ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ АНТИМАЛЯРИЙНОГО СРЕДСТВА И ПРОБИОТИКА

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии и медицине и представляет собой новый противомалярийный препарат на основе противомалярийного средства (примахина или хинина) и биомассы пробиотических штаммов Bacillus subtilis.

Малярия относится к группе трансмиссивных инфекционных заболеваний, передаваемых человеку при укусах комаров рода Anopheles («малярийных комаров») и сопровождающихся лихорадкой, ознобами, спленомегалией (увеличением размеров селезенки), гепатомегалией (увеличением размеров печени), анемией. Характеризуется хроническим рецидивирующим течением. Вызывается паразитическими протистами рода Plasmodium (80-90% случаев - Plasmodium falciparum). Малярия ежегодно вызывает около 350-500 миллионов инфицирований и около 1,3-3 миллиона смертей у людей. Смертность, как ожидается, вырастет вдвое на протяжении следующих 20 лет.

После кратковременного пребывания в крови спорозоиты малярийного плазмодия проникают в гепатоциты печени, давая тем самым начало доклинической печеночной (экзоэритроцитарной) стадии заболевания. В процессе бесполого размножения, называемого шизогонией, из одного спорозоита в итоге образуется от 2000 до 40 000 печеночных мерозоитов, или шизонтов. В большинстве случаев эти дочерние мерозоиты через 1-6 недель снова попадают в кровь.

При инфекциях, вызываемых P.falciparum и P.malariae, печеночная стадия развития паразитов на этом и заканчивается. При инфекциях, вызванных другими видами малярийного плазмодия, «спящие» печеночные стадии (так называемые гипнозоиты) остаются и длительно персистируют в печени, они могут вызывать спустя месяцы и годы после заражения новые рецидивы заболевания и новые эпизоды выхода паразитов в кровь (паразитемии).

Эритроцитарная, или клиническая, стадия малярии начинается с прикрепления попавших в кровь мерозоитов к специфическим рецепторам на поверхности мембраны эритроцитов. Эти рецепторы, служащие мишенями для заражения, по-видимому, различны для разных видов малярийных плазмодиев.

Иммунитет против малярийной инфекции развивается медленно. Он характеризуется малой эффективностью и практически не защищает от повторного инфицирования. Приобретенный иммунитет развивается после нескольких заболеваний малярией за несколько лет. Этот иммунитет специфичен к стадии заболевания, к виду и даже к конкретному штамму малярийного плазмодия. Но клинические проявления и симптомы уменьшаются с развитием специфического противомалярийного иммунитета.

Среди возможных объяснений такого слабого иммунного ответа называют нахождение малярийного плазмодия в клетках на протяжении большей части его жизненного цикла, общее угнетение иммунной системы, присутствие антигенов, которые не опознаются Т-клетками, подавление пролиферации В-клеток, значительный полиморфизм малярийного плазмодия и быстрая смена потенциальных антигенов на его поверхности.

Исходя из клиники заболевания, при заболевании малярией страдают печень, органы кроветворения и снижается иммунитет.

Самым распространенным медикаментом для лечения малярии сегодня, как и раньше, является хинин. На какое-то время он был заменен хлорохином, но с недавнего времени хинин снова приобрел популярность. Причиной этому стало появление в Азии и затем распространение по Африке и другим частям света Plasmodium falciparum с мутацией устойчивости к хлорохину.

Также существует несколько других веществ, которые используются для лечения и иногда для профилактики малярии. Многие из них могут использоваться для обеих целей. Среди них примахин, прогуанил, котрифазид и другие. Их использование зависит преимущественно от устойчивости к ним паразитов в области, где используется тот или другой препарат.

Хинин оказывает сложное и многостороннее действие на организм человека и животных. Смертельной разовой дозой для взрослого человека считается 8 г (1). При лечении малярии (хинин угнетает развитие эритроцитарных фор цизонтов и гамонтов, ингибирует репликацию ДНК) потребляется в сутки в дозе 1-1,2 г хинина, при тяжелом течении 1,5 г в 3 приема в течение 5-7 дней (2).

При назначении хинина существует ряд противопоказаний, при которых применять хинин запрещается. При его применении отмечается ряд побочных эффектов: шум в ушах, ослабление слуха и зрения, рвота, ощущение сердцебиения, тремор конечностей, бессонница, аллергические реакции.

Более современными средствами для лечения малярии являются делагил (хлорохин) или дараприм (пириметамин) - антипротозойные средства, вызывают гибель бесполых эритроцитарных форм всех видов плазмодиев. Делагил является также иммунодепрессивным и антиаритмическим средством.

