×
27.02.2013
216.012.2aa5

Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА НОНА-β-(1→3)-ГЛЮКОЗИДА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ СКВАРАТНЫМ МЕТОДОМ

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ синтеза конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином (БСА) скваратным методом. Первоначально осуществляют взаимодействие нона-β-(1→3)-глюкозида с диэтилскваратом. Затем проводят реакцию полученного лиганда - моноамида скваратовой кислоты с белком БСА в смеси боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида. При этом соотношение боратного буфера и диметилсульфоксида составляет 9:1. Способ позволяет увеличить эффективность реакции конъюгации и на 20-25% снизить потребление используемого лиганда. 5 пр.
Основные результаты: Способ синтеза конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином скваратным методом, отличающийся тем, что стадию конъюгации проводят в смеси боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида, где соотношение боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида составляет 9:1.

Изобретение относится к области синтеза гликоконъюгатов, построенных на основе углеводных лигандов и белковых носителей. Предлагаются новые условия получения таких соединений на примере конъюгатов нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином (БСА), в которых углеводные и белковый компоненты соединены посредством скваратного линкера. Соединения такого типа в настоящее время широко используются в качестве иммуногенов и для получения вакцин против инфекционных заболеваний и рака, что позволяет расширить арсенал медицинских препаратов, используемых для лечения этих заболеваний.

Конъюгаты олиго- или полисахаридов с другой иммуногенной молекулой, такой как полипептид или белок, использовались для инициирования иммунного ответа на ряд грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также других возбудителей инфекций. Конъюгирование полисахарида или олигосахарида с полипептидом превращает иммунный ответ на олиго- или полисахарид, который обычно является Т-независимым, в Т-зависимый ответ.

В предыдущем уровне техники раскрывается как прямое, так и непрямое соединение полисахаридов с белками с образованием конъюгатов (итог подведен в ссылке [1] и патенте США №5 306 492). Методы конъюгирования включают в себя диазосочетание, тиоэфирное связывание, амидирование, восстановительное аминирование и тиокарбамоилирование для присоединения к белковому носителю.

Gever et al., Med. Microbiol. Immunol., 165: 171-288 (1979) описали получение конъюгатов некоторых капсульных полисахаридных фрагментов Klebsiella pneumoniae с нитрофенилэтиламиновым линкером путем восстановительного аминирования и присоединения производного сахара с помощью азосочетания.

В патенте США №4057685, Mclntire, описан липополисахарид Escherichia coli с пониженной токсичностью, ковалентно связанный с белковым антигеном в результате взаимодействия с галогенангидридом.

В патенте США №4 356 170, Jennings et al., описывается получение полисахарид-белковых конъюгатов методом восстановительного аминирования.

В патенте США №4673574, 4761283 и 4808700, Anderson, описано получение иммуногенных конъюгатов, включающих в себя продукт восстановительного аминирования иммуногенного фрагмента капсульного полисахарида, полученного из капсульного полимера Streptococcus pneumoniae или Н.influenzae окислительным расщеплением периодатом или гидролизом гликозидной связи и содержащего свободную альдегидную группу на восстанавливающем конце, и бактериальный токсин или анатоксин в качестве белкового носителя.

В патенте США №4459286, Hillman et al., описано получение полисахарид-белкового конъюгата путем активации полисахарида Н.influenzae типа В бромцианом, получения производного активированного полисахарида со спейсерной молекулой, 6-аминокапроновой кислотой, и присоединения основного белка внешней мембраны Neisseria meningitidis с использованием водорастворимого карбодиимида с образованием связи амидного типа с белком через сложный ряд связующих звеньев от 6-аминокапроновой кислоты до полисахарида.

В патенте США №4965338, Gordon, описано получение водорастворимого ковалентного конъюгата полисахарида с дифтерийным анатоксином, где чистый полисахарид Н. influenzae типа b активируют бромцианом и сразу смешивают с дифтерийным анатоксином, модифицированным ADH-спейсером.

В патенте США №4663160, Tsay et al., описан детоксифицированный полисахарид грамотрицательных бактерий, ковалентно связанный с детоксифицированным белком, полученным из тех же видов грамотрицательных бактерий, посредством фрагмента, имеющего 4-12 атомов углерода.

В патенте США №4619828, Gordon et al., описаны конъюгаты молекул полисахаридов патогенных бактерий, таких как Haemophilus influenzae типа b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis и Escherichia coli, с Т-зависимыми антигенами, такими как дифтерийный и столбнячный анатоксины.

