×
27.02.2013
216.012.2aa5

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА НОНА-β-(1→3)-ГЛЮКОЗИДА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ СКВАРАТНЫМ МЕТОДОМ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ синтеза конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином (БСА) скваратным методом. Первоначально осуществляют взаимодействие нона-β-(1→3)-глюкозида с диэтилскваратом. Затем проводят реакцию полученного лиганда - моноамида скваратовой кислоты с белком БСА в смеси боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида. При этом соотношение боратного буфера и диметилсульфоксида составляет 9:1. Способ позволяет увеличить эффективность реакции конъюгации и на 20-25% снизить потребление используемого лиганда. 5 пр.
Основные результаты: Способ синтеза конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином скваратным методом, отличающийся тем, что стадию конъюгации проводят в смеси боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида, где соотношение боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида составляет 9:1.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области синтеза гликоконъюгатов, построенных на основе углеводных лигандов и белковых носителей. Предлагаются новые условия получения таких соединений на примере конъюгатов нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином (БСА), в которых углеводные и белковый компоненты соединены посредством скваратного линкера. Соединения такого типа в настоящее время широко используются в качестве иммуногенов и для получения вакцин против инфекционных заболеваний и рака, что позволяет расширить арсенал медицинских препаратов, используемых для лечения этих заболеваний.

Конъюгаты олиго- или полисахаридов с другой иммуногенной молекулой, такой как полипептид или белок, использовались для инициирования иммунного ответа на ряд грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также других возбудителей инфекций. Конъюгирование полисахарида или олигосахарида с полипептидом превращает иммунный ответ на олиго- или полисахарид, который обычно является Т-независимым, в Т-зависимый ответ.

В предыдущем уровне техники раскрывается как прямое, так и непрямое соединение полисахаридов с белками с образованием конъюгатов (итог подведен в ссылке [1] и патенте США №5 306 492). Методы конъюгирования включают в себя диазосочетание, тиоэфирное связывание, амидирование, восстановительное аминирование и тиокарбамоилирование для присоединения к белковому носителю.

Gever et al., Med. Microbiol. Immunol., 165: 171-288 (1979) описали получение конъюгатов некоторых капсульных полисахаридных фрагментов Klebsiella pneumoniae с нитрофенилэтиламиновым линкером путем восстановительного аминирования и присоединения производного сахара с помощью азосочетания.

В патенте США №4057685, Mclntire, описан липополисахарид Escherichia coli с пониженной токсичностью, ковалентно связанный с белковым антигеном в результате взаимодействия с галогенангидридом.

В патенте США №4 356 170, Jennings et al., описывается получение полисахарид-белковых конъюгатов методом восстановительного аминирования.

В патенте США №4673574, 4761283 и 4808700, Anderson, описано получение иммуногенных конъюгатов, включающих в себя продукт восстановительного аминирования иммуногенного фрагмента капсульного полисахарида, полученного из капсульного полимера Streptococcus pneumoniae или Н.influenzae окислительным расщеплением периодатом или гидролизом гликозидной связи и содержащего свободную альдегидную группу на восстанавливающем конце, и бактериальный токсин или анатоксин в качестве белкового носителя.

В патенте США №4459286, Hillman et al., описано получение полисахарид-белкового конъюгата путем активации полисахарида Н.influenzae типа В бромцианом, получения производного активированного полисахарида со спейсерной молекулой, 6-аминокапроновой кислотой, и присоединения основного белка внешней мембраны Neisseria meningitidis с использованием водорастворимого карбодиимида с образованием связи амидного типа с белком через сложный ряд связующих звеньев от 6-аминокапроновой кислоты до полисахарида.

В патенте США №4965338, Gordon, описано получение водорастворимого ковалентного конъюгата полисахарида с дифтерийным анатоксином, где чистый полисахарид Н. influenzae типа b активируют бромцианом и сразу смешивают с дифтерийным анатоксином, модифицированным ADH-спейсером.

В патенте США №4663160, Tsay et al., описан детоксифицированный полисахарид грамотрицательных бактерий, ковалентно связанный с детоксифицированным белком, полученным из тех же видов грамотрицательных бактерий, посредством фрагмента, имеющего 4-12 атомов углерода.

