Результат интеллектуальной деятельности: АНТИЭЙМЕРИОЗНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ СОЛИ ЧЕТВЕРТИЧНОГО ФОСФОНИЯ И ЗАМЕЩЕННОГО ДИНИТРОБЕНЗОФУРОКСАНА

Изобретение относится к фармации, а именно к антипаразитарным фармацевтическим композициям, и может быть использовано в качестве антиэймериозного препарата в ветеринарии и медицине.

Кокцидиозы - остро, подостро и хронически протекающие болезни животных и человека, вызываемые различными видами простейших, относящихся к подцарству Protozoa, типу Apicomlexa, классу Sporozoa, отряду Coccidiida, семейству Eimeriidae.

Эймериозы вызываются простейшими, паразитирующими преимущественно в эпителиальных клетках кишечника. Некоторые виды паразитируют в желчных протоках печени у кроликов (E. stiedae) и слизистой оболочке почечной лоханки гусей (E. truncate). В организме больных эймериозом животных и птиц происходит интоксикация продуктами обмена простейших и гнилостной микрофлоры, что ведет к нарушению функций нервной системы, вызывая угнетение животных, вплоть до коматозного состояния, тремора мышц и паралича конечностей. Животные теряют в весе; мясо переболевших животных имеет низкую питательную ценность и быстро портится при хранении. У птиц снижается яйценоскость. Хозяйства несут большие расходы на приобретение препаратов для лечения, профилактики и проведения дезинвазии помещений. При сильной степени инвазии эймериозы могут вызывать массовую гибель животных (Акбаев М.Ш., Воселеевич Ф.И., Акбаев P.M. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М.: Колос. - 2008. - 756 с.) [1].

Для лечения эймериозов животных и птиц предложены ряд лекарственных препаратов, обладающих антиэймериозной активностью: химкокцид, трихопол, салиномицин, байкокс, нитрофурановые (фуракриллин, фуразолан, фуразолидон) и сульфаниламидные препараты (сульфадимезин, сульфадиметоксин, сульфапередозин, норсульфазол, фталазол), а также левомецетин, мономиецин и многие другие (Акбаев М.Ш., Водянов А.А., Косминков Н.Е. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М.: Колос. - 2000. 559 с. [2]; Плешаков С.А., Ларионов С.В., Розовенко М.В. Эффективность фуракриллина и фуразонала при эймериозе кроликов // Ж. «Ветеринария». - №8. - Саратов, 1997. С.28-30 [3]; Плешаков С.А. Научные основы применения комплексных препаратов на базе нитрофуранов при эймериозе кроликов // Автореф. дисс. канд. вет. наук. - 1999. - 18 с. [4]). Однако до сих пор не найдено специфически действующих на эймерий лекарственных препаратов, а те, которые широко применяются, обладают одним или несколькими негативными свойствами: дороговизна, токсичность, кумуляция в съедобных тканях животных, иммунодепрессивное действие, опасность развития резистентных штаммов возбудителя.

Несмотря на широкое использование лекарственных препаратов в качестве средств лечения и профилактики эймериозов, получить 100% показатели экстенс- и интенсэффективности не удается. Поэтому эти препараты применяются неоднократно. Например, для лечения эймериоза кроликов применяют фуразолидон по 250 мг/кг в течение 10 дней, а после 5-дневного перерыва - сульфадиметоксин - в первый день 2 г, в последующие 9 дней - по 1 г на животного (Пономаренко В.Я. К вопросу о химиопрофилактике кокцидиоза кроликов // Мат-лы научной конференции паразитологов УАССР. - Ч.2. - Киев. - 1975. - С.116) [5].

Предложен способ лечения фуракрилином или фуразоналом в комплексе с витаминами и солями гидроксиэтилидендифосфорной кислоты, что позволяет уменьшить разовые дозы препаратов (действующего начала) до 30 мг/кг и 15 мг/кг массы тела соответственно (патент РФ 2154470, опубл. 20.08.2000) [6].

Известен способ лечения коров, больных эймериозом, включающий скармливание с кормом кокцидина и дополнительное введение однократно 10% раствора эраконда - фитопрепарата, стимулирующего обменные процессы и повышающего резистентность организма, в дозе 4,5-5,5 мг/кг массы тела (патент РФ 2234932, опубл. 27.08.2004) [7].

