СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ ПРЕЭКЛАМПСИИ

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения преэклампсии.

Актуальность разработки способа определяется высоким риском материнской и перинатальной заболеваемости и смертности при данном осложнении беременности.

Для прогнозирования эффективности терапии преэклампсии в настоящее время проводится определение целого ряда клинико-лабораторных показателей: оценка состояния глазного дна, биохимических показателей крови (печеночные трансаминазы, билирубин и его фракции, общий белок, мочевина, креатинии и т.д.), параметров гемостаза (тромбоэластография, АЧТВ, число и агрегация тромбоцитов, фибриноген, продукты его деградации, концентрация эндогенного гепарина, антитромбина III), концентрационных показателей крови (гематокрит, гемоглобин, число эритроцитов), центрального венозного давления, ультразвуковое исследование жизненно важных органов матери и плода [Современные подходы к диагностике, профилактике и лечению гестоза. Методические указания №99/80 Министерства здравоохранения РФ, 1999].

Недостатком этих методов прогнозирования эффективности терапии преэклампсии является их низкая информативность и специфичность, необходимость определения чрезвычайно большого количества параметров, изменения которых могут иметь место и при экстрагенитальных заболеваниях, и других осложнениях беременности.

Известен способ прогнозирования эффективности терапии преэклампсии с использованием допплерометрии материнской и плодовой гемодинамики [Стрижаков А.Н. с соавт. Значение допплерометрии маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока в выборе тактики ведения беременности и метода родоразрешения // Акушерство и гинекология. - 1989. - №3. - с.24-27], при этом были выделены четыре основных патогенетических варианта нарушений материнской гемодинамики:

1) гиперкинетический тип центральной маточной гемодинамики независимо от значений общего периферического сопротивления сосудов (ОПСС) и эукинетический тип с нормальными значениями ОПСС. При данном варианте проводимая терапия преэклампсии с точки зрения авторов эффективна в большинстве наблюдений;

2) эукинетический тип центральной маточной гемодинамики с повышенными значениями ОПСС и гипокинетический тип центральной маточной гемодинамики с нормальными значениями ОПСС. При данном типе. Проводимая терапия преэклампсии оказывает эффект в 36%;

3) гипокинетический тип центральной маточной гемодинамики с повышением ОПСС. Улучшение гемодинамических и клинических показателей на фоне проводимой терапии не отмечается, а в 50% наблюдается ухудшение;

4) выраженные нарушения мозговой гемодинамики (повышение пульсационного индекса во внутренней сонной артерии более 2,0 и/или ретроградный кроваток в надблоковых артериях). При данном типе выявляется преэклампсия с быстрым прогрессированием клинической картины (в течение 2-3 суток) независимо от терапии.

Недостатком данного способа является низкая специфичность оценки изменения материнской гемодинамики, сложность применения в практическом здравоохранении, необходимость проведения исследования специально обученными специалистами.

Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования эффективности терапии преэклампсии в третьем триместре беременности, который заключается в том, что с 28 недель беременности в периферической венозной крови беременных с тяжелой преэклампсией определяют содержание CD16+CD3-клеток и при его значениях менее 9% прогнозируют эффективность стандартной терапии тяжелой преэклампсии, а при значении 9% и менее - отсутствие эффективности лечения преэклампсии [патент RU 2377569 C1, G01N 33/577, 2009]. Точность указанного способа 90,6%. Недостатки данного способа:

- способ малоспецифичен и в силу этого недостаточно точен, так как повышение уровня CD16+CD3-популяции естественных киллеров, свидетельствующее о глубоком поражении эндотелия сосудов, тканей различных органов и нарушении функционирования ренин-ангиотензиновой системы, может иметь место не только при преэклампсии, но и при других соматических заболеваниях и осложнениях беременности;

- прогрессирование и нарастание тяжести преэклампсии может наблюдаться в течение нескольких суток или даже часов, а изменение уровня CD16+CD3-клеток не является достаточно быстрым, динамически подвижным показателем.

Задачей изобретения является повышение точности прогнозирования эффективности терапии преэклампсии у беременных, так как клиническая симптоматика зачастую не соответствует истинной степени тяжести состояния пациенток.

