Результат интеллектуальной деятельности: СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки США № 62/316516, поданной 31 марта 2016 года, полное содержание которой включено посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится, в основном, к связывающим белкам, таким как антитела, которые связываются с белком, подобным альфа-рецептору семейства GDNF (GFRAL), включая белок GFRAL человека, и к способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фактор роста и дифференцировки 15 (GDF15) представляет собой белок, относящийся к суперсемейству трансформирующего фактора роста бета (TGF-β). GDF15 также известен как TGF-PL, MIC-1, PDF, PLAB, NAG-1 и PTGFB. Описано, что мРНК GDF15 наиболее часто встречается в печени, а в некоторых других тканях наблюдаются более низкие уровни. Его экспрессия в печени может значительно повышаться при повреждении таких органов, как печень, почка, сердце и легкое.

Описано, что GDF15 играет роль в регуляции воспалительных и апоптотических путей в поврежденных тканях и во время патологических процессов. Опубликовано, что GDF15 является медиатором кахексии при различных заболеваниях. Однако кахексия представляет собой сложный и не до конца понятный синдром. Кроме того, по меньшей мере, некоторые опухоли сверхэкспрессируют и секретируют GDF15, и повышенные уровни GDF15 в сыворотке были связаны с различными злокачественными опухолями. GDF-15 был описан как негативный регулятор активации макрофагов за счет подавления высвобождения TNF-α, IL-1, IL-2 и MCS-F, таким образом, ингибируя положительную обратную связь местного воспалительного сигнала, аналогично эффектам TGF-β. Моноклональные антитела против GDF15 были описаны в качестве потенциальных терапевтических средств для лечения кахексии и рака. Рецептор для GDF15 неизвестен.

Существует значительная неудовлетворенная потребность в терапевтических средствах, эффективных для лечения потери массы тела, связанной с рядом заболеваний и состояний, включая болезни истощения, такие как кахексия или саркопения, и воспалительные состояния, такие как системное воспаление или острый воспалительный ответ. Существует также значительная неудовлетворенная потребность в терапевтических средствах, эффективных для лечения хронических заболеваний, включая злокачественную опухоль, хроническую почечную недостаточность, хроническое обструктивное заболевание легких, СПИД, туберкулез, хроническое воспалительное заболевание, системное воспаление, и мышечные атрофии, в которые вовлечена непреднамеренная потеря массы тела и/или потеря мышечной массы.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к белкам, которые связываются с белком, подобным альфа-рецептору семейства GDNF (GFRAL), включая такие связывающие белки, как антитела, которые связываются с белком GFRAL. Такие связывающие белки, включая антитела, могут связываться с полипептидом GFRAL, фрагментом GFRAL и/или эпитопом GFRAL. Такие связывающие белки, включая антитела, могут быть антагонистами (например, ингибируют связывание белка GDF15 с белком GFRAL, ингибируют связывание белка RET с белком GFRAL, ингибируют передачу сигнала, индуцированную белком GDF15, и/или ингибируют образование рецепторного комплекса GDF15/GFRAL или GDF15/GFRAL/RET).

Настоящее изобретение также относится к связывающим белкам, включая антитела (например, моноклональные антитела) или их фрагменты, которые (i) связываются с белком GFRAL, (ii) ингибируют связывание белка GDF15 с белком GFRAL, и/или (iii) ингибируют связывание белка RET с белком GFRAL.

В некоторых вариантах осуществления антитела к GFRAL представляют собой гуманизированные антитела, которые связываются с полипептидом GFRAL, фрагментом GFRAL или эпитопом GFRAL. В определенных вариантах осуществления антитело к GFRAL содержит VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и/или VL CDR3 из моноклонального антитела, обозначенного 1C1, 3P10, 12A3, 5F12, 5A20, 8D8, 17J16, 25M22, 2B8, 22N5, 2I23, 6N16, 1B3, 19K19, 2B3, 8C10, 2A9, 24G2, 6G9, 2B11, 1A3, P1B6, P1H8 или P8G4, как описано в настоящем документе, или его гуманизированного варианта. В определенных вариантах осуществления антитело к GFRAL может дополнительно содержать VH FR1, VH FR2, VH FR3, VH FR4, VL FR1, VL FR2, VL FR3 и/или VL FR4 из аминокислотной последовательности иммуноглобулина человека или ее варианта.

В некоторых вариантах осуществления связывающий белок (например, антитело к GFRAL) содержит шесть CDR или менее чем шесть CDR. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок (например, антитело к GFRAL) содержит одну, две, три, четыре, пять, или шесть CDR, выбранных из VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок (например, антитело к GFRAL) содержит одну, две, три, четыре, пять, или шесть CDR, выбранных из VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3 из моноклонального антитела, обозначенного 1C1, 3P10, 12A3, 5F12, 5A20, 8D8, 17J16, 25M22, 2B8, 22N5, 2I23, 6N16, 1B3, 19K19, 2B3, 8C10, 2A9, 24G2, 6G9, 2B11, 1A3, P1B6, P1H8, или P8G4, как описано в настоящем документе, или его гуманизированного варианта. В некоторых вариантах осуществления связывающий белок (например, антитело к GFRAL) дополнительно содержит остовную область или каркасную область, включающую VH FR1, VH FR2, VH FR3, VH FR4, VL FR1, VL FR2, VL FR3, и/или VL FR4 из аминокислотной последовательности иммуноглобулина человека или ее варианта.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело, моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, антигенсвязывающий фрагмент или любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с полипептидом GFRAL (например, с экспрессируемым на клеточной поверхности или растворимым GFRAL), фрагментом GFRAL или эпитопом GFRAL.