При назначении делагила также имеются противопоказания (печеночная недостаточность, заболевания органов кроветворения и цнс). Его применение может сопровождаться побочным действием: тошнотой, рвотой, гастралгией, шумом в ушах, уртрикарной сыпью, дерматитом (2). При назначении дараприма отмечаются спазмические боли в животе, сухость во рту и горле, диарея, слабость, депрессия, дерматит (3).

Все противомалярийные препараты с осторожностью применяют у лиц с печеночной или почечной недостаточностью.

Для профилактики побочных осложнений при использовании противомалярийных препаратов, а также для оказания протекторного действия на слизистую желудочно-кишечныого тракта, микробиоценоз кишечника и повышения иммунного статуса организма желательно при прохождении курса лечения от малярии включить препараты-пробиотики.

Препараты-пробиотики предотвращают развитие микроэкологических изменений в кишечнике, которые возникают при развитии любого инфекционного процесса и усугубляются на фоне адекватной химио- или антибиотикотерапии заболевания. При этом происходит снижение колонизационной резистентности слизистой желудочно-кишечного тракта, угнетение функций иммунной системы организма, повышается восприимчивость к инфекционным заболеваниям (4). Наблюдаемое в настоящее время увеличение частоты и тяжести острых инфекционных заболеваний, торпидное течение и хронизация воспалительного процесса, некоторыми исследователями связывается с развивающимися или имевшими место дисбактериозами, сопровождающими основную болезнь. Клинические проявления дисбактериоза могут быть ассоциированы с возникновением аллергодерматозов и нейродермитов с различной степенью выраженности аллергических реакций.

О пользе для здоровья пробиотиков свидетельствует наличие устойчивого рынка разнообразных продуктов, содержащих живые бактерии, а также многочисленные публикации, подтверждающие с научной точки зрения механизмы пробиозиса - выгодного содружества животных организмов с определенными группами автохтонных микроорганизмов. Хотя большинство бактерий, обладающих пробиотическими свойствами, являются представителями семейств Lactobacillus и Bifidobacterium, все чаще в таком качестве стали использоваться и спорообразующие бактерии, в особенности из рода Bacillus.

Такое применение пробиотиков на основе бактерий из рода Bacillus обусловлено их преимуществами перед антибиотиками и химиотерапевтическими препаратами: широкий диапазон лечебно-профилактического действия, безвредность для организма, экологическая безопасность, относительная дешевизна. Пробиотики из бацилл иногда проявляют антагонизм даже в отношении патогенных штаммов, утративших чувствительность к антибиотикам. Если нет глубоких нарушений в слизистой кишечника, то нормофлора может восстановиться после применения споровых пробиотиков самопроизвольно (7).

Поэтому задачей предлагаемого изобретения является создание комплексного противомалярийного препарата, совмещающего антипротозойное действие с пробиотическим эффектом от применения сапрофитных штаммов бактерий из рода Bacillus.

Поставленная задача решается созданием комплексных препаратов на основе противомалярийных средств (хинина и примахина) и пробиотических штаммов микроорганизмов Bacillus subtilis для использования в противомалярийной терапии.

Пример 1. В смеситель загружают 13,5% хинина сульфата, 74,6% вспомогательных веществ и 11,9% бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 12B, входящего в состав Споровита (8), в том числе:

Хинина сульфат - 0,136 кг

Крахмал картофельный - 0,3 кг

Сахар молочный - 0,430 кг

Поливинилпирролидон - 0,02 кг

Перемешивают смесь в течение 3-5 мин и добавляют 0,12 л жидкой бактериальной массы Споровита с содержанием бактерий не менее 1,0×10⁹ кл/мл. Перемешивают до равномерного увлажнения смеси. Увлажненную массу выгружают на лотки, высушивают при температуре 40°C, загружают в ножевую мельницу и просеивают сквозь сита с определенным размером пор. Досушивают полученный гранулят в сушилке до остаточной влажности 1,5-3,0%. При необходимости получения таблеток, из сухого гранулята на машине таблетировочной роторной получают таблетки комбинированного препарата, содержащего Хинин и бактерии штамма В. Subtilis 12 В. Препарат получил название "Хиноспорин-12В".

Готовые таблетки содержат хинин в количестве 0,25 г и биомассу штамма В. Subtilis 12B в количестве не менее 1,0×10⁸ КОЕ.

