СПОСОБ ОЦЕНКИ НЕЙТРОФИЛОЦИТОПОЭЗА НА ОСНОВЕ СПОСОБНОСТИ КЛЕТОК РЕАГИРОВАТЬ НА НЕЙТРОФИЛОКИНЫ

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической гематологии, и может использоваться для диагностики состояния имунной системы и онкологических заболеваний.

Известен способ оценки функциональной активности нейтрофилов и образования нейтрофильных внеклеточных ловушек в периферической крови у пациентов с хроническим одонтогенным верхнечелюстным синуситом, описанный в одноименной статье автора Малышевой Л.Ю. в сборнике трудов Челябинской государственной медицинской академии (см. Приложение).

Известный способ заключается в том, что для изучения показателей периферической крови забор материала проводили на 2-е и 14-е сутки лечения и исследовали: способность нейтрофилов к фагоцитозу с расчетом процента фагоцитов (активность фагоцитоза) и числа поглощенных объектов в 100 подсчитанных лейкоцитах (интенсивность фагоцитоза); состояние лизосомного аппарата; внутриклеточный кислородзависимый метаболизм нейтрофилов и макрофагов (НСТ-тест), также определяли число нейтрофильных внеклеточных ловушек (%) - количество нейтрофильных ловушек, содержащих бактериальные клетки, из 100 подсчитанных сетеподобных структур. Данные, обработанные методами вариационной статистики, выражали в виде медианы и процентилей (M[Q1; Q2], n - количество наблюдений в выборке. О достоверности различий судят при помощи непараметрического критерия Вилкоксона. Для определения статистической значимости межгрупповых различий применяют непараметрический критерий Манна-Уитни. Данные считаются статистически значимыми при ρ≤0,05. Результаты исследований обрабатывались на ПЭВМ с с использованием пакета прикладных программ «Statistika 6.0».

Недостатком известного способа является сложность его осуществления и ограниченное применение - для больных хроническим одонтогенным верхнечелюстным синуситом.

Известен способ оценки секреторной активности нейтрофилов на основе их влияния на моноциты, описанный в Методических рекомендациях для аспирантов «Изучение кооперации нейтрофилов с клетками иммунной системы в норме и патологии», Челябинск, 1992 г., и выбранный в качестве прототипа.

Известный способ заключается в том, что получают взвесь нейтрофилов, доведенную до концентрации 5*10 в шестой степени, инкубируют ее взвесью полистирольного монодисперсного латекса в соотношении 1:50-1:100 при 37°С в течение 1 часа, после чего отделяют клетки от супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, затем супернатант отфильтровывают через милипоровый фильтр и добавляют к адгезированным на покровном стекле моноцитам донора из расчета 1 мл/сапожок, клетки инкубируют в течение 1 часа и изучают их свойства: НСТ-тест, фагоцитарную и лизосомальную активность по стандартным методикам, при этом в качестве контрольной определяют функцию моноцитов, инкубируемых в среде 199.

Известный способ является весьма простым в осуществлении, однако недостатком известного способа является кратковременность исследования, что позволяет оценить комплексную функциональную активность нейтрофилов лишь в условиях культивирования в течение часа, что обеспечивает его применение только в экспериментальных исследованиях.

Задачей является расширение эксплуатационных возможностей способа - обеспечение возможности применения его не только в экспериментальных исследованиях, но и в клинике за счет обеспечения оценки становления нейтрофилоцитов красного костного мозга на основе их восприимчивости к секреторным продуктам зрелых нейтрофилов периферической крови и их способности на разных стадиях дифференцировки адекватно реагировать на межклеточные сигналы - цитокины, вырабатываемые зрелыми клетками того же типа, при сохранении простоты осуществления способа.

Поставленная задача решается тем, что в способе оценки нейтрофилоцитопоэза на основе способности клеток реагировать на нейтрофилокины, заключающемся в том, что получают взвесь нейтрофилов, доведенную до концентрации 5*10 в шестой степени, увеличивают ее концентрацию, инкубируя ее при 37°С, после чего отделяют клетки от супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, затем супернатант добавляют к клеткам донора, клетки инкубируют в культивационной среде и изучают их свойства - НСТ-тест, фагоцитарную и лизосомальную активность по стандартным методикам, при этом в качестве контрольной определяют функцию клеток, инкубируемых в среде 199, СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ, для получения супернатанта взвесь нейтрофилов, доведенную до концентрации 5*10 в шестой степени (в среде 199 с добавлением гентамицина и пенициллина), инкубируют в стерильных условиях при 37°С в течение 48 часов для получения большей концентрации, в качестве клеток используют костный мозг от животных контрольной и опытной групп, который разделяют на кусочки (0,125 мм³) и помещают в 4 стерильные одноразовые чашки Петри в среде 199 с добавлением гентамицина и пенициллина, при этом в первую чашку помещают только кусочки мозга контрольного животного в культивационной среде, во вторую чашку - только кусочки мозга подопытного животного в культивационной среде, в 3-ю чашку - только кусочки мозга контрольного животного в культивационной среде с добавлением нейтрофильного супернатанта, в четвертую чашку - только кусочки мозга подопытного животного в культивационной среде с добавлением нейтрофильного супернатанта, культивируют все 4 чашки Петри в стерильных условиях при 37°С 48 часов, затем отмывают клетки при 1500 об/мин в среде 199, после чего изучают количественное соотношение клеток на разных стадиях миелопоэза, дополнительно пероксидазную активность нейтрофилов и оценивают результаты, сравнивая функциональную активность нейтрофилов на разных стадиях дифференцировки в чашках 1 и 3, а также в чашках 2 и 4, и определяют клетки как здоровые в случае угнетения дифференцировки и морфофункционального становления нейтрофильных предшественников в присутствии большого количества нейтрофилокинов или в противном случае - как патологичные.

