Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения сухого солянокислого гидролизата казеина

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве питательной среды для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (АМП).

Неуклонный рост инфекций, вызванных устойчивыми к АМП штаммами микроорганизмов, и снижение эффективности АМП, используемых для лечения, является одной из важнейших проблем современного здравоохранения во всем мире. Для сдерживания роста инфекций, обусловленных резистентными штаммами, необходимо назначение АМП для лечения осуществлять строго на основе результатов определения чувствительности к ним возбудителя.

Определение чувствительности микроорганизмов к АМП проводят несколькими методами, среди которых диско-диффузионный метод является самым распространенным во всем мире из-за его дешевизны и простоты выполнения. На основании результатов, полученных данным методом, возбудитель классифицируется как чувствительный или устойчивый к тому или иному АМП.

Для выполнения диско-диффузионного метода и получения достоверных результатов необходимо использовать питательную среду со строго определенными физико-химическими свойствами, описанными в международном стандарте ISO/TS 16782:2016 (Clinical laboratory testing - Criteria for acceptable lots of dehydrated Mueller-Hinton agar and broth for antimicrobial susceptibility testing), которая удовлетворяет как отечественным (Клинические рекомендации по определению чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам), так и международным стандартам по определению чувствительности EUCAST и CLSI.

В соответствии с ISO/TS 16782:2016 приемлемость питательной среды для исследования определяют при ее тестировании с использованием контрольных штаммов и дисков с АМП. Результаты тестирования должны соответствовать определенным критериям, которые выражаются в значениях диаметров зон подавления роста, для каждой комбинации АМП и контрольного штамма.

Для выполнения этих требований питательная среда должна соответствовать следующим показателям качества:

1. иметь значение рН, равное 7,2-7,4, поскольку активность некоторых АМП, например, тетрациклина, ампициллина, карбенициллина, тобрамицина и др. зависит от величины рН;

2. иметь достаточные концентрации катионов, чтобы обеспечить адекватный рост тест-штаммов и получение зон подавления роста для каждой комбинации контрольный штамм - АМП, значения диаметров которых укладываются в требуемый стандартами диапазон:

a. концентрация ионов кальция и магния влияет на результаты определения чувствительности микроорганизмов к аминогликозидам. О сбалансированном содержании в составе питательной среды кальция и магния можно косвенно судить по значению диаметра зоны подавления роста тест-штамма Pseudomonas aeruginosa WDCM 00025 (соответствует P. aeruginosa АТСС 27853) вокруг диска с гентамицином (10 мкг), которое должно находится в диапазоне от 17 мм до 23 мм;

b. концентрация марганца должна быть ниже 8,0 мг/л, чтобы избежать интерпретации результатов как ложно устойчивые к новому классу антибиотиков - глицилциклинам. Косвенно о содержании марганца в питательной среде в концентрации не более 8,0 мг/л можно судить по величине диаметра зоны подавления роста в приемлемом диапазоне (20-27) мм, полученным путем испытания Escherichia coli WDCM 00013 (соответствует Escherichia coli АТСС 25922) с тигециклином (15 мкг);

с. концентрация цинка должна быть ниже 3,0 мг/л, чтобы избежать интерпретации результатов как ложно устойчивые к карбапенемам. Косвенно об этом свидетельствует значение диаметра зоны для комбинации P. aeruginosa АТСС 27853 - имипенем (10 мкг);

3. иметь концентрацию тимидина менее 0,03 мг/л, так как присутствие тимидина в питательной среде оказывает влияние на результаты чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидным препаратам. О содержании тимидина в питательной среде в концентрации не более 0,03 мг/л можно косвенно судить по четкой зоне подавления роста тест-штамма E. faecalis WDCM 00210 (соответствует Е. faecalis АТСС 33186) вокруг триметоприм/сульфаметоксазола (1,25/23,75 мкг), значение диаметра которой должно быть больше или равно 20 мм или по значению диаметра зоны подавления роста тест-штамма E. faecalis WDCM 00087 (соответствует Е. faecalis АТСС 29212), которое соответствует интервалу значений (26-32) мм.