Поставленная задача достигается путем определения концентраций нейроспецифической енолазы (NSE) и молекул межклеточной адгезии сосудов (ICAM) и сосудисто-эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF) в сыворотке крови беременных женщин, вычисления значений классификационной функции G по формуле G=0.019*VEGF+0.019*ICAM+0.113*NSE-18.46, где VEGF, ICAM и NSE концентрации маркеров, при ее величине <-1,111 делают вывод о наличии легкой ПЭ, при величине >0,636 - тяжелой ПЭ, при значениях от -1,111 до 0,636 - о ПЭ средней степени тяжести.

Чувствительность предложенного теста составила 77,27% для легкой ПЭ и 83,33% для ПЭ тяжелой степени. Специфичность составила 97,87% и 98,04% соответственно, что превышает соответствующий показатель способа-прототипа.

Таким образом, предлагаемый способ высоко информативен и точен, позволяет четко прогнозировать эффективность проводимой терапии преэклампсии, своевременно решить вопрос о длительности лечения, определить тактику ведения и родоразрешения.

Положительная динамика маркеров свидетельствует о возможности пролонгирования беременности (при легкой и среднетяжелой ПЭ).

Отрицательная динамика, или значения классификационной функции, соответствующие тяжелой ПЭ, диктуют необходимость досрочного родоразрешения. Исследование динамики маркеров эндотелиальной дисфункции при лечении ПЭ позволяет оценить эффективность лечения, избежать запоздалого родоразрешения и предупредить развитие тяжелых осложнений ПЭ (эклампсии, HELLP синдрома, антенатальной смерти плода).

Способ основан на патогенетическом факторе развития преэклампсии, который обусловлен развитием системного повреждения эндотелия сосудов микроциркуляции. Полагают, что этот процесс носит иммунный характер и связан с попаданием в кровоток матери нейроспецифических белков мозга матери и/или плода. Эти белки определяются в повышенных концентрациях соответственно тяжести преэклампсии.

Генерализованное повреждение эндотелия сосудов, как известно, является частью системной воспалительной реакции, при которой происходит активация моноцитов, гранулоцитов и лейкоцитов, компонентов комплемента, системы свертывания крови, избыточная экспрессия молекул адгезии, повышенный выброс в кровоток провоспалительных цитокинов и других биологически активных веществ. «Активированные» эндотелиальные клетки индуцируют экспресию адгезивных молекул ICAM, повышенные концентрации которого являются маркером повреждения эндотелия сосудов и эндотелиальной дисфункции.

Поскольку в основе преэклампсии лежит плацентарная недостаточность вследствие нарушения второй волны инвазии цитотрофобласта и генерализованная эндотелиальная дисфункция, представляет огромный научный интерес определение роли факторов ангиогенеза (VEGF) в формировании и обеспечении компенсаторно-приспособительных реакций сосудов фетоплацентарного комплекса.

Комплексная оценка концентрации NSE, ICAM и VEGF позволяет более точно оценить патофизиологические процессы при преэклампсии и определить тактику ведения пациенток с этим осложнением беременности.

Способ практически осуществляют следующим образом.

В качестве исследуемого материала использовали сыворотку крови беременных женщин с ПЭ различной степени тяжести, также здоровых беременных женщин.

Забор периферической венозной крови осуществляли натощак (при критических состояниях - в любое время суток) сразу при поступлении в родильный дом, а также после 7-10 дневного курса стационарного лечения при легкой и среднетяжелой ПЭ. При тяжелой ПЭ образцы крови брали сразу после поступления в стационар и после родоразрешения, так как тяжесть состояния пациенток и/или плода не позволяли пролонгировать беременность.

Кровь собирали в сухую пробирку без активатора и стабилизаторов. Образцы крови отстаивали до образования плотного сгустка и центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут.

Полученную сыворотку собирали в пробирки типа «Appendorf», затем подвергали поэтапной заморозке и хранили при -80°C не более 3 месяцев до проведения анализа. Повторно замораживание образцов сыворотки крови не проводили.

Процедура постановки твердофазного иммуноферментного анализа NSE.

Для количественного определения NSE в сыворотке крови, содержащей эти антигены лишь в очень низких концентрациях, был применен метод иммуноферментного анализа - твердофазный (гетерогенный) вариант иммуноферментного анализа с пределом чувствительности 128 нг/мл. Принцип метода состоит в одновременном взаимодействии антигена изучаемого образца со специфическими антителами, иммобилизованными на твердой матрице (первичные антитела) и конъюгатом таких специфических антител с ферментом (вторичные антитела). Количество связанного конъюгата выявляется с помощью хромогенного субстрата, вступающего в реакцию с ферментом. При этом интенсивность приобретенного окрашивания пропорциональна количеству антигена в образце.