В патенте США №4619828, Gordon et al., описаны конъюгаты молекул полисахаридов патогенных бактерий, таких как Haemophilus influenzae типа b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis и Escherichia coli, с Т-зависимыми антигенами, такими как дифтерийный и столбнячный анатоксины.

В патенте США №4711779, Porro et al., описаны вакцины на основе конъюгатов гликопротеинов, обладающие трехвалентной иммуногенной активностью, содержащие антигенные детерминанты капсульных полисахаридов грамположительных бактерий, а также либо CRM197, столбнячный анатоксин, либо коклюшный токсин.

В патенте США №5306492, Porro, описан конъюгат олигосахарида с белком-носителем, полученный путем взаимодействия по реакции восстановительного аминирования олигосахарида, имеющего концевую альдегидную группу, с диаминометаном в присутствии пиридинборана, дальнейшей реакции аминированного олигосахаридного продукта с молекулой, имеющей две функциональные группы, и затем взаимодействия активированного олигосахаридного продукта с белком-носителем.

В патенте США №5192540, Kuo et al., описан конъюгат олигосахарида с белком, включающий в себя продукт восстановительного аминирования окисленного полирибозил-рибитолфосфатного фрагмента, полученного из капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, и белка внешней мембраны Haemophilus influenzae типа b.

В публикации заявки на европейский патент №ЕР 0747063 А2 описан модифицированный капсульный полисахарид, содержащий различные производные сиаловой кислоты, и гетеробифункциональную линкерную молекулу, связанную с молекулой носителя. Линкеры используются для N-алкилирования приблизительно до 5 остатков сиаловой кислоты на полисахарид. Затем оставшиеся аминогруппы ацилируют пропионовым или уксусным ангидридом.

Существует потребность в более эффективных очищенных иммуногенных олигосахарид-белковых конъюгатах, которые могут быть получены более простым способом и с более высоким выходом, для широкомасштабного получения вакцин на основе иммуногенных олигосахарид-белковых конъюгатов.

Одним из наиболее эффективных в настоящее время способов конъюгации олигосахаридов, содержащих свободную аминогруппу в агликоне, с белками является скваратный метод [2]. Так, в качестве прототипов данного изобретения могут выступать патенты США №7,722,890, Bundle, et al. и заявка на патент США №20090304734, Oscarson; Stefan; et al., в которых в качестве одного из наиболее эффективных способов конъюгирования углеводной цепи с белковым носителем также использовался скваратный метод.

Наше изобретение иллюстрируется примером получения конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с белком-носителем БСА.

Целью данного изобретения является разработка эффективного способа получения иммуногенных конъюгатов нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА скваратным методом, который имеет преимущество по сравнению с применяющимися в настоящее время методологиями и приводит к продукту с расчетной степенью включения олигосахарида в конъюгат.

Техническим результатом изобретения является увеличение эффективности реакции конъюгации, снижение потребления используемого в избытке лиганда с достижением того же соотношения лиганд-БСА в конечном конъюгате, как и при проведении конъюгации без добавки диметилсульфоксида, но с использованием большего количества реагента.

Указанный технический результат достигается за счет того, что способ синтеза конъюгатов олигосахаридных лигандов с белком БСА скваратным методом, отличающийся тем, что стадия конъюгации проводится в смеси боратного буфера (рН 9.0) и диметилсульфоксида. Кроме того, в качестве олигосахарида используется нона-β-(1→3)-глюкозид. Кроме того, соотношение боратного буфера (рН 9.0) и диметилсульфоксида составляет 9:1.

Способ получения иммуногенных олигосахарид-белковых конъюгатов 5 (Схема 1) включает в себя первоначальное взаимодействие 3-аминопропилгликозида олигосахарида 1 с диэтилскваратом 2 с последующей реакцией моноамида скваратовой кислоты 3 с белком БСА 4 в боратном буфере (рН 9.0).

Предлагается способ получения конъюгатов нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА, в которых углеводные и белковый компоненты соединены посредством скваратного линкера, отличающийся тем, что реакция моноамида скваратовой кислоты 3 с белком-носителем БСА 4 проводится в смеси боратного буфера (рН 9.0) и диметилсульфоксида в соотношении 9:1 (по объему), что позволяет заметно увеличить эффективность реакции конъюгации и на 20-25% снизить потребление используемого в избытке лиганда 3 с достижением то же соотношения лиганд-БСА в конечном конъюгате 5, как и при проведении конъюгации без добавки диметилсульфоксида, но с использованием большего количества реагента 3.

