СПОСОБ ВИЗУАЛИЗАЦИИ АМИНОКИСЛОТ НА ЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ МАТРИЦЕ, СРЕДСТВО ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА

Группа изобретений относится к аналитической химии, а именно к способам идентификации и экспрессного полуколичественного определения биологически активных соединений в сложных смесях. Гистидин является одной из 20 аминокислот природных белков и определяет многие жизненно важные функции живого организма: входит в активные центры многих ферментов, в биосинтезе - предшественник гистамина; относится к частично заменимым (недостаточно синтезируемым в организме) аминокислотам. Является диагностическим фактором при гистидинемии новорожденных и взрослых, беременности, гемолизе, болезни Хартнупа, генерализованной аминоацидурии.

Гистидин применяют в смеси аминокислот для парэнтерального питания больных, входит в состав многих витаминных препаратов как добавка в корма животных и др. В связи с этим востребованы доступные методы экспресс-диагностики гистидина в смесях аминокислот. Наиболее часто для этих целей применяют планарную хроматографию и электрофорез на целлюлозной матрице (в частности, фильтровальной бумаге). После отделения гистидина методом зонального электрофореза из смесей аминокислот важнейшей стадией является визуализация выделенной зоны. От качества визуализированной зоны (скорость развития окраски, ее интенсивность, однородность полученного на твердой матрице продукта, его устойчивость во времени и т.п.) зависит конечный результат: точность анализа, выполняемого денситометрическим или цветометрическим методами.

Известен способ визуализации гистидина на целлюлозной матрице с помощью изатина (Дж.Гринштейн., М.Винниц. Химия аминокислот и пептидов, М., Мир, 1965, с.791), однако нестабильность окраски (розовые блекнущие пятна), малая чувствительность реакции, наличие окраски самого реагента не позволяют применить такой способ визуализации для количественного определения гистидина ни денситометрически, ни цветометрически. Идентификация возможна с этим реагентом лишь на качественном уровне и больших концентраций гистидина.

Известен способ визуализации гистидина с помощью 1,2 нафтохинон-4-сульфоната натрия (Хайс И.М., Мацек К. Хроматография на бумаге. 1962, с.495). Однако реакция мало чувствительна, плохо воспроизводима, использует нестандартный реагент. Она также требует применения токсичного растворителя (метанола) и мало применима для массовых анализов в клинических и производственных условиях.

Наиболее близким к предложенной группе изобретений является способ визуализации гистидина после его отделения от остальных аминокислот с помощью нингидрина (Ф.Файгль. Капельный анализ органических веществ. Гос. Научно-техн. Издат-во хим. литературы. М., 1962, с.372). Способ предусматривает нанесение нескольких капель нингидрина на фильтровальную бумагу и высушивание в сушильном шкафу при 100-105°C с последующим нанесением нескольких капель испытуемого раствора и снова высушиванием бумаги в течение 5-10 мин при вышеуказанной температуре с появлением синего, фиолетового или красноватого окрашивания. Однако данный способ является качественным тестом и не может быть применен для количественного (полуколичественного) определения гистидина как вследствие неприменимой при электрофорезе последовательности нанесения реактантов на целлюлозную матрицу, так и вследствие возможности возникновения нескольких разноокрашенных продуктов реакции или их смеси в разных соотношениях, что обусловливает полную несходимость количественных результатов при повторных определениях. К тому же проведенная в таком варианте реакция является мало чувствительной.

Задачей предлагаемой группы изобретений является разработка доступного клиническим и производственным лабораториям простого, экспрессного, дешевого и экологически чистого способа полуколичественного (с погрешностью до 10%) определения гистидина в смесях аминокислот после его электрофоретического отделения и визуализации выделенной зоны предлагаемым способом.

Технический результат заключается в упрощении, ускорении и удешевлении процедуры определения гистидина или других аминокислот при сохранении высоких метрологических параметров методики определения.

Поставленная задача решается тем, что средство для визуализации аминокислот на целлюлозной матрице, содержащее водный раствор нингидрина, согласно решению содержит K₂HPO₄, лимонную кислоту, цетилпиридиний хлорида в следующих соотношениях, мас.%: K₂HPO₄ - 0,06-0,08; лимонная кислота - 0,01-0,02; цетилпиридиний хлорида - 0,4-0,6; пингидрин - 0,2-0,4; вода - остальное. Способ получения средства для визуализации аминокислот на целлюлозной матрице, включающий приготовление водного раствора, согласно решению, предварительно смешивают 0,2 М водный раствор K₂HPO₄, 0,1 М водный раствор лимонной кислоты и воду в объемном соотношении 23:1:95 соответственно для получения цитратно-фосфатного буфера; получают предварительную смесь, представляющую собой 0,5% раствор цетилпиридиний хлорида в цитратно-фосфатном буфере; средство получают путем изготовления 0,3% раствора нингидрина в предварительной смеси. Способ визуализации аминокислот, нанесенных на целлюлозную матрицу, включающий нанесение на целлюлозную матрицу средства для визуализации, согласно решению после нанесения аминокислот на целлюлозную матрицу ее выдерживают в сушильном шкафу в течение 10-15 мин при 70-75°C, а после этого на целлюлозную матрицу двукратно наносят средство для визуализации по п.1, причем после каждого нанесения целлюлозную матрицу выдерживают в сушильном шкафу в течение 20-30 мин при 70-75°C.