Увеличение концентрации супернатанта за счет длительного инкубирования в совокупности с использованием в качестве клеток донора костного мозга и длительным культивированием контрольных и опытных партий клеток костного мозга и их смеси с супернатантом в отдельных чашках Петри с последующим изучением количественного соотношения клеток на разных стадиях дифференцирования дает возможность оценить способность нейтрофилопоэтических клеток костного мозга реагировать на межклеточные сигналы - цитокины, вырабатываемые зрелыми клетками того же типа, и определить их как здоровые в случае угнетения дифференцировки и морфофункционального становления нейтрофильных предшественников в присутствии большого количества нейтрофилокинов или в противном случае - как патологичные.

Технический результат - возможность достаточно просто оценивать активность клеток в динамике.

Следует отметить также, что в клинической практике нет доступных способов комплексного исследования гемопоэза, все они являются достаточно дорогостоящими и трудоемкими. Именно поэтому техническая результативность заявляемого способа заключается в его общедоступности (он прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, нет необходимости в специально обученном персонале, для проведения исследования достаточно стандартно оснащенной лаборатории культивирования) и возможности более широкого применения как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях, поскольку он позволяет оценивать степень зрелости гемопоэтических клеток костного мозга при любой патологии кроветворной системы, поэтому спектр применения данного способа очень широк. Он позволяет работать с материалом отсроченно, а не непосредственно после забора, так как сроки культивации достаточно длительны. Это дает исследователю время для проведения других анализов.

Заявляемый способ обладает новизной, отличаясь от прототипа такими существенными признаками как инкубирование для получения супернатанта взвеси нейтрофилов, доведенной до концентрации 5×10⁶ (в среде 199 с добавлением гентамицина и пенициллина), в стерильных условиях при 37°С в течение 48 часов для получения большей концентрации, использование в качестве клеток костного мозга от животных контрольной и опытной групп, разделение полученного костного мозга на кусочки (0,125 мм³) и помещение их в 4 стерильные одноразовые чашки Петри в среде 199 с добавлением гентамицина и пенициллина при помещении в первой чашке только кусочков мозга контрольного животного в культивационной среде, во второй чашке - только кусочков мозга подопытного животного в культивационной среде, в 3-й чашке - только кусочков мозга контрольного животного в культивационной среде с добавлением нейтрофильного супернатанта, в четвертой чашке - только кусочков мозга подопытного животного в культивационной среде с добавлением нейтрофильного супернатанта, культивирование всех 4 чашек Петри в стерильных условиях при 37°С 48 часов, затем отмывание клеток при 1500 об/мин в среде 199, последующее изучение количественного соотношения клеток на разных стадиях миелопоэза, дополнительно пероксидазной активности нейтрофилов и оценка результатов сравнением функциональной активности нейтрофилов на разных стадиях дифференцировки в чашках 1 и 3, а также в чашках 2 и 4, обеспечивающих в совокупности достижение заданного результата.

Заявителю не известны технические решения, обладающие совокупностью указанных существенных признаков, обеспечивающих в совокупности достижение заданного результат, и поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Заявляемый способ может найти применение как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях, поскольку он позволяет оценивать степень зрелости гемопоэтических клеток костного мозга при любой патологии кроветворной системы, поэтому спектр применения заявляемого способа в клинической гематологии может быть очень широк. Поэтому он соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемый способ заключается в следующем.

Для получения супернатанта взвесь нейтрофилов, доведенную до концентрации 5*10 в шестой степени (в среде 199 с добавлением гентамицина и пенициллина), инкубируют в стерильных условиях при 37°С в течение 48 часов для получения большей концентрации.

