Результат интеллектуальной деятельности: КОМПОЗИЦИОННЫЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ПРЕПАРАТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и предназначено для лечения и профилактики различных заболеваний в ветеринарии. Композиционный ветеринарный препарат на основе углеродного носителя с биологически активным компонентом обладает адсорбционной и биологической активностью, в том числе иммунокорригирующим действием. Предназначен для использования в качестве лекарственного средства пролонгированного действия при нарушении работы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и иммунной системы, а также усиления терапевтического эффекта других лекарственных средств при профилактике и лечении ряда болезней животных и птиц.

Известно, что болезни ЖКТ наносят значительный экономический ущерб, который складывается из летальности животных и птиц, отставания в росте и развитии, снижении продуктивности.

Одной из причин заболеваний являются поступившие в организм извне вместе с кормом токсические вещества разной природы (Иванов А.В. и др. Применение сорбентов для профилактики микотоксикозов животных. Успехи медицинской микологии. М.: Национальная академия микологии, 2006, Т.7, 346 с.).

Традиционным способом лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных и птиц является использование химиотерапевтических средств, в частности антибиотиков (Кочиц И.И., Петраш М.Г., Смирнов С.Б. Птицеводство. М.: КолосС. 2000, 407 с.). Однако продолжительное их использование ведет к развитию множественной антибиотикорезистентности у микроорганизмов и иммунодефицитных состояний у животных, образованию в организме токсичных соединений, снижению эффективности лечебно-профилактических мероприятий.

Поступающие в организм человека по пищевой цепочке: «животные-продукция-человек» антибиотики, как и токсины, представляют серьезную опасность для его здоровья (Уша Б.В., Кальницкая О.И. Контроль остатков антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения // «Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии». Второй съезд ветеринарных фармакологов и токсикологов России. Казань. 9-12 июня 2009 г. Материалы съезда. - Казань, 2009. С.11-14).

Известно применение в комплексном лечении заболеваний животных и птиц сорбентов различной природы (Фомичев Ю.П. и др. Эффективность применения энтеросорбентов при выращивании молодняка крупного рогатого скота в техногенных зонах России // Аграрная Россия. 2004. №5. С.12-17).

Энтеросорбенты в желудочно-кишечном тракте путем адсорбции, ионообмена, комплексообразования, действия других механизмов связывают экзо- и эндогенные вещества и выводят их из организма. Удаление или снижение концентрации токсических веществ активизирует работу собственной системы детоксикации организма, повышает чувствительность к воздействию лекарственных средств и способствует снижению применяемой дозы, поэтому использование сорбентов в комплексной терапии повышает эффективность лечения и безопасность продукции животноводства и птицеводства для человека.

Применение известных сорбентов на основе природного сырья имеет ряд негативных последствий:

полифепан и другие сорбенты на основе природного сырья способны набухать в биологических жидкостях; шероховатая поверхность их частиц оказывает травматическое действие на ткани органов ЖКТ;

полисорб и другие сорбенты с размером частиц 0,1 мм и менее способны проникать через стенки кишечника в кровь, доставляющую их в другие органы (Коваленко В.Л., Лесных А.Ю., Каточкова И.М., Ефремов О.Т. Микроэмболия легких частицами синтетического полимерного препарата «Полисорб» при лечении послеродового эндометрита // Архив патологии. 2000.1.62. №3. С.46-48).

Указанные недостатки данных сорбентов устранены применением в ветеринарии синтетических углеродных сорбентов высокого качества, состоящих из прочных гранул с гладким рельефом поверхности (Мухин В.М., Тарасов А.В., Клушин В.Н. Активные угли России // М.: Металлургия, 2000, с.120). Однако выпуск синтетических углеродных сорбентов ограничил недостаток сырьевых ресурсов, сложность технологических процессов их получения.

Следовательно, для медицинской биотехнологии актуальной стала разработка качественных сорбционных материалов с заданными свойствами для очищения организма от токсикантов разной природы.

