×
27.04.2013
216.012.385f

Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ИРИСА СИБИРСКОГО (I.SIBIRICA L.)

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения I.sibirica L. in vitro. Растения, идентичные исходным экземплярам, получают методом прямой регенерации, минуя каллусную культуру, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки. Экспланты культивируют на питательной среде Мурасиге-Скуга, в которую вносят фитогормоны 3 мкМ НУК в сочетании с 8 мкМ БАП и добавляют 0,6% агара. Затем побеги переносят на питательную среду, дополненную 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК, размножают по схеме, чередуя среды с высоким (5-7,5 мкМ) и низким (1 мкМ) содержанием БАП. Затем побеги укореняют на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мкМ НУК. Изобретение позволяет ускорить получение регенерантов данного вида ириса прямым методом, минуя каллусную культуру, и повысить их выход путем увеличения коэффициента размножения для получения растений, идентичных исходным экземплярам. 1 табл.
Основные результаты: Способ микроклонального размножения ириса Сибирского (I.sibirica L.) in vitro, включающий, культивирование эксплантов на питательной среде, размножение и укоренение регенерантов, отличающийся тем, что применяют метод прямой регенерации, минуя каллусную культуру, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки, причем экспланты культивируют в течение 30 суток на питательной среде Мурасиге-Скуга (MS), в которую вносят фитогормоны 3 мкМ НУК в сочетании с 8 мкМ БАП и добавляют 0,6% агара, затем полученные побеги переносят на питательную среду, дополненную 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК, размножают по схеме, чередуя среды с высоким (5-7,5 мкМ) и низким (1 мкМ) содержанием БАП, укореняют на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мкМ НУК.

Изобретение относится к цветоводству и биотехнологии, может быть использовано для массового размножения ценных декоративных сортов и гибридов ириса сибирского, освобождения их от системных патогенов, а также в селекционной практике для создания новых улучшенных сортов.

Известен способ получения растений-регенерантов I.Sibirica, согласно которому эксплантами являются верхушечные и боковые почки, изолированные с корневищ многолетних генеративных растений во время вегетации (июнь-июль) и после ее окончания (сентябрь-октябрь). Корневища выкапывали из земли, очищали от частиц почвы и отмерших тканей, делили на участки, содержащие почки, промывали в мыльном растворе и проводили стерилизацию растительного материала. Стерильность и жизнеспособность эксплантов при введении в культуру in vitro составила 49-68%. Экспланты культивировали на безгормональной среде, после формирования первых листьев пересаживали на питательные среды мультипликации побегов. В результате из одного экспланта формировалось одно растение-регенерант (Ишмуратова М.М. Особенности культивирования in vitro растений различных экологических групп на примере видов рода Iris L. Растительные ресурсы. - 1999. - 35, №4. Москва. 1999. - С.67-74).

Недостатком данного способа (аналога) является сложность проведения стерилизации растительного материала. I.sibirica является геофитом, поэтому получение стерильного и жизнеспособного материала при введении в культуру in vitro почек вегетативного побега представляет большую трудность. Даже при условии успешной поверхностной стерилизации внутренняя инфекция проявляет себя на протяжении всех этапов микроклонального размножения этой культуры. При данном способе повреждается или уничтожается растение-донор.

Наиболее близким (прототипом) является способ получения растений-регенерантов I.sibirica на основе индукции развития почек в каллусной культуре из изолированных фрагментов трубки околоцветника. После стерилизации бутонов из них извлекали части околоцветника, которые делили на фрагменты размером 0,5×0,5 см и помещали на поверхность питательной среды Мурасиге-Скуга, дополненной 10, 20 и 30 мкМ 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) в сочетании с 5 мкМ БАП (6-бензиламинопурин). Культивирование осуществляли в условиях темноты. В первые дни культивирования наблюдали увеличения размеров эксплантов за счет растяжения клеток, а в дальнейшем сформировался зеленый плотный каллус. При пересадке каллуса на среду с уменьшенным содержанием 2,4-Д (0,2 мкМ) и культивировании его в условиях фотопериода происходила регенерация флоральных почек у I.sibirica. Индуцировать регенерацию вегетативных почек на данной среде не удалось. В связи с этим каллусную ткань с флоральными почками пересаживали на среду с повышенной концентрацией БАП - 20 мкМ. В конце пассажа на этой среде происходила регенерация вегетативных почек. Продолжительность пассажа на одной среде составляла 25-30 суток (Вечернина Н.А., Таварткиладзе O.К., Клементьева Л.А., Долганова З.В. Особенности регенерации и размножения растений рода Iris (Iridaceae) in vitro // Раст. Ресурсы, 2004. - Т.40, вып.4. - С.56-60).

