СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТРАНСЛОКАЦИИ БАКТЕРИЙ В КРОВЬ ПРИ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОМ ХРОНИЧЕСКОМ ПАРОДОНТИТЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования транслокации бактерий в кровь при генерализованном хроническом пародонтите.

R.D.Berg дал определение транслокации как прохождение жизнеспособных бактерий из желудочно-кишечного тракта через слизистую оболочку в экстраинтестинальные участки макроорганизма, например, мезентеральные лимфоузлы, печень, селезенку, кровоток и др. [Berg R.D. Bacterial translocation from the intestines // Jikken Dobutsu, 1985, Jan., 34 (1), 1-16].

В настоящее время описана бактериальная транслокация из других биотопов человека: зубной бляшки, ротоглотки, синусов носа [Савельев B.C., Федоров В.Д., Воробьев А.И. и др. Сепсис в начале XXI века: классификация, клинико-диагностическая концепция и лечение / Метод. реком. М. 2004. 129 с.]. Проникновение патогена в кровь приводит к развитию очагов поражения разной локализации и сепсиса [Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Зверев В.В. Колонизация Staphylococcus aureus биотопов желудочно-кишечного тракта крыс // Вестник РАМН, 2009, №4, с.28-30; Бондаренко В.М., Рябиченко Е.В. Роль дисфункции кишечного барьера в поддержании хронического воспалительного процесса различной локализации // Ж. микробиол., 2010, 1, 92-100].

Однако причины, условия и механизмы транслокации бактерий изучены недостаточно. Транслокация может быть связана с ослаблением иммунитета организма по разным причинам. Транслокация кишечной микрофлоры описана при кишечной непроходимости [Пашков С.А., Плечев В.В., Мурысева Е.М. Интраперитонеальная транслокация бактерий и антибиотикотерапия при острой спаечной кишечной непроходимости // Казанский медицинский журнал, 2004, т.85, №5, с.346-350; Салато О.В. Исследование транслокации бактерий при механической непроходимости тонкой кишки // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2008, №4 (62), с.76-79], при хирургических инфекциях [Апарцин К.А., Лишманов Ю.Б., Галеев Ю.М. и др. Бактериальная транслокация при релапаротомии в условиях распространенного перитонита // Бюллетень СО РАМН, 2009, №2 (136), с.95-100; Шестаков А.И., Хафизов А.Р. К вопросу о транслокации бактерий в хирургии аорты // Вестник Башкирского университета, 2006, №2, с.70-73; Тарасенко B.C., Никитенко В.И., Кубышкин В.А. Острый панкреатит и транслокация бактерий. // Вестн. хирургии им. И.И.Грекова. 2000, - Т.159, №6. - С.86-88], при стрессовых ситуациях, ожогах, радиационных поражениях [Павлович Е.Р., Дугин С.Ф. Патофизиологическое значение трансинтестинальной транслокации бактерий // Успехи современного естествознания, 2006, №6, с.81-82].

Известно, что механизмы, контролирующие транслокацию, могут зависеть не только от состояния организма хозяина, но и от свойств самих бактерий - транслокантов. Одним из факторов, способствующих транслокации бактерий является эндотоксин, увеличивающий проницаемость слизистых оболочек [Домарадский И.В., Хохоев Т.Х., Кондракова О.А. и др. Противоречивая микроэкология // Рос. хим. журн. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева), 2002, т.XLVI, №3, с.80-89].

Возможно, механизмы транслокации связаны с модификацией уровня экспрессии факторов патогенности и персистенции микроорганизмов в условиях межмикробных взаимодействий при ассоциативном симбиозе [Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург: УрО РАН, 2007. 264 с.]. Поэтому возможность транслокации бактерий определяется не только состоянием макроорганизма - формированием имммунодифицита, но и той микроэкологической ситуацией, которая складывается в микросимбиоцинозе определенного биотопа тела человека.

Известно, что хронический генерализованный пародонтит приводит к существенному подавлению факторов местного и общего иммунитета, что провоцирует транслокацию бактерий в кровь.

Аналогов заявляемого изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в создании способа прогнозирования транслокации бактерий в кровь при генерализованном хроническом парадонтите.

