Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения биопрепарата для коррекции метаболизма у поросят-сосунов

Изобретение относится к биотехнологии в животноводстве и может быть использовано в кормлении сельскохозяйственных животных для коррекции метаболизма и показателей неспецифического иммунитета за счет введения в организм биологически активных веществ (метабиотиков) образующихся в процессе жизнедеятельности микроорганизмов, тормозящих развитие патогенной микрофлоры и стимулирующих развитие полезных микроорганизмов.

В настоящее время в научной литературе имеется недостаточное количество публикаций, посвященных вопросам изучения и биотехнологического производства различных видов биологически активных веществ, продуцируемых преимущественно спорообразующими микроорганизмами, применяемых в кормлении животных. Вместе с тем, проблема системного изучения метаболитов пробиотических бактерий в силу своей сложности еще достаточно далека от окончательного решения. Это касается вопросов синтеза биологически активных веществ при различных условиях культивирования пробиотических микроорганизмов, качественного и количественного состава компонентов биопрепаратов, их взаимоотношений, совершенствования способов выделения и очистки. Культивирование пробиотических организмов происходит в основном на зерновых питательных средах. Отличительной особенностью наших исследований является культивирование пробиотических микроорганизмов на 5-25% среде из мелассы.

Применение мелассы в качестве питательной среды известно при создании кормовой добавки «ЭМ-Вита», которая состоит из смеси штаммов Lactobacillus plantarum 376, Lactobacillus casei МДП-1, Saccharomyces cerevisiae, мелассы и воды. В 1 см³ содержалось не менее 1×107 КОЕ (колониеобразующих единиц) молочнокислых бактерий и 1×104 КОЕ дрожжей (ЗАО «Биопрогресс») [Крапивина Е.В. Продуктивность и иммунный статус организма коров при использовании кормовой добавки «ЭМ-Вита» / Е.В. Крапивина, Д.С. Жук, Д.И. Иванов, А.И. Албулов, Ю.Н. Федоров // Молодой ученый. Казань. - 2015. - №8.3 (88.3). - С. 30-33.], тем не менее кормовая добавка «ЭМ-Вита» не отражает качественный и количественный состав метаболитов лактобактерий. Известна кормовая добавка на основе мелассы с микроэлементами в виде сульфата железа и янтарной кислотой (патент РФ №2554498), при этом меласса используется как кормовое средство и не дополнена пробиотическими микроорганизмами. Недостатком таких препаратов является их относительно невысокая биологическая активность, связанная с процессом дезактивации живых микроорганизмов при их прохождении через верхние отделы ЖКТ (желудок, двенадцатиперстная кишка), а также отсутствие стабильности их биологических свойств при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности применения. Известен препарат, применяемый в медицинской практике - Бактистатин, включающий (мас. %): стерилизованную культуральную жидкость, содержащую метаболиты Bacillus subtilis - 0,1-2,0%; цеолит - 68-85%; гидролизат соевой муки - 15-30%; стеарат кальция - 0,5-5,0%. [Патент РФ №2287335]. Вместе с тем, получение составов указанных препаратов имеет трудоемкие технические сложности и их получение связано с выращиванием пробиотических культур на специальных средах.

Наиболее близким по назначению и совокупности существенных признаков является «Способ получения биологически активной кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птицы с пробиотиком и белком насекомых» (RU 2576200, 27.02.2016). Кормовую добавку готовили, смешивая часть биомассы личинок Hermetia illucens с частью сырого пробиотического продукта, полученного твердофазной ферментацией штамма Bacillus subtilis на стерильном носителе, представляющем собой свекловичный жом, пропитанный питательной средой, содержащей мелассу, соли калия и магния, автолизат дрожжей и воду. Способ обеспечивает повышение продуктивности и сохранности поголовья животных и птиц, стимуляцию обменных и иммунных процессов, однако он технологически сложен, составные части многокомпонентны, а сам процесс состоит из нескольких стадий.

Целью изобретения является получение БАД на основе компонентов биологически активных веществ пробиотических культур для коррекции метаболизма у сельскохозяйственных животных посредством воздействия на состояние микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и показатели неспецифического иммунитета.