В ИППУ СО РАН разработана современная технология матричного синтеза углеродных материалов различного назначения на основе нанодисперсного углерода (Лихолобов В.А. Институт проблем переработки углеводородов СО РАН. Достижения науки и практики для решения проблем химической переработки углеводородов // Рос. хим. журнал (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева). 2007. T. LI. №4. С.4-10).

На основе данной технологии создан высококачественный ветеринарный препарат - углеродный энтеросорбент ЗООКАРБ (В.Ф.Суровикин, Л.Г.Пьянова, Л.С.Лузянина. Новые гемо- и энтеросорбенты на основе нанодисперсных углерод-углеродных материалов. Российский химический журнал. 2007. Т. LI. №5. С.159-165) (прототип).

Энтеросорбент углеродный ЗООКАРБ состоит из прочных гранул размером 0,1-1,0 мм, обладает высокой адсорбирующей способностью по отношению к широкому спектру токсических веществ различной природы, преимущественно, со средней молекулярной массой, полностью выводится из организма. Применение его в ветеринарной практике повысило эффективность лечения при острых и хронических отравлениях ядами различного происхождения; при заболеваниях, сопровождающихся развитием эндогенного токсикоза, процессами гниения и брожения в кишечнике, при внутриутробной интоксикации.

Расширить спектр полезного действия энтеросорбентов позволяет создание на их основе комплексных препаратов. Технология получения комплексных препаратов основана на закреплении определенным способом на поверхности носителя активного сорбирующего действия биологически активных компонентов. Применение полученных препаратов значительно снижает их дозировки с целью достижения необходимого терапевтического эффекта, что обусловлено переходом биологически активного компонента в биологическую жидкость организма при движении препарата по системе ЖКТ. Характер постепенного освобождения поверхности носителя от активного компонента сохраняет его адсорбционную активность по отношению к токсическим веществам на всем протяжении тракта. Совместное действие данных факторов обеспечивает терапевтический эффект, необходимый для лечения и профилактики целого ряда болезней, реабилитации организма. Так, комплексный препарат «БИФИТРИЛАК», состоящий из адсорбента вермикулита и лиофилизированных штаммов бактерий-пробиотиков Lactobacillus bulgaricus, lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium bifidum, успешно назначается в момент антибиотикотерапии (патент РФ №2119796 «Комплексный пробиотический препарат для животных "БИФИТРИЛАК").

Задачей предлагаемого изобретения является создание композиционного ветеринарного препарата, объединяющего лучшие свойства составляющих его компонентов: высокие адсорбирующие свойства углеродного носителя и биологическую активность диспергированного в его пористую структуру вещества, полученного на основе природного сырья. Постепенная миграция диспергированного вещества из пор и поверхности носителя в биологическую жидкость на всем пути движения препарата по желудочно-кишечному тракту позволит усилить его терапевтическую эффективность, в первую очередь, за счет проявления иммунокорригирующего действия, при сохранении адсорбирующей активности носителя.

Для решения поставленной задачи предлагается композиционный ветеринарный препарат в виде сферических гранул углеродного материала высокой прочности, который содержит биологически активное вещество природного происхождения бетулин или бетулин и глицерин, при следующем содержании компонентов, мас.%: бетулин 0,5-1,8, глицерин 0-5, углеродный носитель - остальное, и характеризуется размером гранул 0,5-0,8 мм и удельной адсорбционной поверхностью 170-250 м²/г.

Предлагаемый способ получения композиционного ветеринарного препарата включает гидромеханическую обработку пористого углеродного материала с последующим высушиванием продукта и отличается тем, что бетулин растворяют в этаноле при массовом соотношении бетулин:этанол 0,01-0,06:1 или этанольно-глицериновом растворе при массовом соотношении бетулин:глицерин:этанол 0,03:0,14:1 и диспергируют в пористую структуру углеродного носителя методом пропитки этанольным раствором бетулина или этанольно-глицериновым раствором бетулина при соотношении раствор бетулина:углеродный носитель 0,4:1, при комнатной температуре и перемешивании.

