Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ОЧИСТИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ЛИМФАТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МОЗГА

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в нейрореабилитационной медицине и сомнологии для фотодинамического воздействия на лимфоток оболочек мозга, головы и шеи с целью повышения восстановительных свойств мозга во время сна после перенесенных черепно-мозговых травм, интракраниальных геморрагий, при лечении опухолей и нейродегенеративных патологий.

Известен способ воздействия на лимфодренажные свойства сосудов оболочек мозга и брыжейки мышей лазерным излучением длиной волны 1267 нм от 2-9 Дж/см² (Oxana Semyachkina-Glushkovskaya, Arkady Abdurashitov, Maria Klimova, Alexander Dubrovsky, Alexander Shirokov, Alexander Fomin, Andrey Terskov, Ilana Agranovich, Aysel Mamedova, Aleksandr Khorovodov, Valeria Vinnik, Inna Blokhina, Nikita Lezhnev, Ali E. Shareef, Anna Kuzmina, Sergey Sokolovski, Valery Tuchin, Edik Rafailov, Jurgen Kurths. Photostimulation of cerebral and peripheral lymphatic functions. Translational Biophotonics. 2020; e201900036). Показано, что одноразовое воздействие лазером 1267 нм в оптимальной дозе 9 Дж/см² через неповрежденный череп способствует повышению выведения красителей из тканей мозга по лимфатическим сосудам его оболочек.

Нет данных, какие анатомические участки головы должны освещаться лазером для достижения фотодинамической стимуляции лимфотока и на какую глубину необходимо светить. Может ли способ применяться курсовым воздействием или только однократно.

Известен способ низкоуровневой светотерапии для лечения инсульта (см. US 2003/0109906, МПК A61N 005/06, опубл. 12.01. 2003). Способ основан на фотодинамическом воздействии в инфракрасном диапазоне (630 – 904 нм) на ткани мозга у пациентов после перенесенного инсульта с целью поддержания восстановительных ресурсов за счет повышения синтеза энергетической молекулы - аденозинтрифосфата. Излучение подается в месте поражения мозга не менее, чем через 6 часов после инсульта, в дозе, рассчитанной индивидуально, в зависимости от глубины нахождения инсульта. Используется широкий диапазон доз излучения 0.01 мВ/cм² до 100 мВ/cм².

Недостатком данного способа является отсутствие сведений об эффективности прохождения света через череп и кожу пациентов разного возраста, что имеет значение в эффективности доставки излучения в ткани мозга. Способ не предназначен для лимфатического дренажа и освобождения тканей мозга от токсичных продуктов.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ применения лазера с длиной волны 1267 нм для стимуляции очистительной функции лимфатической системы мозга от белка бета-амилоида и лечения болезни Альцгеймера (Zhinchenko, E., Navolokin, N., Shirokov, A., Khlebcov, B., Dubrovsky, A., Saranceva, E., Abdurashitov A., Khorovodov, A., Terskov A., Mamedova, A., Klimova, M., Agranovich, I., Martinov, D., Tuchin, V., Semyachkina-Glushkovskaya, O., Kurths, J. Pilot study of transcranial photobiomodulation of lymphatic clearance of beta-amyloid from the mouse brain: breakthrough strategies for nonpharmacologic therapy of Alzheimer’s disease. Biomedical Optics Express. 10(8): doi.org/10.1364/BOE.10.004003 (2019)). Способ заключается в том, что удаляется скальп и далее подается транскраниальное излучение лазером 1267 нм в оптимальной дозе 32 Дж/см² в течение 10 дней, что способствует выведению бета-амилоида из тканей мозга и улучшению нейрокогнитивного статуса мышей с болезнью Альцгеймера.

Однако, в данном способе требуется удаление скальпа из-за рассеивающих свойств кожи и не показана возможность применения лазера 1267 нм для очищения тканей мозга от крови и лечения заболеваний мозга, связанных с повреждением его тканей, например, после травмы мозга и развития интракраниальных геморрагий.

Техническая проблема заключается в разработке неинвазивного способа фотодинамической стимуляции вывода спинномозговой жидкости, крови, в частности эритроцитов и токсинов из мозга.