В соответствии с ISO/TS 16782:2016, питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к АПМ состоит из следующих компонентов:

- кислотный гидролизат казеина - 17,5 г/л;

- мясной экстракт - 2,0 г/л;

- крахмал - 1,5 г/л;

- агар бактериологический - 12,0 г/л - 17,0 г/л (концентрация варьирует в зависимости от прочности агара).

Предварительными испытаниями показано, что качество питательной среды для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам, определяется, в основном, качеством используемого гидролизата казеина.

В РФ в настоящее время отсутствует промышленное производство гидролизата данного назначения. На основе коммерчески доступных гидролизатов казеина иностранного производства приготовили два экспериментальных варианта питательной среды для определения чувствительности микроорганизмов к АМП. Оба варианта содержали 2,0 г/л мясного экстракта (Conda Pronadisa, кат. №1700), 12,0 г/л бактериологического агара европейского типа (Conda Pronadisa, кат. №1800), 1,5 г/л крахмала растворимого (амилодекстрин) по ГОСТ 10163-76 (ООО «Химприбор-СПб»). Вариант №1 дополнительно содержал 17,5 г/л Bacto casamino Acid, Technical (Acid-Hydrolyzed casein) (BD Difco, кат. №223120), а вариант №2 - 17,5 г/л Casein Acid Hydrolysate, Technical (HiMedia, кат. № RM 013).

Использование обоих вариантов среды №1 и №2 обеспечивало равномерный рост тест-штаммов, но приводило к получению значений диаметров зон подавления роста тест-штаммов вокруг АМП, не удовлетворяющих требованиям нормативных документов. Результаты представлены в табл. 1. Для сравнения в табл. 1 также представлены характеристики двух коммерческих питательных сред Mueller Hinton II Agar (BD BBL, кат. №6103881) и Mueller Hinton Agar №2 (HiMedia, кат. №M 173).

Как видно из табл. 1, значения рН экспериментальных вариантов №1 и №2 находились в диапазоне 6,8-6,9, что значительно отличается от требуемого. Поэтому в процессе приготовления этих сред необходимо было дополнительно корректировать значение рН внесением раствора гидроксида натрия. Для коммерческих питательных сред необходимости корректировки рН не возникало.

Из табл. 1 также видно, что зоны подавления роста Е. faecalis АТСС 29212 вокруг дисков с триметопримом/ сульфаметоксазолом на экспериментальных вариантах №1 и №2, в отличие от обеих коммерческих питательных сред, отсутствовали, что не соответствует требованиям ISO/TS 16782:2016. Для других комбинаций тест-штамм - АМП зоны соответствовали требованиям.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения кислотного гидролизата казеина по методу Мюллера и Джонсона (Mueller Н., Johnson Е.R. Acid Hydrolysates of Casein to Replace Peptone in the Preparation of Bacteriological Media. // The Journal of Immunology. - 1941. - T. 40, №1. - C. 33-39.), который используется при производстве питательной среды для определения чувствительности микроорганизмов к АМП [Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media. Second edition / M.J. Zimbo (ei. al.). - USA: Sparks, 2009. - 126 с.]. Метод включал в себя гидролиз казеина 8 N соляной кислотой в течение 10 часов при температуре 48°С. Удаление хлор-ионов проводят при помощи перегонки под вакуумом до полного прекращения выделения HCl. После этого корректируют рН до 5,0 при помощи 36% раствора гидроксида натрия. При данном значении рН гидролизат казеина освобождают от избытка железа при помощи обработки его либо оксидом, либо гидроксидом кальция. Затем гидролизат казеина осветляют при помощи активированного угля и фильтруют. После освобождения гидролизата казеина от избытка железа проводят осаждения кальция. Для этого обрабатывают его раствором гидрофосфата натрия и дигидрофосфата калия (140 г Na₂HPO₄×12H₂O и 57 г KH₂PO₄ растворяют в 300 мл дистиллированной воды) при значении рН гидролизата казеина около 7,6, установленном при помощи 36% раствора гидроксида натрия. Нагревают полученный раствор до температуры 85°С и горячим фильтруют. Готовый гидролизат казеина имел степень расщепления около 76%, содержание аминного азота и хлор-ионов - 5,1 и 20,2, соответственно.