Настоящее изобретение также относится к связывающим белкам, таким как антитела к GFRAL, (i) которые конкурентно блокируют связывание (например, дозозависимым образом) антитела к GFRAL, предлагаемого в настоящем документе, с полипептидом GFRAL (например, с экспрессируемым на клеточной поверхности или растворимым GFRAL), фрагментом GFRAL или эпитопом GFRAL и/или (ii) которые связываются с эпитопом GFRAL, который связан с антителом к GFRAL, предлагаемым в настоящем документе. В других вариантах осуществления связывающие белки, такие как антитело к GFRAL, конкурентно блокируют связывание (например, дозозависимым образом) моноклонального антитела 25M22, 3P10, 8D8 или 5F12, описываемого в настоящем документе или его гуманизированного варианта с полипептидом GFRAL (например, с экспрессируемым на клеточной поверхности или растворимым GFRAL), фрагментом GFRAL или эпитопом GFRAL. В других вариантах осуществления связывающие белки, такие как антитело к GFRAL, связываются с эпитопом GFRAL, который связан (например, распознан) моноклональным антителом 25M22, 3P10, 8D8 или 5F12, описываемым в настоящем документе, или его гуманизированным вариантом.

Настоящее изобретение также относится к связывающим белкам, включая антитела или их фрагменты, которые (i) связываются с эпитопом белка GFRAL, распознаваемого антителом, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:3, 7, 11, или 15 и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:4, 8, 12, или 16, соответственно; или (ii) конкурируют за связывание с белком GFRAL с антителом, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:3, 7, 11, или 15 и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:4, 8, 12, или 16, соответственно. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предлагаются связывающие белки, включая антитела или их фрагменты, которые связываются с областью, включающей эпитоп, из одной или нескольких аминокислот белка GFRAL (например, человеческого белка GFRAL). В некоторых вариантах осуществления связывающие белки, включая антитела или их фрагменты, связываются с областью белка GFRAL (например, с одним или несколькими аминокислотными остатками внеклеточного домена) включая, например, те белки, которые связываются с: (i) доменом 1 белка GFRAL (например, с аминокислотными остатками от Q20 до S130 из SEQ ID NO:1797); (ii) доменом 2 белка GFRAL (например, с аминокислотными остатками от C131 до C210 из SEQ ID NO:1797); (iii) доменом 3 белка GFRAL (например, с аминокислотными остатками от C220 до C316 из SEQ ID NO:1797); или (iv) внеклеточным доменом белка GFRAL (например, с аминокислотными остатками от Q20 до E351 из SEQ ID NO:1797).

В некоторых вариантах осуществления связывающие белки, включая антитела или их фрагменты, предлагаемые в настоящем документе, связываются с определенным эпитопом (например, с одним или несколькими аминокислотными остатками) белка GFRAL, включая, например, те белки, которые связываются с: (i) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков SER156, GLN147, LEU148, ALA149, SER150, TYR151, LEU152, LYS153, ALA154, CYS155, PHE174, TYR175, GLU136, ALA137, CYS138, VAL139, GLY140, ASP141, VAL142, VAL143, CYS144, ASN145, ALA146, LEU186, CYS189, CYS191, ALA192, GLN193, SER194, ASP195, ILE196, PRO197, CYS198, GLN199, GLN200, SER201, LYS202, GLU203, ALA204, LEU205, HIS206, SER207, SER130, CYS131, LEU132, GLU133, VAL134, или ALA135 белка GFRAL (SEQ ID NO:1797); (ii) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков LEU132, GLU133, VAL134, ALA135, GLU136, ALA137, CYS138, VAL139, GLY140, ASP141, VAL142, VAL143, CYS144, ASN145, ALA146, GLN147, LEU148, ALA149, SER150, TYR151, PHE174, TYR175, ALA169, ALA170, ILE171, ARG172, PHE173, GLN176, ASN177, ILE178, PRO179, PHE180, ASN181, ILE182, ALA183, GLN184, MET185, LEU186, ALA187, PHE188, или CYS189 из SEQ ID NO:1797; (iii) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков LEU164, LYS208, VAL212, ASN213, MET214, VAL215, PRO216, PRO217, PRO218, THR219, CYS220, LEU221, VAL223, TRP245, LEU267, CYS269, GLN28, VAL289, GLN290, CYS291, THR292, CYS293, ARG294, THR295, ILE296, THR297, GLN298, SER299, GLU300, GLU301, SER302, LEU303, CYS304, LYS305, ILE306, PHE307, GLN308, HIS309, MET310, LEU311, HIS312, ARG313, LYS314, SER315, CYS316, или PHE317 из SEQ ID NO:1797; (iv) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков CYS233, ARG234, ARG235, HIS236, TYR237, ARG238, THR239, PHE240, GLN241, SER242, LYS243, CYS244, TRP245, GLN246, ARG247, VAL248, THR249, ARG250, LYS251, CYS252, HIS253, GLU254, ASP255, GLU256, ASN257, CYS258, ILE259, SER260, THR261, LEU262, SER263, LYS264, ASP266, LEU267, THR268, SER272, ASP274, CYS275, ALA278, CYS269, SER270, SER302, LEU303, ILE306, HIS309, LEU311, MET310, SER315, или CYS316 из SEQ ID NO:1797; (v) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков GLY140, LEU148, ALA149, ALA146, VAL142, ASN145, VAL139, ALA135, GLU136, LEU152, LEU132, SER201, ALA204, LEU205, LYS153, ILE196, PRO197, или GLN200 из SEQ ID NO:1797; (vi) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков GLU136, ALA137, VAL139, GLY140, ASP141, VAL142, VAL143, CYS144, ASN145, ALA146, GLN147, PHE173, ASN177, ILE178, PRO179, ASN181, ILE182, или MET185 из SEQ ID NO:1797; (vii) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков GLN298 или GLU301 из SEQ ID NO:1797; или (viii) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков ARG234, ARG238, GLN241, SER242, LYS243, TRP245, GLN246, THR249, ARG250, LYS251, CYS252, HIS253, ASP255, ASN257, CYS258, SER260, THR261, или LEU262 из SEQ ID NO:1797. Такие вышеуказанные антитела могут, в некоторых вариантах осуществления, ингибировать передачу сигнала, индуцированную GDF15, и/или передачу сигнала или активацию рецепторного комплекса GFRAL/GDF15 или RET/GFRAL/GDF15, например, в клетке, которая экспрессирует белок GFRAL. Дополнительно, в некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело, например, гуманизированное, человеческое или химерное антитело.