Задачей, решаемой авторами, являлось создание эффективного и стабильного биопрепарата для формирования микробиоценоза ЖКТ и повышения неспецифического иммунитета за счет введения в организм веществ биологически активных веществ (метабиотиков), образующихся в процессе жизнедеятельности микроорганизмов, тормозящих развитие патогенной микрофлоры и стимулирующих развитие полезных микроорганизмов. Указанная задача решалась путем создания биопрепарата, в состав которого входят стерилизованная культуральная жидкость мелассы свекловичной (СКЖ), содержащая метаболиты, полученные в результате культивирования штаммов: Clostridium thermocellulociticus, Ruminococcus olbus, Clostridium lochheadii на 5-10-15-25% питательной среде из мелассы, при введении которых в ЖКТ происходит торможение патогенной микрофлоры.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Объектом исследований служила меласса сахарной свеклы 5%-10%-15%-20%-25%. Для ферментации мелассы использовали пробиотические микроорганизмы Clostridium thermocellulociticus, Ruminococcus olbus, Clostridium lochheadii, входящие в состав ферментативного пробиотика Целлобактерин. Для получения бактериального концентрата использовали суточную культуру микроорганизмов, которую стандартизировали до 1×10⁶ КОЕ/см³.

Показатели химического состава мелассы сахарной свеклы, принятой за основу питательной среды за счет достаточного содержания углеводных компонентов для питания микроорганизмов, приведены в таблице 1.

По результатам тестирования ферментационной активности установлена вариабельность массовой доли суммы сбраживаемых сахаров в пределах 53,70%-33,79%, водородного показателя от 6,70 до 3,87 в опытных образцах культивируемых микроорганизмов, что свидетельствует об активности микроорганизмов в питательной среде.

Для приготовления культуральной жидкости взвешивали соответствующую процентной концентрации массовую долю мелассы свекловичной (5,0 г, 10,0 г, 15,0 г, 20,0 г, 25,0 г) в 0,5 л колбе. Доводили объем до 100,0 мл дистиллированной водой. Стерилизовали на водяной бане в течение 35-45 минут при температуре 85-90°С. После стерилизации питательную среду фильтровали и добавляли 1 мл бактериального концентрата суточной культуры микроорганизмов, которую стандартизировали до 1×10⁶ КОЕ/см³. Культивирование проводили в термостате в течение 10 суток при температуре 37°С. При получении биологически активной добавки обеспечивается постоянство биохимических характеристик состава, исключается последующее появление в конечном продукте живых клеток продуцента за счет пастеризации при температуре от 90°С до 22°С в течение 35 минут.

Проведенные исследования позволяют отметить вариабельность динамики колониеобразующих единиц (КОЕ 10⁶) пробиотических микроорганизмов по отношению к питательной среде, которой являлась меласса в различной концентрации (фиг.).

При ферментации патоки комплексом пробиотических микроорганизмов Целлобактерин максимальное значение КОЕ 9,5×10⁶ КОЕ/см³ в 20% мелассе достигается на 2-3 сутки, минимальное 5×10⁶ КОЕ/см³ в 25% мелассе, это связано с определенным видом микроорганизма и специфичностью его метаболизма: отмечается резкое увеличение и затем снижение численности. При использовании Целлобактерина повторное нарастание численности КОЕ отмечалось на четвертые сутки (1,3-3×10⁶ КОЕ/см³) и достигало максимума на восьмые сутки (9,9×10⁶ КОЕ/см³) при концентрации мелассы в 15%. При ферментации данным пробиотиком наиболее оптимальная концентрация мелассы, по нашему мнению, является 15%, так как обеспечивала наибольшую численность КОЕ за счет ферментации менее доступных питательных веществ с 4 до 8 суток.

Таким образом, установлено, что количество пробиотических микроорганизмов, входящих в состав ферментативного пробиотика Целлобактерин на восьмые сутки в 15%-ной питательной среде на основе мелассы, составляет 9,9×10⁶ КОЕ/см³.

Анализ показателей, приведенных в таблице 2, позволяет отметить продуцирование метабиотиков у всех культивируемых микроорганимов. Известно, что аминокислоты на 16% состоят из азота, это является их основным химическим отличием от двух других важнейших элементов питания - углеводов и жиров. Каждый белок в организме уникален и существует для специальных целей. Белки не являются взаимозаменяемыми. Они синтезируются в организме из аминокислот, которые образуются в результате расщепления белков, находящихся в пищевых продуктах.

