Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ФЕРМЕНТАЦИИ УГЛЕВОДОВ БАКТЕРИЯМИ ESCHERICHIA COLI

Изобретение относится к способу ускорения биохимических процессов микроорганизмами и может быть использовано в различных областях биотехнологического синтеза.

Известен способ ферментации углеводов микроорганизмами [SU 1090717 Α1, МПК C12Q 1/04(2006.01), опубл. 07.05.1984], включающий посев чистой культуры бактерий P.aeruginosa, Staphylococcus aureus в пробирки с питательной средой, содержащей никотиновую кислоту, хлористый кальций, сернокислый магний, сернокислое железо, углевод, хлористый натрий, фосфорнокислый двузамещенный калий, бромтимоловый голубой и дистиллированную воду, с последующим созданием в пробирке анаэробных условий, инкубированием посевов и определением ферментации по изменению окраски среды.

Этот способ требует использования многокомпонентной питательной среды и длительного периода времени.

Известен способ ферментации углеводов [ГОСТ 30726-2001], таких как сорбит, лактоза и глюкоза, выбранный в качестве прототипа, который включает посев чистой культуры Escherichia coli в пробирки с питательной средой или Кларка, или Гисса, последующее инкубирование и учет ферментации по изменению цвета среды.

Однако, учет ферментации только по изменению цвета среды не является количественным показателем процесса.

Технический результат предложенного изобретения заключается в создании способа ферментации углеводов бактериями Escherichia coli, позволяющего ускорить процесс ферментации, и провести его количественный учет.

Предложенный способ ферментации углеводов, также как в прототипе, включает посев чистой культуры Escherichia coli на стерильную питательную среду, инкубирование и учет ферментации по изменению цвета культуральной среды.

Согласно изобретению, до стерилизации питательной среды в нее вносят навеску порошка сукцината лития в количестве 5-20 ммоль/дм³, а учет ферментации дополнительно проводят по изменению рН.

Если углеводом является глюкоза, то в качестве питательной среды используют среду Кларка.

Если углеводом является лактоза или сорбит, то в качестве питательной среды используют среду Гисса.

Добавление сукцината лития в питательную среду в концентрации 5-20 ммоль/дм³ приводит к сокращению времени ферментации глюкозы до 49 с и к изменению рН культуральной среды до 4; к сокращению времени ферментации лактозы до 39 с при изменении рН культуральной среды до 6; к сокращению времени ферментации сорбита до 8 с при изменении рН культуральной среды до 6.

Достигаемый эффект ускорения процесса ферментации выявлен впервые и является перспективным для использования в биотехнологических процессах.

В таблице 1 представлены результаты ферментации глюкозы бактериями Escherichia coli.

В таблице 2 представлены результаты ферментации лактозы бактериями Escherichia coli.

В таблице 3 представлены результаты ферментации сорбита бактериями Escherichia coli.

Пример 1. Способ ферментации глюкозы.

Музейный штамм бактерий Escherichia coli АТСС25922 предварительно культивировали на мясопептонном агаре (Merck) в течение 24 часов при температуре 37°С в термостате-шейкере WiseCube. Из выращенной культуры готовили водную суспензию с плотностью бактерий 10⁸ КОЕ/мл согласно стандарту Макфарланда №3.

Параллельно приготовили питательную среду Кларка. Для этого в 1 дм³ дистиллированной воды при нагревании растворили 5,0 г пептона, 5,0 г глюкозы, 5,0 г фосфорнокислого двузамещенного калия, затем охладили до 47°С и установили рН 7,2 [ГОСТ 30726-2001]. Полученную среду разлили по 4 см³ в каждую из 8 пробирок.

Затем в 6 пробирок с питательной средой Кларка добавили навеску порошка сукцината лития (BLD Pharm) в количестве 5 ммоль/дм³, 10 ммоль/дм³ и 20 ммоль/дм³ (по две пробирки на каждую концентрацию).

Подготовленные 8 пробирок с содержимым простерилизовали при температуре 121°С в течение 15 мин.

После этого в каждую пробирку добавили по 1 см³ ранее полученной суспензии бактерий Escherichia coli.

Две пробирки, содержащие стерильную питательную среду Кларка без сукцината лития и суспензию бактерий Escherichia coli, использовали для контроля.

Инкубирование бактерий Escherichia coli во всех 8 пробирках проводили в термостате-шейкере WiseCube при температуре 37°С со скоростью вращения 100 об/мин в течение 48 часов.

После этого в каждую пробирку добавили по 5 капель реактива Кларка, полученного при растворении 0,1 г метилового красного в 300 см³ этилового спирта с последующим добавлением 200 см³ дистиллированной воды [ГОСТ 30726-2001].

Контроль ферментации глюкозы бактериями Escherichia coli в каждой пробирке осуществляли визуально по изменению окраски и с использованием универсальной индикаторной бумаги НПО Экрос (рН 0-12) в течение 1 мин.

Присутствие сукцината лития в концентрации 5-20 ммоль/дм³ (таблица 1) в питательной среде Кларка приводит к уменьшению времени ферментации глюкозы до 57-49 с изменением окраски культуральной среды с красной в ярко-оранжевую. рН культуральной среды снизилась в 1,25 раза с 5 до 4.