Известен способ лечения эймериоза у животных и птиц, включающий двукратное с интервалом 5 дней скармливание ксимедона или ксимедонгидрохлорида в дозе 30 мг/кг массы тела мелким животным и дополнительно введение фуразолидона в дозе 20 мг/кг массы тела пятидневным курсом с интервалом 3 дня (патент РФ 2322235, опубликован 20.04.2008, бюл. №11) [8].

Таким образом, принцип использования антиэймериозных препаратов основан на многократном их применении, что неиндифферентно для любого организма. Многие из них обладают токсическим, раздражающим и иммунодепрессивным действием. Кроме того, длительное применение одного кокцидиостатика приводит к появлению устойчивых рас эймерий, которые вызывают явления дисбактериоза, способствуют угнетению ферментативной активности желудочно-кишечного тракта и могут быть причиной других функциональных изменений в организме животных.

Кроме того, при применении сульфаниламидов могут возникнуть аллергические реакции и другие побочные явления: дерматиты, лейкопения, невриты. Вследствие плохой растворимости сульфаниламиды и особенно продукты их ацетилирования, образующиеся в организме путем замещения водорода аминогруппы остатком уксусной кислоты, могут выпадать в почках в виде кристаллов и закупоривать мочевые пути (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Ч.2. М., Медицина, 1993, с.688) [9].

Следовательно, изыскание новых препаратов и схем их применения для профилактики и лечения эймериозов животных, птиц и человека, воздействующих на различные звенья патологического процесса, является актуальной задачей как фармации, так и ветеринарии.

Задачей заявленного технического решения является создание эффективного нетоксичного антиэймериозного препарата нового поколения - проникающего через мембрану паразита, обладающего вследствие этого характерным комплексом свойств:

- сверхнизкими лечебными дозами;

- высоким значением ЛД₅₀ 2500 мг/кг;

- высокой эффективностью в отношении эймерий, обеспечивающей расширение арсенала известных малоэффективных, токсичных и дорогостоящих средств указанного назначения.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание новой по механизму действия нетоксичной (ЛД₅₀ 2500 мг/кг) фармацевтической композиции «Депрот-14», эффективной для лечения эймериозов при 2-кратном приеме с интервалом в 24 часа в дозе 4 мг/кг (в пересчете на действующее вещество - соль фосфония А). Препарат принимается 1 раз в день в утреннее кормление в течение 2 дней подряд.

Заявленный технический результат достигается применением композиции «Депрот-14», содержащей н-тетрадецилтрибутилфосфоний хлорид (А) и 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксан (В) в качестве активных компонентов при весовом соотношении 1:10 и глюкозу (вспомогательное вещество), как показано на рисунке 1:

Как нами показано, четвертичные соли фосфония обладают высокими антибактериальными свойствами вследствие взаимодействия с липидными компонентами клеточных мембран [Галкина И.В., Мельникова Н.Б., Тудрий Е.В., Галкин В.И., Жильцова О.Е., Жукова О.В., Егорова С.Н. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран / Фармация, 2009. - №4. - С.35-38]. Производные бензофуроксанов обладают широким спектром биологической активности, например акарицидной и бактерицидной [пат. РФ 2255935, опубл. 10.07.2005], фунгицидной [пат. РФ 2032678, опубл. 10.04.1995]; предложено их использование также для лечения стенокардии [заявка РФ 2000132204, опубл. 10.11.2002; заявка РФ 2000132206, опубл. 20.10.2002]. Из исследованного уровня техники не выявлены сведения о наличии антиэймериозной активности у бензофуроксанов и у солей четвертичного фосфония, как по отдельности, так и в совокупности, что является доказательством соответствия заявленного технического решения критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям. При этом широко известны антибактериальные, противогрибковые и антимикробные свойства приведенных выше препаратов [Галкина И.В., Тудрий Е.В., Бахтиярова Ю.В., Егорова С.Н., Галкин В.И. Синтез, строение и исследование биологической активности солей фосфония / В сб.: Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ. - Казань, 2008. - С.23; pat. JP 2002308713, publ. 23.10.2002; pat. JP 2005060332, publ. 10.03.2005; pat. JP 2000316701, publ. 21.11.2003]. Активные компоненты заявляемой композиции на основе соли четвертичного фосфония и замещенного динитробензофуроксана используются в заявленном техническом решении по новому для них назначению - в качестве антиэймериозного препарата, что не является очевидным для специалиста в анализируемой области техники; таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленная композиция может быть получена посредством использования известных компонентов с применением стандартного оборудования и известных приемов.

