СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ

Изобретение относится к клинической медицине, а именно фтизиатрии и иммунологии, и может быть использовано для оценки эффективности противотуберкулезной терапии у больных туберкулезом легких (ТБ).

В настоящее время резко возросла заболеваемость туберкулезом и смертность от этой инфекции. При этом отмечается множественная лекарственная устойчивость возбудителей заболевания и высокий уровень инфицирования Mycobacterium tuberculosis (Mtb) среди здорового населения. Для предупреждения распространения заболевания большое значение имеют своевременная диагностика и эффективное лечение активных форм туберкулеза.

Основными методами диагностики и мониторинга ТБ, используемыми в настоящее время, являются клинические, микробиологические, молекулярно-генетические и лучевые исследования. Однако каждый из этих подходов имеет свои ограничения. Идентификация микобактерий в мокроте с помощью микробиологических (мазок, посев, ВАСТЕС) или молекулярно-генетических (ПЦР) методов может быть невозможна в связи с отсутствием мокроты (например, у пациентов с ограниченными процессами в легочной ткани без деструкции). При наличии мокроты микобактерии в мокроте нередко не удается идентифицировать, что, однако, не может служить показателем отсутствия инфекции или ее низкой активности. Кроме того, при исходном (в начале лечения) отсутствии микобактерий микробиологические методы не могут быть использованы для мониторинга за эффективностью проводимой терапии. При наличии бактериовыделения, его исчезновение в процессе лечения позволяет говорить об эффекте от проводимой терапии, однако даже в этом случае микробиологические методы не позволяют судить о прекращении патологических процессов в легочной ткани, т.е. служить критерием излеченности больного (в большинстве случаев микобактерии в мокроте исчезают существенно раньше, чем происходит заживление деструктивных процессов в легочной ткани). В целом, микробиологические методы исследования важны для определения контагиозности ТБ, но недостаточны для оценки состояния патологического процесса в легочной ткани при оценке эффективности лечения заболевания.

Лучевые методы исследования, особенно компьютерная томография, дают наиболее адекватную информацию о процессах, проходящих в легочной ткани (таких как степень инфильтрации и деструкции), и их изменении в ответ на противотуберкулезную терапию. Однако даже компьютерная томография не всегда позволяет однозначно оценить активность процесса, дифференцировать ТБ, опухолевые и некоторые другие заболевания. Кроме того, оценка динамики туберкулезного процесса (ТП) с помощью лучевых методов исследования является достаточно субъективной, а само рентгенологическое обследование обладает рядом побочных эффектов и является дорогостоящим.

Клинические симптомы ТБ не являются специфичными; у многих больных клинические проявления ТБ отсутствуют даже в начале лечения.

В целом, в настоящее время имеется острая необходимость в новых методах диагностики и мониторинга ТБ, не требующих мокроты для проведения анализа и позволяющих оценивать активность туберкулезного процесса при определении адекватности и эффективности проводимого лечения.

В связи с их высокой антигенной специфичностью, большим потенциалом для диагностики ТБ обладают иммунологические методы, в частности методы, основанные на оценке продукции интерферона-гамма Т-лимфоцитами (так называемые «интерфероновые» тесты).

Существующие интерфероновые тесты основаны на определении количества (частоты) клеток, продуцирующих интерферон-гамма (метод T-SPOT), или уровня продукции интерферона-гамма (метод QuantiFERON-TB) клетками периферической крови при стимуляции образцов крови антигенами микобактерий. Метод иммунологической диагностики и мониторинга туберкулезной инфекции T-SPOT (USPTO Applicaton №20070196878) основан на определении количества клеток, продуцирующих интерферон-гамма в ответ на стимуляцию образцов крови антигенами микобактерий ESAT-6 и CFP-10. Данный метод был предложен для диагностики туберкулеза, дифференциальной диагностики активного туберкулеза и латентной инфекции и мониторинга течения и лечения ТБ. Однако, по данным большинства исследователей, основной областью применения данного метода является диагностика инфекции М. tuberculosis, а не активности инфекционного процесса или эффективности лечения (Streitz М, Tesfa L, Yildirim V, Yahyazadeh A, Ulrichs Т, et al. 2007 Loss of Receptor on Tuberculin-Reactive T-Cells Marks Active Pulmonary Tuberculosis. PLoS ONE 2(8): e735. doi:10.1371/journal.pone.0000735). Помимо этого, метод является сложным и трудоемким, требует культивирования клеток в стерильных условиях и дорогостоящих реагентов.