Пример 2. Способ ферментации лактозы.

Музейный штамм бактерий Escherichia coli АТСС25922 предварительно культивировали на мясопептонном агаре (Merck) в течение 24 часов при температуре 37°С в термостате-шейкере WiseCube. Из выращенной культуры готовили водную суспензию с плотностью бактерий 10⁸ КОЕ/мл согласно стандарту Макфарланда №3.

Параллельно приготовили питательную среду Гисса с лактозой. Для этого в 1 дм³ дистиллированной воды при нагревании растворили 10,0 г пептона, 5,0 г хлористого натрия, далее отфильтровали через бумажный фильтр и прибавили 10,0 г лактозы, затем охладили до 47°С, установили рН 7,2 и внесли 10,0 см³ раствора индикатора Андреде, полученного при растворении 0,5 г кислого фуксина в 100 см³ дистиллированной воды с последующим добавлением 16,4 см³ раствора гидроокиси натрия с концентрацией 1 моль/ дм³ и простерилизованного при температуре 100°С в течение 5 минут [ГОСТ 10444.1-84]. Полученную среду разлили по 4 см³ в 8 пробирок.

Затем в 6 пробирок с питательной средой Гисса добавили навеску порошка сукцината лития (BLD Pharm) в количестве 5 ммоль/дм³, 10 ммоль/дм³ и 20 ммоль/дм³ (по две пробирки на каждую концентрацию).

Подготовленные 8 пробирок с содержимым простерилизовали при температуре 121°С в течение 15 мин.

После этого в каждую пробирку добавили по 1 см³ ранее полученной суспензии бактерий Escherichia coli.

Две пробирки, содержащие стерильную питательную среду Гисса без сукцината лития и суспензию бактерий Escherichia coli, использовали для контроля.

Инкубирование бактерий Escherichia coli во всех 8 пробирках проводили в термостате-шейкере WiseCube при температуре 44°С со скоростью вращения 100 об/мин в течение 24 часов.

Контроль ферментации лактозы бактериями Escherichia coli в каждой пробирке осуществляли визуально по изменению окраски и с использованием универсальной индикаторной бумаги НПО Экрос (рН 0-12) в течение 1 мин.

Присутствие сукцината лития в концентрации 5-20 ммоль/дм³ (таблица 2) в питательной среде Гисса приводит к уменьшению времени ферментации лактозы до 39 с с изменением окраски культуральной среды с соломенно-желтой в светло-желтую. рН культуральной среды снизилась в 1,17 раза с 7 до 6.

Пример 3. Способ ферментации сорбита.

Музейный штамм бактерий Escherichia coli АТСС25922 предварительно культивировали на мясопептонном агаре (Merck) в течение 24 часов при температуре 37°С в термостате-шейкере WiseCube. Из выращенной культуры готовили водную суспензию с плотностью бактерий 10⁸ КОЕ/мл согласно стандарту Макфарланда №3.

Параллельно приготовили питательную среду Гисса с сорбитом. Для этого в 1 дм³ дистиллированной воды при нагревании растворили 10,0 г пептона, 5,0 г хлористого натрия, далее отфильтровали через бумажный фильтр и прибавили 10,0 г сорбита, затем охладили до 47°С, установили рН 7,2 и внесли 10,0 см³ раствора индикатора Андреде, полученного при растворении 0,5 г кислого фуксина в 100 см³ дистиллированной воды с последующим добавлением 16,4 см³ раствора гидроокиси натрия с концентрацией 1 моль/ дм³ и простерилизованного при температуре 100°С в течение 5 минут [ГОСТ 10444.1-84]. Полученную среду разлили по 4 см³ в каждую из 8 пробирок.

Затем в 6 пробирок с питательной средой Гисса добавили навеску порошка сукцината лития (BLD Pharm) в количестве 5 ммоль/дм³, 10 ммоль/дм³ и 20 ммоль/дм³ (по две пробирки на каждую концентрацию).

Подготовленные 8 пробирок с содержимым простерилизовали при температуре 121°С в течение 15 мин.

После этого в каждую пробирку внесли по 1 см³ ранее полученной суспензии бактерий Escherichia coli.

Две пробирки, содержащие стерильную питательную среду Гисса без сукцината лития и суспензию бактерий Escherichia coli, использовали для контроля.

Инкубирование бактерий Escherichia coli во всех 8 пробирках проводили в термостате-шейкере WiseCube при температуре 370°С со скоростью вращения 100 об/мин в течение 24 часов.

Контроль ферментации сорбита бактериями Escherichia coli в каждой пробирке осуществляли визуально по изменению окраски и с использованием универсальной индикаторной бумаги НПО Экрос (рН 0-12) в течение 1 мин.

Присутствие сукцината лития в концентрации 5-20 ммоль/дм³ (таблица 3) в питательной среде Гисса приводит к уменьшению времени ферментации сорбита до 8 с с изменением окраски культуральной среды с соломенно-желтой в оранжевую. рН культуральной среды снизилась в 1,17 раза с 7 до 6.