Углеродный носитель - микросферический нанопористый углеродный материал - получен по технологии матричного синтеза энтеросорбента углеродного ЗООКАРБ (патент №2211727 «Способ обработки гранул углеродного материала для гемо- и энтеросорбции и реактор для его осуществления»). Представлен прочными гранулами (прочность при истирании не менее 90%) сферической формы размером 0,5-0,8 мм, с гладким рельефом поверхности.

В качестве биологически активного вещества выбран бетулин, содержащийся во внешнем слое коры березы (бересте).

Бетулин безопасен для животных (4 класс токсичности по международной классификации), обладает капилляроукрепляющим, гепатопротекторным, гастрозащитным эффектами (Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития, 2005, №13, C.1-30).

Перспективность применения бетулина в фармацевтической промышленности определяют его антисептические, противовоспалительные, антивирусные (вирус герпеса), антиоксидантные и другие полезные свойства (Кузнецов Б.Н., Кузнецова С.А. Левданский В.А., Судакова И.Г., Веселова О.Ф. Совершенствование методов выделения, изучения состава и свойств экстрактов березовой коры // Химия в интересах устойчивого развития, 2005, №13, 391-400; A. Sami and el. Pharmacological properties of the ubiguitous natural product betulin // European journal of pharmaceutical sciences, 29, 2006, 1-13).

Применение бетулина ограничивает его нерастворимость в воде и недостаточная растворимость во многих органических растворителях (в этаноле составляет 0,9 г/100 г при 20°С и 4,3 г/100 г при 78°С). Внесение бетулина с кормовой смесью не позволяет установить с достаточной точностью дозу введенного в организм животных препарата.

Процесс получения композиционного ветеринарного препарата включает следующие стадии:

- приготовление этанольного раствора бетулина при массовом соотношении бетулин:этанол 0,01-0,06:1 или этанольно-глицеринового раствора бетулина при массовом соотношении бетулин:глицерин:этанол 0,03:0,14:1;

- диспергирование в пористую структуру углеродного носителя бетулина методом его пропитки этанольным раствором бетулина или этанольно-глицериновым раствором бетулина при соотношении раствор бетулина:углеродный носитель 0,4:1, при комнатной температуре и перемешивании;

- выделение этанола из композиционного препарата нагреванием до (120±5)°С;

- сушка полученного композиционного ветеринарного препарата при температуре 100-110°С до остаточной влажности не более 2 мас.%.

Основные характеристики полученных композиционных ветеринарных препаратов представлены в таблице.

Исследования основных характеристик проведены стандартными методами:

- удельная адсорбционная поверхность - по низкотемпературной адсорбции азота (Т=-195,7°С) на объемной статической вакуумной установке Sorptomatic-1900, "Carlo Erba". Перед проведением адсорбционных измерений образцы тренировали в вакууме при температуре 200-300°С в течение не менее 6-8 часов. По данным изотерм адсорбции азота, измеренных в области относительных давлений паров азота Р/Р₀=10^-4÷0,35, рассчитаны значения удельной поверхности по методу БЭТ S_БЭТ;

- рельеф, морфология поверхности гранул образцов, фазовое состояние бетулина на поверхности композиционного препарата в вакуумной камере растрового электронного микроскопа JSM - 6460 LV, JEOL;

- рентгеновский микроанализ поверхности исследуемых образцов на энергодисперсионном спектрометре EDAX;

- количество диспергированного в структуру углеродного носителя бетулина определено спектрофотометрическим методом по изменению концентрации его раствора до и после контакта с углеродным носителем и хромато-масс-спектрометрическим методом на приборе Agilent Technologies 6890/5973N, с использованием неполярной капиллярной хроматографической колонки HP 5ms. диаметром 0,25 мм, длиной 30 м.

На фиг.1 представлены электронно-микроскопические снимки гранулы композиционного ветеринарного препарата (а), поверхности гранулы углеродного носителя - микросферического нанопористого углеродного материала (б) и поверхности гранулы композиционного ветеринарного препарата, содержащего 1,8% бетулина (в).

