Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекулярной диагностике, и может быть использовано в пищевой промышленности для видовой идентификации рыб семейства тресковых (Gadidae) в пищевых продуктах и продовольственном сырье.

Cуществуют стандарты, регламентирующие видовую идентификацию рыб, в том числе семейства тресковых способами электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [ГОСТ Р 54414-2011 Видовая идентификация рыбы методом электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2013.], изоэлектрофокусировки [ГОСТ Р 52840-2007 Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2008.] и секвенирования [ГОСТ 34106-2017 Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции. Москва, Стандартинформ, 2017.].

Однако, эти способы по сравнению с ПЦР в режиме реального времени более трудоемки и времязатратны, требуют наличия у персонала специальных навыков, более сложного оборудования и наличия стандартных образцов для каждого вида рыб.

Известен подход к видовой идентификации тресковых рыб [Namikoshi, A., Takashima, Y., Iguchi, J., Yanagimoto, T., &Yamashita, M. (2011). Species identification of Alaska pollock, Gadus spp., and Micromesistius spp. in cod roe products using a PCR-based method.FisheriesScience, 77(4), 671-678.], основанный на детекции видоспецифической ДНК методом ПЦР. Тест-системы, описанные в этой научной работе, в качестве метода регистрации результата используют гель-электрофорез, что существенно усложняет анализ и увеличивает время, необходимое для его проведения.

Технической задачей настоящего изобретения является идентификация рыб семейства тресковых с помощью обнаружения специфических ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени».

Способ основан на выявлении специфических участков генапантофизина, NADH-дегидрогеназы, АТФазы 6 и родопсина с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов. Разработанные олигонуклеотиды имеют следующие последовательности:

Для проведения ПЦР используют геномную ДНК рыб. Для выделения ДНК используют готовые наборы реактивов, предназначенные для работы с пищевыми продуктами и продовольственным сырьем. Выделение ДНК осуществляют из кусочков филе рыб или образца продукта питания, не имевших контакта с внешней средой (с целью избежать возможной исходной контаминации чужеродной ДНК) в соответствии с протоколом (инструкцией по применению), рекомендованным производителем.

Оценку чистоты полученных препаратов ДНК производят спектрофотометрическим методом с помощью спектрофотометра, позволяющего измерять оптическую плотность при длинах волн 260 и 280 нм. Для анализа используют препараты ДНК с соотношением оптической плотности при длинах волн 260 нм и 280 нм (A260/A280) в пределах 1,8-2,0. Полученные препараты ДНК хранят в морозильной камере при −20°С до использования.

Для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени» используют амплификатор нуклеиновых кислот, позволяющий осуществлять термоциклирование и одновременную регистрацию флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» в формате микропробирок, микрочипов или микропланшетов.

Разработанный состав смеси для ПЦР и концентрации отдельных компонентов представлены в таблице.

Объем реакции может быть масштабирован в соответствии с типом используемого оборудования (амплификатора нуклеиновых кислот).

Для корректной работы тест-систем используется следующая программа термоциклирования:

Первичная денатурация - 120с при 94°С с последующим циклированием: денатурация - 5с при 94°С, отжиг праймеров и элонгация - 30с при 60°С (45 циклов). Регистрация сигнала осуществляется после прохождения этапа отжига праймеров и элонгации.

Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривойфлуоресценции с установленной пороговой линией (Threshold) и значения порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора, следующим образом:

1. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30.

2. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают обнаруженной, если одновременно выполняются следующие условия:

- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) значение порогового цикла не превышают 30;

- в пробирках/реакторах с тест-системами для определения путассу (Micromesisteus poutassou) и сайды (Pollachius virens) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30.

3. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, Melanogrammus aeglefinus) считают не обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышает 30.

4. ДНК пикши (Melanogrammus aeglefinus) считают не обнаруженной, если выполняется хотя бы одно из следующих условий:

- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышают 30;

- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) и сайды (Pollachius virens);

- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши (Melanogrammus aeglefinus) и путассу (Micromesisteus poutassou).

Разработанный способ видовой идентификации тресковых рыб по сравнению с существующими методами обладает следующими преимуществами:

- возможность идентификации основных промысловых видов тресковых рыб;

- идентификация всех заявленных видов тресковых рыб в рамках одного анализа за счет оптимизированных последовательностей специфических олигонуклеотидов и унифицированной программы термоциклирования;

- ускоренное по сравнению с существующими способами получение результата анализа.

--->

Перечень последовательностей

<110> Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит"

<120> СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ МЕТОДОМ ПЦР

В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

<140> 2020133599

<141> 13.10.2020

<160> 21

<210> 1

<211> 26

<212>ДНК

<213>Gadus macrocephalus

<400> 1

atgtgtcagattataccagttaattc

<210>2

<211> 24

<212>ДНК

<213>Gadus macrocephalus

<400> 2

gttggttaaattgtataacaagga

<210>3

<211> 22

<212>ДНК

<213>Gadus macrocephalus

<400>3

tctgggcgtgacctcaacacta

<210> 4

<211> 24

<212>ДНК

<213>Gadus morhua

<400> 4

caatgttaatgtttctcctacttt

<210>5

<211> 20

<212>ДНК

<213>Gadus morhua

<400> 5

tgacgaagtgtagttgccaa

<210>6

<211> 24

<212>ДНК

<213>Gadus morhua

<400> 6

cagcatccttaccaagtccctacc

<210> 7

<211> 23

<212>ДНК

<213>Gadus chalcogrammus

<400> 7

gcaatgttaatgtttctcctact

<210>8

<211> 22

<212>ДНК

<213>Gadus chalcogrammus

<400> 8

agttagttgccaataaggaaag

<210> 9

<211> 25

<212>ДНК

<213>Gadus chalcogrammus

<400> 9

cagcattcttacacagtccctacct

<210> 10

<211> 20

<212>ДНК

<213>Melanogrammus aeglefinus

<400>10

aatttaggcttagctgttcc

<210>11

<211> 20

<212>ДНК

<213>Melanogrammus aeglefinus

<400>11

gaattagagctgtaggggtg

<210>12

<211> 27

<212>ДНК

<213>Melanogrammus aeglefinus

<400>12

tagcaactgttcttattggaatacgaa

<210>13

<211> 22

<212>ДНК

<213>Micromesisteus poutassou

<400>13

actctcctggttgattgatatt

<210>14

<211> 20

<212>ДНК

<213>Micromesisteus poutassou

<400>14

ctatacaggtgttggaagcc

<210>15

<211> 26

<212>ДНК

<213>Micromesisteus poutassou

<400> 15

cttgtttcttagattgatgcagcatt

<210>16

<211> 21

<212>ДНК

<213>Pollachius virens

<400> 16

gtttgtgctatcatacccatc

<210>17

<211> 20

<212>ДНК

<213>Pollachius virens

<400> 17

ggactttgtaagaatgctgc

<210>18

<211> 22

<212>ДНК

<213>Pollachius virens

<400> 18

ctcctaaatcgtggctggttga

<210>19

<211> 16

<212>ДНК

<213>Merlangius merlangus

<400>19

tacacccgcgctgagg

<210>20

<211> 20

<212>ДНК

<213>Merlangius merlangus

<400>20

gtagatggacgaggacttgg

<210>21

<211> 20

<212>ДНК

<213>Merlangius merlangus

<400>21

agatgggaccgaagacgctg

<---