В некоторых вариантах осуществления связывающие белки, такие как антитела к GFRAL, предлагаемые в настоящем документе, конъюгированы или рекомбинантно связаны с диагностическим средством, детектируемым средством (например, радиоактивным изотопом, ферментом, флуоресцентным соединением, биолюминисцентным соединением или хемилюминесцентным соединением). В некоторых вариантах осуществления связывающие белки, такие как антитела к GFRAL, предлагаемые в настоящем документе, применяют (например, вводят) с терапевтическим средством. В некоторых аспектах, терапевтическое средство представляет собой лекарственное средство, в том числе одно или несколько лекарственных средств, таких как ингибитор активина-A, ингибитор ActRIIB, ингибитор IL-6 или ингибитор IL-6R, грелин, миметик грелина или агонист GHS-Rla, SARM, ингибитор TNFα, ингибитор IL-la, ингибитор миостатина, бета-блокатор, ингибитор пептида меланокортина, ингибитор рецептора меланокортина, или противоопухолевое средство.

В определенных вариантах осуществления предлагаются композиции, содержащие связывающий белок, такой как антитело к GFRAL, описываемое в настоящем документе. Также в настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции, содержащие связывающий белок, такой как антитело к GFRAL, описываемое в настоящем документе.

Настоящее изобретение также относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелую цепь иммуноглобулина, легкую цепь иммуноглобулина, область VH, область VL, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3 связывающих белков (например, антител к GFRAL), которые связываются с полипептидом GFRAL, полипептидным фрагментом GFRAL или эпитопом GFRAL (например, с одной или несколькими аминокислотами белка GFRAL, в том числе из внеклеточного домена белка GFRAL). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует область VH, область VL, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3 моноклонального антитела, обозначенного как 1C1, 3P10, 12A3, 5F12, 5A20, 8D8, 17J16, 25M22, 2B8, 22N5, 2I23, 6N16, 1B3, 19K19, 2B3, 8C10, 2A9, 24G2, 6G9, 2B11, 1A3, P1B6, P1H8, или P8G4, как описано в настоящем документе, или его гуманизированного варианта. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты дополнительно кодирует остовную область или каркасную область, включая VH FR1, VH FR2, VH FR3, VH FR4, VL FR1, VL FR2, VL FR3, и/или VL FR4 из аминокислотной последовательности иммуноглобулина человека или ее варианта. Также в настоящем документе предлагаются векторы и клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающий белок, такой как антитело к GFRAL, а также предлагаются способы получения связывающего белка, такого как антитело к GFRAL, путем культивирования клеток-хозяев, предлагаемых в настоящем документе, в условиях, которые способствуют выработке связывающего белка, такого как антитело к GFRAL.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения, профилактики или облегчения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GFRAL, включая заболевание, нарушение или состояние, опосредованное GDF15 (например, один или несколько симптомов), включающим введение индивидууму, в том числе нуждающемуся в этом индивидууму, терапевтически эффективного количества связывающего белка, такого как антитело к GFRAL, предлагаемого в настоящем документе, таким образом, проводя лечение, профилактику или облегчение заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние вызвано белком GDF15 или иным образом ассоциировано с белком GDF15 (например, человеческим белком GDF15) и/или белком GFRAL (например, человеческим белком GFRAL), такое как заболевания, связанные с передачей сигнала, индуцированной GDF15, у индивидуума. В определенных вариантах осуществления заболевание, нарушение, или состояние можно лечить путем уменьшения возникновения, частоты или тяжести кахексии, саркопении, или мышечной атрофии, костной атрофии или непреднамеренной потери массы тела. В определенных вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой кахексию. В определенных вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой злокачественную опухоль. В определенных вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой сердечно-сосудистое заболевание. В определенных вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой хроническое воспалительное заболевание (например, хроническую почечную недостаточность, хроническое обструктивное заболевание легких). В определенных вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой злокачественную опухоль, которая имеет сниженную чувствительность (например, устойчивость) к химиотерапевтическому средству (например, антителу к опухоли, такому как трастузумаб), которая вызвана белком GDF15 или связана с белком GDF15, в том числе, с повышенными уровнями GDF15.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой кахексию, саркопению, мышечную атрофию или потерю мышечной массы, костную атрофию, непреднамеренную потерю массы тела, или связано с кахексией, саркопенией, мышечной атрофией или потерей мышечной массы, костной атрофией, непреднамеренной потерей массы тела (например, потерей массы тела, связанной с заболеванием, нарушением или состоянием, или вызванной заболеванием, нарушением или состоянием). В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние выбрано из группы первичных заболеваний, ассоциированных с кахексией, включая в качестве неограничивающих примеров, злокачественную опухоль, хроническую почечную недостаточность, хроническое обструктивное заболевание легких, СПИД, туберкулез, хронические воспалительные заболевания, сепсис и другие формы системного воспаления, мышечную атрофию, такую как миодистрофия, и пищевое расстройство, известное как нервная анорексия.

