Результат интеллектуальной деятельности: Способ защиты от контаминации реакционных смесей для ПЦР

Изобретение относится к области генетической инженерии, конкретно к биотехнологии, и может быть использовано для амплификации ДНК.

Способы ферментативного анализа нуклеиновых кислот являются неотъемлемой частью современных фундаментальных исследований и прикладных дисциплин, включая медицинскую и ветеринарную диагностику. Среди них важное место занимает полимеразная цепная реакция (ПЦР), применяющаяся в том числе для выявления патогенных микроорганизмов и для амплификации ДНК для последующего секвенирования. Продуктом ПЦР является фрагмент ДНК, длина которого ограничена расстоянием между 5'-концами олигонуклеотидных праймеров. В ходе реакции этот фрагмент нарабатывается в большом количестве и может быть детектирован с помощью гель-электрофореза, интеркалирующих красителей, флуоресцентно-меченых зондов. В дальнейшем продукт ПЦР может быть секвенирован, гидролизован эндонуклеазами рестрикции и подвергнут иным манипуляциям в тех случаях, когда требуется анализ нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК.

При проведении ПЦР в диагностических целях наработанный фрагмент ДНК не используется для дальнейшего анализа и представляет собой серьезную угрозу как источник контаминации (нежелательных примесей) ПЦР. Контаминация продуктами предыдущих запусков ПЦР может приводить к ложнопозитивным результатам и неверному выбору терапии. Поскольку продукты диагностической ПЦР чаще всего представляют короткие последовательности ДНК, до 200-300 п.н., они являются стабильными во внешней среде и деградируют с низкой скоростью. Эти фрагменты ДНК могут сохраняться в течение нескольких месяцев на поверхностях лабораторной мебели и приборов, дозаторов, и т.д. [1]. ПЦР является чувствительным методом и способна детектировать единичные молекулы ДНК, присутствующие в реакционной смеси. Таким образом, попадание в реакционную смесь даже 3-10 молекул ДНК-матрицы с дозаторов или вместе с реагентами может привести к появлению нежелательных продуктов. Практически неизбежной контаминация становится при работе с продуктами ПЦР, поэтому их анализ требует выделения отдельных помещений и сотрудников во избежание загрязнения помещений и реагентов для проведения ПЦР.

Последствия контаминации, как уже упоминалось выше, - это ложнопозитивные результаты ПЦР. Степень их влияния на результаты диагностики может быть разной. Так, при генотипировании терминальных мутаций наличие малого количества молекул ДНК минорного аллеля не повлияет на общий результат тестирования, поскольку при анализе истинного образца-гетерозиготы содержание обоих аллелей в реакционной смеси одинаково и значения Cq для обоих аллелей практически одинаковы. Вместе с тем, при поиске соматических мутаций и иных редких событий наличие минимальной примеси продуктов ПЦР из предыдущих запусков может иметь критическое значение. Массовое параллельное секвенирование (NGS, next generation sequencing) является особенно уязвимым, поскольку реакционные смеси необходимо переносить из пробирок, в которых проводилась амплификация, что значительно повышает вероятность загрязнения продуктами предыдущих запусков.

Наиболее разумным средством борьбы с контаминацией представляется предотвращение распространения продуктов ПЦР по лаборатории. Для этого необходимо разделять помещения и сотрудников на чистые и грязные зоны с организацией одностороннего потока образцов, своевременно избавляться от пластика, контактировавшего с реакционными смесями ПЦР, проводить регулярную обработку помещений и оборудования специальными растворами для деконтаминации и постоянно проводить контроль чистоты реагентов для ПЦР. Кроме того, могут применяться ферментативные способы гидролиза продуктов ПЦР, когда непосредственно в реакционные смеси добавляются дополнительные ферменты, специфически гидролизующие ДНК, наработанные в предыдущих запусках. В частности, могут использоваться эндонуклеазы рестрикции [2], термочувствительные нуклеазы [3], урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ) [4].