Технический результат заключается в повышении эффективности путем активации очистительной функции и упрощении способа за счет исключения дополнительного применения фотосенсибилизаторов, обеспечения возможности многократного повторения курса лечения во время глубокого сна (non rapid eyes movement - NREM стадия) при появлении медленных δ-волн на электроэнцефалограмме (ЭЭГ).

Техническая проблема изобретения решается тем, что в способе стимуляции очистительной функции лимфатической системы мозга путём фотодинамического воздействия на лимфатические сосуды, согласно решению, воздействие осуществляют неинвазивно излучением видимого или инфракрасного диапазона с мощностью ниже порога фотоповреждения тканей (дозированного низкоинтенсивного светового воздействия в диапазоне от 400 до 1300 нм) на зоны расположения лимфатических сосудов оболочек мозга, головы и шеи во время стадии глубокого сна на протяжении всего цикла сна, который регистрируют на электроэнцефалограмме, однократно или курсом, который подбирают индивидуально.

Способ поясняется иллюстрациями и таблицами, где представлены:

на фиг. 1 - 3D конфокальное изображение менингеальных лимфатических сосудов (зеленая окраска, мечение маркером Lyve-1) и присутствие в их просвете эритроцитов (красные точки), n=10;

на фиг. 2 - Иммуногистохимическая картина присутствия эритроцитов в лимфатических сосудах (коричневая окраска, маркер Lyve-1) оболочек мозга новорожденного ребенка, умершего от интракраниального кровоизлияния, n=5. Контролем служили оболочки мозга, взятые от новорожденных детей (n=3), умерших от врожденной патологии сердца: a) оболочки мозга новорожденного ребенка в норме; б) оболочки мозга новорожденного ребенка после развития интракраниального кровоизлияния (белыми стрелками показаны эритроциты, голубыми – иммунные клетки крови); в) число эритроцитов в кровеносных и лимфатических сосудах (показано, что после интракраниального кровоизлияния обнаруживается эритроциты в лимфососудах также, как в кровеносных сосудах. Отметим, что присутствие эритроцитов в лимфососудах является признаком только мозговых кровоизлияний и не обнаруживается в норме. Это отражает тот факт, что лимфатические сосуды оболочек мозга являются выводящими путями очищения тканей мозга от крови;

на фиг. 3 - Гистологический анализ тканей мозга в норме (слева) и после (справа) фотодинамического воздействия (1267 нм, 54 Дж/см², цикл 61 мин: 17 мин – излучение и 5 мин – пауза). Стрелкой показана периваскулярная эдема вокруг кровеносного капилляра, n=10;

на фиг. 4 - Эффекты однократного лазерного воздействия (1267 нм, 28 Дж/см², цикл 61 мин: 17 мин – излучение и 5 мин – пауза) на показатели интракраниального давления новорожденных крыс в группах: ЛО – ложнооперированных животных, которым вводили физиологический раствор в объеме 5 мкл в правый боковой желудочек; ВЖК – животные с моделью внутрижелудочкового кровоизлияния (ВЖК), которое моделировали путем введения 5 мкл крови в правый боковой желудочек; ВЖК+1267 нм, n=10 в каждой группе, * - P<0.05;

на фиг. 5 - Выживаемость новорожденных крыс после развития внутрижелудочкового кровоизлияния без и после 7-дневного курса фотостимуляции лимфатических процессов очищения и дренажа тканей мозга, n=30 в каждой группе;

на фиг. 6 - Накопление красителя FITC-декстрана в глубоком шейном лимфоузле новорожденной крысы после однократного лазерного (1267 нм, 28 Дж/см², 61 мин цикл: 17 мин – излучение, 5 мин – пауза) воздействия в бодрствовании и по время глубокого (NREM стадия) сна и в период сновидений (REM стадия);

на фиг. 7 - Схематическое изображение фотодинамической стимуляции лимфотока во время сна в лимфатических сосудах, расположенных в оболочках мозга, носа и шеи.

Таблица 1 – Сравнение эффективности разных доз 7-ми дневного курса лазерного воздействия (1267 нм, 61 мин цикл: 17 мин – излучение, 5 мин – пауза) на лимфатические процессы очищения тканей мозга от крови: *** - p<0.001, n=7 в каждой группе.