В некоторых вариантах осуществления способы лечения, профилактики или улучшения включают способы улучшения набора массы тела или уменьшения потери массы тела, или улучшения набора мышечной массы или уменьшения потери мышечной массы. В некоторых вариантах осуществления способы лечения, профилактики или улучшения приводят к улучшению способов лечения злокачественной опухоли, за счет профилактики, минимизирования или уменьшения возникновения, частоты или тяжести кахексии, саркопении, или мышечной атрофии, костной атрофии или непреднамеренной потери массы тела.

Настоящее изобретение также относится к способам детекции GFRAL в образце, которые включают контакт образца со связывающим белком, таким как антитело к GFRAL, как описано в настоящем документе, который содержит детектируемое вещество. В определенных вариантах осуществления образец содержит клетку, которая экспрессирует на своей поверхности GFRAL.

Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим связывающий белок, такой как антитело к GFRAL, который связывается с полипептидом GFRAL, фрагментом GFRAL или эпитопом GFRAL, как описано в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ.1 показывает выравнивание последовательностей между различными белками GFRAL. SEQ ID NO обозначены в круглых скобках жирным шрифтом.

ФИГ.2 показывает выравнивание последовательностей между различными белками GDF15. SEQ ID NO обозначены в круглых скобках жирным шрифтом.

ФИГ.3 показывает результаты эксперимента по аффинности связывания иллюстративных антител к GFRAL 1C1 и 3P10 с белком GFRAL.

ФИГ.4A-4B показывают выравнивания последовательностей VH и VL для иллюстративных антител к GFRAL. SEQ ID NO обозначены в круглых скобках жирным шрифтом.

ФИГ.5A-5F показывают выравнивания последовательностей VH и VL для иллюстративных антител к GFRAL, которые связываются с доменом 1 (ФИГ.5A-5B), доменом 2 (ФИГ.5C-5D), или доменом 3 (ФИГ.5E-5F) GFRAL. SEQ ID NO обозначены в круглых скобках жирным шрифтом.

ФИГ.6A-6B показывают выравнивания последовательностей VH и VL гуманизированных антител 1C1. SEQ ID NO обозначены в круглых скобках жирным шрифтом.

ФИГ.7A-7B показывают выравнивания последовательностей VH и VL гуманизированных антител 25M22. SEQ ID NO обозначены в круглых скобках жирным шрифтом.

ФИГ.8A-8B показывают выравнивания последовательностей VH и VL гуманизированных антител 17J16. SEQ ID NO обозначены в круглых скобках жирным шрифтом.

ФИГ.9A-9B показывают выравнивания последовательностей VH и VL гуманизированных антител 5F12. SEQ ID NO обозначены в круглых скобках жирным шрифтом.

ФИГ.10A-10B показывают выравнивания последовательностей VH и VL гуманизированных антител 3P10. SEQ ID NO обозначены в круглых скобках жирным шрифтом.

ФИГ.11 показывает результаты анализа антагониста рецептора с использованием гуманизированного антитела к GFRAL.

ФИГ.12 показывает результаты репортерного анализа с Elk1 для гуманизированных антител.

ФИГ.13A-13C показывают результаты эксперимента специфичности иллюстративного гуманизированного антитела к GFRAL.

ФИГ.14A-14B показывают результаты эксперимента, в котором антитело к GFRAL ингибирует потерю массы, индуцированную GDF15, у мышей DIO. На ФИГ.14A, слева направо, вводимое лечение было PBS, 3P10, 1C1, 17J16, 5A20, 25M22, 5F12, и 1MO3, соответственно (для d1, d2 и d3, соответственно). На ФИГ.14B, слева направо, вводимое лечение было PBS, 8D8 и 12A3, соответственно (для d1, d2 и d3, соответственно).

ФИГ.15 показывает результаты эксперимента для антител к GFRAL на модели потери массы тела, индуцированной GDF15.

ФИГ.16 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия антител к GFRAL на потребление пищи.

ФИГ.17 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия антител к GFRAL на массу тела у мышей DIO.

ФИГ.18 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия антител к GFRAL на потребление пищи у мышей DIO.

ФИГ.19 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия антител к GFRAL на жировую массу.

ФИГ.20 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия антител к GFRAL на потерю массы тела, индуцированную GDF15, и потерю жировой ткани и массу нежировых тканей у мышей DIO.

ФИГ.21 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия антител к GFRAL на повышение потребления энергии, индуцированное GDF15, и снижение потребления пищи, индуцированное GDF15, у мышей DIO.

ФИГ.22 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия антител к GFRAL на потерю массы тела, индуцированную GDF15, и потерю жировой ткани и массу нежировых тканей у худых мышей.

ФИГ.23 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия антител к GFRAL на изменения в RER, индуцированные GDF15, и снижение потребления пищи, индуцированное GDF15, у худых мышей.

ФИГ.24 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия антитела к GFRAL (3P10) на массу тела у худых мышей.

ФИГ.25 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего эффекты введения антитела к GFRAL на потребление пищи у худых мышей.

ФИГ.26A-26C показывают результаты эксперимента, демонстрирующего эффекты пищевого аденина.

ФИГ.27A показывает результаты эксперимента, демонстрирующего эффекты пищевого аденина.

ФИГ.27B показывает результаты эксперимента, демонстрирующего эффекты иллюстративного антитела к GFRAL (3P10) на мышах с хронической почечной недостаточностью.

ФИГ.28 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего эффекты иллюстративного антитела к GFRAL (3P10) на мышах с хронической почечной недостаточностью.

ФИГ.29 показывает результаты эксперимента, демонстрирующего воздействия иллюстративного гуманизированного антитела к GFRAL (h3P10) на потерю массы тела, индуцированную GDF15.

ФИГ.30 показывает иллюстративный кристалл комплекса белка GFRAL и белка GDF15.

ФИГ.31 показывает иллюстративную карту электронной плотности для GFRAL.