В патенте США №4711779, Porro et al., описаны вакцины на основе конъюгатов гликопротеинов, обладающие трехвалентной иммуногенной активностью, содержащие антигенные детерминанты капсульных полисахаридов грамположительных бактерий, а также либо CRM197, столбнячный анатоксин, либо коклюшный токсин.

В патенте США №5306492, Porro, описан конъюгат олигосахарида с белком-носителем, полученный путем взаимодействия по реакции восстановительного аминирования олигосахарида, имеющего концевую альдегидную группу, с диаминометаном в присутствии пиридинборана, дальнейшей реакции аминированного олигосахаридного продукта с молекулой, имеющей две функциональные группы, и затем взаимодействия активированного олигосахаридного продукта с белком-носителем.

В патенте США №5192540, Kuo et al., описан конъюгат олигосахарида с белком, включающий в себя продукт восстановительного аминирования окисленного полирибозил-рибитолфосфатного фрагмента, полученного из капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, и белка внешней мембраны Haemophilus influenzae типа b.

В публикации заявки на европейский патент №ЕР 0747063 А2 описан модифицированный капсульный полисахарид, содержащий различные производные сиаловой кислоты, и гетеробифункциональную линкерную молекулу, связанную с молекулой носителя. Линкеры используются для N-алкилирования приблизительно до 5 остатков сиаловой кислоты на полисахарид. Затем оставшиеся аминогруппы ацилируют пропионовым или уксусным ангидридом.

Существует потребность в более эффективных очищенных иммуногенных олигосахарид-белковых конъюгатах, которые могут быть получены более простым способом и с более высоким выходом, для широкомасштабного получения вакцин на основе иммуногенных олигосахарид-белковых конъюгатов.

Одним из наиболее эффективных в настоящее время способов конъюгации олигосахаридов, содержащих свободную аминогруппу в агликоне, с белками является скваратный метод [2]. Так, в качестве прототипов данного изобретения могут выступать патенты США №7,722,890, Bundle, et al. и заявка на патент США №20090304734, Oscarson; Stefan; et al., в которых в качестве одного из наиболее эффективных способов конъюгирования углеводной цепи с белковым носителем также использовался скваратный метод.

Наше изобретение иллюстрируется примером получения конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с белком-носителем БСА.

Целью данного изобретения является разработка эффективного способа получения иммуногенных конъюгатов нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА скваратным методом, который имеет преимущество по сравнению с применяющимися в настоящее время методологиями и приводит к продукту с расчетной степенью включения олигосахарида в конъюгат.

Техническим результатом изобретения является увеличение эффективности реакции конъюгации, снижение потребления используемого в избытке лиганда с достижением того же соотношения лиганд-БСА в конечном конъюгате, как и при проведении конъюгации без добавки диметилсульфоксида, но с использованием большего количества реагента.

Указанный технический результат достигается за счет того, что способ синтеза конъюгатов олигосахаридных лигандов с белком БСА скваратным методом, отличающийся тем, что стадия конъюгации проводится в смеси боратного буфера (рН 9.0) и диметилсульфоксида. Кроме того, в качестве олигосахарида используется нона-β-(1→3)-глюкозид. Кроме того, соотношение боратного буфера (рН 9.0) и диметилсульфоксида составляет 9:1.

Способ получения иммуногенных олигосахарид-белковых конъюгатов 5 (Схема 1) включает в себя первоначальное взаимодействие 3-аминопропилгликозида олигосахарида 1 с диэтилскваратом 2 с последующей реакцией моноамида скваратовой кислоты 3 с белком БСА 4 в боратном буфере (рН 9.0).

Предлагается способ получения конъюгатов нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА, в которых углеводные и белковый компоненты соединены посредством скваратного линкера, отличающийся тем, что реакция моноамида скваратовой кислоты 3 с белком-носителем БСА 4 проводится в смеси боратного буфера (рН 9.0) и диметилсульфоксида в соотношении 9:1 (по объему), что позволяет заметно увеличить эффективность реакции конъюгации и на 20-25% снизить потребление используемого в избытке лиганда 3 с достижением то же соотношения лиганд-БСА в конечном конъюгате 5, как и при проведении конъюгации без добавки диметилсульфоксида, но с использованием большего количества реагента 3.