Электронно-микроскопическими исследованиями (фиг.1) установлено:

- диспергирование бетулина с глицерином в пористую структуру углеродного носителя - микросферического нанопористого углеродного материала - не приводит к изменению формы и размера гранул полученного композиционного ветеринарного препарата (фиг.1а);

- бетулин и глицерин при выбранных концентрациях заполняют доступные по размеру их молекул поры углеродного носителя, стыки базальных плоскостей поверхности, щели и другие ее микронеровности, формируя островковый характер своего распределения, при сохранении мезопористой структуры углеродного носителя (фиг.1б, в).

Методом рентгеновского микроанализа установлено, что диспергирование бетулина в структуру углеродного носителя (от 0,5 до 1,8 мас.%) на определенных участках поверхности его гранул снижает на них содержание углерода со 100 до 95,44 вес.% и повышает содержание кислорода от 0 вес.% до 4,6 вес.%.

Присутствие глицерина, содержащего 10,47 вес.% кислорода, повышает общее содержание кислорода в композиционном ветеринарном препарате до 5,7 вес.% при снижении содержания углерода до 94,33 вес.%.

При физической сорбции, характеризующейся обратимым характером, бетулин десорбируется из пористой структуры и поверхности композиционного ветеринарного препарата при прохождении его по желудочно-кишечному тракту в биологическую жидкость. Моделированием процесса десорбции бетулина в средах с разным значением pH установлен количественно полный переход бетулина в исследуемую среду. Глицерин в составе композиционного ветеринарного препарата повышает скорость и полноту удаления бетулина.

Диспергирование бетулина в пористую структуру углеродного носителя в процессе пропитки его раствором и физическая адсорбция бетулина на стенках пор меняет текстурные характеристики композиционного ветеринарного препарата: снижает величину удельного объема пор каждого вида, суммарного объема пор и удельной адсорбционной поверхности.

В лаборатории кафедры диагностики внутренних незаразных болезней и фармакологии Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет» (г.Омск) проведены исследования хронической токсичности композиционных ветеринарных препаратов для лабораторных животных (крыс) при ежедневном скармливании им с кормом в дозах по 200 мг/кг массы тела в течение 14 суток. Установлено, что испытуемые композиционные ветеринарные препараты:

- не обладают хронической токсичностью;

- в терапевтических дозах не вызывают макроскопических изменений внутренних органов, гибели и острой интоксикации лабораторных животных (крыс);

- не влияют на их поведение, общее состояние;

- не нарушают функциональную активность органов и систем организма.

Морфологическими исследованиями периферической крови лабораторных животных (крыс) при приеме ими предлагаемых композиционных ветеринарных препаратов установлено, что они обладают выраженной иммунокорригирующей активностью (таблица).

Оценка влияния предлагаемых композиционных ветеринарных препаратов на состав периферической крови проведена по показателю общего количества лейкоцитов и лейкограмме. Введение животным энтеросорбента углеродного ЗООКАРБ сопровождается увеличением числа лейкоцитов в крови. Однако прием предлагаемых композиционных ветеринарных препаратов снижает интенсивность ответной реакции организма, уменьшая выработку лейкоцитов. Выраженное снижение уровня лейкоцитов наблюдалось при введении композиционного ветеринарного препарата, содержащего 1,0 мас.% бетулина и 5 мас.% глицерина, на фоне выраженного лейкоцитоза. Установленный эффект позволяет сделать вывод об иммунокорригирующем действии композиционного ветеринарного препарата.

В оценке результатов морфологических исследований крови имеет значение процентное соотношение всех видов лейкоцитов - лейкограмма (таблица). Прием энтеросорбента углеродного ЗООКАРБ достоверно снижает число лимфоцитов, ответственных за иммунный ответ. Предлагаемые композиционные ветеринарные препараты повышают уровень лимфоцитов, нивелируя оказываемый на состав крови эффект энтеросорбента. Прием энтеросорбента углеродного ЗООКАРБ достоверно повышает количество сегментоядерных нейтрофилов, тогда как прием предлагаемых композиционных ветеринарных препаратов снижает их количество. Увеличение количества нейтрофилов (сдвиг лейкоцитарной формулы влево) наблюдается при острых инфекционных, воспалительных заболеваниях, а также при лейкозах. Установленный эффект позволяет сделать вывод о возможности применения композиционных ветеринарных препаратов при лечении данных заболеваний.