ФИГ.32 показывает иллюстративную ленточную диаграмму комплекса GFRAL/GDF15, образованного в ассиметричной кристаллической единице GFRAL/GDF15. Домены D2 и D3 белка GFRAL указаны как GFRAL D2 и GFRAL D3.

ФИГ.33 показывает иллюстративную ленточную диаграмму димера двух комплексов GFRAL/GDF15. Домены D2 и D3 белка GFRAL указаны как GFRAL D2 и GFRAL D33.

ФИГ.34A-34B показывают различное представление поверхности димера двух комплексов GFRAL/GDF15.

ФИГ.35 показывает аминокислотные остатки GFRAL, взаимодействующие с аминокислотными остатками GDF15.

ФИГ.36A-36D показывают границу GFRAL/GDF15. Домены D2 и D3 белка GFRAL указаны как GFRAL D2 и GFRAL D3.

ФИГ.37A-37B показывают различные аспекты наложения белка GFRAL на GFRα1, показанные в виде ленточных диаграмм.

ФИГ.38A-38D показывают различные аспекты взаимодействия белка GFRAL с белком RET в модели RET/GFRAL/GDF15.

ФИГ.39A-39B показывают аминокислотные остатки белка GFRAL в интерфейсе с белком RET.

ФИГ.40 показывает примеры кристаллов комплекса с белком GFRAL, 3P10 Fab и 25M22 Fab, полученных в условиях кристаллизации B11, D11, и H8.

ФИГ.41 показывает примеры кристаллов комплекса с белком GFRAL, 8D8 Fab и 5F12 Fab, полученных в условиях кристаллизации C6, E11, и C2.

ФИГ.42 показывает иллюстративные карты электронной плотности областей CDR 3P10 Fab и 25M22 Fab в кристаллической структуре комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab.

ФИГ.43 показывает пример электронной плотности комплекса GFRAL/8D8/5F12 Fab.

ФИГ.44 показывает иллюстративную ленточную диаграмму комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab, образованного в ассиметрической кристаллической единице комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab.

ФИГ.45 показывает выравнивания последовательностей CDR 3P10 Fab и 25M22 Fab (верхние строки) с аминокислотными остатками GFRAL (нижние строки), которые участвуют в связывании 3P10 Fab и 25M22 Fab. Остатки, участвующие во взаимодействии GFRAL-Fab, находятся в рамке. Для 3P10 Fab показаны аминокислотные остатки от Q1 до S120 из SEQ ID NO:1824 для тяжелой цепи и показаны аминокислотные остатки от D1 до F120 из SEQ ID NO:1825 для легкой цепи. Для 25M22 Fab показаны аминокислотные остатки от Q1 до S120 из SEQ ID NO:1826 для тяжелой цепи.

ФИГ.46 показывает ленточную диаграмму, иллюстрирующую взаимодействие эпитопа GFRAL для 3P10 Fab и области CDR тяжелой цепи 3P10 Fab.

ФИГ.47 показывает ленточную диаграмму, иллюстрирующую взаимодействие эпитопа GFRAL для 3P10 Fab и области CDR легкой цепи 3P10 Fab.

ФИГ.48 показывает ленточную диаграмму, иллюстрирующую взаимодействие эпитопа GFRAL для 25M22 и области CDR тяжелой цепи 25M22 Fab.

ФИГ.49 показывает аминокислотные последовательности для белка GFRAL (остатки от S130 до N318 из SEQ ID NO:1797) и остатки тяжелой цепи (HC) 25M22 Fab от Q1 до P138 и от G146 до P225 из SEQ ID NO:1826 и остатки легкой цепи (LC) от D1 до E218 из SEQ ID NO:1827. Остатки, обозначенные белым шрифтом на сером фоне, указывают на аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия для белка GFRAL, и для 25M22 Fab. Остатки на Fab HC или LC на сером фоне с черными или белыми буквами указывают иллюстративные последовательности CDR для 25M22 Fab.

ФИГ.50A-50B показывает аминокислотные остатки в центре интерфейса взаимодействия на белке GFRAL и на 25M22 Fab, участвующие во взаимодействии GFRAL/25M22 Fab.

ФИГ.51 показывает аминокислотные остатки на границе интерфейса взаимодействия на белке GFRAL, участвующие во взаимодействии GFRAL/25M22 Fab.

ФИГ.52 показывает примеры боковых видов ленточной диаграммы, показывающей перекрывание 25M22 Fab и эпитопов GDF15 на белке GFRAL в виде пространственных моделей поверхности (аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия).

ФИГ.53 показывает вид сверху ленточной диаграммы, показывающей перекрывание 25M22 Fab и эпитопов GDF15 на белке GFRAL в виде пространственных моделей поверхности (аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия).

ФИГ.54 показывает аминокислотные последовательности для белка GFRAL (остатки от S130 до N318 из SEQ ID NO:1797) и остатки тяжелой цепи (HC) 3P10 Fab от Q1 до A130 и от G138 до C221 из SEQ ID NO:1824 и остатки легкой цепи (LC) от D1 до C218 из SEQ ID NO:1825. Остатки, обозначенные белым шрифтом на сером фоне, указывают на аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия и для белка GFRAL, и для 3P10 Fab. Остатки на Fab HC или LC на сером фоне с черными или белыми буквами указывают иллюстративные последовательности CDR для 3P10 Fab.

ФИГ.55A-55B показывают ленточную диаграмму, иллюстрирующую кристаллическую структуру комплекса GFRAL/3P10 Fab. Остатки в интерфейсе взаимодействия показаны в виде стержневых моделей (ФИГ.55A) или пространственных моделей поверхности (ФИГ.55B).