Сущность заявленного технического решения заключается в создании антипротозойной композиции, содержащей н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний хлорид и 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксан в качестве активных компонентов при их весовом соотношении 1:10 и глюкозу как вспомогательное вещество.

Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом.

1. Получают первый действующий компонент (А) заявляемой композиции - н-тетрадецилтрифенилфосфонийхлорид формулы:

способом, описанным в [Галкина И.В., Мельникова Н.Б., Тудрий Е.В., Галкин В.И., Жильцова О.Е., Жукова О.В., Егорова С.Н. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран / Фармация, 2009. - №4. - С.35-38]:

2. Получают второй действующий компонент - 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксан формулы (В), который синтезировали по методике [Л.М.Юсупова, С.Ю.Гармонов, И.М.Захаров и др. Средства биологической защиты многоцелевого назначения на основе хлорпроизводных нитробензофуроксана / Вестник Казанского технологического университета, 2005 г., №1, с.103-111]:

Глюкозу кристаллическую медицинскую использовали по ГОСТ 975-88 в качестве питательного вещества для простейших и наполнителя (производитель Днепропетровский крахмально-паточный комбинат).

Заявленное техническое решение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение антиэймериозной композиции «Депрот-14» и лекарственных форм на ее основе

В фарфоровой ступке смешивают и растирают 2,25 г глюкозы, 0,25 г н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний хлорида А и 2,50 г 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксана В до получения однородного порошка красного цвета (фармацевтическая композиция «Депрот-14»). Порошок является лекарственной формой для лечения птиц. Для дозирования у животных порошком наполняли облатки (дозированные закрывающиеся контейнеры из крахмала). Пероральная дозированная лекарственная форма весом 0,5 г содержала 0,025 г соли фосфония (А), 0,250 г динитробензофуроксана (В) и 0,225 г глюкозы.

Пример 2. Изучение антиэймериозной активности «Депрот-14» в отношении смешанного эймериоза животных и птиц, вызванного эймерией: Е. stidae, E. perforans, E. magna, E. intestinalis и др.

Испытание лечебной эффективности соединения «Депрот-14» при эймериозе животных и птиц проводили в 3 опытах.

В первом опыте использовали 15 кроликов, свободных от кокцидий и гельминтов. Животных заражали смешанной культурой спорулизованных ооцист эймерий (E. stidae, E. perforans, E. magna, E. intestinalis и др.). Для этого неспорулированные ооцисты эймерий культивировали в чашках Петри в термостате при температуре 26-27°C, периодически орошая дехлорированной водой. Суспензию ооцист отмывали 2 раза водопроводной водой центрифугированием и подсчитывали количество ооцист в 1 мл. Каждому животному перорально вводили ооцисты эймерий в расчете 20000 на 1 кг массы.

После заражения кролики были разделены на 3 группы. Через 10 дней после заражения животным первой группы вместе с концентрированным кормом давали соединение «Депрот-14» в дозе 350 мг/кг, дважды с интервалом в 1 день, второй группы - фуразолидон в дозе 20 мг/кг, двумя пятидневными курсами с интервалом в 3 дня. Кроликов третьей группы не лечили, и они служили в качестве контроля.

Животные в течение опыта находились в одинаковых условиях содержания, предотвращающих спонтанное заражение. Кормление животных осуществлялось в соответствии с зоотехническими нормами. Ежедневно проводили клинический осмотр поголовья. Пробы фекалий для исследования брали до заражения и введения препаратов и через 10, 15, 30 и 45 дней после лечения.

Для копрологических исследований проб материала использовали комбинированные гельминтоовоскопические методы.

Данные о противоэймериозной эффективности препаратов представлены в таблице 1.

Из таблицы видно, что до лечения все кролики были заражены эймериозом, интенсивность инвазии (ИИ) колебалось от 195±1,1 до 218±2,3.

Через 10 дней после начала лечения в 2 опытных группах ИИ снизилась и составила в первой группе («Депрот-14») 58,0±2,5 во второй (фуразолидон) 92,8±0,9. У кроликов контрольной группы отмечали незначительное увеличение количества ооцист (228±0,6). Интенсэффективность (ИЭ) соединения «Депрот-14», которое использовали при лечении кроликов первой группы, составила 73,6%, во второй группе ИЭ фуразолидона равнялась 52,4%, т.е. была ниже на 21,2%. Необходимо отметить, что в этот период, несмотря на снижение количества ооцист у животных как первой, так и второй групп, ни один из кроликов полностью не освободился от ооцист.