Недостатками данного способа (прототипа) является длительный период получения вегетативных почек (90 суток). Получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриогенеза непригодно для использования при микроразмножении сортов растений, так как при дедифференциации клеток может происходить полиплоидизация и анеуплоидизация числа хромосом, которое способствует получению неоднородного потомства.

Задачей заявляемого изобретения является создание способа микроклонального размножения I.sibirica за счет ускорения получения регенерантов данного вида ириса прямым методом, минуя каллусную культуру, и повышение их выхода путем увеличения коэффициента размножения для получения растений, идентичных исходным экземплярам.

Сущность изобретения заключается в том, что способ микроклонального размножения Ириса Сибирского (I.sibirica L.) in vitro позволяет применять метод прямой регенерации, минуя стадию каллусообразования, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки. Причем экспланты культивируют на питательной среде, которая обеспечивает высокий процент выхода генетически стабильных регенерантов в более короткие сроки. После обеззараживания бутонов трубку околоцветника и цветоножку делят на фрагменты 3×3 мм, которые затем высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 3 мкМ НУК (α-нафтилуксусную кислоту) в сочетании с 8 мкМ БАП, через 30 суток образовавшиеся вегетативные побеги из всех предложенных типов эксплантов пересаживают на питательную среду, дополненную 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК (3-индолилмасляную кислоту) при чередовании высоких (5-7,5 мкМ) и низких (1 мкМ) концентраций БАП, укореняют побеги на среде Мурасиге-Скуга, дополненной 1 мкМ НУК.

Способ осуществляют в два этапа.

1 этап. Цветки берут в фазе бутонизации (VII этап органогенеза), когда они плотно закрыты листочками обертки, и в условиях ламинарбокса проводят стерилизацию. Части трубки околоцветника и цветоножки делят на фрагменты размером не более 3×3 мм и помещают на питательные среды.

Питательные среды готовят по прописи Мурасиге и Скуга (MS), содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводят фитогормоны в разных концентрациях: 3 мкМ НУК в сочетании с 8 мкМ БАП, рН среды доводят до 5,8-5,9 и добавляют 0,6% агара. Среды разливают в пластиковые контейнеры (по 30 мл) или в культуральные флаконы (по 10 мл). Автоклавируют приготовленные питательные среды в течение 20 мин при 120°С. Экспланты культивируют в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24-26°С.

Через 30 суток в ткани эксплантов развиваются вегетативные побеги достаточной величины для пересадки на среды размножения. В результате прямого органогенеза получают полноценные вегетативные побеги I.sibirica в количестве 10-15 штук на один эксплант.

2 этап. На этапе собственно микроклонального размножения I.sibirica L субкультивирование побегов проводят на питательной среде, содержащей 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 ДмкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК, по схеме чередуя среды с высоким и низким (1 мкМ БАП) содержанием цитокинина, (используются питательные среды: Мурасиге-Скуга или Гамборга и Эвелега (B5), дополненные 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК). Данные питательные среды позволяют получать морфологически не измененные побеги с хорошей способностью к укоренению (табл.1).

Укоренение проводят на питательной среде Мурасиге-Скута, дополненной 1 мкМ НУК. Способность к укоренению на данной среде составляет 100%. После укоренения растения переносят в контейнеры с почвой и выращивают обычным способом до получения стандартной рассады с закрытой корневой системой.

Необходимым условием клонального микроразмножения является стабильное воспроизводство исходного генотипа. Однако соблюдение этого условия вызывает ряд трудностей, т.к. биологически активные компоненты питательных сред способны вызвать генетические изменения в клетках, что приводит к генетической вариабельности полученных регенерантов. Для подтверждения идентичности регенерантов материнским растениям I.sibirica сорт Стерх, полученных в результате прямой регенерации побегов из тканей трубки околоцветника, проводят анализ с помощью ПЦР. Методом RAPD-анализа полногеномной ДНК не выявлено никаких отличий между материнскими экземплярами I.sibirica сорт Стерх и полученными от них растениями-регенерантами.

В результате использования микроклонального размножения I.sibirica от одного экспланта за 4 месяца культивирования получают около 100 штук растений-регенерантов, морфологически генетически идентичных материнским.