Одним из механизмов реализации выраженной биологической активности композиционного ветеринарного препарата, содержащего 1,0 мас.% бетулина и 5 мас.% глицерина, являются мембраностабилизирующие и антиоксидантные эффекты, так как при снижении общего количества нейтрофилов уменьшается содержание миелопероксидазы в крови.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами приготовления конкретных рецептур заявляемых композиционных ветеринарных препаратов.

Пример 1. Пневмогидромеханической обработкой в псевдоожиженном слое углеродного пористого материала получен углеродный энтеросорбент ЗООКАРБ со следующими характеристиками: содержание углерода 100 вес.%, размер гранул 0,1-1,0 мм, удельной адсорбционной поверхностью 320 м²/г. При его скармливании крысам по 200 мг/кг с кормом в течение 2-х недель изменения состава крови составили: повышение лейкоцитов с (15,46±4,16)×10⁹/л до (24,49±1,62)×10⁹/л, снижение лимфоцитов с (75,8±1,88)% до (59,2±3,15)%, повышение сегментоядерных нейтрофилов с (18,2±0,8)% до (30,4±4,05)%.

Пример 2. В пористую структуру углеродного носителя - микросферического нанопористого углеродного материала диспергированием методом пропитки этанольным раствором бетулина (соотношение бетулин: этанол 0,015: 1) приготовлен композиционный ветеринарный препарат, содержащий 0,5 мас.% бетулина, с характеристиками: содержание углерода 97,68 вес.%, кислорода 2,32 вес.%; удельная адсорбционная поверхность 245 м²/г. При его скармливании крысам по 200 мг/кг с кормом в течение 2-х недель наблюдались следующие изменения состава крови: повышение лейкоцитов с (8,41±1,00)×10⁹/л до (17,21±1,53)×10⁹/л, повышение лимфоцитов с (55,6±2,95)% до (60,0±3,00)%, снижение сегментоядерных нейтрофилов с (28,8±1,1)% до (25,6±1,5)%.

Пример 3. В пористую структуру углеродного носителя - микросферического нанопористого углеродного материала диспергированием методом пропитки этанольным раствором бетулина (соотношение бетулин:этанол 0,03:1) приготовлен композиционный ветеринарный препарат, содержащий 1,0 мас.% бетулина, с характеристиками: содержание углерода 96,35 вес.%, кислорода 3,65 вес.%, удельная адсорбционная поверхность 239 м²/г. При его скармливании крысам по 200 мг/кг с кормом в течение 2-х недель изменения состава крови составили: повышение содержания лейкоцитов с (11,4±2,7)×10⁹/л до (19,04±2,78)×10⁹/л, повышение лимфоцитов с (53,2±7,66)% до (69±3,9)%, снижение сегментоядерных нейтрофилов с (41,8±7,98)% до (21,8±1,85)%.

Пример 4. В пористую структуру углеродного носителя - микросферического нанопористого углеродного материала диспергированием методом пропитки этанольным раствором бетулина (соотношение бетулин: этанол 0,06: 1) приготовлен композиционный ветеринарный препарат, содержащий 1,8 мас.% бетулина, с характеристиками: содержание углерода 95,44 вес.%, кислорода 4,56 вес.%, удельная адсорбционная поверхность 233 м²/г. При его скармливании крысам по 200 мг/кг с кормом в течение 2-х недель изменения состава крови составили: повышение лейкоцитов с (11,7±2,61)×10⁹/л до (18,1±3,10)×10⁹/л, повышение лимфоцитов с (58,6±2,15)% до (61,4±1,9)%, снижение сегментоядерных нейтрофилов с (30,1±3,95)% до (22,4±2,81)%.