После этого отделяют клетки от супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, затем супернатант добавляют к клеткам донора. При этом в качестве клеток донора используют костный мозг животных контрольной и опытной групп, полученный костный мозг разделяют на кусочки (0,125 мм³) и помещают в 4 стерильные одноразовые чашки Петри в среде 199 с добавлением гентамицина и пенициллина. В первую чашку помещают только кусочки мозга контрольного животного в культивационной среде, во вторую чашку - только кусочки мозга подопытного животного в культивационной среде, в 3-ю чашку - только кусочки мозга контрольного животного в культивационной среде с добавлением нейтрофильного супернатанта, в четвертую чашку - только кусочки мозга подопытного животного в культивационной среде с добавлением нейтрофильного супернатанта. Затем культивируют все 4 чашки Петри в стерильных условиях при 37°С 48 часов, затем отмывают клетки при 1500 об/мин в среде 199. После этого изучают количественное соотношение клеток на разных стадиях миелопоэза, НСТ-тест, фагоцитарную и лизосомальную и пероксидазную активность нейтрофилов по стандартным методикам и оценивают результаты, сравнивая функциональную активность нейтрофилов на разных стадиях дифференцировки в чашках 1 и 3, а также в чашках 2 и 4.

Клетки определяют как здоровые в случае угнетения дифференцировки и морфофункционального становления нейтрофильных предшественников в присутствии большого количества нейтрофилокинов и как патологичные в противном случае.

Способ осуществляют следующим образом.

Забирают периферическую кровь от интактных животных. На градиенте плотности фиколл-верографин (1,095) после центрифугирования про 1500 об/мин в течение 40 минут получают кольцо нейтрофилов. Полученную клеточную суспензию трижды отмывают от градиента и плазмы и доводят до концентрации 5*10⁶ клеток/мл.

Для получения супернатанта взвесь нейтрофилов, доведенную до концентрации 5*10⁶ клеток/мл (в среде 199 с добавлением гентамицина и пенициллина), инкубируют в стерильных условиях при 37°С в течение 48 часов. Время культивации увеличено с целью получения большей концентрации нейтрофилокинов в супернатанте. После инкубации клетки отделяют от супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут.

Забирают костный мозг как от животных контрольной группы, так и от подопытных крысят. Для этого бедренную кость животного препарируют от мышц, удаляют эпифизы и из диафиза извлекают костный мозг методом промывания физиологическим раствором. Полученный костный мозг разделяют на кусочки (0,125 мм³) и помещают в стерильные одноразовые чашки Петри (диаметр 20 мм) в среде 199 с добавлением гентамицина и пенициллина.

Кусочки костного мозга помещают в 4 чашки Петри. В 1 чашку помещают только кусочки костного мозга контрольного крысенка в культивационной среде. Во 2 чашку помещают только кусочки костного мозга подопытного крысенка в культивационной среде. В 3 чашку помещают кусочки костного мозга контрольного крысенка в культивационной среде с добавлением нейтрофильного супернатанта. Наконец, в 4 чашку помещают кусочки костного мозга подопытного крысенка в культивационной среде с добавлением нейтрофильного супернатанта. Все чашки Петри в стерильных условиях культивируют при 37°С в течение 48 часов.

Затем клетки отмывают при 1500 об/мин в среде 199, после чего изучают количественное соотношение клеток на различных стадиях миелопоэза, НСТ-тест, фагоцитарную, лизосомальную и пероксидазную активность нейтрофилоцитов.

Оценивают результаты проведенного исследования, сравнивая функциональную активность нейтрофилоцитов на разных стадиях дифференцировки в чашках 1 и 3, а также в чашках 2 и 4.

Исходя из полученных результатов, оценивают способность клеток нейтрофилоцитарного ряда реагировать на цитокиновое поле зрелых нейтрофилов. Угнетение дифференцировки и морфофункционального становления нейтрофильных предшественников в присутствии большого количества нейтрофилокинов, например, является нормальной реакцией здоровых клеток на избыток продуктов клеток того же типа.

Если же угнетения дифференцировки и функционального становления не происходит, это позволяет предположить, что клетки патологичны и потеряли способность адекватно реагировать на межклеточные сигналы - цитокины. Можно говорить о нарушении принципа отрицательной обратной связи - клетки получают сигнал о достаточном количестве и высокой активности таких же клеток, на который они должны ответить снижением своей пролиферации, дифференцировки активности, однако этого не происходит.

Таким образом, в сравнении с прототипом заявляемый способ имеет более широкие эксплуатационные возможности, поскольку позволяет оценить степень зрелости нейтрофилов красного костного мозга на основе их способности адекватно реагировать на цитокины, вырабатываемые зрелыми активными нейтрофилами, что не имеет аналогов в литературе и позволяет существенно расширить представление о возможностях клинического и экспериментального исследования гемопоэтических клеток при множестве различных патологий. При этом он является также простым и доступным.