Таблица 2 – Сравнение эффективности очищения тканей мозга от крови у новорожденных крыс (n=10) в зависимости от лазерного воздействия (1267 нм, 28 Дж/см², 61 мин цикл: 17 мин – излучение, 5 мин – пауза, курс 7 дней) на лимфатические сосуды оболочек мозга, головы и шеи: * - p<0.001 по сравнению с лимфатическим сосудами головы; † - по сравнению с лимфатическими сосудами шеи, n=10 в каждой группе.

Таблица 3 – Сравнение эффективности применения лазерного излучения (61 мин цикл: 17 мин – излучение, 5 мин – пауза, курс 7 дней) в диапазоне от 450 до 1267 нм на выведение из тканей мозга крови и флуресцентного альбумина у новорожденных (n=10) и взрослых мышей (n=10).

Таблица 4 – Сравнение эффективности прохождения лазерного излучения в диапазоне от 400 до 1300 нм через кожу и череп новорожденных детей.

Таблица 5 - Значения коэффициента поглощения и транспортного коэффициента рассеяния при прохождении светового излучения через кожу и череп новорожденных детей в диапазоне от 400 до 1300 нм.

Таблица 6 – Сравнение эффективности очищения тканей мозга новорожденной крысы от FITC-декстарана 70 кДа после однократного лазерного (1267 нм, 28 Дж/см², 61 мин цикл: 17 мин – излучение, 5 мин – пауза) воздействия на лимфососуды оболочек мозга в бодрствовании и во время разных стадий сна: *** - p<0.001 по сравнению с бодрствованием, † - p<0.001 между разными стадиями сна.

Для очищения тканей мозга от крови и токсичных молекул воздействие осуществляют на лимфатические сосуды оболочек мозга, носовых пазух, лица и шеи с мощностью ниже порога фотоповреждения тканей (согласно СанПиН 2.2.4.3359-16) однократно или курсом продолжительностью несколько дней, что устанавливается индивидуально. Фотодинамическое воздействие на лимфатические сосуды световым излучением длиной волны в диапазоне от 400 до 1300 нм. Наиболее эффективно осуществлять воздействие с длиной волны 900-1300 нм во время стадии глубокого сна на протяжении всего цикла сна, который регистрируют на электроэнцефалограмме.

Способ апробирован на новорожденных крысах следующим образом. У новорожденных крыс вызывают развитие внутричерепного кровоизлияния с пропитыванием кровью тканей мозга. Для этого кровь в количестве 5 мкл берется из хвоста животного и вводится в правый желудочек под ингаляционной анестезией (2% изофлуран, N2O/O2 – 70:30) в соответствии со стереотаксическими координатами (AP – 1.06 mm; ML – 2.00 mm; DV – 2.50 mm).

Данная модель выбрана в связи с высокой частотой развития внутрижелудочковых кровоизлияний у недоношенных детей (в 85 % случаев), что приводит к серьезным неврологическим патологиям (Semyachkina-Glushkovskaya O., Kurths J., Pavlov A., Abdurashitov A., Borisova E., Zhu A., Li P., Luo Q., Tuchin V (2016) Silent Vascular Catastrophes in the Brain in Term Newborns: Strategies for Optical Imaging.IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 99: doi: 10.1109/JSTQE.2016.2523982).

Фигура 1 и 2 отражают примеры конфокального (у новорожденных крыс возрастом 12 дней) и иммуногистохимического (у новорожденных детей) методов визуализации лимфатических сосудов мозга и присутствие в них эритроцитов, указывая на тот факт, что кровь выводится их тканей мозга по лимфатическим путям. Лимфатические сосуды являются высокопроницаемыми, через мембрану которых жидкости из межклеточного пространства входят путем диффузного передвижения из-за разницы гидростатического давления и вместе с током жидкостей в лимфатическое сосуды попадают макромолекулы и клетки. В этом заложены механизмы лимфатического очищения тканей от вирусов, бактерий и токсинов (Semyachkina-Glushkovskata O. et al. Blood–Brain Barrier, Lymphatic Clearance, and Recovery: Ariadne’s Thread in Labyrinths of Hypotheses / Journal: Int. J. Mol. Sci., 2018. Vol. 19. No. 3818; doi: 10.3390/ijms19123818).

