Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ БЕСКИСЛОТНОЙ ДЕКАЛЬЦИНАЦИИ ОБРАЗЦА КОСТНОЙ ТКАНИ ПЕРЕД ГИСТОХИМИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЕМ

Предлагаемое изобретение относится к получению и подготовке образцов для исследования в медицине и может быть использовано при гистологических исследованиях биологических образцов тканей, взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах или при аутопсии.

Существующие сегодня бескислотные способы декальцинации образцов костной ткани (ОКТ) возникли как своеобразная альтернатива кислотной декальцинации, которая имеет ряд недостатков, среди которых набухание коллагеновых волокон и разрыв межтрабекулярных связей, растворение в кислотных растворах важных для исследования клеточных структур и межклеточного вещества, дезактивация ферментов, вследствие которой невозможны дальнейшие гистохимические исследования, образование пузырьков газа, разрывающих межклеточные связи, поэтому именно бескислотная декальцинация рекомендуется для гистохимических исследований ОБК.

Таким образом, способ бескислотной декальцинации должен быть прост и эффективен, дешев и доступен и не повреждать элементы тканей, сохраняя их пригодными для гистохимических исследований.

Из уровня техники известны следующие способы бескислотной декальцинации.

Бескислотная декальцинация с помощью специальных приборов - декальцинаторов, в которых декальцинация производится с помощью электролиза или ультразвука, например, с помощью аппарата Mt Point Sonocool или аппарата U-100. Преимуществом приборов является возможность декальцинирования образцов тканей, чувствительных к нагреву, например, трепанобиоптатов головного или костного мозга. Недостатками таких приборов является высокая вероятность повреждения структуры исследуемых тканей (Цитология: учеб. Пособ. для мед. вузов / сост.: А.Г. Сирак и др. - Ставрополь: Изд-во СтГМУ. 2017. - 88 с) [1].

Следует отметить, что чрезмерный подогрев, мешалки, вакуум, микроволны, ультразвук и воздействие электрического поля могут изменить структуру белковых молекул и повредить антигены, что сделает полученные образцы непригодными для гистохимического исследования.

Известна бескислотная декальцинация солями этилендиаминтетрауксусного ацетата (ЭДТА). ЭДТА и ее натриевые соли (Версен, Секвестрен, Трилон Б, Комплексон-3) относятся к хелатообразующим агентам и имеют свойство формировать легкорастворимые отрицательно заряженные комплексы кальция. ЭДТА и ее соли обычно используют в виде 5-10% водного раствора. Декальцинация проходит быстрее при ежедневной смене раствора. Щелочные растворы в некоторой степени гидролизуют белки, поэтому рекомендуется применять растворы ЭДТА и ее солей в пределах рН 6,5-7,5. Губчатая кость в этих растворах декальцинируется в течение 3-7 сут, компактная кость - в течение 14-25 суток (Гистология, эмбриология, цитология: учеб. / под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 800 с) [2].

Например, известен способ декальцинации Версеном по Хиллеману-Ли (Быков В.Л. Гистология, цитология и эмбриология: атлас: учеб. пособие для вузов / В.Л. Быков, С.И. Юшканцева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. - 296 с) [3]. Смесь состоит из 5,5% раствора Версена, приготовленного на 10% растворе формалина. Перед декальцинацией образцы в течение 24 ч фиксируют в нейтральном формалине. Декальцинирующий раствор обновляют каждые 10 сут.

Критериями хорошей декальцинации костной ткани является полное удаление солей кальция, отсутствие в изучаемых срезах признаков разрушения клеток и соединительнотканных волокон, отсутствие отрицательного влияния декальцинации на процессы окрашивания срезов костной ткани.

Факторы, влияющие на продолжительность декальцинации: концентрация активного агента и температура, при которой протекает процесс декальцинации.

Наиболее близким по технический сути и выбранный в качестве прототипа является бескислотный способ декальцинации ЭДТА по Фрейману (Пешков М.В. Декальцинация в гистологической лабораторной технике. Архив патологии. 2012; 74(6):43-45) [4].

Декальцинирующая жидкость представляет собой 5-10% водный раствор ЭДТА, рН которого доведен с помощью гидроксида натрия до 6,0-7,0. Материал фиксируют в 80% спирте в течение 24 ч при 4°С, затем промывают под проточной водой. Декальцинацию в первые 24 ч проводят при 4°С, затем раствор меняют на свежий, и декальцинация продолжается при комнатной температуре в течение 21 сут.

Недостатки: длительный срок декальцинации (например, декальцинация большеберцовой кости крысы занимает в среднем 4 недели), образование пузырьков газа внутри декальцинируемых образцов костной ткани, вследствие чего повреждаются исследуемые структуры тканей и клеток, что искажает результаты гистохимического исследования.

Задача изобретения - сокращение сроков декальцинации при сохранении всех тканевых и клеточных структур в исследуемом образце костной ткани, пригодном для гистохимического исследования.