В качестве твердой матрицы применялись 96-луночные полистирольные планшеты фирмы «Costar» (USA).

Порядок постановки иммуноферментного анализа NSE:

1. Адсорбция антител на твердой фазе в покрывающем буфере.

2. Внесение образцов биологических жидкостей; комплементарное связывание соответствующих NSE с антителами.

3. Внесение конъюгата антител с ферментом; комплементарное связывание соответствующих идиотипов антител конъюгата с эпитопами NSE.

4. Внесение субстратной смеси для энзима конъюгата, изменение цвета субстратной смеси, регистрируемое фотометром.

Покрывающий буфер рН 9,6

Na₂CO - 1,59 г

NaHCO₃ - 2,93 г

H₂O - до 1000 мл

Отмывающий буфер рН 7,0

Трис - 6,05 г

CaCl₂ - 1,11 г

NaCl - 0,2 г

Тритон Х-100 - 1,0 мл

H₂O - до 1000 мл

Проявление ферментативной активности пероксидазы в связанном конъюгате проводится с использованием субстратного буфера. В качестве хромогенного субстрата применяли ортофенилендиамин в концентрации 0,4 мг/мл в цитрат-фосфатном буфере рН 4,5 (7,3 г лимонной кислоты, 11,86 г NaH₂PO₄×2H₂O, вода до 1000 мл). В субстратную смесь непосредственно перед внесением в ячейки добавляли 10 мкл 30% перекиси водорода. Полную субстратную смесь разливали по лункам (по 100 мкл) и инкубировали 10-20 минут при комнатной температуре. Затем ферментативную реакцию останавливали внесением 100 мкл 4 М H₂SO₄. Считывание результатов проводили с помощью многоканального спектрофотометра Е1х 800 (Bio-Tek Instruments) при длине волны 490 нм.

По результатам определения оптической плотности и известным концентрациям антигенов в стандартных пробах строили калибровочные кривые, которые использовали в дальнейшей работе для определения концентраций NSE в исследуемых образцах биологических жидкостей.

Калибровочная кривая строилась путем графического отображения зависимости оптической плотности раствора от концентрации антигена в стандартном образце. При этом учитывали наличие фонового уровня оптической плотности, представленного соответствующими значениями отрицательных контрольных образцов, не содержащих NSE. Таким образом, по оси ординат откладывали не абсолютные показатели оптической плотности, а разницу между исследуемыми и отрицательными контрольными пробами. Рабочим промежутком считали наиболее близкий к линейному участок кривой. В случае тест-системы определения NSE, этот участок был определен в диапазоне концентраций от 1,0 до 128 нг/мл. Чувствительность тест-системы (минимальное количество АГ, которое возможно определить с ее помощью) определялась путем экстраполяции на ось абсцисс начальной точки линейной зависимости и составила, соответственно 1,0 нг/мл.

На рисунке 1 приведена калибровочная кривая иммуноферментного анализа NSE.

Процедура постановки твердофазного иммуноферментного анализа ICAM, VEGF.

Для количественного определения ICAM, VEGF мы применяли коммерческие иммуноферментные тест-системы фирмы «Bender MedSystems», Австрия с пределами чувствительности 30,0 нг/мл, 17,9 пг/мл соответственно. Принцип метода аналогичен таковому при определении NSE. В качестве твердой матрицы использовались 96-луночные полистирольные планшеты фирмы Bender MedSystems, активированные соответствующими антителами.

Постановка иммуноферментного анализа:

1. Внесение образцов биологических жидкостей (стандартные образцы, стандарты и контрольные образцы) в ячейки планшета; проведение инкубации.

2. Добавление смеси коньюгата Биотин - моноклональные антититела с конюгатом стрептавидин - пероксидаза. Биотиновый конъюгат связывает антигены, захваченные первыми антителами.

3. Стрептавидиновый конъюгат связывает биотинилированный конъюгат. После инкубации и промывки из ячеек удаляются несвязавшиеся конъюгаты, и в ячейки добавляется субстратный раствор, который взаимодействует с ферментным комплексом с образованием окрашенного раствора.