Для визуализации лимфатических сосудов была использована конфокальная микроскопия с применением антитела, связывающегося с эндотелиальным рецептором гиалуронана 1 эндотелия лимфатических сосудов - Live-1-Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 Семячкина-Глушковская О.В. Лимфатическая система в оболочках мозга: новые открытия в нейрофизиологии / Сибирское медицинское обозрение. Т.6, С.39-50 (2017); Semyachkina-Glushkovskata O. et al. Blood–Brain Barrier, Lymphatic Clearance, and Recovery: Ariadne’s Thread in Labyrinths of Hypotheses / Journal: Int. J. Mol. Sci., 2018. Vol. 19. No. 3818; doi: 10.3390/ijms19123818). Для этого на следующие сутки после возникновения внутрижелудочкового кровоизлияния голова новорожденных крыс иссекалась и помещалась на 2 суток в 4% забуференный формалин. После чего ткани мозга и его оболочки извлекались и проходили подготовку для конфокальной микроскопии. Конфокальную микроскопию проводили с помощью автоматизированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа с водной иммерсией Olympus FV10i-W (Olympus, Япония). Неспецифическую активность белков блокировали 2-часовой инкубацией при комнатной температуре с 10% бычьим сывороточным альбумином в растворе 0,2% Triton X-100 в натрий-фосфатном буфере. Инкубация с первичными антителами в разведении 1:500 проводили в течение ночи при 4°С с кроличьими анти-мышиными антителами: goat anti-rabbit LYVE-1 antibody (1:500; PA-16635, Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, США). На всех этапах проводили 2-3-кратная промывку образцов 5-минутной инкубацией в промывочном растворе.

Для проведения иммуногистохимических исследований применяли стандартный протокол с использованием антител (Антитела кролика (клон EPR21857) к белку LYVE1 человека, ab219556, США).

У новорожденных крыс кортикальная ЭЭГ (Pinnacle Technology, İnc., 2 EEG, 1 EMG, 1 BIO», Тайвань, 2019) регистрировалась путем введения электродов (диаметр наконечника 2-3 мкм) по координатам от брегмы (L 2.5 mm; D 2 mm) на глубину 150 мкм. Сигналы оценивались с помощью программного обеспечения (Sirenia, Тайвань, 2019) в 5-минутные периоды без артефактов. Эти периоды далее разбивали на диапазоны мощности δ-волны (0–4 Гц), τ-волны (4–7 Гц), α-волны (8–13 Гц) и α-волны (13–20 Гц). Бодрствование определяли как десинхронизированную ЭЭГ с низкой амплитудой, в то время как глубокий сон (NREM стадия) определяли как синхронизированную активность с высокой амплитудой, в которой преобладали низкочастотные δ-волны (0-4 Гц), сон со сновидениями (rapid eye movement, REM) идентифицировали по наличию тета-волн (5-10 Гц), составляющих > 20% ЭЭГ.

Для выявления эффективной дозы лазерного воздействия с целью стимуляции лимфатического выведения клеток крови из мозга осуществляли курсовое транскраниальное фотодинамическое воздействие на протяжении 7 дней (1267 нм излучение во время ЭЭГ регистрации стадии глубокого сна) в разных дозах излучения на лимфатические сосуды в области сагиттального синуса у новорожденных крыс. Были использованы следующие дозы лазерного излучения (7-14-21-28-54 Дж/см²) (Таблица 1). Эффективность воздействия оценивали по числу выведенных из мозга эритроцитов, что подсчитывали на иммуногистохимических снимках в лимфососудах, меченных Lyve-1/Prox-1, с помощью программы Ореол и ImageJ. Площадь присутствия эритроцитов изучали с применением программы (плагин “Analyze Particles” во вкладке “Analyze”, подсчитывая суммарное число эритроцитов в лимфососудов одного диаметра).