Пример 2. В смеситель загружают 13,5% хинина сульфата, 74,6% вспомогательных веществ и 11,9% бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 11 В (9), в том числе:

Хинина сульфат - 0,136 кг

Крахмал картофельный - 0,3 кг

Сахар молочный - 0,430 кг

Поливинилпирролидон - 0,02 кг

Перемешивают смесь в течение 3-5 мин и добавляют 0,12 л жидкой бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 11 В с содержанием бактерий не менее 1,0×10⁹ кл/мл. Перемешивают до равномерного увлажнения смеси. Увлажненную массу выгружают на лотки, высушивают при температуре 40°C, загружают в ножевую мельницу и просеивают сквозь сита с определенным размером пор. Досушивают полученный гранулят в сушилке до остаточной влажности 1,5-3,0%. При необходимости получения таблеток, из сухого гранулята на машине таблетировочной роторной получают таблетки комбинированного препарата, содержащего хинин и бактерии штамма В. Subtilis 11B (хиноспорин-11В).

Готовые таблетки содержат хинин в количестве 0,25 г и биомассу штамма В. Subtilis 11B в количестве не менее 1,0×10⁸ КОЕ.

Пример 3. В смеситель загружают 13,5% хинина сульфата, 74,6% вспомогательных веществ и 11,9% бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 3H (10), в том числе:

Хинина сульфат - 0,136 кг

Крахмал картофельный - 0,3 кг

Сахар молочный - 0,430 кг

Поливинилпирролидон - 0,02 кг

Перемешивают смесь в течение 3-5 мин и добавляют 0,12 л жидкой бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 3H с содержанием бактерий не менее 1,0×10⁹ кл/мл. Перемешивают до равномерного увлажнения смеси. Увлажненную массу выгружают на лотки, высушивают при температуре 40°C, загружают в ножевую мельницу и просеивают сквозь сита с определенным размером пор. Досушивают полученный гранулят в сушилке до остаточной влажности 1,5-3,0%. При необходимости получения таблеток, из сухого гранулята на машине таблетировочной роторной получают таблетки комбинированного препарата, содержащего хинин и бактерии штамма В. Subtilis 3H (хиноспорин-3Н).

Готовые таблетки содержат хинин в количестве 0,25 г и биомассу штамма В. Subtilis 3H в количестве не менее 1,0×10⁸ КОЕ.

Пример 4. В смеситель загружают 0,8% примахина дифосфата, 88,5% вспомогательных веществ и 10,7% бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 12B (8), в том числе:

Примахин дифосфат - 0, 009 кг

Крахмал картофельный - 0,231 кг

Сахар молочный - 0,74 кг

Поливинилпирролидон - 0,02 кг

Перемешивают смесь в течение 3-5 мин и добавляют 0,12 л жидкой бактериальной массы штамм Bacillus subtilis 12B с содержанием бактерий не менее 1,0×10⁹ кл/мл. Перемешивают до равномерного увлажнения смеси. Увлажненную массу выгружают на лотки, высушивают при температуре 40°C, загружают в ножевую мельницу и просеивают сквозь сита с определенным размером пор. Досушивают полученный гранулят в сушилке до остаточной влажности 1,5-3,0%. При необходимости получения таблеток, из сухого гранулята на машине таблетировочной роторной получают таблетки комбинированного препарата, содержащего примахин и бактерии штамма Bacillus subtilis 12B. Препарат получил название «Примахиноспорин-12В».

Готовые таблетки содержат примахин в количестве 0,009 г и биомассу штамма В. Subtilis 12B в количестве не менее 1,0×10⁸ КОЕ.

Пример 5. В смеситель загружают 0,8% примахина дифосфата, 88,5% вспомогательных веществ и 10,7% бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 11B (9), в том числе:

Примахин дифосфат - 0,009 кг

Крахмал картофельный - 0,231 кг

Сахар молочный - 0,74 кг

Поливинилпирролидон - 0,02 кг

Перемешивают смесь в течение 3-5 мин и добавляют 0,12 л жидкой бактериальной массы штамм Bacillus subtilis 11B с содержанием бактерий не менее 1,0×10⁹ кл/мл. Перемешивают до равномерного увлажнения смеси. Увлажненную массу выгружают на лотки, высушивают при температуре 40°C, загружают в ножевую мельницу и просеивают сквозь сита с определенным размером пор. Досушивают полученный гранулят в сушилке до остаточной влажности 1,5-3,0%. При необходимости получения таблеток, из сухого гранулята на машине таблетировочной роторной получают таблетки комбинированного препарата, содержащего примахин и бактерии штамма Bacillus subtilis 11В. Препарат получил название «Примахиноспорин-11В».