При проведении конъюгации скваратсвязянного нонасахарида 3 (лиганд) с БСА 4 в обычных условиях (боратный буфер, рН 9.0) при начальном мольном соотношении лиганд - БСА 20:1 происходит включение 10 лигандов в конъюгат 5 (n=10) (здесь и далее определено методом масс-спектрометрии MALDI-TOF), то есть, не менее 50% исходного лиганда не включается и теряется (Пример 3). При снижении начального соотношения лиганд 3 - БСА 4 до 10:1 происходит пропорциональное снижение степени включения лиганда в конъюгат, то есть повысить таким образом степень конверсии лиганда 3 не удается (Пример 3). При соотношении лиганд 3 - БСА 4 16:1 степень включения лиганда составляет промежуточную величину в 7 единиц (Пример 4). Проведение конъюгации в смеси боратный буфер (рН 9.0) - ДМСО (9:1) позволяет на 20-25% снизить потребление лиганда 3 при том же соотношении лиганд-БСА в конечном конъюгате 5 (Пример 5).

Пример 1. Получение скваратного производного нонасахарида 3. К раствору исходного нона-β-(1→3)-глюкозида 1 (11,6 мг, 7,56 мкмоль) в 2 мл 50%-ого водного этанола добавляли диэтилскварат 2 (1,34 мкл, 9,07 мкмоль) и триэтиламин (1,1 мкл, 8,0 мкмоль). Полученную смесь оставляли на 2,5 часа. Затем растворитель упаривали. Остаток растворяли в 2 мл воды, раствор наносили на патрон Sep-Pak C-18, который промывали 5 мл воды, затем элюировали градиентом метанола в воде (10%→20%). Элюат упаривали, остаток лиофилизовали из воды и получили 12,2 мг (7,35 мкмоль, 97%) моноамида скваратной кислоты 3.

Пример 2. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 10:1 без добавления ДМСО. Производное 3 в количестве 6,1 мг (3,67 мкмоль, 10 экв.) и БСА 4 в количестве 22,5 мг (0,34 мкмоль) растворили в 2 мл буферного раствора (350 мкМ КНСОз и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9), выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 3 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 20,2 мг (0,27 мкмоль, 80%) конъюгата 3 (n ~5), MS MALDI-TOF: m/z 74090.

Пример 3. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 20:1 без добавления ДМСО. Производное 3 в количестве 12,2 мг (7,35 мкмоль, 20 экв.) и БСА 4 в количестве 22,6 мг (0,341 мкмоль) растворили в 2 мл буферного раствора (350 мкМ KНСО3 и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9.0) и выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 5 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 24,3 мг (0,29 мкмоль, 85%) конъюгата 5 (n ~10), MS MALDI-TOF: m/z 82110.

Пример 4. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 16:1 без добавления ДМСО. Производное 3 в количестве 8,5 мг (5,09 мкмоль, 16 экв.) и БСА 4 в количестве 21 мг (0,318 мкмоль) растворили в 1.8 мл буферного раствора (350 мкМ KНСО3 и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9), выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 3 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 20,8 мг (0,21 мкмоль, 81%) конъюгата 3 (n ~7), MS MALDI-TOF: m/z 77230.

Пример 5. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 16:1 в присутствии ДМСО. Производное 3 в количестве 8,5 мг (5,09 мкмоль, 16 экв.) и БСА 4 в количестве 21 мг (0,318 мкмоль) растворили в смеси 1.8 мл буферного раствора (350 мкМ KНСО3 и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9) и 0,2 мл ДМСО, выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 3 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 22,8 мг (0,28 мкмоль, 87%) конъюгата 3 (n ~10), MS MALDI-TOF: m/z 82150.

Источники информации

1. Dick. W.E., Jr. and M.Beurret. 1989. Glycoconjugates of bacterial carbohydrate antigens, p.48-114. In: Conjugate Vaccines Contributions to Microbiology and Immunology. J.M.Cruse and R.E.Lewis, Jr., (eds) S.Karger, Basel.