Способ получения кислотного гидролизата казеина по методу Мюллера и Джонсона имеет следующие недостатки:

1. Длительность процесса гидролиза казеина.

2. Устранения хлор-ионов путем перегонки гидролизата под вакуумом, что не технологично при производстве и увеличивает продолжительность процесса.

3. Очистка гидролизата казеина от железа при помощи оксида или гидроксида кальция, что приводит к обогащению гидролизата казеина кальцием.

4. Дополнительная обработка гидролизата казеина раствором гидрофосфата натрия и дигидрофосфата калия, что приводит к дополнительным затратам при производстве и удлиняет продолжительность процесса.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа получения гидролизата казеина с определенными свойствами, позволяющими производить питательную среду, удовлетворяющую требованиям нормативных документов.

Технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предложен модифицированный способ получения сухого солянокислотного гидролизата казеина, включающий гидролиз казеина соляной кислотой, удаление хлор-ионов, осветление активированным углем, освобождение от железа, причем гидролиз проводят (1,8-4,0) N соляной кислотой при гидромодуле 1:5 и температуре (131±2)°С в течение 2 ч, затем проводят двухстадийную деионизацию на анионообменной смоле для удаления хлор-ионов, на первой стадии до рН 1,9-2,0, добавляют активированный уголь из расчета 30,0 г/л, нагревают смесь до температуры (100±1)°С, выдерживают в течение 15 мин и фильтруют для освобождения от тимидина, вторую стадию деионизации проводят до рН от 3,5 до 4,5, после чего добавляют активированный уголь из расчета 20,0 г/л, нагревают смесь до температуры (100±1)°С, выдерживают в течение 15 мин и фильтруют для осветления гидролизата, далее добавляют гидроксид натрия до рН 8,5-9,0, нагревают смесь до температуры (100±1)°С, выдерживают в течение 2-3 мин до выпадения нерастворимого осадка и фильтруют для освобождения от кальция, магния, марганца и железа, затем добавляют гидроксид натрия до рН 11,0-12,0, нагревают до (100±1)°С, выдерживают в течение 2-3 мин до выпадения нерастворимого осадка и фильтруют для освобождения от цинка, а нейтрализацию очищенного гидролизата проводят добавлением соляной кислоты с последующим высушиванием.

Предлагаемый способ получения сухого СГК состоит из нескольких стадий:

1. Гидролиз казеина проводили (1,8-4,0) IN соляной кислотой при гидромодуле 1:5 и температуре (131±2)°С в течение двух часов.

2. Деионизацию проводили в две стадии на анионообменной смоле марки АН-3.

Первую стадию деионизации проводили до рН от 1,9 до 2,0, после чего обрабатывали активированным углем из расчета 30,0 г/л, нагревали полученную смесь до температуры (100±1)°С и выдерживали в течение 15 мин, после чего смесь остужали до температуры (30±10)°С и фильтровали.

Вторую стадию деионизации проводили до значения рН (3,5-4,5), после чего обрабатывали активированным углем в количестве 20,0 г/л, нагревали до температуры (100±1)°С и выдерживали в течение 15 мин. Через 15 минут смесь остужали до температуры (30±10)°С и фильтровали.