ФИГ.56A-56B показывают остатки интерфейса эпитопа GFRAL для 3P10 Fab в виде пространственных моделей поверхности на ленточной диаграмме GFRAL. ФИГ.56A показывает остатки в центре интерфейса взаимодействия, и ФИГ.56B показывает остатки на границе интерфейса взаимодействия.

ФИГ.57 показывает перекрывающиеся остатки белка GFRAL, которые связываются с 3P10 Fab, и остатки белка GFRAL, которые связываются с белком RET в виде пространственных моделей поверхности на ленточной диаграмме белка GFRAL.

ФИГ.58 показывает объединенную область остатков белка GFRAL на границе интерфейса взаимодействия, которые связываются с 3P10 Fab и 25M22 Fab.

ФИГ.59 показывает иллюстративную ленточную диаграмму комплекса GFRAL/8D8/5F12 Fab, образованного в ассиметричной кристаллической единице комплекса GFRAL/8D8/5F12 Fab.

ФИГ.60 показывает иллюстративную ленточную диаграмму участков связывания 8D8 Fab и 5F12 Fab на белке GFRAL. Остатки на белке GFRAL, которые важны для связывания Fab, показаны в виде стержневых моделей.

ФИГ.61 показывает аминокислотные последовательности для белка GFRAL (остатки от S130 до N318 из SEQ ID NO:1797) и остатки тяжелой цепи (HC) 8D8 Fab от Q1 до K217 из SEQ ID NO:1828 и остатки легкой цепи (LC) от D1 до R211 из SEQ ID NO:1829. Остатки, обозначенные белым шрифтом на сером фоне, указывают на аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия и для белка GFRAL, и для 8D8 Fab. Остатки на Fab HC или LC на сером фоне с черными или белыми буквами указывают на иллюстративные последовательности CDR для 8D8 Fab.

ФИГ.62A, 62B, 62C и 62D показывают аминокислотные остатки в центре и на границе интерфейса взаимодействия GFRAL/8D8 Fab.

ФИГ.63A, 63B, 63C и 63D показывают аминокислотные остатки в центре и на границе интерфейса взаимодействия GFRAL/5F12 Fab.

ФИГ.64 показывает аминокислотные последовательности для GFRAL (остатки от S130 до N318 из SEQ ID NO:1797) и остатки тяжелой цепи (HC) 5F12 Fab от Q1 до K223 из SEQ ID NO:1830 и остатки легкой цепи (LC) от N1 до E217 из SEQ ID NO:1831. Остатки, обозначенные белым шрифтом на сером фоне, указывают на аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия и для белка GFRAL, и для 5F12 Fab. Остатки на Fab HC или LC на сером фоне с черными или белыми буквами указывают на иллюстративные последовательности CDR для 5F12 Fab.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе предлагаются связывающие белки, такие как антитела, которые связываются с белком GFRAL, в том числе человеческим белком GFRAL. Уникальным свойством таких связывающих белков, включая антитела, описываемые в настоящем документе, является их антагонистическая природа, в том числе способность ингибировать воздействие белка GDF15 и/или ингибировать связывание белка GDF15 с белком GFRAL или ингибировать связывание белка RET с белком GFRAL, в том числе, когда ингибирование связывания снижает (например, блокирует) передачу сигнала через GDF15. Явно и специфически, связывающие белки, такие как антитела к белку GFRAL, описываемые в настоящем документе (i) связываются с белком GFRAL, (ii) ингибируют связывание белка GDF15 с белком GFRAL, и/или (iii) ингибируют связывание белка RET с белком GFRAL, включая блокирование образования белкового комплекса GDF15/GFRAL или белкового комплекса GDF15/GFRAL/RET или передачу сигнала через GDF15, в том числе, например, измеренные путем нескольких клеточных анализов in vitro. Такие анализы могут включать (1) репортерный анализ ELK1-люцифераза (см., например, Пример 3); и/или (2) анализ ERK-фосфорилирования в клетках U2OS (см., например, Пример 4). Таким образом, ожидается, что связывающие белки, такие как антитела к GFRAL, как описано в настоящем документе, будут ингибировать действия GDF15 in vivo (например, связанные с сигнальной функцией GDF15). Это свойство делает описанные связывающие белки, включая антитела к GFRAL, полноценными терапевтическими средствами для лечения заболеваний, нарушений или состояний, которые вызваны белком GDF15 или иным образом ассоциированы с белком GDF15 (например, человеческим белком GDF15) и/или белком GFRAL (например, человеческим белком GFRAL), таких, как заболевания, связанные с GDF15-индуцированной передачей сигнала у индивидуума.