Установлено, что после транскраниального фотодинамического воздействия дозой 28 Дж/см2 выход из мозга эритроцитов увеличился в 3,7 раза по сравнению с состоянием без световых влияний (5.6±0.2 усл.ед. против 1.5±0.1 усл.ед, p<0.001). Менее интенсивное фотодинамическое воздействие оказывало менее выраженные эффекты на повышение очищения тканей мозга от эритроцитов (3.6±0.1 усл.ед. против 1.5±0.1 усл.ед, p<0.001 для 7 Дж/см2; 3.0±0.3 усл.ед. против 1.5±0.1 усл.ед, p<0.001 для 14 Дж/см2; 4.0±0.1 усл.ед. против 1.5±0.1 усл.ед, p<0.001 для 21 Дж/см2). Более интенсивное лазерное воздействие 54 Дж/см2 оказывало эффективное влияние на лимфатическое выведение эритроцитов из тканей мозга (4.7±0.5 усл.ед. против 1.5±0.1 усл.ед, p<0.001). Однако, эти воздействия сопровождались появлением негативных эффектов в виде периваскулярного отека (Фигура 3).

Таким образом, показано, что доза 28 Дж/ светового излучения 1267 нм является оптимальной для наиболее интенсивного лимфатического выведения продуктов крови (эритроцитов) из тканей мозга новорожденных крыс во время глубокого сна.

Дополнительно изучали фотостимуляцию лимфодренажной функции мозга путем однократного воздействия лазерного излучения 1267 нм (28 Дж/см2 в течение 61 мин: 17 мин излучение, 5 мин - пауза) на интракраниальное давление во время глубокого сна.

Измерения внутричерепного давления проводили с помощью датчика давления (TruStability® Board Mount Pressure Sensors: HSC Series, Honeywell, Нью-Джерси, США), в состав которого входит серебренный электрод (наружный диаметр 0,70 мм; длина 6 мм), соединенный с силиконовой трубкой (наружный диаметр 4 мм; длина 250 мм), которую вставляли в правый боковой желудочек. Оценку данные проводили с применением программы LabVIEW 2013 (National Instruments Corp, Остин, Техас, США).

Фигура 4 отражает результаты, показывающие, что развитие внутрижелудочкового кровоизлияния в первые минуты после введения крови в правый боковой желудочек сопровождается повышением интракраниального давления в 7,5 раз (75±2,0 против 10±1,2, p<0.001) по сравнению с нормой, что опасно для жизни и может привести к фатальному исходу за счет скопления жидкости внутри черепа. Через 1 час после индуцирования кровоизлияния наблюдалась тенденция в восстановлению интракраниального давления, однако, данный показатель оставался выше нормы в 3,2 раза (32±2,0 против 10±1,2, p<0.01). Фотодинамическое воздействие значительно ускоряло процессы восстановления интракраниального давления, за счет чего данный показатель уже через 1 час опускался до 20±1,7, т.е. в 1,6 раза восстанавливался быстрее, чем без лазерного излучения (32±2,0 против 20±1,7, p<0.05).

7-дневный курс фотодинамического воздействия на лимфатические процессы очищения и дренажа тканей мозга во время глубокого сна приводило к повышению выживаемости новорожденных крыс (Фигура 5).

В целом, результаты позволяют заключить, что фотостимуляция (1267 нм с оптимальной дозой лазерного излучения 28 Дж/см²) лимфатических процессов очищения и дренажа спящего мозга способствует эффективному выведению токсичных продуктов крови (эритроцитов) из его тканей в периферическую лимфатическую систему, повышению скорости восстановления интракраниального давления и повышению выживаемости новорожденных крыс после развития внутрижелудочкового кровоизлияния.

Фигура 6 отражает результаты, доказывающие, что именно стадия глубокого сна, по сравнению со стадий сновидения и бодрствованием, является эффективным периодом фотостимуляции лимфатических процессов освобождения тканей мозга от ненужных молекул на примере очищения оболочек мозга от красителя FITC-декстарана 70 кДа, введенного в цистерну магна.

Фигура 7 иллюстрирует схематически фотостимуляцию лимфотока в лимфатических сосудах оболочек мозга, носа и шеи во время глубокого сна.