Таблица 1
Влияние концентрации БАП и способа культивирования на число и высоту побегов у I.sibirica сорт Стерх
БАП, мкМ Без ауксинов С ауксинами (0.1 мкМ НУК+ОДмкМ ИМК)
Без чередования Чередование сред с 1 мкМ БАП Без чередования Чередование сред с 1 мкМ БАП
ч.п. в.р., мм ч.п. в.р., мм ч.п. в.р., мм ч.п. в.р., мм
2,5 2,5±0,5 40,5±7,7 1,8±0,1 55,3±3,6 2,2±0,3 35,7±3,1 2,4±0,4 42,7±2,3
5,0 1,7±0,1 41,4±9,3 2,0±0,1 56,0±4,6 1,9±0,3 34,7±3,8 1,9±0,2 52,3±3,0
7,5 1,9±0,3 42,7±3,0 2,0±0,3 52,0±6,3 1,5±0,2 55,0±4,2 1,8±0,2 52,1±3,1
10,0 1,5±0,2 65,3±4,6 1,5±0,2 53,4±3,6 1,5±0,3 53,6±5,9 2,0±0,5 57,1±5,5
1,0 контр 1,3±0,1 58,4±5,8
Примечание:
1) ч.п. - число побегов;
2) в.р. - высота растения.

Способ микроклонального размножения ириса Сибирского (I.sibirica L.) in vitro, включающий, культивирование эксплантов на питательной среде, размножение и укоренение регенерантов, отличающийся тем, что применяют метод прямой регенерации, минуя каллусную культуру, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки, причем экспланты культивируют в течение 30 суток на питательной среде Мурасиге-Скуга (MS), в которую вносят фитогормоны 3 мкМ НУК в сочетании с 8 мкМ БАП и добавляют 0,6% агара, затем полученные побеги переносят на питательную среду, дополненную 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК, размножают по схеме, чередуя среды с высоким (5-7,5 мкМ) и низким (1 мкМ) содержанием БАП, укореняют на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мкМ НУК.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-10 из 32.
27.02.2013
№216.012.2c3e

Экстракционно-вольтамперометрический способ определения цинка, кадмия, свинца и меди

Изобретение относится к экстракционно-вольтамперометрическому способу определения цинка, кадмия, свинца и меди, позволяющего осуществлять поэлементный мониторинг природных вод и водных экосистем. Способ заключается в экстрагировании металлов из жидкой водной фазы в органическую компоненту...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476853
Дата охранного документа: 27.02.2013
10.03.2013
№216.012.2ea1

Способ определения висмута

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения висмута(III) в технических объектах. Способ определения заключается в потенциометрическом титровании пробы комплексоном(III) с индикаторным электродом из металлического висмута при рН 1,9-4,2. Достигается...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002477468
Дата охранного документа: 10.03.2013
20.05.2013
№216.012.3f44

Способ получения растений-регенерантов ириса мечевидного (i. ensata thunb.) in vitro

Изобретение относится к способу получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro. Способ включает стерилизацию бутонов при условии, что бутоны, смоченные в 96%-ном этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, обеззараживают в 0,1%-ном растворе сульфохлорантина в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002481766
Дата охранного документа: 20.05.2013
27.01.2014
№216.012.9ca7

Способ определения свинца

Настоящее изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения свинца(II) в технических объектах. Способ определения свинца заключается в потенциометрическом титровании пробы комплексоном(III) с индикаторным электродом из металлического висмута с буферным...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002505809
Дата охранного документа: 27.01.2014
27.01.2014
№216.012.9ca8

Способ определения меди

Настоящее изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения меди (II) в технических объектах. Способ определения меди заключается в прямом потенциометрическом титровании комплексоном (III) при рН от 4,1-9,0 с индикаторным электродом из металлического висмута...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002505810
Дата охранного документа: 27.01.2014
27.02.2014
№216.012.a748

Способ определения цинка

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения цинка (II) в технических и природных объектах. Способ заключается в потенциометрическом титровании пробы комплексоном (III) с индикаторным электродом из металлического висмута с буферным раствором при рН 4,1 -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002508539
Дата охранного документа: 27.02.2014
20.04.2014
№216.012.b990

Композиция на основе 24-эпибрассинолида для регулирования развития и защиты растений

Изобретение относится к области сельского хозяйства, точнее к химическим средствам, используется в растениеводстве. Композиция на основе 24-эпибрассинолида для регуляции развития и защиты растений включает в себя источник аминокислот - гидролизат соевого белка, ПАВ - гептаметилтрисилоксан,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002513232
Дата охранного документа: 20.04.2014
20.05.2014
№216.012.c596

Способ получения растений-регенерантов земляники (in vitro)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов земляники in vitro, включающий в себя введение эксплантов в культуру, размножение и укоренение вновь образованных in vitro побегов, где в качестве эксплантов используют фрагменты...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002516341
Дата охранного документа: 20.05.2014
20.07.2014
№216.012.e151