При проведении конъюгации скваратсвязянного нонасахарида 3 (лиганд) с БСА 4 в обычных условиях (боратный буфер, рН 9.0) при начальном мольном соотношении лиганд - БСА 20:1 происходит включение 10 лигандов в конъюгат 5 (n=10) (здесь и далее определено методом масс-спектрометрии MALDI-TOF), то есть, не менее 50% исходного лиганда не включается и теряется (Пример 3). При снижении начального соотношения лиганд 3 - БСА 4 до 10:1 происходит пропорциональное снижение степени включения лиганда в конъюгат, то есть повысить таким образом степень конверсии лиганда 3 не удается (Пример 3). При соотношении лиганд 3 - БСА 4 16:1 степень включения лиганда составляет промежуточную величину в 7 единиц (Пример 4). Проведение конъюгации в смеси боратный буфер (рН 9.0) - ДМСО (9:1) позволяет на 20-25% снизить потребление лиганда 3 при том же соотношении лиганд-БСА в конечном конъюгате 5 (Пример 5).

Пример 1. Получение скваратного производного нонасахарида 3. К раствору исходного нона-β-(1→3)-глюкозида 1 (11,6 мг, 7,56 мкмоль) в 2 мл 50%-ого водного этанола добавляли диэтилскварат 2 (1,34 мкл, 9,07 мкмоль) и триэтиламин (1,1 мкл, 8,0 мкмоль). Полученную смесь оставляли на 2,5 часа. Затем растворитель упаривали. Остаток растворяли в 2 мл воды, раствор наносили на патрон Sep-Pak C-18, который промывали 5 мл воды, затем элюировали градиентом метанола в воде (10%→20%). Элюат упаривали, остаток лиофилизовали из воды и получили 12,2 мг (7,35 мкмоль, 97%) моноамида скваратной кислоты 3.

Пример 2. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 10:1 без добавления ДМСО. Производное 3 в количестве 6,1 мг (3,67 мкмоль, 10 экв.) и БСА 4 в количестве 22,5 мг (0,34 мкмоль) растворили в 2 мл буферного раствора (350 мкМ КНСОз и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9), выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 3 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 20,2 мг (0,27 мкмоль, 80%) конъюгата 3 (n ~5), MS MALDI-TOF: m/z 74090.

Пример 3. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 20:1 без добавления ДМСО. Производное 3 в количестве 12,2 мг (7,35 мкмоль, 20 экв.) и БСА 4 в количестве 22,6 мг (0,341 мкмоль) растворили в 2 мл буферного раствора (350 мкМ KНСО3 и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9.0) и выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 5 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 24,3 мг (0,29 мкмоль, 85%) конъюгата 5 (n ~10), MS MALDI-TOF: m/z 82110.

Пример 4. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 16:1 без добавления ДМСО. Производное 3 в количестве 8,5 мг (5,09 мкмоль, 16 экв.) и БСА 4 в количестве 21 мг (0,318 мкмоль) растворили в 1.8 мл буферного раствора (350 мкМ KНСО3 и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9), выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 3 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 20,8 мг (0,21 мкмоль, 81%) конъюгата 3 (n ~7), MS MALDI-TOF: m/z 77230.

Пример 5. Получение конъюгата 5 нона-β-(1→3)-глюкозида с белком БСА при мольном соотношении углеводного лиганда и белка 16:1 в присутствии ДМСО. Производное 3 в количестве 8,5 мг (5,09 мкмоль, 16 экв.) и БСА 4 в количестве 21 мг (0,318 мкмоль) растворили в смеси 1.8 мл буферного раствора (350 мкМ KНСО3 и 70 мкМ Na2B4O7·10H2O, pH=9) и 0,2 мл ДМСО, выдерживали 6 суток при комнатной температуре. Конъюгат 3 выделяли колоночной гель-хроматографией на сефадексе G-15 в воде и лиофилизовали. Получили 22,8 мг (0,28 мкмоль, 87%) конъюгата 3 (n ~10), MS MALDI-TOF: m/z 82150.

Источники информации

1. Dick. W.E., Jr. and M.Beurret. 1989. Glycoconjugates of bacterial carbohydrate antigens, p.48-114. In: Conjugate Vaccines Contributions to Microbiology and Immunology. J.M.Cruse and R.E.Lewis, Jr., (eds) S.Karger, Basel.