Группа изобретений поясняется чертежами, где на фиг.1 представлена электрофореграмма смеси аминокислот (1 - смесь аминокислот: валин, лейцин, глутаминовая кислота, изолейцин, тирозин, треонин, аланин; 2 - гистидин); на фиг.2 представлена электрофореграмма смеси аминокислот (1 - смесь аминокислот: валин, лейцин, глутаминовая кислота, изолейцин, тирозин, треонин, аланин; 2 - гистидин 3,1 мкг); на фиг.3 представлена электрофореграмма смеси аминокислот (1 - смесь аминокислот: валин, лейцин, глутаминовая кислота, изолейцин, тирозин, треонин, аланин; 2 - гистидин 6,2 мкг); на фиг.4 представлена электрофореграмма смеси аминокислот (1 - смесь аминокислот: валин, лейцин, глутаминовая кислота, изолейцин, тирозин, треонин, аланин; 2 - гистидин 9,3 мкг); на фиг.5 представлен градуировочный график зависимости площади зоны пятна S от концентрации гистидина с при двукратной обработке электрофореграммы визуализирующим раствором; на фиг.6 представлен градуировочный график зависимости параметра S от концентрации гистидина при однократной обработке электрофореграммы визуализирующим раствором.

В качестве визуализирующего реагента использована композиция, состоящая из буферного цитратно-фосфатного раствора pH 7,94 с добавкой катионного поверхностно-активного вещества (ПАВ) цетилпиридиний хлорида и 0,3%-ного раствора нингидрина. Растворы смешивают в определенной последовательности; проводят двукратную обработку полученным реактивом выделенной электрофорезом зоны гистидина на фильтровальной бумаге (тест-полоске, целлюлозной матрице); после электрофореза тест-полоску высушивают в сушильном шкафу при температуре 70-75°C. После первой обработки тест-полосы визуализирующим реагентом проводят ее высушивание при вышеуказанной температуре; затем проводят аналогичным образом вторичную обработку тест-полосы визуализирующим реагентом и снова полоску высушивают; реагент наносят на бумажную полосу распылением с помощью пульверизатора. Полученная таким образом аналитическая форма окрашена в интенсивный фиолетовый цвет, устойчивый в течение многих недель.

Буферный раствор, применяемый как основа визуализирующей композиции, готовят следующим образом: 195 мл 0,2 М раствора K₂HPO₄ смешивают с 8,5 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты и доводится в мерной колбе дистиллированной водой до 1 литра. Буферный раствор имеет pH 7,94 pH.

В качестве реагента применяется специально приготовленный раствор нингидрина:

Нингидрин растворим в воде. При взаимодействии с гистидином образуются конечные продукты:

дикетогидринденкетогидринамин

и гидриндантин

Предлагаемый способ визуализации гистидина на фильтровальной бумаге применим к другим α-аминокислотам (валин, лейцин, изолейцин, тирозин, треонин, глутаминовая кислота, аланин), они дают сине-фиолетовое окрашивание с образованием аналогичных продуктов.

На образование конечного продукта реакции на целлюлозной поддерживающей среде сильно влияет добавка катионного ПАВ цетилпиридиний хлорида (ЦПХ) в визуализирующую смесь, углубляя окраску и увеличивая устойчивость продукта реакции.

Средство для визуализации содержит 0,3% раствор нингидрина в щелочном цитратно-фосфатном буфере (pH 7,94) с добавкой катионного поверхностно-активного вещества - ЦПХ: 0,2 М K₂HPO₄ (для приготовления 200 мл берут навеску кристаллогидрата K₂HPO₄·3H₂O в количестве 9,12 г), 0,1 М лимонной кислоты (для приготовления 25 мл берут навеску кристаллогидрата H₃C₆H₅O₇·H₂O в количестве 0,525 г), ЦПХ (0,5% раствор), нингидрин (0,3% раствор). Полученное в итоге средство содержит растворенные в воде K₂HPO₄, лимонную кислоту, цетилпиридиний хлорида и нингидрин в следующих пропорциях: K₂HPO₄ - 0,067%; лимонная кислота - 0,016%; цетилпиридиний хлорида - 0,5%; нингидрин - 0,3%; вода - остальное.

Способ получения средства заключается в следующем. 195 мл 0,2 М раствора K₂HPO₄ смешивают с 8,5 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты в колбе вместимостью на литр, доводят дистиллированной водой до метки (соотношение K₂HPO₄, лимонная кислота и вода составляет 23:1:95 соответственно). Тщательно перемешивают смесь для получения цитратно-фосфатного буфера с pH 7,94 (раствор 1). В колбу вместимостью 1 л помещают 5 г ЦПХ и доводят ранее приготовленным буферным раствором (pH 7,94) до метки. Тщательно перемешивают до растворения ЦПХ для получения раствора 2 (предварительной смеси). Затем берут колбу вместимостью 200 мл, помещают 0,6 г нингидрина (ч.д.а.). Доводят раствором 2 (предварительной смесью) до метки и тщательно перемешивают.