Задача изобретения достигнута путем сочетания оптимальной концентрации активного агента (ЭДТА), температуры и вибрации.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемый образец костной ткани фиксируют в 80% спирте в течение 24 ч при 4°С, затем промывают под проточной водой в течение 10 минут. Декальцинацию образца костной ткани проводят в герметичной емкости без смены декальцинирующей жидкости, представляющей собой 10% водный раствор ЭДТА, рН которого доведен с помощью гидроксида натрия до 7,0, при соотношении объема ЭДТА и исследуемого образца костной ткани 150:1 и температуре раствора 38°С, размещенной в течение 6 часов на зуботехническом вибростолике в режиме 1 (колебания низкой частоты и высокой амплитуды) и следующие 6 часов - в режиме 2 (колебания высокой частоты и низкой амплитуды).

Характеристика этапов декальцинации.

10% водный раствор ЭДТА в соотношении объема ЭДТА и образца костной ткани 150:1 выбран для исключения значительного истощения активного декальцинирующего агента при его взаимодействии с кальцием из образца костной ткани.

рН ЭДТА доведен с помощью гидроксида натрия до 7 ед поскольку в пределах определенных ограничений рН растворы реагентов, например, с рН 3,5-4 (кислый) или 7,5 (щелочной) действуют быстрее, но более вредно для обрабатываемых тканей, что делает их непригодными для гистохимического исследования.

Температура раствора 38°С обеспечивает оптимальные параметры декальцинации костного материала без риска денатурации белковых структур, при увеличении температуры, например, до 60°С кость может полностью мацерироваться, а образующийся при мацерации плохо растворимый дикальцийфосфат остается в кости. В то же время при низкой температуре, например, в диапазоне от 4 до 16°С процесс декальцинации значительно замедляется.

Использование вибростолика зуботехнического позволяет предотвратить образование пузырьков газа в декальцинируемом образце костной ткани, благодаря двум диапазонам: в режиме 1 - при колебаниях низкой частоты и высокой амплитуды, в режиме 2-е колебаниями высокой частоты и низкой амплитуды. Принцип действия вибростолика зуботехнического связан с силовым взаимодействием электромагнита с металлической пластиной, в результате которого система начинает совершать механические колебания в горизонтальном и вертикальном направлениях. При помощи двухпозиционного выключателя пользователь устанавливает скорость (интенсивность) действия устройства, соответственно меняется частота/амплитуда колебаний рабочей поверхности. Возможно два рабочих режима: колебания низкой частоты, но высокой амплитуды (режим 1) и колебания высокой частоты и низкой амплитуды (режим 2).

Под колебаниями низкой частоты подразумеваются настройки вибростолика, обеспечивающие частоту колебаний от 30 до 50 Гц, под колебаниями высокой частоты подразумеваются настройки вибростолика, обеспечивающие частоту колебаний в диапазоне от 70 до 90 Гц.

Под низкой амплитудой колебаний подразумеваются настройки вибростолика, обеспечивающие амплитуду колебаний от 0,1 до 0,5 мм, под высокой амплитудой колебаний подразумеваются настройки вибростолика, обеспечивающие амплитуду колебаний от 1 до 2 мм.

Время работы вибростолика зуботехнического в каждом режиме выбрано опытным путем. Возможно использование любого доступного на рынке вибростолика зуботехнического, имеющего требуемые режимы, например, Renfert Vibrax (Германия) или VIBR-X-34 (Италия) или Аверон (Россия).

Возникающий синергический эффект от воздействия 10% водного раствора ЭДТА, рН которого доведен с помощью гидроксида натрия до 7,0, при соотношении ЭДТА и образца костной ткани 150:1, температуре раствора 38°С, размещенной в течение 6 часов на зуботехническом вибростолике в режиме 1 (колебания низкой частоты и высокой амплитуды) и следующие 6 часов - в режиме 2 (колебания высокой частоты и низкой амплитуды), позволяет сократить время полной декальцинации образца костной ткани до 36 часов (24 часа - фиксация в 80% спирте при 4°С, декальцинация в ЭДТА в течение 12 часов), при этом гарантировать сохранность всех тканевых и клеточных структур в исследуемом образце костной ткани, пригодном для гистохимического исследования.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа свидетельствует о соответствии заявленного решения критериям «новизна» и «промышленная применимость».

Результаты поиска показали, что заявляемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, поскольку не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками заявленного технического решения, что обеспечивает решение поставленной технической задачи.

Заявляемые параметры декальцинации определены опытным путем.

С целью отбора наиболее оптимальных параметров, ускоряющих декальцинацию, проведен эксперимент в 3 сериях. Декальцинацию большеберцовых костей крыс осуществляли по описанному выше способу.