Метод QuantiFERON-TB Gold in-tube основан на определении уровня продукции интерферона-гамма клетками периферической крови в ответ на стимуляцию клеток антигенами микобактерий ESAT-6 и CFP-10. Метод используется для диагностики туберкулезной инфекции. Основным недостатком данного метода является то, что он не позволяет проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и инфицирования Mtb, не сопровождающегося развитием заболевания («латентной инфекции»), оценивать активность туберкулезного процесса или эффективность лечения. В 2011 г. ВОЗ пришла к заключению, что «интерфероновые тесты» не могут быть использованы для диагностики ТБ в странах с низким и средним уровнем дохода на душу населения, что связано с широким распространением латентной инфекции в этих странах.

Наиболее близким по своей сущности к методу, предлагаемому в данном изобретении, являются подходы, описанные Лядовой и соавт. (Лядова, Никитина, Кондратюк, Васильева «Способ оценки эффективности лечения и динамики деструктивных изменений в легочной ткани при туберкулезе легких», заявка на патент №2010150484/15 (072863)). При этом проводят определение показателя процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- по отношению ко всем лимфоцитам CD4⁺ периферической крови больных ТБ в процессе лечения. При исходно высоком значении данного показателя (более 12% от всех лимфоцитов CD4⁺ периферической крови) его снижение до нормальных величин - менее 12% - является признаком закрытия полостей распада в легочной ткани; снижение без достижения нормальных значений и сохранение его выше 12% свидетельствует об уменьшении деструктивных процессов в легких, но сохранении полостей распада, отсутствие изменений или увеличение данного показателя - об отсутствии динамики патологических изменений в легких или прогрессировании заболевания и увеличении процессов распада в легочной ткани. Этот подход связывает изменение процентного содержания лимфоцитов CD2T^- в периферической крови с динамикой деструктивных изменений в легких. Однако он основан на анализе процентного содержания лимфоцитов CD27^- среди всей популяции лимфоцитов CD4⁺ крови. Данная популяция включает в себя как клетки, специфичные к антигенам микобактерий, так и клетки посторонней специфичности. Это снижает чувствительность метода, поскольку в область анализа попадают клетки, не подвергающиеся воздействию со стороны специфического антигена. В результате, у многих больных с явными деструктивными изменениями в легочной ткани исходное (до лечения) процентное содержание лимфоцитов CD27^- в крови оказывается меньше 12%, т.е. «нормальным». Поэтому метод Лядовой и соавт. может быть использован только для оценки эффективности лечения туберкулеза у больных с исходно повышенным содержанием лимфоцитов CD27^-CD4⁺.

Задачей, решаемой данным изобретением, является разработка способа, который позволял бы объективно оценивать эффективность лечения. Технический результат состоит в том, что объективизация оценки эффективности лечения основывается на определении активности туберкулезного процесса (ТП) и выраженности деструктивных изменений в легочной ткани у больных ТБ легких, а также их репарации в процессе лечения, путем анализа клеток периферической крови на содержание лимфоцитов CD4⁺IFNγ⁺CD27^-.

Решение задачи достигается тем, что оценивают процентное содержание лимфоцитов, имеющих фенотип CD27^-, не среди всех лимфоцитов CD4⁺ (как в способе Лядовой и соавт.), а среди лимфоцитов CD4⁺, продуцирующих IFN-γ (подобно тому, как это делают в способе Streitz и соавт., Streitz М, Tesfa L, Yildirim V, Yahyazadeh A, Ulrichs Т, et al (2007) Loss of Receptor on Tuberculin-Reactive T-Cells Marks Active Pulmonary Tuberculosis. PLoS ONE 2(8): e735. doi:10.1371/journal.pone.0000735). В отличие от способа Streitz и соавт., исследование проводят на клетках цельной крови (а не на мононуклеарах крови), что существенно упрощает процедуру. Принципиальным отличием предлагаемого способа от метода Streitz и соавт. является то, что предлагаемый способ направлен на оценку выраженности деструктивных изменений легочной ткани у больных ТБ и позволяет мониторировать уменьшение деструкции легочной ткани в процессе лечения ТБ. Способ, описанный Streitz и соавт., направлен на дифференциальную диагностику лиц с латентной инфекцией и больных ТБ, причем только больных с достаточно выраженными изменениями легочной ткани. Возможность оценки степени деструкции легочной ткани и ее изменения в процессе лечения ТБ в способе Streitz и соавт. не рассматривается.