Готовые таблетки содержат примахин в количестве 0,009 г и биомассу штамма В. Subtilis 11B в количестве не менее 1,0×10⁸ КОЕ.

Пример 6. В смеситель загружают 0,8% примахина дифосфата, 88,5% вспомогательных веществ и 10,7% бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 3H (10), в том числе:

Примахин дифосфат - 0,009 кг

Крахмал картофельный - 0,231 кг

Сахар молочный - 0,74 кг

Поливинилпирролидон - 0,02 кг

Перемешивают смесь в течение 3-5 мин и добавляют 0,12 л жидкой бактериальной массы штамм Bacillus subtilis 3H с содержанием бактерий не менее 1,0×10⁹ кл/мл. Перемешивают до равномерного увлажнения смеси. Увлажненную массу выгружают на лотки, высушивают при температуре 40°C, загружают в ножевую мельницу и просеивают сквозь сита с определенным размером пор. Досушивают полученный гранулят в сушилке до остаточной влажности 1,5-3,0%. При необходимости получения таблеток, из сухого гранулята на машине таблетировочной роторной получают таблетки комбинированного препарата, содержащего примахин и бактерии штамма Bacillus subtilis ЗН. Препарат получил название «Примахиноспорин-3Н».

Готовые таблетки содержат примахин в количестве 0,009 г и биомассу штамма В. Subtilis 3Н в количестве не менее 1,0×10⁸ КОЕ.

Проверяли безвредность полученных препаратов на лабораторных животных. Препараты характеризуются безвредностью (таблица 1).

Для определения безвредности таблетку каждого препарата растворяли в 10 мл физиологического раствора и 0,5 мл вводили перорально мышам. Для каждого варианта опыта использовали не менее 10 мышей массой 16-18 г (таблица 1).

Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания. Испытание показало, что все животные остались живыми, их первоначальная масса увеличилась, отсутствовали какие-либо признаки заболевания.

При непереносимости гамонтоцидных препаратов (хинина и примахина) для лечения больных малярией назначают гамостатические препараты, к которым относятся пириметамин и прогуанил. Выбор препаратов определяется чувствительностью к нему штаммов возбудителя. Назначение противомалярийных препаратов этой группы также вызывают побочные явления: при кратковременном применении пириметамина может отмечаться головная боль, головокружения и диспептические расстройства.

Наиболее тяжелыми проявлениями побочного действия пириметамина, при длительном использовании, могут быть мегалобластическая анемия, лейкопения и тератогенный эффект, что обусловлено антифолиевыми свойствами препарата.

При применении прогуанила у некоторых больных наблюдается преходящее повышение числа нейтрофилов в крови и лейкемоидные реакции. Длительный прием прогуанила натощак сопровождается потерей аппетита, возможно вследствие угнетения желудочной секреции.

Противопоказаниями для применения препаратов этой группы являются нарушения функции печени и почек, беременность и нарушения картины периферической крови.

Для снятия побочных эффектов являлось также целесообразным комбинировать специфические противомалярийные препараты этой группы с пробиотическими штаммами микроорганизмов. В качестве пробиотического штамма был взят штамм Bacillus subtilis 534, используемый для получения препарата "Споробактерин" и штамм Bacillus subtilis 26Д, используемый для получения препарата «Фитоспорин».

Пример 6. В смеситель загружают 1,4% пириметамина, 86,7% вспомогательных веществ и 11,9% бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 534, входящего в состав Споробактерин (11), в том числе:

Пириметамин - 0,014 кг

Крахмал картофельный - 0,435 кг

Сахар молочный - 0,430 кг

Поливинилпирролидон - 0,02 кг

Перемешивают смесь в течение 3-5 мин и добавляют 0,12 л жидкой бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 534 с содержанием бактерий не менее 1,0×10⁹ кл/мл. Перемешивают до равномерного увлажнения смеси. Увлажненную массу выгружают на лотки, высушивают при температуре 40°C, загружают в ножевую мельницу и просеивают сквозь сита с определенным размером пор. Досушивают полученный гранулят в сушилке до остаточной влажности 1,5-3,0%. При необходимости получения таблеток, из сухого гранулята на машине таблетировочной роторной получают таблетки комбинированного препарата, содержащего пириметамин и бактерии штамма В. Subtilis 534. Препарат получил название "Пириметаминоспорин-534".