4. Интенсивность окраски, измеренная на длине волны 450 нм, прямо пропорциональна концентрации антигенов, присутствующих в образцах.

5. Для определения концентрации антигенов в опытных образцах строят калибровочные кривые по пяти разведениям стандарта. Сыворотка разбавляется 1:50 Рабочим буфером.

Требуемое количество стрипов помещают в держатель. Все Стандарты, Бланки, Образцы анализируются в дублях. Ячейки промываются два раза 300 мкл Промывочного Буфера; полностью удаляется жидкость между промывками. Готовится смесь конъюгатов (разбавляется 1:100 концентрат Смеси конъюгатов в чистой пластиковой посуде, который используется не позднее 30 минут после разбавления). Добавляется по 50 мкл разбавленной Смеси конъюгатов во все ячейки, в том числе «Бланк». По схеме добавляется по 100 мкл предварительно подготовленных Стандартов в ячейки. Добавляется 100 мкл Рабочего буфера в ячейки, предназначенные для Бланка. Вносится по 100 мкл разбавленного 1:50 каждого образца в дублях в соответствующие ячейки. Закрытый пленкой планшет инкубируется 2 часа при комнатной температуре (18-25°C). Готовится Субстратный раствор. Полностью удаляется содержимое ячеек аспирацией или сливом, затем вносится по 100 мкл Субстратного раствора ТМБ во все ячейки, включая «Бланк». Инкубирование при комнатной температуре в темноте 10-20 минут, с использованием орбитального встряхивателя, установленного на 100 об/мин. Время инкубации с субстратным раствором определяется типом используемого микропланшетного ридера. Многие ридеры способны считать только до 2,0 Ед оптической плотности, при этом реакция должна быть остановлена до достижения наиболее ярко окрашенными ячейками предела измерения инструмента. Добавляется по 100 мкл стоп-раствора во все ячейки, включая «Бланк», чтобы полностью инактивировать фермент в ячейках. Оптическая плотность считается немедленно, после внесения стоп-реагента. Определение оптической плотности ячеек проводили при 450 нм, против «Бланка», с использованием длины волны сравнения 610-650 нм.

Примеры практического применения.

Пример 1. Беременная Г., 35 лет. Настоящая беременность 2-я. Первая беременность закончилась своевременными родами в сроке 39 недель и рождением доношенного ребенка с массой тела 3600 г, ростом 52 см. Третий триместр осложнился преэклампсией легкой степени. Настоящая беременность до 35 недель протекала без осложнений.

При обследовании в сроке 35 недель у беременной Г. отмечено повышение АД до 130/90-140/90 мм рт.ст., появление белка в моче 0,66 г/л, отеки голеней. Результаты УЗИ и допплерометрии - без патологии. Диагноз: Беременность 29-30 недель. Преэклампсия легкой степени.

Проведено исследование периферической крови на наличие NSE и IСAM и VEGF. Концентрация NSE составила 12,4 нг/мл, ICAM - 615,4 нг/мл, VEGF 190,3 пг/мл. Значение классификационной функции составило: 0.019*190,3+0.019*615,4+0.113*12,4-18.46=-1,751, что соответствует преэклампсии легкой степени (<-1,111) и позволяет прогнозировать эффективность общепринятой комплексной терапии.

Через 7 дней терапии вновь определены концентрации NSE, ICAM и VEGF, которые составили 10,7 нг/мл, 583,2 нг/мл и 215,3 пг/мл соответственно. Значение классификационной функции составило: 0.019*215,3+0.019*583,2+0.113*10,7-18.46=-2,079. Снижение уровней NSE, ICAM и увеличение концентраций VEGF позволило пролонгировать беременность. Беременность закончилась самопроизвольными родами в сроке 38 недель и рождением живой доношенной девочки массой 2900 г, ростом 50 см, оценкой по шкале Апгар 8/9 баллов.

Пример 2. Беременная Л., 31 год. Соматический анамнез отягощен нарушением жирового обмена II степени, вегетососудистой дистонией по гипертоническому типу. Настоящая беременность первая, в первом триместре протекала с тошнотой, рвотой. С 30 недель - отмечено появление отеков голеней и стоп, периодические подъемы АД до 140/90 мм рт.ст.