Пример 5. В пористую структуру углеродного носителя - микросферического нанопористого углеродного материала диспергированием методом пропитки этанольно-глицериновым раствором бетулина (соотношение бетулин: глицерин:этанол 0,03:0,14:1) приготовлен композиционный ветеринарный препарат, содержащий 1,0 мас.% бетулина и 5 мас.% глицерина, с характеристиками: содержание углерода 94,33 вес.%, кислорода 5,67 вес.%, удельная адсорбционная поверхность 228 м²/г. При скармливании препарата крысам по 200 мг/кг с кормом в течение 2-х недель изменения состава крови составили: содержание лейкоцитов снизилось с (21±3,18)×10⁹/л до (10,96±1,62)×10⁹/л, лимфоцитов - повысилось с (67,0±4,21)% до (70,2±6,45)% и сегментоядерных нейтрофилов снизилось с (24±4,67)% до (23,4±2,82)%.

Как следует из примеров и таблицы, предлагаемый композиционный ветеринарный препарат сочетает свойства составляющих его компонентов: высокие адсорбирующие свойства углеродного носителя и биологическую активность диспергированного в его пористую структуру бетулина. Наибольший эффект на состав крови животных при приеме внутрь оказывает композиционный ветеринарный препарат, содержащий 1,0 мас.% бетулина и 5 мас.% глицерина: эффективно снижает количество лейкоцитов на фоне выраженного лейкоцитоза, повышает уровень ответственных за иммунный ответ лимфоцитов, снижает количество сегментоядерных нейтрофилов, повышение которых наблюдается при ряде заболеваний (острых инфекционных, воспалительных, а также при лейкозах). Кроме того, данный препарат стимулирует пищевой рефлекс животных при поедании.

Проведены испытания опытной партии композиционного ветеринарного препарата, содержащего 1,0 мас.% бетулина и 5 мас.% глицерина, в ГНУ Сибирском научно-исследовательском институте птицеводства Российской сельскохозяйственной академии г.Омска на птице. Исследовалось влияние композиционного ветеринарного препарата на ряд учитываемых показателей цыплят-бройлеров.

1. Иммунологические показатели: определение количества поствакцинальных антител в сыворотке крови к вирусам инфекционной бурсальской болезни (ИББ) в возрасте 28,35,42 дня (по 10 проб с группы).

Через две недели после приема композиционного ветеринарного препарата в возрасте 28 дней поствакциональные антитела в диагностических титрах к вирусу ИББ имело 33% цыплят-бройлеров опытной группы, средний титр 3714. В возрасте 35 и 42 дней (через три и четыре недели после приема препарата) количество иммунной птицы в опытной группе составило 100%. При применении препарата пик антителообразования наблюдается через 3 недели после его приема: количество иммунной птицы составило 100%, титры антител в пределах поствакцинальных значений. У цыплят четко выражена закономерность влияния разработанного композиционного ветеринарного препарата на выработку поствакцинальных антител к вирусу ИББ: увеличение среднего титра в течение всего срока испытания от 3714 до 9468.

2. Зоотехнические показатели: сохранность, привес, живая масса птиц. Сохранность птиц опытной группы находилась на довольно высоком уровне и снизилась за четвертую неделю на 1,4%. По живой массе цыплята опытной группы во все возрастные периоды превосходили цыплят из контрольной группы. В возрасте 7 дней живая масса петушков и курочек опытной группы была больше, чем в контрольной соответственно на 15,3% и 11,3%; в конце выращивания живая масса цыплят опытной группы была больше массы цыплят из контрольной группы: петушки - на 8,0% и курочки на 3,0%; при более высокой скорости роста.

Данные исследования позволяют сделать вывод, что применение композиционного ветеринарного препарата повышает мясную продуктивность бойлеров, переваримость и способность использовать питательные вещества комбикорма (сырой протеин, сырая клетчатка), трансформировать их в прирост массы тела, что возможно лишь при общей нормализации обменных процессов цыплят. Эффективность использования корма птицей можно рассматривать не только как биологическую функцию организма в виде ответной реакции на определенные условия кормления, но и важнейший экономический показатель эффективности производства.

3. Общебиологические показатели: применение композиционного ветеринарного препарата не оказало отрицательного влияния на гематологические показатели цыплят.