3. Для освобождения от кальция, магния, марганца и железа устанавливали рН в диапазоне от 8,5 до 9,0 с помощью гидроксида натрия с последующим нагреванием до температуры (100±1)°С и выдерживанием в течение 2-3 мин до выпадения нерастворимого осадка в виде гидроксидов двухвалентных металлов, который затем отфильтровывали. Для осаждения цинка устанавливали рН в интервале от 11,0 до 12,0 с помощью гидроксида натрия. Затем гидролизат нагревали до температуры (100±1)°С и выдерживали в течение 2-3 мин. до выпадения нерастворимого осадка в виде гидроксида цинка и фильтровали.

4. Нейтрализацию проводили соляной кислотой до рН 8,4-8,5.

5. Гидролизат сушили на распылительной сушильной установке при следующих параметрах рабочего режима: температура воздуха на входе в сушильную камеру составляла (120±0,5)°С, а на выходе из сушильной камеры - (90±3)°С.

6. Контроль качества сухого препарата СГК. Внешний вид готового препарата - однородный, мелкодисперсный, гигроскопичный порошок от светло-желтого до желтого цвета, который в количестве 2,0 г полностью растворяется в 100 мл дистиллированной воды, а 2% раствор - прозрачный, светло-желтого цвета. Обладает следующими физико-химическими показателями: рН от 7,3 до 7,4; потеря в массе при высушивании не более 7,0%; содержание аминного азота от 4,5% до 6,5%; содержание хлор-ионов от 18% до 24,0%; содержание общего азота от 9,0% до 13,0%, степень гидролиза - (70,0-80,0)%. Обеспечивает адекватный рост тест-штаммов и получение зон подавления роста для каждой комбинации контрольный штамм - АМП, соответствующих требованиям ISO/TS 16782:2016.

Способ получения гидролизата казеина по прототипу и предлагаемый способ получения СГК объединяют следующие этапы их производства: гидролиз казеина с использованием соляной кислоты, удаление хлор-ионов, осветление активированным углем, очистка от железа.

Отличием предлагаемого способа получения СГК от прототипа является снижение продолжительности гидролиза, не оказывающие влияние на степень гидролиза и содержание аминного азота; упрощение процесса удаления хлор-ионов с помощью двухстадийной деионизации на анионообменной смоле; удаление тимидина; освобождение от двухвалентных металлов, включая не только железо, но и кальций, магний, марганец и цинк.

Ниже приведены примеры обоснования выбранного способа получения СГК.

Пример 1. Получение сухого СГК. В титановый реактор заливают 800 л водопроводной воды, 200 л 1,8 N соляной кислотой, 200 кг казеина и равномерно перемешивают при помощи мешалки. Гидролиз проводят при температуре (131±2)°С в течение 2 часов. Затем гидролизат казеина охлаждают до температуры (90±5)°С и фильтруют.

Далее следует деионизация СГК в две стадии на анионообменной смоле марки АН-3.

Первую деионизацию проводят до рН от 1,9 до 2,0, обрабатывают активированным углем из расчета 30,0 г/л, гидролизат нагревают до температуры (100±1)°С и выдерживают в течение 15 мин, после чего остужают до температуры (30±10)°С и фильтруют. Вторую деионизацию проводят до рН от 3,5 до 4,5, после чего добавляют 20,0 г/л активированного угля, гидролизат нагревают до температуры (100±1)°С и выдерживают в течение 15 мин. Затем гидролизат остужают до температуры (30±10)°С и фильтруют. После деионизации проводят освобождение гидролизата от двухвалентных металлов, устанавливая гидроксидом натрия рН 8,5-9,0 для осаждения кальция, магния, железа, марганца и рН 11,0-12,0 для осаждения цинка. В каждом диапазоне рН гидролизат нагревают до температуры (100±1)°С и выдерживают в течение 2-3 мин до выпадения нерастворимого осадка в виде гидроксидов металлов, который затем удаляют фильтрованием.