Через 15 дней после лечения в первой группе количество ооцист составило 119±1,7, против 218±2,3 (до лечения), ИЭ составила 45,3%. Два кролика полностью освободились от ооцист; экстенсэффективность препаратов (ЭЭ) равнялась 40,0%. Во второй группе ИИ составила 135,2±2,4 против 195±1,1 (до лечения). ИЭ составила 30,7%, а экстенсэффективность - 20%. Через 30 дней после лечения в первой группе интенсивность эймериозной инвазии снизилась до 14,6 ооцист, интенсэффективность составила 93,3%, а экстенсэффективность - 60,0%. После лечения фуразолидоном среднее количество ооцист у кроликов составило 69,0±2,5, интенсэффективность - 64,6%, а экстенсэффективность - 20%. Через 45 дней кролики, леченные соединением «Депрот-14», полностью освободились от ооцист эймерий. Во второй группе (лечение фуразолидоном) интенсивность инвазии стала выше по сравнению с предыдущими сроками, причем ооцисты были выделены у всех кроликов, и поэтому ЭЭ составила 0%, а интенсэффективность - 25%.

У кроликов контрольной группы интенсивность эймериозной инвазии в ходе опыта не снижалась и составила через 15 дней 235±2,1 - через 30 дней 213±1,4, через 45 дней 213±1,9 (против 207±1,6 до лечения).

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что после лечения экспериментально зараженных эймериозом кроликов интенсэффективность соединения «Депрот-14» через 10 дней была достоверно выше на 21,2%, через 15 дней - 14,6%, через 30 дней - 28,7% и через 45 дней - 75%. Аналогичная закономерность выявлена и при определении экстенсэффективности препаратов.

Второй опыт проводили на телятах 1-1,5-месячного возраста, которые были естественно инвазированы эймериями видов Е. bovis, E. zuernii, E. ellipsoidalis и др.

После проведения копрологических исследований животные по признаку аналогов (имеющие сходные клинические признаки, одинаковую живую массу и степень инвазии) были разделены на 3 группы (по 10 голов), из которых две опытные и одна контрольная.

Телятам 1-й группы вместе с концентратами задавали соединение «Депрот-14» в дозе 100 мг/кг дважды с интервалом в 1 день. Животные второй группы получали фуразолидон (20 мг/кг) двумя пятидневными курсами с интервалом в 3 дня. Телята третьей группы служили контролем. Животные всех групп содержались в одинаковых условиях, а кормление их проводилось в соответствии с зоотехническими нормами. Ежедневно проводили клинический осмотр поголовья. Пробы фекалий для исследования брали до введения препаратов и через 10, 15, 30 и 45 дней после лечения.

Результаты изучения противоэймериозной эффективности исследуемых препаратов на крупном рогатом скоте также представлены в таблице 1. Из нее видно, что интенсивность эймериозной инвазии у естественно зараженных телят колебалась от 91,0±1,5 до 112±2,9. Через 10 дней после лечения у животных опытных групп произошло снижение количества ооцист. Однако интенсэффективность препаратов была разная, и в первой группе («Депрот-14») она составила 59,6%, во второй (фуразолидон) - 34,6%.

Через 15 дней после лечения произошло дальнейшее снижение количества ооцист эймерий у животных опытных групп, и в первой группе их количество равнялось 26,5±1,4, во второй - 54,3±1,6, а интенсэффективность - 76,3% и 44,6% соответственно. В этот период три животных из первой и два из второй группы полностью освободились от эймерий.

Через 30 дней после лечения препаратом «Депрот-14» интенсивность эймериозной инвазии в первой группе снизилась до 6,4±2,0 ооцист, интенсэффективность составила 94,3%, а экстенсэффективность - 80%. После лечения фуразолидоном среднее количество ооцист у телят составило 41,6, интенсэффективность - 57,6%, экстенсэффективность - 30%. Через 45 дней телята, леченные соединением «Депрот-14», полностью освободились от ооцист эймерий. Во второй группе интенсивность инвазии составила 52,5±3,0, интенсэффективность 46,4%, а экстенсэффективность 30%. Интенсивность эймериозной инвазии у телят нелеченной группы за 45 дней опыта возросла до 180±1,4 ооцист, против 91,0±1,5 в начале опыта.