Для достижения названного технического результата в заявляемом способе из биоценоза пародонтального кармана выделяют чистые культуры штаммов-симбионтов, их идентифицируют, определяют количество и направленность сигналов, принятых и отданных каждым штаммом-симбионтом по гемолитической активности (ГА), по антилизоцимной активности (АЛА) и по росту в отношении других штаммов-симбионтов, если штаммом-симбионтом принято сигналов на усиление гемолитической активности более 25% от общего количества принятых сигналов по биоценозу на усиление ГА, АЛА и роста и/или принято сигналов на усиление антилизоцимной активности 30% и более и/или отдано сигналов на подавление роста других штаммов-симбионтов 20% и более от общего количества принятых сигналов по биоценозу на усиление ГА, АЛА и роста прогнозируют транслокацию этого штамма-симбионта в кровь.

Технический результат от реализации изобретения выражается в возможности прогнозирования транслокации бактерий в кровь при генерализованном хроническом парадонтите.

Авторами экспериментально установлена зависимость между характером связей между штаммами-симбионтами в микросимбиоценозах биотопов человека и транслокацией бактерий в кровь, в частности транслокации бактерий в кровь при генерализованном хроническом парадонтите.

Были проведены следующие исследования.

У больных, с клиническим диагнозом «Хронический генерализованный пародонтит», брался тампоном материал со слизистой оболочки пародонтального кармана. Параллельно из локтевой вены проводился забор крови, в объеме 10,0 мл. Затем, тампон с исследуемым материалом (слизистый секрет из пародонтального кармана) засевали на чашку Петри с 5% кровяным агаром, а кровь в объеме 10,0 мл засевали в 100,0 мл сахарного бульона. Выделяли чистые культуры бактерий, их идентифицировали до вида по общепринятым методикам [Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1982, 462 с.].

Для доказательства транслокации бактерий в кровь чистые культуры одного вида, выделенные из крови и парадонтального кармана, сравнивали по типу антибиотикограмм.

В случае совпадения антибиотикограмм делали заключение об идентичности культур [Самикова В.Н. Микробиологическая характеристика возбудителей внутрибольничных инфекций и разработка метода диагностики госпитальных штаммов. Автореф. дисс… канд. биол. наук. Оренбург, 2009, 19 с.] и их транслокации из пародонтального кармана в кровь.

У чистых культур, выделенных из пародонтального кармана определяли гемолитическую активность (ГА), лецитовитолазную активность (ЛецА), лизоцимную активность (ЛА), антилизоцимную активность (АЛА), рост. [Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1982, 462 с.; Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина, 1999, 367 с.].

Модификацию ГА, ЛА, ЛецА, АЛА и роста изучали в условиях межмикробных взаимодействий [Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова Л.М. Межбактериальные взаимодействия // Журн. микробиологии, 2003, №4, с.3-8]. Функциональную структуру микросимбиоценоза парадонтального кармана оценивали по числу сигналов, отдаваемых и принятых штаммами-симбионтами на модификацию факторов патогенности, персистенции и роста штаммов [Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хлопко Ю.А. Структурно-функциональная характеристика микросимбиоценоза человека // Ж. микробиол., 2009, 4, с.4-8].

На фиг.1 представлены графы межмикробных взаимодействий в биоценозе пародонтального кармана больной Б. по модификации ГА, ЛецА, ЛА, АЛА и роста, где 1 - Staphylococcus epidermidis, 2 - Streptococcus mitis, 3 - Enterococcus faecium, 4 - Neisseria sicca. Сплошной линией обозначено усиление свойства штаммов, штриховой линией - подавление свойства, отсутствие линий - индифферентность. Стрелки обозначают направленность сигналов.

Результаты анализа графов представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, штаммы-симбионты внутри микросимбиоценоза отличаются по числу принятых и отданных сигналов на усиление, либо на подавление экспрессии разных свойств. Так, штамм № 1 характеризовался максимальным числом принятых сигналов на усиление факторов патогенности и персистенции (ГА и АЛА) 5 из 6, а так же максимальным числом отданных сигналов на подавление экспрессии факторов патогенности, персистенции и роста штаммов-симбионтов - 7 из 12.

В то же время штамм №2 характеризовался максимальным числом принятых сигналов на подавление свойств штаммов-симбионтов - 6 из 12.