В предлагаемом способе клетки крови стимулируют антигенами микобактерий, что вызывает продукцию антиген-специфичными клетками цитокина IFN-γ. По продукции IFN-γ лимфоцитами СВ4⁺ идентифицируют клетки, специфичные к антигенам микобактерий, и определяют содержание среди них лимфоцитов CD27^- (процент клеток «IFN-γ⁺CD27^-»).

Изобретение основано на открытии того факта, что процентное содержание в периферической крови лимфоцитов CD4⁺, специфичных к антигенам микобактерий и экспрессирующих фенотип CD27^-, зависит от выраженности деструктивных изменений в легочной ткани. Эффекторные лимфоциты CD4 (лимфоциты CD4⁺CD62L^-) образуются из наивных лимфоцитов при стимуляции последних антигеном и костимуляционными сигналами. Известно, что начальные стадии дифференцировки эффекторных лимфоцитов происходят за пределами легочной ткани, в лимфоидных органах. При этом большинство лимфоцитов, находящихся в лимфатических узлах, экспрессируют маркер CD27 и имеют фенотип CD62L⁺CD27⁺или CD62L^-CD27⁺. Ранее нами было показано, что когда лимфоциты CD62L^-CD27⁺ мигрируют из лимфатических узлов в очаг инфекции в легочной ткани, они теряют экспрессию молекул CD27 и превращаются в эффекторные лимфоциты CD62L^-CD27^- (Kapina MA, Shepelkova GS, Bogacheva PV, MischenkoVV Sayles P, Winslow G, Apt AS, Lyadova IV. CD27^low CD4⁺ lymphocytes that accumulate in the mouse lung tissue during mycobacterial infection differentiate from CD27^hi precursors in situ produce IFN-γ, and protect the host against ТВ infection. J. Immunol., 2007, 178: 976-985). Лимфоциты CD62L^-CD27^- характеризуются высоким «сродством» к легочной ткани, в связи с чем они накапливаются преимущественно в легких, где при туберкулезе составляют подавляющее большинство Mtb-специфичных лимфоцитов CD4⁺. Находящиеся в легких лимфоциты CD27^- выходят в кровь, по-видимому, только тогда, когда целостность легочной ткани становится нарушенной. Именно это, по-видимому, и обуславливает установленную в настоящем изобретении ассоциацию между содержанием в крови Mtb-специфичных лимфоцитов CD27^- и степенью деструкции легочной ткани.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Образцы цельной крови (500 мкл), стабилизированной гепарином (50 ед/мл), культивируют в течение 12 часов в присутствии антигена микобактерий (сониката микобактерий, PPD - очищенного белкового деривата туберкулина или др.) и ингибитора комплекса Гольджи. После окончания культивирования клетки собирают, добавляют к ним флуоресцентно-меченые антитела, специфичные к антигенам GD4 и CD27, инкубируют полученную смесь при комнатной температуре 15 мин, после чего лизируют эритроциты и смесь отмывают центрифугированием в забуференном физиологическом растворе с добавлением белка. Полученные клетки пермеабилизируют и добавляют к ним меченые антитела, специфичные к IFN-γ. Клетки анализируют на проточном цитофлуориметре и определяют процентное содержание лимфоцитов CD27^- среди лимфоцитов CD4⁺, продуцирующих IFN-γ⁺ («клетки IFN-y⁺CD27^-»). Исследование проводят в начале лечения ТБ и в процессе лечения.

Оценка результатов. У людей с подозрением на ТБ определяют процентное содержание клеток IFN-γ⁺CD27^-. Исследование проводят в начале лечения ТБ и в процессе лечения. При исходно высоких значениях показателя (процент клеток IFN-γ⁺CD27^->31,2%) делают вывод об активности ТП. При этом значения показателя выше 31,2%, но менее 47%, являются признаком активного ТБ без выраженных деструктивных изменений легочной ткани (отсутствие полостей деструкции, единичная полость деструкции или несколько мелких полостей распада); значение показателя более 47% является признаком ТБ, сопровождающегося выраженными деструктивными изменениями легочной ткани (множественные полости деструкции, система полостей деструкции; как в способе Лядовой и соавт., Лядова, Никитина, Кондратюк, Васильева «Способ оценки активности туберкулезного процесса и степени деструкции легочной ткани», заявка на патент №20111549565/20(074413)).