Использование нуклеаз предполагает ферментативное расщепление ДНК перед проведением амплификации с последующей термической инактивацией этих ферментов. Применение урацил-ДНК-гликозилаз предусматривает введение в реакционную смесь для ПЦР дополнительного нуклеотида 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (дУТФ). Последний частично заменяет дТТФ (2'-дезокситимидин-5'-трифосфат) и встраивается в растущую цепь ДНК Taq-полимеразой. Таким образом, все вновь синтезированные в ходе ПЦР молекулы ДНК будут содержать некоторое количество нуклеотида дУМФ (2'-дезокситимидин-5'-монофосфата) на месте нуклеотида дТМФ (2-дезокситимидин-5'-монофосфата). Подобные фрагменты ДНК при попадании в реакционную смесь, содержащую УДГ, подвергаются гидролизу с образованием апиримидиновых сайтов. При повышении температуры происходят одноцепочечные разрывы ДНК по апиримидиновым сайтам. Апиримидиновые сайты и одноцепочечные разрывы эффективно блокируют работу Taq-полимеразы и предотвращают амплификацию паразитных фрагментов ДНК. Использование УДГ и дУТФ стало стандартным приемом при проведении ПЦР в целях защиты от контаминации, часто используются в коммерчески доступных реакционных смесях для ПЦР.

Наиболее близки к заявляемому способу - прототипом, является способ защиты от контаминации реакционных смесей для ПЦР с помощью УДГ [4], заключающийся в использовании дУТФ вместо дТТФ и УДГ для гидролиза УМФ в ранее наработанных продуктах ПЦР. При добавлении дУТФ и УДГ в реакционные смеси для ПЦР в ходе реакции нарабатываются фрагменты ДНК, несущие апиримидиновые сайты. При нагревании до 95°С в ходе ПЦР большая часть апиримидиновых сайтов превращается в одноцепочечные разрывы. Обработанные таким образом продукты ПЦР прошлых запусков, попавшие в реакционные смеси для ПЦР, не могут быть эффективно использованы как матрица для ПЦР, поскольку апиримидиновые сайты и одноцепочечные разрывы блокируют работу Taq-полимеразы. В результате контаминация ПЦР предотвращается за счет деградации продуктов ПЦР прошлых запусков.

Недостатками данного способа является низкая эффективность защиты от контаминации, так как часть апиримидиновых сайтов не превращается в одноцепочечные разрывы, а также за счет способности Taq-полимеразы преодолевать апиримидиновые сайты за счет встройки случайных нуклеотидов (преимущественно, дАМФ). Таким образом, использование дУТФ и УДГ не позволяет полностью ликвидировать продукты прошлых запусков ПЦР и не обеспечивает полной защиты от контаминации.

Задачей изобретения является разработка более эффективного способа защиты от контаминации реакционных смесей для ПЦР.

Поставленная задача достигается тем, что к реакционной смеси для ПЦР, содержащей ферменты дУТФ и УДГ, дополнительно добавляют рекомбинантную ДНК-гликозилазу Fpg и/или рекомбинантную ДНК-гликозилазу Nei, в экспериментально подобранных, оптимальных концентрациях, обеспечивающих гидролиз одноцепочечных разрывов ДНК.