Способ экстракционного извлечения ртути (ii) из хлоридных растворов

Изобретение может быть использовано в аналитической химии для контроля полноты очистки технологических растворов от ионов ртути. Способ экстракционного извлечения ртути (II) из хлоридных растворов включает экстракцию ртути из водной фазы в органическую компоненту расслаивающей системы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002523467
Дата охранного документа: 20.07.2014
20.07.2014
№216.012.e153

Способ экстракции цинка из донных осадков ионной жидкостью

Изобретение относится к области аналитической химии объектов окружающей среды и направлено на разработку средств аналитического контроля параметров экосистем и полиэлементного фонового мониторинга природных вод и водных экосистем. Способ экстракции цинка из донных осадков ионной жидкостью...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002523469
Дата охранного документа: 20.07.2014
Показаны записи 1-10 из 38.
27.02.2013
№216.012.2c3e

Экстракционно-вольтамперометрический способ определения цинка, кадмия, свинца и меди

Изобретение относится к экстракционно-вольтамперометрическому способу определения цинка, кадмия, свинца и меди, позволяющего осуществлять поэлементный мониторинг природных вод и водных экосистем. Способ заключается в экстрагировании металлов из жидкой водной фазы в органическую компоненту...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476853
Дата охранного документа: 27.02.2013
10.03.2013
№216.012.2ea1

Способ определения висмута

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения висмута(III) в технических объектах. Способ определения заключается в потенциометрическом титровании пробы комплексоном(III) с индикаторным электродом из металлического висмута при рН 1,9-4,2. Достигается...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002477468
Дата охранного документа: 10.03.2013
20.05.2013
№216.012.3f44

Способ получения растений-регенерантов ириса мечевидного (i. ensata thunb.) in vitro

Изобретение относится к способу получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro. Способ включает стерилизацию бутонов при условии, что бутоны, смоченные в 96%-ном этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, обеззараживают в 0,1%-ном растворе сульфохлорантина в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002481766
Дата охранного документа: 20.05.2013
27.01.2014
№216.012.9ca7

Способ определения свинца

Настоящее изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения свинца(II) в технических объектах. Способ определения свинца заключается в потенциометрическом титровании пробы комплексоном(III) с индикаторным электродом из металлического висмута с буферным...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002505809
Дата охранного документа: 27.01.2014
27.01.2014
№216.012.9ca8

Способ определения меди

Настоящее изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения меди (II) в технических объектах. Способ определения меди заключается в прямом потенциометрическом титровании комплексоном (III) при рН от 4,1-9,0 с индикаторным электродом из металлического висмута...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002505810
Дата охранного документа: 27.01.2014
27.02.2014
№216.012.a748

Способ определения цинка

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения цинка (II) в технических и природных объектах. Способ заключается в потенциометрическом титровании пробы комплексоном (III) с индикаторным электродом из металлического висмута с буферным раствором при рН 4,1 -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002508539
Дата охранного документа: 27.02.2014
20.04.2014
№216.012.b990

Композиция на основе 24-эпибрассинолида для регулирования развития и защиты растений

Изобретение относится к области сельского хозяйства, точнее к химическим средствам, используется в растениеводстве. Композиция на основе 24-эпибрассинолида для регуляции развития и защиты растений включает в себя источник аминокислот - гидролизат соевого белка, ПАВ - гептаметилтрисилоксан,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002513232
Дата охранного документа: 20.04.2014
20.05.2014
№216.012.c596

Способ получения растений-регенерантов земляники (in vitro)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов земляники in vitro, включающий в себя введение эксплантов в культуру, размножение и укоренение вновь образованных in vitro побегов, где в качестве эксплантов используют фрагменты...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002516341
Дата охранного документа: 20.05.2014
20.07.2014
№216.012.e151

Способ экстракционного извлечения ртути (ii) из хлоридных растворов

Изобретение может быть использовано в аналитической химии для контроля полноты очистки технологических растворов от ионов ртути. Способ экстракционного извлечения ртути (II) из хлоридных растворов включает экстракцию ртути из водной фазы в органическую компоненту расслаивающей системы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002523467
Дата охранного документа: 20.07.2014
20.07.2014
№216.012.e153

Способ экстракции цинка из донных осадков ионной жидкостью

Изобретение относится к области аналитической химии объектов окружающей среды и направлено на разработку средств аналитического контроля параметров экосистем и полиэлементного фонового мониторинга природных вод и водных экосистем. Способ экстракции цинка из донных осадков ионной жидкостью...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002523469
Дата охранного документа: 20.07.2014
+ добавить свой РИД