Повторное определение показателя проводят через 2 или более месяцев после начала лечения. Снижение исходно высоких значений исследуемого показателя до нормальных значений (<31,2%) расценивают как признак закрытия полостей распада или значительного их уменьшения; снижение исследуемого показателя (на 40 и более % от исходного значения) без его полной нормализации (значения показателя остаются >31,2%) свидетельствует об уменьшении деструктивных изменений, но неполном закрытии полостей распада; отсутствие изменения исходно высоких значений показателя указывает на сохранение в легочной ткани множественных очагов деструкции.

Предложенные критерии (31,2% - для идентификации больных ТБ с выраженной активностью ТП; 47% - для разделения больных активным ТБ с разной степенью деструкции легочной ткани) подобраны на основании клинических исследований 52 больных туберкулезом легких (30 женщин и 22 мужчин, средний возраст - 31 год) 21 здорового человека из зон контакта с больными ТБ (16 женщин, 5 мужчин, средний возраст 47 лет) и 15 здоровых людей с низким риском инфицирования М. tuberculosis (8 женщин, 7 мужчин, средний возраст 38 лет) (способ Лядовой и соавт., Лядова, Никитина Кондратюк, Васильева «Способ оценки активности туберкулезного процесса и степени деструкции легочной ткани», заявка на патент №20111549565/20 (074413)).

Обследование больных проводили в первые дни поступления в стационар. Кровь забирали из вены утром натощак и анализировали согласно описанному способу. У всех больных с помощью микробиологических, клинических и рентгенологических методов анализировали: наличие микобактерий в мокроте, клинические проявления ТБ, распространение инфекции (сегмент, сегменты, доля, несколько долей одного легкого, оба легких), выраженность инфильтративных изменений, наличие в легочной ткани полостей деструкции. Выраженность указанных выше проявлений ТБ оценивали в баллах по следующей системе. Распространенность ТБ: 1 балл - поражен один или несколько сегментов; 2 балла - доля; 3 балла - целое легкое или оба легких. Степень деструкции легочной ткани: 0 - полости распада отсутствуют, 1 - единичная полость распада; 2 - несколько полостей распада; 3 - множественные полости распада; 4 - системы полостей распада. Клиническая тяжесть течения ТБ: 0 - жалобы (похудение, слабость и др.) отсутствуют, температура тела нормальная, 1 - незначительные жалобы, нормальная температуры; 2 - жалобы на слабость, похудение, субфебрильная температура тела; 3 - выраженные признаки интоксикации (кахексия, сильная слабость), фебрильная температура. Все исследования и оценки проводили двойным слепым методом. Для выявления факторов, определяющих высокое содержание в крови больных ТБ клеток IFN-γ⁺CD27^-, проводили математический анализ результатов с использованием методов множественной линейной регрессии, критериев F, AIC.

Проведенный анализ показал, что основным фактором, определяющим высокие значения исследуемого показателя, было наличие и выраженность деструктивных изменений легочной ткани. Анализ ROC-кривых показал, что порог в 31,2% клеток IFN-γ⁺CD27^- разделяет больных ТБ и здоровых людей из зон контакта с больными ТБ (людей с высоким риском инфицирования М. tuberculosis, но без признаков активного заболевания), с чувствительностью 83% и специфичностью 90%. Внутри группы больных ТБ содержание лимфоцитов IFN-γ⁺CD27^-, равное 47%, разделяло больных с выраженной деструкцией легочной ткани (значения показателя >47%) и больных с отсутствием или единичными полостями распада (значения показателя<47%) с чувствительностью 95% и специфичностью 75% (как в способе Лядовой и соавт., Лядова, Никитина, Кондратюк, Васильева «Способ оценки активности туберкулезного процесса и степени деструкции легочной ткани», заявка на патент №20111549565/20 (074413)).

Критерии оценки эффективности лечения по изменению показателя IFN-γ⁺CD27^- в процессе лечения ТБ основаны на динамических исследованиях, проведенных на 25 больных ТБ. У больных, имеющих исходно высокие значения исследуемого показателя (процентное содержания клеток IFN-γ⁺CD27^- в крови выше 31,2%), анализировали изменение этого показателя в процессе лечения. В зависимости от изменения показателя в процессе лечения больные были разделены на три группы. Для каждого больного двойным слепым методом анализировали характер деструктивных изменений легочной ткани в начале лечения и к концу 2 мес. лечения.

В первую группу вошли 13 больных, у которых к концу 2 мес. лечения существенных изменений исследуемого показателя (процентного содержания в крови клеток IFN-γ⁺CD27^-) не наблюдалось. По данным рентгенологических исследований к концу 2 месяца лечения у большинства больных данной группы (11 из 13) отмечалось сохранение множественных полостей деструкции. К концу 4 месяца лечения множественные полости деструкции сохранялись у 5 больных.

