Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В НАТУРАЛЬНЫХ МЕДАХ И ДРУГИХ ПРОДУКТАХ ПЧЕЛОВОДСТВА

Изобретение относится к способам анализа пищевых продуктов, а именно к способу количественного определения в натуральном меде и других продуктах пчеловодства пероксида водорода (ПВ), и может быть использовано в пищевой промышленности для оценки качества меда, а также в практике научно-исследовательских работ при изучении биологических свойств продуктов пчеловодства.

ПВ является высокоэффективным дезинфектантом, так как пероксиды быстро уничтожают различные микроорганизмы. ПВ в очень слабых концентрациях (~5-10 мг/кг) содержится в натуральном меде и других природных продуктах пчеловодства и является важнейшей составляющей естественной антибактериальной системы таких продуктов. ПВ образуется в меде и продуктах пчеловодства под воздействием глюкооксидазы - фермента, вырабатываемого глоточными железами пчел. В результате катализируемого глюкооксидазой окисления глюкозы образуются ПВ и глюконовая кислота (Аганин А.В. Мед и его исследование. Изд-во Саратовского ун-та, 1985 г., с.53).

Первые данные о содержании в меде ПВ относятся к 1962 году (White J.W., Subers М.Н., Schepartz A.I., The Identification of Inhibine, American Bee Journal, Vol.102, November 1962, pp.459-431). Исследований о содержании ПВ в других продуктах пчеловодства до настоящего времени не проводилось.

Известен способ количественного определения ПВ в меде, заключающийся в окислении ПВ 3,3'-диметоксибензидина (o-дианизидина) в присутствии пероксидазы. (Пероксидаза - фермент, катализирующий окисление различных полифенолов, алифатических и ароматических аминов и других соединений с помощью ПВ или органических перекисей). ПВ выступает в роли акцептора водорода и в ходе реакции превращается в воду. 3,3'-Диметоксибензидин при окислении превращается в окрашенную хиноидную структуру, поглощающую при длине волны 450 нм, что позволяет судить о количестве ПВ. Данный способ требует предварительной калибровки (White J.W., Subers М.Н. Studies on Honey Inhibine. 2. A Chemical Assay. Journal of Apicultural Research, 2(2), 1963, p.93-100 - прототип).

Главным недостатком способа-прототипа является его сложность и высокая трудоемкость, кроме того, он требует использования дорогостоящих реактивов: фермент пероксидаза и 3,3'-диметоксибензидин. Данный способ применялся в научных исследованиях при изучении биологических свойств меда, но для количественного анализа он не может быть рекомендован.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка такого способа количественного определения ПВ в натуральных медах и других продуктах пчеловодства, который будет значительно менее сложным и трудоемким, позволит отказаться от использования дорогостоящих реагентов и будет отличаться высокой чувствительностью.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым способом количественного определения пероксида водорода в натуральных медах и других продуктах пчеловодства, включающим взаимодействие пероксида водорода с окисляющимся соединением, образующим при окислении окрашенный продукт, в котором в качестве окисляющегося соединения используют йодид анион, количество образовавшегося йода в виде комплексного аниона регистрируют методом электронной абсорбционной спектроскопии и рассчитывают содержание пероксида водорода в анализируемом продукте в мг на кг продукта.

При определении пероксида водорода в прополисе, или перге, или пыльце указанные продукты пчеловодства предварительно экстрагируют диметилсульфоксидом.

Полученный при экстрагировании раствор отфильтровывают.

В предлагаемом способе для количественного определения содержания ПВ был выбран йодометрический метод. При взаимодействии йодида калия с ПВ в кислой среде выделяется молекулярный йод, который с избытком иодид-аниона образует комплексный анион , который регистрируют методом электронной абсорбционной спектроскопии (длина волны регистрации λ_max=351 нм, коэффициент молярного погашения растворов ), что позволяет достичь высокой чувствительности определения ПВ - до значения 0.1 мг ПВ на 1 кг меда, что соответствует 10^-5% ПВ.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

К навеске образца меда массой 1 г (m_нав) добавляют дистиллированную воду до объема 2 мл (для быстрого растворения можно дополнительно использовать перемешивающие устройства).