В 1 серии эксперимента исследовали эффект ускорения декальцинации при помещении раствора ЭДТА с ОКТ в заявляемых параметрах (рН=7, соотношение жидкости и ткани = 150:1, температура раствора = 38°С) на вибростоликах зуботехнических Renfert Vibrax (Германия), VIBR-X-34 (Италия) и Аверон (Россия) в 2 режимах (1 режим - колебания низкой частоты, но высокой амплитуды, 2 режим - колебания высокой частоты и низкой амплитуды) с длительностью 3 часа работы каждого режима, во 2-ой серии - с длительностью 6 часов каждого, в 3-ей серии - по 12 часов каждого.

Степень декальцинации образцов костной ткани устанавливали на основании субъективных тестов: сгибания кусочка ОКТ, прокола образца тонкой иглой и объективных тестов - микроскопического изучения препаратов кости, окрашенных гематоксилином и эозином.

В результате проведенных исследований установлено оптимальное время для работы каждого режима по 6 часов, обеспечивающее по данным субъективных и объективных тестов полную декальцинацию ОКТ, также установлено отсутствие статистически значимых различий результата от используемого вибростолика зуботехнического - Renfert Vibrax (Германия), VIBR-X-34 (Италия) и Аверон (Россия).

Установление оптимального времени для работы каждого режима и соотношения компонентов декальцинирующего раствора является компромиссом, позволяющим добиться баланса между желаемым результатом, выражающегося в сокращении сроков декальцинации и нежелательным повреждающим действием на ткани, что подтверждено в результате микроскопического изучения препаратов кости, окрашенных гематоксилином и эозином.

Пример практического использования заявляемого способа бескислотной декальцинации костной ткани перед гистохимическим исследованием.

Для экспериментального исследования интенсивности репаративной регенерации кости получен образец костной ткани челюсти барана. После соответствующей подготовки, произведена его декальцинация по заявляемому способу, включающему фиксацию в 80% спирте в течение 24 ч при 4°С, промывке под проточной водой в течение 10 минут, погружение в 10% водный раствор ЭДТА, рН которого доведен с помощью гидроксида натрия до 7,0, при соотношении объема ЭДТА и исследуемого образца костной ткани 150:1 и температуре раствора 38°С, с размещением в течение 6 часов на зуботехническом вибростолике в режиме 1 (колебания низкой частоты и высокой амплитуды) и следующие 6 часов - в режиме 2 (колебания высокой частоты и низкой амплитуды). Полное время декальцинации составило 36 часов.

Образец костной ткани залит в парафин, после чего изготовлены срезы, окрашенные гематоксилином и эозином и по Маллори.

Высокое качество проведенной декальцинации позволило успешно провести планируемую иммуногистохимическую реакцию на антитела к пролиферирующим клеткам стадии интерфазы (Ki-67).

Исследование выполнено в условиях гистохимической лаборатории кафедры гистологии ФГБОУ ВО Ставропольский государственный медицинский университет Минздрава России.

На фигурах изображены отпечатки микрофотограмм образцов челюстной кости экспериментального животного после их декальцинации по заявляемому способу.

На фиг. 1 представлено ремоделирование губчатого компонента кости в ретикулофиброзную ткань (1) с оголением волокнистого компонента матрикса кости, Ki67⁺ клетка (2) возле костных трабекул в зоне контакта с регенератом.

Иммуногистохимическая реакция на Ki67. Продукт реакции коричневого цвета. Ок. 20. Об. 40.

На фиг. 2 представлены Ki67⁺ клетки (3), визуализирующиеся в стенке формирующихся кровеносных сосудов (4) микроциркуляторного русла. Иммуногистохимическая реакция на Ki67. Продукт реакции коричневого цвета. Ок. 10. Об. 40

Полученный результат позволил сократить время декальцинации и точно дифференцировать все исследуемые тканевые и клеточные структуры.

Таким образом, в результате практического использования разработанного способа бескислотной декальцинации образца костной ткани перед гистохимическим исследованием получен технический результат ранее неизвестный, который может быть широко использован в практике. Заявляемое изобретение полностью удовлетворяет основным критериям оценки патентоспособности - новизне, воспроизводимости и промышленной применимости.

Разработанный способ позволяет сократить продолжительность бескислотной декальцинации образцов костной ткани до 36 часов при сохранении всех тканевых и клеточных структур в исследуемом образце костной ткани, пригодном для гистохимического исследования.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Цитология: учеб. Пособ. для мед. вузов / сост.: А.Г. Сирак и др. - Ставрополь: Изд-во СтГМУ. 2017. - 88 с.

2. Гистология, эмбриология, цитология: учеб. / под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 800 с.

3. Быков В.Л. Гистология, цитология и эмбриология: атлас: учеб. пособие для вузов / В.Л. Быков, С.И. Юшканцева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. - 296 с.

4. Пешков М.В. Декальцинация в гистологической лабораторной технике. Архив патологии. 2012; 74(6):43-45.