Технический результат: повышение эффективности защиты реакционных смесей для ПЦР от контаминации за счет внесения одноцепочечных разрывов во фрагменты ДНК, содержащие апиримидиновые сайты.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Готовят реакционную смесь, содержащую дУТФ (2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат), УДГ (урацил ДНК-гликозилазу), а также рекомбинантную ДНК-гликозилазу Fpg в концентрациии 0,35-1,75 мкг и/или рекомбинантную ДНК-гликозилазу Nei в концентрациии 0,5-2,0 мкг. Проводят ПЦР с полученной реакционной смесью в режиме реального времени в реакционном объеме 20 мкл, содержавшем 1 х реакционный буфер для ПЦР (65 мМ Tris-HCl, рН 8,9, 24 мМ (NH₄)₂SO₄, 0.05% Tween-20, 3 мМ MgSO₄), 0,2 мМ каждого дНТФ, 450 нМ праймеры IL17RA-F, IL17RA-R, TaqMan-зонд IL17RA-P, последовательности которых представлены в таблице 1, ДНК-матрицу, 2 е.а. Taq-полимеразы (СибЭнзим, Россия). Детекцию результатов проводят с помощью интеркалирующего красителя, TaqMan-зонда или с помощью гель-электрофореза, олигонуклеотидных праймеров и ДНК- или РНК-матрицы. Отсутствие контаминации продуктами предыдущих запусков ПЦР устанавливают по отсутствию амплификации в пробах ПЦР без матрицы. Снижение концентрации ДНК-матрицы с дУТФ устанавливают по увеличению значений Cq или по снижению интенсивности полос продуктов ПЦР на электрофореграммах в пробах, содержащих УДГ и ДНК-гликозилазы Fpg, Nei, по сравнению с пробами с УДГ без ДНК-гликозилаз Fpg, Nei.

Определяющим отличием заявляемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что в реакционную смесь перед проведением реакции добавляют рекомбинантные ДНК-гликозилазу Fpg (в концентрации 0,35-1,75 мкг) и/или ДНК-гликозилазу Nei (в концентрации 0,5-2,0 мкг), что позволяет повысить эффективность защиты ПЦР от контаминации за счет внесения одноцепочечных разрывов во фрагменты ДНК, содержащие апиримидиновые сайты.

ДНК-гликозилаза Fpg (формамидопиримидин-ДНК гликозилаза) является ферментом бактерии Е. coli, входит в систему эксцизионной репарации ДНК в клетке и играет основную роль в репарации повреждений ДНК, вызванных воздействием активного кислорода.

ДНК-гликозилаза Nei (эндонуклеаза VIII, endonuclease eight, Nei), также является ферментом бактерии Е. coli, представляет собой ДНК-гликозилазу с ассоциированной АР-лиазной активностью, как и Fpg, фермент катализирует последовательные реакции b,d-элиминации с образованием на месте поврежденного звена ДНК однонуклеозидной бреши, обрамленной фосфатными группами, и высвобождением поврежденного основания и углеводного фрагмента в виде 4-оксопент-2-еналя.

Использование данных ДНК-гликозилаз в экспериментально подобранных, оптимальных концентрациях, позволяет существенно повысить эффективность защиты реакционных смесей для ПЦР от контаминации. При добавлении рекомбинантных ДНК-гликозилаз Fpg и/или Nei в реакционную смесь для ПЦР эффективность амплификации продуктов ПЦР с дУМФ понижается в 500-1000 раз по сравнению с контрольными пробами с УДГ без дополнительных ферментов.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения, оно иллюстрируется следующими примерами осуществления.

Пример 1. Получение штаммов Е. coli - продуцентов рекомбинантных ДНК-гликозилазы Fpg и ДНК-гликозилазы Nei.