Связывающие белки, такие как антитела, которые связываются с белком GFRAL, предлагаемые в настоящем документе, имеют общую черту, связанную с противодействием связыванию (i) белка GDF15 с белком GFRAL и/или (ii) белка RET с белком GFRAL. Антитела к GFRAL, предлагаемые в настоящем документе, включают гуманизированные антитела к GFRAL, в том числе гуманизированные антитела к GFRAL, на основе или полученные из 1C1, 3P10, 12A3, 5F12, 5A20, 8D8, 17J16, 25M22, 2B8, 22N5, 2I23, 6N16, 1B3, 19K19, 2B3, 8C10, 2A9, 24G2, 6G9, 2B11, 1A3, P1B6, P1H8, и/или P8G4 с последовательностями CDR, как описано в таблицах 1-24 или на ФИГ.4-10. Такие антитела к GFRAL, включая гуманизированные антитела к GFRAL, связываются со специфическим доменом белка GFRAL, включая, например, антитела, которые связываются с: (i) доменом 1 белка GFRAL (например, с аминокислотными остатками с Q20 по S130 из SEQ ID NO:1797); (ii) доменом 2 белка GFRAL (например, с аминокислотными остатками с C131 до C210 из SEQ ID NO:1797); (iii) доменом 3 белка GFRAL (например, с аминокислотными остатками с C220 до C316 из SEQ ID NO:1797); или (iv) внеклеточным доменом белка GFRAL (например, с аминокислотными остатками с Q20 до E351 из SEQ ID NO:1797).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, связывающие белки, такие как антитела к GFRAL, могут содержать вариабельные области иммуноглобулинов, которые включают одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR), как описано в таблицах 1-24. В таких связывающих белках (например, антителах к GFRAL), CDR могут быть соединены с одной или несколькими областями остова или каркасными областями, которые располагают CDR таким образом, что проявляются надлежащие антигенсвязывающие свойства CDR. Такие связывающие белки, в том числе антитела к GFRAL, как описано в настоящем документе, могут ингибировать (например, блокировать) взаимодействие (i) между белком GDF15 и белком GFRAL и/или (ii) между белком RET и белком GFRAL. Такие связывающие белки, в том числе антитела к GFRAL, как описано в настоящем документе, могут ингибировать (например, блокировать) передачу сигнала посредством GDF15.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, связывающие белки, такие как антитела к GFRAL, связываются с: (i) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков SER156, GLN147, LEU148, ALA149, SER150, TYR151, LEU152, LYS153, ALA154, CYS155, PHE174, TYR175, GLU136, ALA137, CYS138, VAL139, GLY140, ASP141, VAL142, VAL143, CYS144, ASN145, ALA146, LEU186, CYS189, CYS191, ALA192, GLN193, SER194, ASP195, ILE196, PRO197, CYS198, GLN199, GLN200, SER201, LYS202, GLU203, ALA204, LEU205, HIS206, SER207, SER130, CYS131, LEU132, GLU133, VAL134 или ALA135 белка GFRAL (SEQ ID NO:1797); (ii) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков LEU132, GLU133, VAL134, ALA135, GLU136, ALA137, CYS138, VAL139, GLY140, ASP141, VAL142, VAL143, CYS144, ASN145, ALA146, GLN147, LEU148, ALA149, SER150, TYR151, PHE174, TYR175, ALA169, ALA170, ILE171, ARG172, PHE173, GLN176, ASN177, ILE178, PRO179, PHE180, ASN181, ILE182, ALA183, GLN184, MET185, LEU186, ALA187, PHE188 или CYS189 из SEQ ID NO:1797; (iii) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков LEU164, LYS208, VAL212, ASN213, MET214, VAL215, PRO216, PRO217, PRO218, THR219, CYS220, LEU221, VAL223, TRP245, LEU267, CYS269, GLN28, VAL289, GLN290, CYS291, THR292, CYS293, ARG294, THR295, ILE296, THR297, GLN298, SER299, GLU300, GLU301, SER302, LEU303, CYS304, LYS305, ILE306, PHE307, GLN308, HIS309, MET310, LEU311, HIS312, ARG313, LYS314, SER315, CYS316 или PHE317 из SEQ ID NO:1797; (iv) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков CYS233, ARG234, ARG235, HIS236, TYR237, ARG238, THR239, PHE240, GLN241, SER242, LYS243, CYS244, TRP245, GLN246, ARG247, VAL248, THR249, ARG250, LYS251, CYS252, HIS253, GLU254, ASP255, GLU256, ASN257, CYS258, ILE259, SER260, THR261, LEU262, SER263, LYS264, ASP266, LEU267, THR268, SER272, ASP274, CYS275, ALA278, CYS269, SER270, SER302, LEU303, ILE306, HIS309, LEU311, MET310, SER315 или CYS316 из SEQ ID NO:1797; (v) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков GLY140, LEU148, ALA149, ALA146, VAL142, ASN145, VAL139, ALA135, GLU136, LEU152, LEU132, SER201, ALA204, LEU205, LYS153, ILE196, PRO197 или GLN200 из SEQ ID NO:1797; (vi) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков GLU136, ALA137, VAL139, GLY140, ASP141, VAL142, VAL143, CYS144, ASN145, ALA146, GLN147, PHE173, ASN177, ILE178, PRO179, ASN181, ILE182 или MET185 из SEQ ID NO:1797; (vii) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков GLN298 или GLU301 из SEQ ID NO:1797; или (viii) эпитопом белка GFRAL, содержащим, по меньшей мере, один (например, один или несколько) из аминокислотных остатков ARG234, ARG238, GLN241, SER242, LYS243, TRP245, GLN246, THR249, ARG250, LYS251, CYS252, HIS253, ASP255, ASN257, CYS258, SER260, THR261 или LEU262 из SEQ ID NO:1797. Такие вышеуказанные антитела могут, в некоторых вариантах осуществления, ингибировать передачу сигнала, индуцированную GDF15 и/или передачу сигнала или активацию рецепторного комплекса GFRAL/GDF15 или RET/GFRAL/GDF15, например, в клетке, которая экспрессирует белок GFRAL. Дополнительно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, антитело представляет собой моноклональное антитело, например, гуманизированное антитело.

ОБЩИЕ СПОСОБЫ

Способы и процедуры, которые описаны или на которые ссылаются в настоящем документе, включают способы и процедуры, которые, как правило, хорошо известны и/или обычно используются с общепринятой методологией специалистами в данной области, такие как, например, широко используемые методики, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3^rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Z. An, ed, Wiley, Hoboken N.J. (2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, M. Albitar, ed., Humana Press, Totawa, N.J. (2010); и Antibody Engineering, 2^nd Ed., Vols 1 и 2, Kontermann и Dubel, eds., Springer-Verlag, Heidelberg, 2010.

ТЕРМИНОЛОГИЯ

Если не описано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют то же значение, в котором их обычно понимает специалист в данной области. С целью объяснения данного описания, прилагается следующее описание терминов, и при необходимости, термины, используемые в единственном числе, также включают множественное число, и наоборот. Все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации в полном объеме включены в качестве ссылки. В случае, если какое-либо описание предложенных терминов противоречит какому-либо документу, включенному в настоящий документ в качестве ссылки, следует руководствоваться описанием термина, предложенным ниже.