2. Chernyak, A.; Karavanov, A.; Ogawa, Y.; Kováč, P.Carbohydr. Res. 2001, 330, 479-486.

Способ синтеза конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином скваратным методом, отличающийся тем, что стадию конъюгации проводят в смеси боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида, где соотношение боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида составляет 9:1.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 31-40 из 260.
27.06.2013
№216.012.51f9

Способ построения системы сообщений многоуровневой несимметричной транспортной системы

Изобретение относится к системам автоматизации, основанным на использовании вычислительных машин. Техническим результатом является территориальная независимость АРМ при неограниченном расширении системы через свои повторяющие структуры с построением иерархической транспортной системы за счет...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002486578
Дата охранного документа: 27.06.2013
10.07.2013
№216.012.5390

Способ получения композиционного катода

Изобретение относится к пайке и может быть использовано, в частности, для изготовления композиционного катода из тугоплавких материалов, используемого для вакуумного нанесения тонкопленочных покрытий различного функционального назначения в отраслях машиностроения, микроэлектроники,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002486995
Дата охранного документа: 10.07.2013
10.07.2013
№216.012.544b

Способ электрошлакового переплава

Изобретение относится к электрометаллургии и может быть использовано при выплавке слитков электрошлаковым переплавом расходуемых электродов. В способе используют по меньшей мере две затравки, которые выполняют в виде цилиндра или параллелепипеда, изолируют от корпуса кристаллизатора и размещают...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002487182
Дата охранного документа: 10.07.2013
10.07.2013
№216.012.5538

Система комплексной обработки информации радионавигационных и автономных средств навигации для определения действительных значений параметров самолетовождения

Изобретение относится к системам навигации летательных аппаратов (ЛА), а именно к обработке информации в навигационно-пилотажных комплексах. На борту ЛА расположены: инерциальная навигационная система (ИНС), радионавигационный корректор - спутниковая навигационная система (СНС) и автономный...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002487419
Дата охранного документа: 10.07.2013
20.07.2013
№216.012.574f

Двухслойный стальной прокат

Изобретение относится к области металлургии и может быть использовано при изготовлении сварных конструкций из двухслойного проката, длительно эксплуатирующихся при отрицательных температурах в условиях интенсивного механического, коррозионно-эрозионного воздействия мощных ледовых полей и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002487959
Дата охранного документа: 20.07.2013
27.07.2013
№216.012.59a0

Сырьевая смесь для изготовления огнестойкого конструкционного материала

Изобретение относится к строительным материалам и может быть использовано в строительстве, судостроении, атомной промышленности для защиты от пожара служебных и жилых помещений в составе огнестойких конструкций, а также в качестве среднего слоя панелей, облицованных декоративно-отделочными...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002488565
Дата охранного документа: 27.07.2013
10.08.2013
№216.012.5c89

Движительно-рулевая колонка

Изобретение относится к судостроению и может быть использовано при создании судовых движительно-рулевых комплексов. Движительно-рулевая колонка содержит баллер, гондолу, гребной винт и механизм поворота колонки. Баллер в верхней части соединен с корпусом через опорный шар, а в нижней части -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002489310
Дата охранного документа: 10.08.2013
20.08.2013
№216.012.5f87

Способ изготовления крепежных элементов из высокопрочных титановых сплавов

Изобретение относится к области металлургии и может быть использовано при изготовлении стержневых деталей с головками из титановых сплавов. Заготовки подвергают термообработке, после чего производят горячую высадку головок крепежных элементов. После механообработки заготовок с головками...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002490087
Дата охранного документа: 20.08.2013
20.08.2013
№216.012.60a4

Способ получения градиентного каталитического покрытия

Изобретение относится к области нанесения покрытий, в частности к каталитическим оксидным покрытиям, а также к электрохимическим производствам, и может быть использовано при изготовлении электродных материалов. Способ получения градиентного каталитического покрытия на подложке из титана или его...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002490372
Дата охранного документа: 20.08.2013
10.09.2013
№216.012.6702

Способ изготовления крепежных элементов из высокопрочных титановых сплавов

Изобретение относится к области металлургии и может быть использовано в авиационно-космической технике, в химическом машиностроении, судостроении, автомобильной промышленности при изготовлении стержневых деталей с головками из титановых сплавов. После горячей высадки на заготовке головки болта,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002492017
Дата охранного документа: 10.09.2013
Показаны записи 31-40 из 193.
20.06.2013
№216.012.4ca7