Способ визуализации аминокислоты заключается в следующем. Тест-полоску с выделенной аминокислотой, например гистидином, после проведения электрофореза высушивают в сушильном шкафу в течение 10 мин при 70-75°C. Визуализирующую композицию наносият дважды на тест-полосу и после каждого нанесения высушивают 20 мин при 70-75°C. Визуализирующую композицию наносият с помощью пульверизатора в виде тонкодисперсной фазы до полного увлажнения тест-полосы, но не допуская ее сильного промокания и стекания капель.

Пример 1. Отделение гистидина (1,55 мкг) из смеси аминокислот производят методом зонального электрофореза при pH 2,3 в цитратно-фосфатной буферной смеси на целлюлозной поддерживающей среде (полоски фильтровальной бумаги длиной 30,3 см и шириной 3 см) при следующих условиях: I=10-12А, U=360 В, t=1 час, t°=18-20°C.

Высушивание разделенных зон проводят при 70°C в сушильном шкафу в течение 10 мин. Визуализирующая смесь готовится следующим образом. В колбу вместимостью 1 л помещают 5 г ЦПХ и доводят ранее приготовленным буферным раствором (pH 7,94) до метки. Тщательно перемешивают до растворения ЦПХ. Затем помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл 0,6 г нингидрина (ч.д.а.) и доводят до метки буферным раствором с ЦПХ, тщательно перемешивают. Далее смесь хранят в холодильнике.

Затем высушенную электрофореграмма равомерно опрыскивают приготовленной визуализирующей смесью до промокания бумаги (не допуская образования и стекания капель!) и высушивают в сушильном шкафу закреплением краев полоски на подвесной стойке, не допуская соприкосновения полоски с дном и стенками шкафа в течение 20 мин. Затем проводят повторное опрыскивание электрофореграммы той же смесью с последующим высушиванием при вышеуказанных условиях. Образующийся продукт реакции окрашен в интенсивный фиолетовый цвет (фиг.1), что связано с полнотой образования конечного продукта в щелочной среде и стабилизацией его с помощью образования ионного ассоциата с катионами цетилпиридиния:

Следовательно, исходная пропитка бумажной матрицы цитратно-фосфатной буферной смесью с pH 2,3, в которой хорошо отделяется гистидин с помощью электрофореза, не мешает визуализации гистидина предлагаемым способом.

Пример 2. Отделение гистидина (13,6 нг) из смеси аминокислот производят методом зонального электрофореза при условиях, указанных в примере 1. Результаты визуализации аминокислот представлены на фиг.2.

Пример 3. Отделение гистидина (6,2 мкг) из смеси аминокислот производят методом зонального электрофореза при условиях, указанных в примере 1. Результаты визуализации аминокислот представлены на фиг.3.

Пример 4. Отделение гистидина (9,3 мкг) из смеси аминокислот производят методом зонального электрофореза при условиях, указанных в примере 1. Результаты визуализации аминокислот представлены на фиг.4.

Таким образом, гистидин можно определить в интервале концентраций 1-10 мкг с погрешностью определения до 10%, что не противоречит данным по этому методу.

Пример 5. Электрофоретическое отделение гистидина от смеси 7 аминокислот проводится методом зонального электрофореза в среде 30% уксусной кислоты при тех же условиях, что и с использованием цитратно-фосфатного буферного раствора.

Следовательно, предварительная пропита бумажной матрицы 30%-ной уксусной кислотой, в которой также хорошо отделяется гистидин от смеси 7 аминокислот, не мешает визуализации гистидина предлагаемой композицией.

Пример 6. Получена серия тест-полосок с разной концентрацией гистидина и проведена двукратная обработка выделенных зон предлагаемым методом с целью построения зависимости S-c (S - площадь зоны пятна, с - концентрация гистидина) и оценки ее пригодности для количественного определения гистидина. Обработка зон на электрофореграммах проводилась по примеру 1. Данные приведены на фиг.5.

Наличие линейной зависимости и ее повторяемость свидетельствуют о стабильности полученных путем предлагаемого способа визуализации результатов и свидетельствует о его пригодности для количественного определения гистидина, либо любой другой аминокислоты, отделенной от смеси других аминокислот, с помощью тест-полосок.

Пример 7. Для сравнения приведены результаты построения градуировочной характеристики определния гистидина по электрофореграммам, визуализация которых проводилась с помощью той же самой композиции при однократной обработке тест-полос заявляемым средством.

Как видно на фиг.6, в этом случае существует большой разброс результатов, не позволяющий получить линейную и стабильную зависимость S-c, необходимую для количественных определений, что связано с неполнотой протекания реакции при однократной обработке тест-полос визуализирующим раствором. Приведенные данные подтверждают целесообразость проведения двукратной обработки электрофореграмм предлагаемой композицией для получения воспроизводимых и стабильных результатов.