Третий опыт проводили на 45 цыплятах 25-дневного возраста, свободных от паразитов. В условиях вивария кафедры паразитологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины птицу заражали смешанной культурой спорулированных ооцист эймерий (Е. tenella, Е. acervulina, Е. maxima и др.). Материал для заражения получали от птиц, естественно зараженных эймериозом. Ооцисты предварительно спорулировали в течение 5 дней. Птицу заражали суспензией ооцист в количестве 1 тысяча ооцист на 1 кг веса, после чего их разделили на 3 группы (по 15 птиц в каждой). Через 6 дней после заражения в первой группе вместе с комбикормом цыплята получали препарат «Депрот-14»в дозе 350 мг/кг, дважды с интервалом в 1 день, во второй группе - фуразолидон в дозе 20 мг/кг двумя пятидневными курсами с интервалом в 3 дня. Третья группа цыплят служила в качестве контроля. Условия кормления и содержания цыплят всех групп были одинаковые и соответствовали зоотехническим нормам. Копрологические исследования проводили через 10, 15, 30 и 45 дней после начала лечения.

Результаты исследований отражены в таблице 1. Данные таблицы показывают, что у цыплят, экспериментально зараженных эймериозом, до лечения количество ооцист колебалось от 60,0±2,9 до 80,0±3,1. Через 10 дней после лечения интенсивность инвазии в первой группе составила 55,9±3,5, во второй - 58,1±3,0, в контрольной группе 74,3±2,8 (против 60,0±2,9 в начале опыта). В этот период полного освобождения цыплят от ооцист не наступило. Интенсэффективность фармацевтической композиции «Депрот-14» составила 30,2%, против 14,7 при использовании фуразолидона. Через 15 дней после лечения произошло дальнейшее снижение ооцист эймерий у животных опытных групп, и в первой группе их количество равнялось 45,1±2,6, во второй - 53,4±1,8, а интенсэффективность - 43,6% и 21,4% соответственно. В этот период часть животных полностью освободились от ооцист эймерий, и ЭЭ препарата в первой группе составила 40,0%, во второй 13,3%. Через 30 дней после лечения интенсивность эймериозной инвазии в первой группе снизилась до 10,9±2,4, во второй до 43,4±1,9. Интенсэффективность препарата в первой группе составила 86,4%, во второй была ниже на 50,2% и составила 36,2%. Через 45 дней 86,7% цыплят, леченных препаратом «Депрот-14», освободились от ооцист, интенсэффективность препарата составила 96,2%. Во второй группе интенс- и экстенсэффективность препарата была значительно ниже и составила 42,7% и 20,0% соответственно.

У цыплят контрольной группы интенсивность эймериозной инвазии за период опыта (45 дней) возросла с 60±2,9 ооцист в начале и до 100,3±3,6 в конце опыта.

Таким образом, заявленный способ лечения эймериоза животных и птиц, заключающийся в применении фармацевтической композиции «Депрот-14», позволяет добиться 96,2%-100% эффективности лечения животных, больных эймериозом.

Пример 3. Определение острой токсичности фармацевтической композиции «Депрот-14»

Уровень острой токсичности заявляемой антиэймериозной композиции определяли на мышах в условиях вивария кафедры паразитологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины по стандартным методикам. Установлено, что при внутрижелудочном введении мышам ЛД₅₀ составила 11500±1281,7 мг/кг. Вариабельность смертельных доз определяли отношением показателей ЛД₈₄ (16175 мг/кг) и ЛД₁₆ (5306 мг/кг). Согласно ГОСТ 12.1.007-76 «Дегельм-14» относится к веществам четвертого класса опасности по Измерову [Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном введении (Справочник). - М.: Медицина, 1977. - С.196-197].

В результате проведенного исследования установлено, что заявляемая фармацевтическая композиция «Депрост-14» обладает высокой антиэймериозной эффективностью при низких курсовых лечебных дозах действующих веществ композиции (0,005 г/кг) (А) и 0,05 г/кг (Б), в то время как препараты сульфаниламидного ряда, например сульфадиметоксин, используются в дозах на курс лечения 0,6 г/кг, что в 120 раз превышает дозу предлагаемого нами препарата по компоненте (А) и в 12 раз - по компоненте (Б). При использовании композиции «Депрост-14» не наблюдается расстройств стула и других признаков кишечной инфекции.

Таким образом, фармацевтическая композиция, включающая три компонента - н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний хлорид, 5,7-бис-(м-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксан в определенном весовом соотношении и глюкозу, обладает высокой эффективностью при лечении эймериозов зараженных животных и птиц в низких лечебных дозах.