У штамма №3 преобладало число принятых сигналов на подавление свойств штаммов-симбионтов по сравнению с отданными сигналами на усиление свойств (5 против 3). Таким образом, внутри микросимбиоценоза штаммы-симбионты можно дифференцировать по числу отданных и принятых сигналов на усиление либо подавление свойств штаммов-симбионтов.

В связи с этим авторы предприняли попытку дифференцировать штаммы-симбионты на штаммы-симбионты-транслоканты и штаммы-симбионты-нетранслоканты по числу и характеру принятых и отданных сигналов.

От больных, с клиническим диагнозом «Хронический генерализованный пародонтит» было выделено 30 штаммов-симбионтов, из которых 10 штаммов были определены как штаммы-симбионты-транслоканты, а 20 - штаммы-симбионты-нетранслоканты, определено всего 132 сигнала на модификацию свойств.

Как видно из таблицы 2, штаммы-симбионты-транслоканты в отличие от штаммов-симбионтов-нетранслокантов, в 6,9 раза чаще принимали сигналы от штаммов-симбионтов на усиление экспрессии ГА и в 4,3 раза на усиление экспрессии АЛА (15,9% против 2,3% и 12,9% и 3,0%). Не выявлено отличий между штаммами-симбионтами-транслокантами и штаммами-симбионтами-нетранслокантами по частоте принятых сигналов на усиление ЛА, ЛецА, роста и подавление свойств штаммов-симбионтов.

Вместе с тем, штаммы-симбионты-транслоканты, по сравнению с штаммами-симбионтами-нетранслокантами, в 3,9 раза чаще отдавали сигналы на подавление роста штаммов-симбионтов (17,4% против 4,5%). Не выявлено отличий между штаммами-симбионтами-транслокантами и штаммами-симбионтами-нетранслокантами по частоте отданных сигналов на подавление ГА, ЛА, АЛА, ЛецА и усиление свойств штаммов-симбионтов.

Таким образом установлено, что информативными показателями транслокации штаммов бактерий из микросимбиоценоза пародонтального кармана в кровь при хроническом пародонтите является число сигналов, принятых штаммом-симбионтом на усиление экспрессии ГА и АЛА, а также число сигналов, отданных штаммом-симбионтом на подавление роста штаммов-симбионтов.

Для определения количественных критериев (диапазона показателей) с целью прогнозирования транслокации бактерий было изучено количество отданных и принятых сигналов каждым штаммом-симбионтом внутри одного биоценоза. Результаты представлены в таблице 3, где выделенены штаммы-симбионты-транслоканты.

Как видно из таблицы 3 штаммы-симбионты-транслоканты принимали сигналы на усиление ГА в диапазоне 25-100%, а штаммы-симбионты-нетранслоканты в диапазоне 0-25%; на усиление АЛА транслоканты в диапазоне 30-50%, нетранслоканты: 0-20%.

На подавление роста отдано сигналов транслокантами в диапазоне 20-40%, нетранслокантами: 0-16,7%. В связи с полученными данными информативными показателями для прогнозирования транслокации бактерий в кровь являются следующие: число принятых сигналов штаммом-симбионтом на усиление ГА более 25%, на усиление АЛА - 30% и более; число отданных сигналов на подавление роста штаммов-симбионтов 20% и более.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Тампон с исследуемым материалом (слизистый секрет из пародонтального кармана) засевают на чашку Петри с 5% кровяным агаром.

2. Выделяют чистые культуры бактерий, их идентифицируют до вида по общепринятым методикам [Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1982, 462 с.].

3. У выделенных культур определяют количество сигналов, принятых штаммами-симбионтами на усиление гемолитической активности и антилизоцимной активности и роста, а также количество сигналов, отданных штаммами-симбионтами на подавление ГА, АЛА и роста симбионтов [Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова Л.М. Способ диагностики хронического тонзиллита. Патент РФ на изобретение № 2188422. 27.08.2002, бюл. №24]. Проводят статистический анализ по принятым и отданным сигналам на модификацию свойств ГА, АЛА, роста. Статистический анализ заключается в определении процентов принятых сигналов на усиление ГА, АЛА от общего количества принятых сигналов по биоценозу на усиление ГА, АЛА и роста и процентов отданных сигналов на подавление ГА, АЛА от общего количества отданных сигналов по биоценозу на подавление ГА, АЛА и роста.