Навеску образца прополиса, или перги, или пыльцы массой 1 г (m_нав) экстрагируют при встряхивании 2 мл диметилсульфоксида в течение 20-30 мин. Полученные при экстрагировании растворы отфильтровывают.

Полученные 2 мл раствора продукта пчеловодства делят на два образца раствора, каждый объемом 1 мл, и используют для параллельного определения. К 1 мл указанного раствора приливают 1 мл раствора серной кислоты (0.2 моль/л), продувают углекислым газом или иным тяжелым инертным газом с целью вытеснения кислорода и смешивают с 2 мл также обескислороженного 5%-ного (масс.) водного раствора иодида калия, после чего проводят повторное продувание углекислым газом. Два полученных аналитических раствора (объемом 4 мл, содержащие ½ m_нав) оставляют при температуре 20-22°C в темноте на сутки (для гарантии полного завершения реакции выделившегося йода с избытком йодид-аниона с образованием комплексного аниона ). Затем с использованием типового спектрофотометра, настроенного на диапазон длин волн 300-800 нм записывают электронные спектры каждого из образцов и проводят определение оптической плотности аналитических растворов (D) при значении длины волны 351 нм. Из найденного значения D необходимо вычесть собственное поглощение раствора соответствующего образца меда, или прополиса, или перги, или пыльцы (D_м), аналогичным образом разбавленного дистиллированной водой, в том же спектральном диапазоне (либо использовать такой раствор в качестве сравнительной кюветы). (Измерение D позволяет определять концентрацию ПВ (С_ПВ) в аналитическом растворе в моль/л: С_ПВ=(D-D_м)/ε·l). В качестве «холостого опыта» для анализа вместо 1 мл раствора продукта пчеловодства берут 1 мл дистиллированной воды и далее аналогично описанному подкисляют, обескислороживают, добавляют раствор иодида калия и выдерживают в темноте (в сравнительную кювету наливают дистиллированную воду).

Содержание ПВ в меде в мг на кг (ω) рассчитывают по формуле:

ω=[(D-D_м)/ε·l]·M/m_нав·V·1000,

где

D - показание спектрофотометра для аналитического раствора меда на длине волны 351 нм;

D_м - показание спектрофотометра на длине волны 351 нм для контрольного раствора меда (без добавления реагентов);

ε - коэффициент молярного погашения , ε=26400 л·моль^-1·см^-1;

l - ширина кюветы, см;

M - молярная масса ПВ, г/моль (34 г/моль);

m_нав - навеска меда, г;

V - объем раствора, содержащего навеску меда m_нав, мл (V=8 мл);

1000 - коэффициент для пересчета содержания ПВ в меде в мг на кг.

Предлагаемый способ был испытан при исследовании большого количества образцов натурального пчелиного меда различного ботанического и территориального происхождения. Объектами исследования служили образцы натурального меда и других продуктов пчеловодства из лаборатории ветеринарной санитарии в пчеловодстве ГНУ ВНИИВСГЭ, отобранные для экспертизы и сертификации с целью дальнейшей реализации на Московской весенней ярмарке 2011 года. Пробы меда отбирали согласно ГОСТ 19792-2001 «Мед натуральный. Технические условия». Определение количественного содержания ПВ проводили в ИХФ РАН. В таблицах 1-3 приведены полученные результаты количественного определения ПВ в различных медах. В таблице 4 приведены полученные результаты количественного определения ПВ в других продуктах пчеловодства.

Таким образом, предлагаемый способ является более простым, менее трудоемким и не требует использования дорогостоящих реагентов. Благодаря применению комбинации методов иодометрического титрования и чувствительной электронной абсорбционной спектроскопии в способе достигается высокая чувствительность определения - 10^-5% ПВ.