Таблица 2 отражает результаты, свидетельствующие, что 7-и дневный курс лазерного излучения с длиной волны 1267 нм (28 Дж/см², 61 мин цикл: 17 мин – излучение, 5 мин – пауза) оказывает стимулирующие эффекты на очищение тканей мозга от крови при воздействии лимфатические сосуды оболочек мозга, головы и шеи с наиболее выраженным результатом при облучении лимфососудов оболочек мозга.

Таблица 3 демонстрирует результаты сравнения эффективности воздействия различных длин волн лазерного излучения (450-635-880-1267 нм: 61 мин цикл: 17 мин – излучение, 5 мин – пауза, 7 дней курс) на очищение тканей мозга от крови и флуоресцентного альбумина. Показано, что длины волн 880 нм и 1267 нм по сравнению с длинами волн 635 нм и 450 нм оказывали более высокую эффективность в отношении очищения тканей мозга от крови и флуоресцентного белка (токсина).

Таблицы 4 и 5 включают результаты изучения эффективности прохождения лазерного излучения на различных длинах волн через кожу и череп новорожденных детей, где показано, что диапазон длин волны 900-1300 нм наиболее эффективно проходит через кожу и фиброзную ткань новорожденных.

Таблица 6 и фигура 7 отражают результаты сравнения эффективности применения лазерного (1267 нм) воздействия в бодрствовании и во время разных стадий сна (NREM, non rapid eyes movement или глубокий сон и REM, rapid eye movement или стадия сновидений) на очищение тканей мозга от флуоресцентного красителя FITC-декстрана 70 кДа. Данные явно свидетельствуют о том, что применение лазерного воздействия во время глубокого сна сопровождается в 1.8 раза более эффективным выведением красителя из мозга в глубокий шейный лимфоузел. Для выполнения данной задачи краситель вводили в цистерну магна в объеме 5 мкл (0.1 мкл/1 мин) с помощью гамельтона (Hamilton Bonaduz AG, Бонадуц, Швейцария) и автоматизированной стереотаксической установки (Stoelting, Сент-Луис, США) с последующим мониторингом результата на конфокальной микроскопии (Leica SP5, Вецлар, Германия).

Полученные результаты носят прогрессивный и пионерский характер. В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа лимфатической стимуляции очищения тканей мозга от крови и токсинов путем применения фотодинамического неинвазивного воздействия во время глубокого сна через интактный череп и без применения фотосенсибилизаторов. Значимость изобретения фотодинамического стимуляции очистительных процессов лимфатической системы мозга будет способствовать развитию прорывных технологий повышения восстановительных свойств центральной нервной системы после перенесенных травм головного и спинного мозга, а также при развитии нейродегенеративных заболеваний. Это будет способствовать повышению качества и продолжительности жизни таких пациентов, снижению затрат государства на их лечение, что соответствует приоритетным направлениям развития здравоохранения.

Технология не имеет аналогов в мире и предлагается в России впервые. Это даст возможность российским ученым занять достойное конкурентоспособное место на международной арене по продвижению новых разработок по управлению лимфатическими и иммунными механизмами мозга. Это также будет являться важной информативной платформой для появления инновационных нефармакологических решений в развитии технологий для неонатологии и нейрореабилитационной медицины. Отметим, что наличие гематоэнцефалического барьера препятствует проникновению 98% существующих лекарственных препаратов, что существенно тормозит прогресс в лечении заболеваний мозга (W.M. Pardridge. Drug transport across the blood–brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 2012 Nov; 32(11): 1959–1972). Это объясняет отсутствие продуманной тактики лечения пациентов с травмами мозга и оказанная им терапия является больше счастливой случайностью, нежели продуманной тактикой медицинской помощи. В связи с этим появление предлагаемой технологии, позволяющей стимулировать лимфатические процессы очищения тканей мозга от токсичных продуктов, таких как кровь (эритроцитов) и белки, является остро востребованной. Данная технология может быть применена также для освобождения тканей мозга от токсичного белка бета-амилоида для лечения болезни Альцгеймера и разных форм деменции.

Новое применение фотодинамического лечения мозга за счет фотоактивации лимфа-очистительной функции во время глубокого сна (non rapid eyes movement - NREM стадия) при появлении медленных δ-волн на электроэнцефалограмме (ЭЭГ) существенно повышает эффективность применения метода для освобождения тканей мозга от токсинов.