4. Если штаммом-симбионтом принято сигналов на усиление гемолитической активности более 25% и/или принято сигналов на усиление антилизоцимной активности 30% и более и/или отдано сигналов на подавление роста штаммов-симбионтов 20% и более, прогнозируют транслокацию бактерий в кровь.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больная Б. Клинический диагноз: «Хронический генерализованный пародонтит». У больной был взят тампоном материал со слизистой оболочки пародонтального кармана и сделан посев на чашку Петри с 5% кровяным агаром, параллельно из локтевой вены сделан посев 10,0 мл крови в 100,0 мл сахарного бульона. Выделены чистые культуры бактерий, проведена их идентификация до вида по общепринятым методикам [Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1982, 462 с.]. Из пародонтального кармана выделено 4 штамма бактерий: 1) Staphylococcus epidermidis, 2) Streptococcus mitis, 3) Enterococcus faecium, 4) Neisseria sicca. У выделенных штаммов определили ГА, АЛА [Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1982, 462с.; Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина, 1999, 367 с.], модификацию данных свойств и роста изучали в условиях межмикробных взаимодействий [Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова Л.М. Способ диагностики хронического тонзиллита. Патент РФ на изобретение № 2188422. 27.08.2002, бюл. №24]. Функциональную структуру микросимбиоценоза пародонтального кармана с учетом межмикробных взаимодействий оценили по числу и направленности сигналов штаммов-симбионтов [Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хлопко Ю.А. Структурно-функциональная характеристика микросимбиоценоза человека // Ж. микробиол., 2009, 4, с.4-8]. Построили граф функциональной структуры микросимбиоценоза (фиг.2) и таблицу 4 по результатам анализа графа.

На фиг.2 представлены графы межмикробных взаимодействий в биоценозе пародонтального кармана больной Б. по модификации ГА, АЛА и роста, где 1. Staphylococcus epidermidis, 2. Streptococcus mitis, 3. Enterococcus faecium, 4. Neisseria sicca. Сплошной линией обозначено усиление свойства штаммов-симбионтов, штриховой линией - подавление свойства, отсутствие линий - индифферентность. Стрелки обозначают направленность сигналов.

Как видно из таблицы 4, штамм №1 оказался наиболее активным: им принято максимальное число сигналов на усиление ГА, ЛА (33,3% и 50%) и отдано больше других симбионтов на подавление роста ассоциантов (25%), что позволило сделать прогноз о возможной транслокации данного штамма в кровь. Дальнейшее исследование подтвердило правильность прогноза - из крови больной Б. был выделен штамм №1 (S. epidermidis).

Идентичность штаммов, выделенных из десневого кармана и крови, доказана путем сравнения их антибиотикограмм [Самикова В.Н. Микробиологическая характеристика возбудителей внутрибольничных инфекций и разработка метода диагностики госпитальных штаммов. Автореф. дисс… канд. биол. наук. Оренбург, 2009, 19 с.].

Пример 2. Больной Г. Клинический диагноз: «Хронический генерализованный пародонтит».

Бактериологическое исследование слизистого отделяемого пародонтального кармана и крови осуществляли согласно примеру 1.

Из пародонтального кармана было выделено 4 штамма: 1) Staphylococcus epidermidis, 2) Corynebacterium, 3) Streptococcus mutans, 4) Candida spp. Межмикробные взаимодействия и структура микросимбиоценоза, свойства штаммов были изучены согласно примеру 1.

В результате был построен граф функциональной структуры микросимбиоценоза (рис.3) и таблица результата его анализа (табл.5).

Как видно из таблицы 5, ни одним штаммом не было принято сигналов на усиление ГА, АЛА от штаммов-симбионтов и ни один штамм не отдал сигналов на подавление роста своих симбионтов. Был дан прогноз на отсутствие риска транслокации. Из крови бактерии не были выделены.

На фиг.3 представлены графы межмикробных взаимодействий в биоценозе пародонтального кармана больного Г. по модификации ГА, АЛА и роста, где 1. Staphylococcus epidermidis, 2. Corynebacterium, 3. Streptococcus mutans, 4. Candida spp., штриховой линией обозначено подавление свойства, отсутствие линий - индифферентность. Стрелки обозначают направленность сигналов.

Таким образом, заявляемый способ позволяет прогнозировать транслокацию бактерий в кровь при генерализованном хроническом пародонтите.