Рекомбинантные ДНК-гликозилазы Fpg и Nei нарабатывали в клетках Е. coli штамма BL21 (DE3) pLysS. Для этого трансформировали плазмидой pET23a-Fpg [5] или pET23a-Nei [6] компетентные клетки Е. coli штамма BL21 (DE3) pLysS и распределяли клетки по чашке Петри со средой LB, содержавшей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (34,5 мкг/мл). Инкубировали чашки Петри при 37°С в течение ночи. На следующий день готовили стартовую культуру. Для этого инокулировали одной колонией пробирку с 2 мл среды LB, содержавшей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (34,5 мкг/мл), инкубировали пробирку в течение 5 часов при 37°С и помешивании со скоростью 200 об/мин до достижения оптической плотности при 600 нМ 1,0. Переносили стартовую культуру в колбу на 1 л с 200 мл среды LB, содержавшей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (34,5 мкг/мл), инкубировали колбу в течение 4 часов при 37°С и помешивании со скоростью 200 об/мин до достижения оптической плотности при 600 нМ 1,0. По достижению указанной оптической плотности индуцировали синтез Fpg с помощью изопропил-β-D-тиогалактозида, добавляя к 200 мл культуры 2 мл 1 М изопропил-β-D-тиогалактозида. После добавления изопропил-β-D-тиогалактозида продолжали инкубацию в течение 4 часов в тех же условиях. По завершению времени инкубации собирали клетки центрифугированием при 4°С и 6000×g в течение 15 мин, клеточный осадок хранили при -70°С до момента выделения RT-Sto.

Пример 2. Выделение и очистка рекомбинантных ДНК-гликозилазы Fpg и ДНК-гликозилазы Nei из клеток-продуцентов Е. coli.

Рекомбинантные ДНК-гликозилазы Fpg и Nei очищали с помощью последовательных хроматографий: металл-хелатной на Ni-NTA-сорбенте и ионообменной на сорбенте HighQ, после чего рекомбинантные ферменты Fpg и Nei переводили в буфер для хранения с помощью диализа. Хроматографию проводили на хроматографе BioLogic LP (Bio-Rad Laboratories, Inc, США), снабженном оптической и кондуктометрической ячейками. Оптическую плотность и электропроводность в элюате визуализировали при помощи программы BioLogicTM LP Data ViewTM Software (Bio-Rad Laboratories, Inc, США). Все растворы подавали на колонку со скоростью 1 мл/мин.

Аффинную хроматографию проводили на колонке, заполненной 5 мл сорбента Profinity IMAC Resin (Bio-Rad Laboratories, Inc, США), которую перед использованием уравновешивали 25 мл буфера А (50 мМ Tris-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl). После уравновешивания колонки подготавливали белковый препарат для очистки. Биомассу после препаративной экспрессии рекомбинантного белка ресуспендировали в буфере А для хроматографии (в соотношении 10 мл буфера на 1 г биомассы) и лизировали клетки обработкой ультразвуком. Растворимую белковую фракцию отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 14000×g.

Подготовленный к очистке белковый препарат наносили на колонку, после чего колонку промывали 25 мл буфера А для хроматографии. Рекомбинантную Fpg или Nei элюировали буфером В (50 мМ Tris-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 0,5 М имидазол) для хроматографии. Элюат собирали фракциями, время сбора фракции - 1 мин, объем фракции - 1 мл. Все фракции, полученные в ходе очистки, анализировали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли.

Ионообменную хроматографию проводили на колонке, заполненной 2 мл сорбента HighQ (Bio-Rad Laboratories, Inc, США), перед использованием уравновешивали 50 мл буфера Е для хроматографии.

На подготовленную колонку наносили препарат Fpg, очищенный с помощью аффинной хроматографии, и промывали колонку 20 мл буфера С (50 мМ Tris-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl). Рекомбинантные белки элюировали буфером D (50 мМ Tris-HCl рН 7,5, 1 М NaCl) для хроматографии. Элюат собирали фракциями, время сбора фракции - 1 мин, объем фракции - 1 мл. Все фракции анализировали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли. Аналогичным методом на колонку наносили препарат Nei, очищенный с помощью аффинной хроматографии, и промывали колонку 20 мл буфера С (50 мМ Tris-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl). Рекомбинантные белки элюировали буфером D (50 мМ Tris-HCl рН 7,5, 1 М NaCl) для хроматографии. Элюат собирали фракциями, время сбора фракции - 1 мин, объем фракции - 1 мл. Все фракции анализировали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли.