2. Chernyak, A.; Karavanov, A.; Ogawa, Y.; Kováč, P.Carbohydr. Res. 2001, 330, 479-486.

Способ синтеза конъюгата нона-β-(1→3)-глюкозида с бычьим сывороточным альбумином скваратным методом, отличающийся тем, что стадию конъюгации проводят в смеси боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида, где соотношение боратного буфера рН 9.0 и диметилсульфоксида составляет 9:1.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-10 из 260.
10.01.2013
№216.012.17dc

Способ газолазерной резки крупногабаритных деталей из композиционных материалов и устройство для его осуществления

Изобретение относится к способу и устройству газолазерной резки композиционных материалов. Способ включает подачу лазерного луча на обрабатываемую поверхность и соосно с лучом - технологического газа, коллимирование лазерного луча, заглубление его в обрабатываемое изделие и перемещение по...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002471600
Дата охранного документа: 10.01.2013
10.01.2013
№216.012.18c2

Полимерная композиция

Изобретение относится к негорючим полимерным композициям холодного отверждения и может применяться для местного упрочнения конструкций в зонах установки крепежа, заполнения пустот в деталях из полимерных композиционных материалов, заделки торцов и упрочнения участков сотовых конструкций,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002471830
Дата охранного документа: 10.01.2013
10.01.2013
№216.012.18cd

Грунтовочная композиция

Изобретение относится к лакокрасочным покрытиям, в частности к грунтовочным композициям с пониженным содержанием летучих веществ холодного отверждения, предназначенным для окраски металлических и неметаллических поверхностей, и может быть использовано в авиационной технике, в строительстве и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002471841
Дата охранного документа: 10.01.2013
10.02.2013
№216.012.2454

Способ адаптации рабочей части аэродинамической трубы для получения безындукционного обтекания моделей летательных аппаратов и устройство для его осуществления

Заявленная группа изобретений относится к области экспериментальной аэродинамики и может быть использована при проведении испытаний в трансзвуковых аэродинамических трубах. Предложен новый способ адаптации рабочей части аэродинамической трубы, содержащий новую технологию получения на границах...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002474802
Дата охранного документа: 10.02.2013
27.02.2013
№216.012.2b51

Износостойкий сплав на основе никеля для нанесения износо- и коррозионно-стойких покрытий на конструкционные элементы микроплазменным или сверхзвуковым газодинамическим напылением

Изобретение относится к области металлургии, в частности к сплавам на основе никеля, используемым в качестве материала для получения износо- и коррозионно-стойких покрытий на функционально- конструкционных элементах методом микроплазменного или сверхзвукового холодного газодинамического...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476616
Дата охранного документа: 27.02.2013
27.02.2013
№216.012.2c2c

Способ измерения температуры поверхности конструкции резистивным чувствительным элементом, устройство для его осуществления и способ изготовления устройства

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано в тепло-прочностных испытаниях авиационно-космических конструкций при определении их поверхностных температурных полей. Согласно заявленному способу для измерения температуры поверхности конструкции чувствительный элемент...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476835
Дата охранного документа: 27.02.2013
27.02.2013
№216.012.2c2d

Способ определения температурной характеристики резисторного чувствительного элемента, устройство для его осуществления и способ изготовления устройства

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано при испытании и калибровке термометров сопротивления и тензорезисторов. Согласно заявленному способу определения температурной характеристики резисторного чувствительного элемента регистрируют температуру воздействия и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476836
Дата охранного документа: 27.02.2013
27.02.2013
№216.012.2c32

Устройство для измерения звукового давления

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано для измерения звукового давления. Устройство содержит датчик с емкостным чувствительным элементом с обкладками конденсатора и экранами, усилитель заряда, состоящий из операционного усилителя, резистора и конденсатора...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476841
Дата охранного документа: 27.02.2013
27.02.2013
№216.012.2c33

Устройство для измерения давления, температуры и теплового потока

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано для одновременного измерения в заданном участке температуры, теплового потока и давления. Техническим результатом изобретения является расширение области применения, повышение информативности и точности измерения давления,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476842
Дата охранного документа: 27.02.2013
27.02.2013
№216.012.2c3d

Способ оценки чистоты воздуха гермокабин летательных аппаратов, поступающего от компрессоров газотурбинных двигателей, на содержание продуктов разложения смазочных масел