Готовые таблетки содержат пириметамин в количестве 0,025 г и биомассу штамма В. Subtilis 534 в количестве не менее 1,0×10⁸ КОЕ.

Пример 7. В смеситель загружают 13,5% прогуанила, 74,6% вспомогательных веществ и 11,9% бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 26Д (12), в том числе:

Прогуанила - 0,218 кг

Крахмал картофельный - 0,550 кг

Сахар молочный - 0,635 кг

Поливинилпирролидон - 0,02 кг

Перемешивают смесь в течение 3-5 мин и добавляют 0,12 л жидкой бактериальной массы штамма Bacillus subtilis 26Д с содержанием бактерий не менее 1,0×10⁹ кл/мл. Перемешивают до равномерного увлажнения смеси. Увлажненную массу выгружают на лотки, высушивают при температуре 40°C, загружают в ножевую мельницу и просеивают сквозь сита с определенным размером пор. Досушивают полученный гранулят в сушилке до остаточной влажности 1,5-3,0%. При необходимости получения таблеток, из сухого гранулята на машине таблетировочной роторной получают таблетки комбинированного препарата, содержащего прогуанил и бактерии штамма В. Subtilis 26Д (прогуанилоспорин-26Д).

Готовые таблетки содержат прогуанил в количестве 0,30 г и биомассу штамма В. Subtilis 26Д в количестве не менее 1,0×10⁸ КОЕ.

Проверяли безвредность группы комбинированных препаратов (на основе противомалярийного гамостатического средства и пробиотического штамма) в сравнении с чистыми противомалярийными препаратами, без комплекса с пробиотическими штаммами, на лабораторных животных. Содержание действующего (протовомалярийного вещества) в контроле и в комбинации с пробиотиком было одинаковым, препарат давали однократно.

Для определения безвредности таблетку каждого препарата растворяли в 10 мл физиологического раствора и 0,5 мл вводили перорально мышам. Для каждого варианта опыта использовали не менее 10 мышей массой 16-18 г (таблица 2).

Через 5 дней наблюдения определяли разницу веса мышей до начала опыта и через 5 суток после введения препарата.

Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания. Испытание показало, что при назначении комплексных препаратов (№7 и №8) все животные остались живыми, их первоначальная масса увеличилась, отсутствовали какие-либо признаки заболевания.

Как следует из представленных данных, при введении мышам чистых антималярийных препаратов, без комплекса с пробиотиком, вес мышей через 5 дней наблюдения был заметно ниже, чем при введении мышам комплекса антималярийного препарата с пробиотическим штаммом. При введении мышам чистого хинина и примахина у мышей отмечались диарейные явления в течение 3-4 дней.

Литература

1) Википедия - свободная энциклопедия.

2) Большая российская энциклопедия лекарственных средств, Т2.

3) Энциклопедия лекарств (Регистр лекарственных средств России), 6 издание, 1999 г. (стр 776).

4) Энциклопедия лекарств (Регистр лекарственных средств России), 6 издание, 1999 г. (стр 797).

5) Бондаренко А.В., Бондаренко Вл.М., Бондаренко В.М. Пути совершенствования этиопатогенетической терапии дисбактериозов // Журн. микробиол. - 1998 - №5. - С.96-101.

6) В.Д.Похиленко, В.В.Перелыгин. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность / Новости медицины и фармации в Украине №18 (259), октябрь 2008 г.

7) Данилевская, Н.В. Фаракологические аспекты применения пробиотиков // Ветеринария 2005 - №11. - С.6-10.

8) Байгузина Ф.А., Кузнецова Т.Н., Баданова С.Ч. Патент №2172175 "Лечебно-профилактический биопрепарат", опубл. 20.08.2001 г.

9) Байгузина Ф.А., Кузнецова Т.Н., Байгузина С.Н. Патент №2182172 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности», опубл. 27.04.2002, бюл. №12.

10) Михайлова Н.А., Кузнецова Т.Н., Кунягина О.В. Патент N2130316 «Лечебно-профилактический препарат Бактиспорин», бюл. №14, 1999.

11) Н.А.Михайлова, Т.Н.Кузнецова О.В.Кунягина, А.Ш.Шаяхметов, Ф.А.Шаймухаметов Патент N2056855, «Способ получения препарата Споробактерин».

12) Ф.А.Байгузина, Т.Н.Кузнецова, Г.А.Штроман, Менликеев М.Я., Алсынбаев М.М., Каверин В.В. Патент N2129375 «Биопрепарат фитоспорин жидкий для защиты растений от болезней».