Состав расплава на основе цинка для нанесения защитных покрытий на стальную полосу горячим погружением

Изобретение относится к области нанесения защитных металлических покрытий, в частности, к нанесению покрытий из расплава на основе цинка на стальную полосу. Расплав содержит 0,7-3,4 мас.% магния, 0,01-0,1 мас.% серебра, 0,84-4,08 мас.% алюминия, цинк - остальное. При этом содержание алюминия к...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002485205
Дата охранного документа: 20.06.2013
20.06.2013
№216.012.4daa

Емкостный датчик давления

Изобретение относится к измерительной технике, в частности для измерения статического и динамического давления без нарушения целостности обтекания потока газа и изделий. Емкостный датчик давления состоит из двухсторонней фольгированной диэлектрической пленки, являющейся основанием датчика. На...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002485464
Дата охранного документа: 20.06.2013
20.06.2013
№216.012.4db8

Устройство для испытаний на контактную выносливость

Изобретение относится к технологии машиностроения, к устройствам для определения пластических деформаций и износа, испытаний на контактную выносливость плоских поверхностей деталей машин, изготовленных из металлических материалов. Устройство содержит привод, обкатник, сепаратор с деформирующими...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002485478
Дата охранного документа: 20.06.2013
20.06.2013
№216.012.4e36

Способ оценки звукоизоляции салона пассажирского самолета

Использование: в способах оценки звукоизоляции салона пассажирского самолета. Сущность: способ оценки звукоизоляции салона самолета в условиях полета заключается в одновременном измерении шума внутри салона с помощью акустических микрофонов или акустических антенн и измерении вибрации на...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002485604
Дата охранного документа: 20.06.2013
27.06.2013
№216.012.5056

Способ получения керамического изделия

Изобретение относится к способам получения керамических материалов, предназначенных для высокотемпературных изделий конструкционного назначения, таких как элементы камеры сгорания и соплового аппарата газотурбинного двигателя. Способ получения керамического изделия на основе муллита,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002486159
Дата охранного документа: 27.06.2013
27.06.2013
№216.012.50c9

Способ изготовления листов из алюминиевых сплавов

Изобретение относится к области металлургии сплавов на основе алюминия, в частности сплавов систем Al-Mg-Si и Al-Zn-Mg, используемых в качестве конструкционных и обшивочных листов в авиакосмической технике, судостроении и транспортном машиностроении, в том числе и в сварных конструкциях. Способ...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002486274
Дата охранного документа: 27.06.2013
27.06.2013
№216.012.51f9

Способ построения системы сообщений многоуровневой несимметричной транспортной системы

Изобретение относится к системам автоматизации, основанным на использовании вычислительных машин. Техническим результатом является территориальная независимость АРМ при неограниченном расширении системы через свои повторяющие структуры с построением иерархической транспортной системы за счет...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002486578
Дата охранного документа: 27.06.2013
10.07.2013
№216.012.5390

Способ получения композиционного катода

Изобретение относится к пайке и может быть использовано, в частности, для изготовления композиционного катода из тугоплавких материалов, используемого для вакуумного нанесения тонкопленочных покрытий различного функционального назначения в отраслях машиностроения, микроэлектроники,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002486995
Дата охранного документа: 10.07.2013
10.07.2013
№216.012.544b

Способ электрошлакового переплава

Изобретение относится к электрометаллургии и может быть использовано при выплавке слитков электрошлаковым переплавом расходуемых электродов. В способе используют по меньшей мере две затравки, которые выполняют в виде цилиндра или параллелепипеда, изолируют от корпуса кристаллизатора и размещают...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002487182
Дата охранного документа: 10.07.2013
10.07.2013
№216.012.5538

Система комплексной обработки информации радионавигационных и автономных средств навигации для определения действительных значений параметров самолетовождения

Изобретение относится к системам навигации летательных аппаратов (ЛА), а именно к обработке информации в навигационно-пилотажных комплексах. На борту ЛА расположены: инерциальная навигационная система (ИНС), радионавигационный корректор - спутниковая навигационная система (СНС) и автономный...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002487419
Дата охранного документа: 10.07.2013
+ добавить свой РИД