Изобретение относится к способу оценки чистоты воздуха гермокабин летательных аппаратов, поступающего от компрессоров газотурбинных двигателей, на содержание продуктов разложения смазочных масел, включающий проведение параллельных отборов проб воздуха гермокабины путем его прокачки через...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476852
Дата охранного документа: 27.02.2013
Показаны записи 1-10 из 193.
10.01.2013
№216.012.17dc

Способ газолазерной резки крупногабаритных деталей из композиционных материалов и устройство для его осуществления

Изобретение относится к способу и устройству газолазерной резки композиционных материалов. Способ включает подачу лазерного луча на обрабатываемую поверхность и соосно с лучом - технологического газа, коллимирование лазерного луча, заглубление его в обрабатываемое изделие и перемещение по...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002471600
Дата охранного документа: 10.01.2013
10.01.2013
№216.012.18c2

Полимерная композиция

Изобретение относится к негорючим полимерным композициям холодного отверждения и может применяться для местного упрочнения конструкций в зонах установки крепежа, заполнения пустот в деталях из полимерных композиционных материалов, заделки торцов и упрочнения участков сотовых конструкций,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002471830
Дата охранного документа: 10.01.2013
10.01.2013
№216.012.18cd

Грунтовочная композиция

Изобретение относится к лакокрасочным покрытиям, в частности к грунтовочным композициям с пониженным содержанием летучих веществ холодного отверждения, предназначенным для окраски металлических и неметаллических поверхностей, и может быть использовано в авиационной технике, в строительстве и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002471841
Дата охранного документа: 10.01.2013
10.02.2013
№216.012.2454

Способ адаптации рабочей части аэродинамической трубы для получения безындукционного обтекания моделей летательных аппаратов и устройство для его осуществления

Заявленная группа изобретений относится к области экспериментальной аэродинамики и может быть использована при проведении испытаний в трансзвуковых аэродинамических трубах. Предложен новый способ адаптации рабочей части аэродинамической трубы, содержащий новую технологию получения на границах...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002474802
Дата охранного документа: 10.02.2013
10.02.2013
№216.012.246f

Способ определения запасов устойчивости рулевого привода и устройство для его осуществления

Изобретение относится к экспериментальным исследованиям приводов систем автоматического управления и предназначено для определения запасов устойчивости рулевого привода. Предлагается способ, в котором вначале снимают логарифмическую частотную характеристику участка контура электромеханической и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002474829
Дата охранного документа: 10.02.2013
20.02.2013
№216.012.27d0

Способ измерения температуры термопарами, измерительная информационная система для его осуществления и температурный переходник

Изобретение относится к области термометрии и может быть использовано при тепловых испытаниях конструкций для определения их поверхностных температурных полей. Заявлен способ измерения температуры термопарами, в котором располагают в районе свободных концов термопар терморезистор. Измеряют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002475712
Дата охранного документа: 20.02.2013
27.02.2013
№216.012.2b51

Износостойкий сплав на основе никеля для нанесения износо- и коррозионно-стойких покрытий на конструкционные элементы микроплазменным или сверхзвуковым газодинамическим напылением

Изобретение относится к области металлургии, в частности к сплавам на основе никеля, используемым в качестве материала для получения износо- и коррозионно-стойких покрытий на функционально- конструкционных элементах методом микроплазменного или сверхзвукового холодного газодинамического...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476616
Дата охранного документа: 27.02.2013
27.02.2013
№216.012.2c2c

Способ измерения температуры поверхности конструкции резистивным чувствительным элементом, устройство для его осуществления и способ изготовления устройства

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано в тепло-прочностных испытаниях авиационно-космических конструкций при определении их поверхностных температурных полей. Согласно заявленному способу для измерения температуры поверхности конструкции чувствительный элемент...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476835
Дата охранного документа: 27.02.2013
27.02.2013
№216.012.2c2d

Способ определения температурной характеристики резисторного чувствительного элемента, устройство для его осуществления и способ изготовления устройства

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано при испытании и калибровке термометров сопротивления и тензорезисторов. Согласно заявленному способу определения температурной характеристики резисторного чувствительного элемента регистрируют температуру воздействия и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476836
Дата охранного документа: 27.02.2013
27.02.2013
№216.012.2c32

Устройство для измерения звукового давления

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано для измерения звукового давления. Устройство содержит датчик с емкостным чувствительным элементом с обкладками конденсатора и экранами, усилитель заряда, состоящий из операционного усилителя, резистора и конденсатора...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002476841
Дата охранного документа: 27.02.2013
+ добавить свой РИД