Профильтрованный гидролизат нейтрализуют соляной кислотой до рН 8,4-8,5 и высушивают на распылительной сушильной установке при следующих параметрах рабочего режима: температура воздуха на входе в сушильную камеру составляла (120±0,5)°С, а на выходе из сушильной камеры -(90±3)°С.

Характеристики полученного СГК и прототипа представлены в таблице 2. Дополнительно в табл. 2 приведены результаты определения концентрации двухвалентных металлов: кальция, магния и железа методом атомно-эмиссионной спектрометрией с индуктивно связанной плазмой, марганца и цинка - методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой, а также концентрации аминокислот методом AccQ•Tag. Содержание тимидина оценивали косвенно в составе питательной среды для определения чувствительности микроорганизмов к АМП (для ее приготовления использовали мясной экстракт, крахмал, агар в концентрациях, описанных выше и СГК или прототип в концентрации 17,5 г/л) при тестировании комбинации Е. faecalis АТСС 29212 - триметоприм/сульфаметоксазол в терминах «Есть/ Нет».

Как видно из результатов, приведенных в табл. 2, полученный СГК и прототип практически не отличаются друг от друга по содержанию общего и аминного азота, степени гидролиза, содержанию хлор-ионов, концентрации двухвалентных металлов (кальция, магния, марганца, железа и цинка) и содержанию аминокислот. Значительные отличия наблюдаются в значении рН и содержании тимидина.

Пример 2. Способ приготовления сухого СГК аналогичен способу, описанному в примере 1, но гидролиз казеина вели с использованием 4,0 N соляной кислотой. Полученный сухой СГК обладал характеристиками, идентичными характеристикам СГК из примера 1.

Пример 3. Приготовление питательной среды для определения чувствительности микроорганизмов к АМП на основе разработанного СГК и прототипа. Характеристики питательных сред представлены в табл. 3.

Из СГК, полученного в соответствии с изобретением, и прототипа готовили три питательные среды следующего состава:

Среда №1:

- солянокислотный гидролизат казеина, приготовленный по примеру 1, - 17,5 г/л;

- мясной экстракт (Conda Pronadisa, кат. №1700) - 2,0 г/л;

- агар бактериологический европейского типа (Conda Pronadisa, кат. №1800) - 12,0 г/л;

- крахмал растворимый (амилодекстрин) по ГОСТ 10163-76 (ООО «Химприбор-СПб») - 1,5 г/л.

Среда №2:

- солянокислотный гидролизат казеина, приготовленный по примеру 2, - 17,5 г/л;

- мясной экстракт (Conda Pronadisa, кат. №1700) - 2,0 г/л;

- агар бактериологический европейского типа (Conda Pronadisa, кат. №1800) - 12,0 г/л;

- крахмал растворимый (амилодекстрин) по ГОСТ 10163-76 (ООО «Химприбор-СПб») - 1,5 г/л.

Среда №3:

- солянокислотный гидролизат казеина по прототипу - 17,5 г/л;

- мясной экстракт (Conda Pronadisa, кат. №1700) - 2,0 г/л;

- агар бактериологический европейского типа (Conda Pronadisa, кат. №1800) - 12,0 г/л;

- крахмал растворимый (амилодекстрин) по ГОСТ 10163-76 (ООО «Химприбор-СПб») - 1,5 г/л.

Все компоненты питательной среды размешивали в 1 л дистиллированной воды, кипятили 2 мин, стерилизовали автоклавированием при температуре 112°С в течение 15 мин и разливали после охлаждения до (45-50)°С в чашки Петри слоем (4,0±0,5) мм.

Из табл. 3 видно, что питательная среда, приготовленная на основе прототипа, имела рН ниже допустимого значения, что требовало его корректировки, и концентрацию тимидина выше нормируемого, что свидетельствует о невозможности ее использования для определения чувствительности к сульфаниламидным препаратам. В то же время питательная среда №1 и №2 из СГК, приготовленного по заявляемому способу, соответствуют всем требованиям ISO /TS 16782:2016.