Таким образом, именно аминокислоты, а не сами белки являются наиболее ценными элементами питания, что особенно важно при разработке биологически активных добавок для формирования микробиоценоза и неспецифического иммунитета у животных. При этом следует учитывать взаимосвязь метаболизма и формирования иммунитета в целом. В исследованиях установлена значительная активность комплекса микроорганизмов Clostridium thermocellulociticus, Ruminococcus olbus, Clostridium lochheadii. Обращает внимание факт значительного увеличения синтеза аминокислот комплексом пробиотических микроорганизмов, входящих в ферментативный пробиотик Целлобактерин, по отношению к контролю. Следует отметить, что аминокислоты переходят в мелассу из свеклы на 50-60%. В исследованиях установлено значительное превышение показателей по Аргинину в 2,8 раза, Тирозину в 57,7 раза, Лейцин+изолейцину 3,9 раз, и другим незаменимым и условно заменимым аминокислотам, что свидетельствует о значительной активности пробиотических микроорганизмов в питательной среде (табл. 2).

Следует отметить, что культуральная жидкость питательной среды из мелассы является адекватной для синтеза аминокислот, в том числе и незаменимых, некоторых витаминов и органических кислот культивируемых видов пробиотических микроорганизмов, что является основой для созданий биологически активной добавки.

В результате проведенных исследований установлена возможность получения метабиотиков пробиотических микроорганизмов при культивировании их на питательной среде из свекловичной мелассы. Культивирование пробиотических микроорганизмов, входящих в состав ферментативного пробиотика Целлобактерин, наиболее эффективно в 15%-ной среде из мелассы. По результатам тестирования установлена вариабельность массовой доли суммы сбраживаемых Сахаров в пределах 53,70%-33,79%, водородного показателя от 6,70 до 3,87 в опытных образцах культивируемых микроорганизмов, что свидетельствует об активном метаболизме микроорганизмов в питательной среде.

Пример 2

Клинические исследования биопрепарата проведены на 30 здоровых поросятах-сосунах 23-25-дневного возраста в период подготовки к отъему и в 60-суточном возрасте при применении комбикорма СК-5. Были сформированы две группы поросят по 15 голов в каждой. Первая группа контрольная, поросятам 2 группы дополнительно один раз в 7 суток выпаивали заявляемый биопрепарат на основе Clostridium thermocellulociticus, Ruminococcus olbus, Clostridium lochheadii в количестве не менее 10⁹ КОЕ/гол. Отбор содержимого толстого отдела кишечника от трех поросят из каждой группы для бактериологических исследований при соблюдении стерильности проводили в 60-суточном возрасте.

Известно, что ранний отъем является мощным стрессовым фактором для организма. При этом полный перевод поросят-отъемышей на растительные комбикорма в 60-суточном возрасте часто вызывает активизацию условно-патогенной микрофлоры и различные заболевания пищеварительной системы, приводящие к нарушению в качественном составе и количественном соотношении кишечной микрофлоры. В период перевода поросят-отъемышей на растительные комбикорма наиболее целесообразно применение пробиотических кормовых добавок, а также биологически активных компонентов (метабиотиков) пробиотических микроорганизмов. Проведенные исследования в 60-суточном возрасте (табл. 3) позволяют отметить, что наблюдается тенденция изменения кишечной микрофлоры с явлениями относительного неблагополучия микробиоценоза. Установлено снижение КОЕ/г лактобактерий 10³, увеличение стафилококков и клостридий до 10⁶ и 10⁷, незначительного увеличения другой условно-патогенной микрофлоры. Вместе с тем содержание бифидобактерий 105 остается на достаточном уровне. При этом в опытной группе также наблюдается естественное снижение бифидум- и лактобактерий, связанное со сменой рациона, но их количество >10⁷ и 10⁵ - существенно выше, чем в контроле. Также в опытной группе отмечено меньшее количество условно патогенной микрофлоры, чем в контроле.

Не менее важна роль нормальной микрофлоры как антигенного стимулятора иммунной системы, отсутствие нормального микробного биоценоза вызывает многочисленные ее дисфункции, а у поросят-сосунов отмечают недоразвитие основных иммунокомпетентных органов. При нормальной колонизации многочисленные микробы индуцируют образование низких титров антител, мишенью которых вряд ли являются конкретные виды. Эти антитела - преимущественно Ig класса А, выделяющиеся на поверхность слизистых оболочек.

Рассматривая отдельно динамику Т- и В-лимфоцитов (таблица 4) следует отметить, что в первые дни жизни поросят основную массу среди лимфоцитов составляли Т-клетки. По мере повышения возраста поросят идет достоверное увеличение абсолютного числа В-лимфоцитов и положительная тенденция увеличения Т-хелперных клеток. Вместе с тем клеточные факторы иммунитета дают объективное представление о взаимосвязи микробиоценоза кишечника и показателей неспецифического иммунитета организма животных.