Во вторую группу вошли 8 больных, у которых значение исследуемого показателя (процентное содержание в крови клеток IFN-γ⁺CD27^-) к концу 2 мес. лечения существенно снижалось, но полной его нормализации не происходило (процент клеток IFN-γ⁺CD27^- снижался на 40 и более % по сравнению с исходным значением, однако сохранялся на уровне, превышающем 31,2%). Рентгенологически, уменьшение полостей распада к концу 2 месяца лечения было отмечено у 3 из 8 больных, к концу 4 месяца - у всех 8 больных из этой группы.

В третью группу вошли 4 больных, у которых исходно высокие значения показателя в процессе лечения значительно снижались и к концу 2 месяца достигали нормальных (<31,2%) значений. К концу 2 месяца лечения у трех из 4 больных рентгенологически было зафиксировано полное закрытие полостей распада, у одного - существенное их уменьшение.

Примеры

Пример 1. Больной Т. Диагноз: инфильтративный ТБ легких в фазе распада. Процент лимфоцитов IFNγ⁺CD27^- в начале лечения: 83,6%, через 2 месяца после начала лечения - 81,6% (без изменений). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. При поступлении в клинику: в S₂ правого легкого и S₁₊₂, S₆ левого легкого крупные инфильтраты и фокусы средней плотности с множественными участками распада на фоне лимфангита и очагов отсева средней плотности в окружающей легочной ткани. Через 2 месяца после начала лечения: множество очагов и фокусов отсева на фоне лимфангита в окружающей легочной ткани, множественные каверны в S₁₊₂, S₆ левого легкого, свежая каверна в S₁ правого легкого. Нарастание размеров каверн и инфильтратов в обоих легких (отрицательная рентгенологическая динамика). Результаты микробиологических исследований. В начале лечения: бактериоскопия и посев мокроты: положительные. Через 2 месяца после начала исследования: отрицательные (положительная бактериологическая динамика).

Пример 2. Больная М. Диагноз: инфильтративный ТБ верхней доли левого легкого в фазе распада и обсеменения. Процент лимфоцитов IFNγ⁺CD27^- в начале лечения: 65,5%, через 2 месяца после начала лечения - 35,5% (значительное уменьшение показателя без его полной нормализации). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. При поступлении в клинику: инфильтрация с двумя участками деструкции размером 1×2 см и 0,5×0,6 см в верхних отделах легких, в S₁₊₂ левого легкого - каверна 3,5 см с инфильтрированными стенками, в верхней доли правого легкого и в S₄, S₅, S₆ левого легкого - группа очагов и фокусов. Через 2 месяца после начала лечения: уменьшение размеров каверны в S₁₊₂ левого легкого с уменьшением лимфангита, очагов и фокусов в обоих легких (частичная положительная рентгенологическая динамика). Результаты микробиологических исследований. В начале лечения: бактериоскопия и посев мокроты: положительные. Через 2 месяца после начала исследования: отрицательные (положительная бактериологическая динамика).

Пример 3. Больная А. Диагноз: Инфильтративный туберкулез нижней доли левого легкого в фазе распада. Процент лимфоцитов IFNγ⁺CD27^- в начале лечения: 70,2%, через 2 месяца после начала лечения - 30,7% (нормализация показателя). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. При поступлении в клинику: каверна 1,5×2 см, массивная инфильтрация с несколькими полостями деструкции в нижних отделах левого легкого, выраженная реакции прилежащей плевры, множество мелких очагов низкой плотности в S₆ левого легкого, единичные очаги отсева в нижних отделах правого легкого. Через 2 месяца после начла лечения: уменьшение инфильтрации с заживлением каверн и полостей деструкции в нижних отделах левого легкого (положительная рентгенологическая: динамика). Результаты микробиологических исследований. В начале лечения: бактериоскопия и посев мокроты: положительные. Через 2 месяца после начала исследования: отрицательные (положительная бактериологическая динамика).

Способ, предлагаемый в настоящем изобретении, отличается от других у существующих методов тем, что: а) основан на анализе небольших образцов периферической крови; б) позволяет оценивать активность туберкулезной инфекции, наличие и выраженность деструктивных изменений в легочной ткани в процессе лечения; в) позволяет оценивать эффективность лечения ТБ с точки зрения развития в легких репаративных процессов, уменьшения и закрытия полостей распада.