Фракции, содержавшие Fpg, объединяли и переносили в диализный мешок (Sigma-Aldrich, США), после чего помещали в 1 литр буфера для хранения (100 мМ Трис-HCl рН 7,5, 300 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 55% глицерин) и оставляли на 12-14 часов при +4°С и постоянном помешивании. Аналогично, фракции, содержавшие Nei, объединяли и переносили в диализный мешок (Sigma-Aldrich, США), после чего помещали в 1 литр буфера для хранения (100 мМ Трис-HCl рН 7,5, 300 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 55% глицерин) и оставляли на 12-14 часов при +4°С и постоянном помешивании.

По окончании диализа препараты белков из диализного мешка анализировали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли и оценивали их концентрацию по методу Брэдфорд. Далее препараты белков делили на аликвоты по 500 мкл каждая и хранили при -20°С.

Пример 3. Эффект присутствия рекомбинантных ДНК-гликозилаз Fpg или Nei в реакционной смеси для ПЦР в режиме реального времени с матрицей без дУМФ.

ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционном объеме 20 мкл, содержавшем 1 * реакционный буфер для ПЦР (65 мМ Tris-HCl, рН 8,9, 24 мМ (NH₄)₂SO₄, 0.05% Tween-20, 3 мМ MgSO₄), 0,2 мМ каждого дНТФ (без добавления дУТФ), 450 нМ праймеры IL17RA-F, IL17RA-R, TaqMan-зонд IL17RA-P, последовательности которых представлены в таблице 1, ДНК-матрицу (тип и количество матрицы указаны ниже), 2 е.а. Taq-полимеразы (СибЭнзим, Россия). Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Программа включала в себя следующие стадии: 15 минут начальной денатурации при 95°С и 45 циклов 95°С - 10 с, 60°С - 40 с. Все эксперименты проводили в трех технических повторах. Съем сигнала флуоресценции проводили по каналу HEX. Полученные данные анализировали с помощью программы CFX Manager (Bio-Rad, США).

В качестве матрицы без дУТФ использовали геномную ДНК человека, выделенную из ядерных клеток крови здорового донора с помощью набора QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Германия) согласно инструкциям производителя. Как матрицы с дУТФ использовали ПЦР-фрагмент, полученный с праймеров IL17RA-F, IL17RA-R в условиях ПЦР, описанных выше. При этом в реакционную смесь для ПЦР добавляли дУТФ таким образом, что конечные концентрации дУТФ и дТТФ были равны 0,1 мМ. Полученный ПЦР-фрагмент очищали из реакционной смеси с помощью QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Германия) и разбавляли 10 мМ Tris-HCl, рН 8,0 до концентрации ДНК 10 пг/мкл.

Эффект присутствия Fpg или Nei в реакционной смеси для ПЦР в режиме реального времени определяли, проводя ПЦР в указанных выше условиях, с добавлением Fpg или Nei. Для этого в реакционную смесь добавляли 10 е.а. урацил-ДНК-гликозилазы и 1,75 мкг Fpg или 2,0 мкг Nei (СибЭнзим, Россия). Количество ДНК-матрицы составляло 30 нг геномной ДНК человека. Результаты показаны на фиг. 1.

Было установлено, что добавление Fpg или Nei в указанных концентрациях не снижает эффективность количественной ПЦР, что выражается в равенстве Cq между пробами с добавленными Fpg или Nei и без дополнительных ферментов. Таким образом, ДНК-гликозилазы Fpg и Nei могут быть раздельно использованы в реакционных смесях для ПЦР в концентрациях ниже 2,0 мкг без потери эффективности ПЦР.

Пример 4. Эффект присутствия рекомбинантных ДНК-гликозилаз Fpg или Nei в ПЦР в режиме реального времени с матрицей с дУМФ.

