуры, концентрировали и очищали биотагом (75% смесь этилацетат:гексаны), получая при этом требуемое соединение в виде твердого вещества. ¹Н ЯМР (ДМСО-d₆, 400 МГц) δ 1,05 (с, 9Н), 2,11 (с, 6Н), 2,17 (с, 2Н), 3,08 (т, J=5,6 Гц, 2Н), 3,64 (т, J=5,9 Гц, 2Н), 4,48 (с, 2Н), 6,76 (с, 2Н), 8,08 (с, 1Н), 8,75 (с, 1Н), 8,90 (с 1Н).

Синтез других замещенных тетрагидро-1,6-нафтиридинов

Замещения в положениях 2 и 3 тетрагидро-1,6-нафтиридинов можно выполнить конденсацией 1-бензил-4-пиперидинона с соответствующими 3-аминоенонами с последующим дебензилированием (схема II).

Алкилирование в 5- или 8-положении тетрагидро-1,6-нафтиридинов можно выполнить химической модификацией производных пиридина (см. схему III).

Биологические результаты

Соединения формулы данного изобретения оценивали в качестве модуляторов калиевых каналов измерением высвобождения иона рубидия следующим анализом.

Способы: клетки PC-12 выращивали при 37°С и 5% CO₂ в среде DMEM/F12, дополненной 10% лошадиной сыворотки, 5% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 Ед./мл пенициллина, 100 Ед./мл стрептомицина. Их засевали в покрытых D-лизином 96-луночных микропланшетах для клеточных культур при плотности 40000 клеток на лунку и дифференцировали 100 нг/мл NGF-7 в течение 2-5 дней. Для анализа среду аспирировали и клетки промывали один раз 0,2 мл буфера для промывания (25 нМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl₂, 0,8 мМ NaH₂PO₄, 2 мМ CaCl₂). Клетки затем нагружали 0,2 мл буфера для нагрузки Rb⁺ (буфер для промывания плюс 5,4 мМ RbCl₂, 5 мМ глюкоза) и инкубировали при 37°С в течение 2 час. Прикрепленные клетки быстро промывали три раза буфером (такой же буфер, как для нагрузки Rb⁺, но содержащий 5,4 мМ KCl вместо RbCl) для удаления внеклеточного Rb⁺. Сразу после промывания к клеткам добавляли 0,2 мл буфера деполяризации (буфер для промывания плюс 15 мМ KCl) без добавления к клеткам соединений или с добавлением соединений для активации оттока каналов калиевых ионов. После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре супернатант осторожно удаляли и собирали. Клетки лизировали добавлением 0,2 мл буфера для лизиса (буфер для деполяризации плюс 0,1% тритона X-100) и также собирали лизаты клеток. Если собранные образцы сразу не анализировали на содержание Rb⁺ атомной абсорбционной спектроскопией (см. ниже), их хранили при 4°С без каких-либо отрицательных влияний на последующий анализ Rb⁺.

Концентрацию Rb⁺ в супернатантах (Rb⁺ _sup) и лизатах клеток (Rb⁺ _Lys) количественно определяли с применением плазменного атомного абсорбционного спектрометра ICR8000 (Aurora Biomed. Inc., Vancouver, B.C.) в условиях, указанных изготовителем. Образцы по 0,05 мл из титрационных микропланшетов автоматически обрабатывали разведением равным объемом буфера для анализа образца Rb⁺ и впрыскивали в пламя воздух-ацетилен. Количество Rb⁺ в образце измеряли поглощением при 780 нм с применением полой электронно-лучевой лампы в качестве источника света и детектора РМТ. Калибровочную кривую, включающую в себя диапазон 0-5 мг/л Rb в буфере анализа образца, строили для каждого набора планшетов. Процент оттока Rb⁺ (F) определяли уравнением

F=[Rb⁺ _sup/(Rb⁺ _sup+Rb⁺ _Lys)]×100%.

Влияние (Е) соединения определяли уравнением: Е=[(F_c-F_b)/(F_s-F_b)]×100%, где F_c представляет собой отток в присутствии соединения в буфере деполяризации, F_b представляет собой отток в базальном буфере, F_s представляет собой отток в буфере деполяризации и F представляет собой отток в присутствии соединения в буфере деполяризации. Строили график зависимости действия (Е) соединения от его концентрации для вычисления величины ЕС₅₀, концентрации соединения для 50% максимального оттока Rb⁺. Результаты показаны ниже. Пояснение условных обозначений:

А: ЕС₅₀ = 1 нМ - 50 нМ; В: EC₅₀ = 50 нМ - 100 нМ; С: E₅₀ = 100 нМ - 500 нМ.

Активность примерного соединения СОЕДИНЕНИЕ АКТИВНОСТЬ А ретигабин С