При обследовании в сроке 35 недель объективно: АД 150/90, отеки голеней, кистей рук, белок в моче - 1,4 г/л, гипопротеинемия 55 г/л. При УЗИ, допплерометрии, КТГ патологии не выявлено.

Диагноз: Беременность 35 недель. Преэклампсия средней степени. Нарушение жирового обмена II степени. Вегетососудистая дистония по гипертоническому типу.

При исследовании периферической крови концентрация NSE составила 15,6 нг/мл, ICAM - 725,3 нг/мл, VEGF 142,9 пг/мл. Значение классификационной функции 0.019*142,9+0.019*725,3+0.113*15,6-18.46=-0,201, что соответствует преэклампсии средней степени тяжести (от -1,111 до 0,636) и позволяет прогнозировать малую эффективность общепринятой комплексной терапии преэклампсии.

На фоне 7-дневной терапии преэклампсии концентрация NSE, ICAM и VEGF составили 15,2 нг/мл, 698,2 нг/мл и 169,5 пг/мл соответственно. Значение классификационной функции 0.019*169,5+0.019*698,2+0.113*15,2-18.46=-0,256, что свидетельствует о малой эффективности проводимой терапии. Пациентка родоразрешена путем операции кесарева сечения в 36 недель беременности в связи с прогрессированием преэклампсии. Родилась живая недоношенная девочка массой 2400 г, ростом 46 см, оценкой по Апгар 7/8 баллов.

Пример 3. Беременная У., 35 лет. Из соматического анамнеза - хронический пиелонефрит, гипертоническая болезнь II ст., гепатит A в детстве. Настоящая беременность 1-я. В сроке 32 недели доставлена машиной «скорой помощи» с жалобами на головную боль, тошноту, слабость. Объективно: АД 165-170/100 мм рт.ст., отеки нижних конечностей, передней брюшной стенки, кистей рук, лица, протеинурия 3,1 г/л, гипопротеинемия 59 г/л, повышение печеночных ферментов ACT и АЛТ, в коагулограмме - признаки активации внутрисосудистого свертывания крови. При УЗИ - задержка роста плода на 2 недели от должного гестационного срока. По результатам допплерометрии - нарушение маточно-плацентарного кровотока.

Диагноз: Беременность 32 недели. Тяжелая преэклампсия. Хронический пиелонефрит, ремиссия. Гипертоническая болезнь II ст. Хроническая плацентарная недостаточность. Задержка роста плода. Нарушение маточно-плацентарного кровотока.

Концентрация NSE, ICAM и VEGF составили 19,2 нг/мл, 918,4 нг/мл и 117,2 пг/мл соответственно. Значение классификационной функции 0.019*117,2+0.019*918,4+0.113*19,2-18.46=3,386, что свидетельствует о тяжелой степени преэклампсии (>0,636) и высоком риске развития эклампсии. Беременная родоразрешена в экстренном порядке путем операции кесарева сечения. Родилась живая недоношенная гипотрофичная девочка массой 1900 г, ростом 41 см, оценкой по Апгар 5/6 баллов.

Пример 4. Беременная П., 28 лет. Соматический анамнез отягощен сахарным диабетом 1 типа и диабетической нефропатией. Данная беременность 2-я. Поступила в стационар в срок 32-33 недели в ОПБ в удовлетворительном состоянии (АД 120/80, белок в моче 1,37 г/л, незначительные отеки, по УЗИ нарушение маточно-плацентарного кровотока 1А). В стационаре проводилась комплексная терапия диабетической нефропатии и ПЭ средней степени тяжести. Однако через неделю наступило резкое ухудшение состояния (повышение АД до 170/100, головокружение, дизорентация, головная боль, тошнота, судороги). Пациентка была экстренно прооперирована с диагнозом эклампсия. Был извлечен живой недоношенный мальчик весом 2400 г в удовлетворительном состоянии.

Концентрации NSE, ICAM и VEGF составили 196,8 пг/мл, 824,1 нг/мл и 21,7 нг/мл соответственно. Уровни NSE и ICAM соответствовали тяжелой ПЭ, a VEGF легкой ПЭ. Значение классификационной функции составило: 0.019*196,8+0.019*824,1+0.113*21,7-18.46=3,389, что соответствует тяжелой ПЭ (значение G>0,636).