Эффект Fpg и Nei на амплификацию ПЦР-фрагмента с 50% содержанием дУТФ определяли, используя ПЦР в реальном времени. Для этого в реакционную смесь добавляли 10 е.а. урацил-ДНК-гликозилазы (СибЭнзим, Россия). В реакционные смеси добавляли 0,35 мкг или 1,75 мкг рекомбинантной ДНК-гликозилазы Fpg либо 0,5 мкг или 2,0 мкг рекомбинантной ДНК-гликозилазы Nei. Количество ДНК-матрицы составляло 20 пг/мкл ПЦР-фрагмента с 50% содержанием дУТФ. Результаты показаны на фиг. 2.

Было установлено, что добавление рекомбинантных ДНК-гликозилаз Fpg или Nei в указанных концентрациях приводит к росту Cq по сравнению с пробами без дополнительных ферментов. Рост Cq указывает на падение концентрации ДНК с дУМФ в 30-60 раз (5-6 циклов разницы). Таким образом, ДНК-гликозилазы Fpg и Nei могут быть раздельно добавлены в реакционную смесь для ПЦР и совместно с УДГ и дУТФ могут быть использованы в реакционной смеси для ПЦР для гидролиза ранее синтезированных фрагментов ДНК и деконтаминации, повышая эффективность защиты от контаминации продуктами ПЦР.

Пример 5. Эффект совместного присутствия рекомбинантных ДНК-гликозилаз Fpg и Nei в ПЦР в режиме реального времени с матрицей с дУМФ.

Эффект совместного добавления рекомбинантных Fpg и Nei на амплификацию ПЦР-фрагмента с 50% содержанием дУТФ определяли, используя ПЦР в реальном времени. Для этого в реакционную смесь добавляли 10 е.а. урацил-ДНК-гликозилазы (СибЭнзим, Россия). В реакционные смеси добавляли 1,75 мкг рекомбинантной ДНК-гликозилазы Fpg и 2,0 мкг рекомбинантной ДНК-гликозилазы Nei. Количество ДНК-матрицы составляло 20 пг/мкл ПЦР-фрагмента с 50% содержанием дУТФ. Результаты показаны на фиг. 3.

На фиг. З видно, что совместное добавление 1,75 мкг Fpg и 2,0 мкг Nei приводит к росту Cq по сравнению с пробами без дополнительных ферментов. Рост Cq указывает на падение концентрации ДНК с дУМФ в 500-1000 раза (9-10 циклов разницы). Таким образом, одновременное добавление в реакционную смесь для ПЦР ДНК-гликозилаз Fpg и Nei совместно с УДГ и дУТФ приводит к более эффективному гидролизу ранее синтезированных фрагменты ДНК для предотвращения контаминации ПЦР. Последнее особенно важно в тех случаях, когда произошел разлив реакционных смесей ПЦР, и продукты ПЦР рассеяны в большом количестве по поверхностям мебели и оборудования.

Источники информации:

1. Robinson-McCarthy L.R. et al. Laboratory-Generated DNA Can Cause Anomalous Pathogen Diagnostic Test Results. // Microbiol. Spectr. 2021. Vol.9, №2. P. e0031321.

2. Ashkenas J., Dennis J.W., Yip Но C. Simple enzymatic means to neutralize DNA contamination in nucleic acid amplification // Biotechniques. 2005. Vol.39, №1. P. 69-73.

3. Champlot S. et al. An Efficient Multistrategy DNA Decontamination Procedure of PCR Reagents for Hypersensitive PCR Applications // PLoS One / ed. Lalueza-Fox C. 2010. Vol. 5, №9. P. el3042.

4. Longo M.C., Berninger M.S., Hartley J.L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. // Gene. 1990. Vol.93, №1. P. 125-128.

5. Gilboa R. et al. Structure of formamidopyrimidine-DNA glycosylase covalently complexed to DNA. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, №22. P. 19811-19816.

6. Zharkov D.O. et al. Structural analysis of an Escherichia coli endonuclease VIII covalent reaction intermediate. // EMBO J. 2002. Vol.21, №4. P. 789-800.