Термин «белок, подобный альфа-рецептору семейства GDNF» «рецептор фактора роста и дифференцировки 15», «GFRAL» или «белок GFRAL» и аналогичные термины относятся к полипептиду («полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо в настоящем документе) или любому нативному GFRAL из любого источника от позвоночных, в том числе млекопитающих, таких как приматы (например, люди, яванский макак), собаки, и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное, и, в определенных вариантах осуществления включает родственные полипептиды GFRAL, в том числе его варианты с SNP. GFRAL также известен в данной области как «C6orf144» «открытая рамка считывания 144 на хромосоме 6», «BA360D14.1», «IVFI9356» и «UNQ9356».

Аминокислотная последовательность полноразмерного предшественника человеческого GFRAL представлена ниже и включает последовательность сигнального пептида (остатки подчеркнуты и написаны строчными буквами):

mivfiflamglsleneytsQTNNCTYLREQCLRDANGCKHAWRVMEDACNDSDPGDPCK MRNSSYCNLSIQYLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNKLLGKKCINKSDNVKEDKFKWNL TTRSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQCQAAIRFF YQNIPFNIAQMLAFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCAVNMVPPPTCLSVIRSCQNDELCR RHYRTFQSKCWQRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQVQCTC RTITQSEESLCKIFQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSPFNGEVI YAAMCMTVTCGILLLVMVKLRTSRISSKARDPSSIQIPGEL (SEQ ID NO:1797).

Аминокислотная последовательность зрелого полипептида человеческого GFRAL представлена ниже:

QTNNCTYLREQCLRDANGCKHAWRVMEDACNDSDPGDPCKMRNSSYCNLSIQ YLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNKLLGKKCINKSDNVKEDKFKWNLTTRSHHGFKGM WSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQCQAAIRFFYQNIPFNIAQML AFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCAVNMVPPPTCLSVIRSCQNDELCRRHYRTFQSKCW QRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQVQCTCRTITQSEESLCKI FQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSPFNGEVIYAAMCMTVTCG ILLLVMVKLRTSRISSKARDPSSIQIPGEL (SEQ ID NO:1798).

В некоторых вариантах осуществления GFRAL относится к белку, который, по меньшей мере, на 55% идентичен аминокислотной последовательности зрелого человеческого GFRAL (SEQ ID NO:1798). Связывающие белки, такие как антитела к GFRAL, как описано в настоящем документе, могут связываться с GFRAL и/или изменять передачу сигнала, как описано в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления антитела, описываемые в настоящем документе, связываются с человеческим GFRAL.

Человеческий GFRAL имеет внеклеточный домен (например, остатки 20-351 из SEQ ID NO:1797), трансмембранный домен (например, остатки 352-371 из SEQ ID NO:1797) и цитоплазматический домен (например, остатки 372-394 из SEQ ID NO:1797).

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид-предшественник GFRAL, представлена ниже:

TTATTCTGGACAGTTACTCTTAAGAAAGTTGTCAGAAGAAACGCATCTGCCTT TTTTTCCAGGTGAACTGCCGTGAGTTGTCCAGCATGATAGTGTTTATTTTCTTGGCTA TGGGGTTAAGCTTGGAAAATGAATACACTTCCCAAACCAATAATTGCACATATTTAA GAGAGCAATGCTTACGTGATGCAAATGGATGTAAACATGCTTGGAGAGTAATGGAA GATGCCTGCAATGATTCAGATCCAGGTGACCCCTGCAAGATGAGGAATTCATCATAC TGTAACCTGAGTATCCAGTACTTAGTGGAAAGCAATTTCCAATTTAAAGAGTGTCTT TGCACTGATGACTTCTATTGTACTGTGAACAAACTGCTTGGAAAAAAATGTATCAAT AAATCAGATAACGTGAAAGAGGATAAATTCAAATGGAATCTAACTACACGTTCCCA TCATGGATTCAAAGGGATGTGGTCCTGTTTGGAAGTGGCAGAGGCATGTGTAGGGG ATGTGGTCTGTAATGCACAGTTGGCCTCTTACCTTAAAGCTTGCTCAGCAAATGGAA ATCCGTGTGATCTGAAACAGTGCCAAGCAGCCATACGGTTCTTCTATCAAAATATAC CTTTTAACATTGCCCAGATGTTGGCTTTTTGTGACTGTGCTCAATCTGATATACCTTG TCAGCAGTCCAAAGAAGCTCTTCACAGCAAGACATGTGCAGTGAACATGGTTCCAC CCCCTACTTGCCTCAGTGTAATTCGCAGCTGCCAAAATGATGAATTATGCAGGAGGC ACTATAGAACATTTCAGTCAAAATGCTGGCAGCGTGTGACTAGAAAGTGCCATGAA GATGAGAATTGCATTAGCACCTTAAGCAAACAGGACCTCACTTGTTCAGGAAGTGA TGACTGCAAAGCTGCTTACATAGATATCCTTGGGACGGTCCTTCAAGTGCAATGTAC CTGTAGGACCATTACACAAAGTGAGGAATCTTTGTGTAAGATTTTCCAGCACATGCT TCATAGAAAATCATGTTTCAATTATCCAACCCTGTCTAATGTCAAAGGCATGGCATT GTATACAAGAAAACATGCAAACAAAATCACTTTAACTGGATTTCATTCCCCCTTCAA TGGAGAAGTAATCTATGCTGCCATGTGCATGACAGTCACCTGTGGAATCCTTCTGTT GGTTATGGTCAAGCTTAGAACTTCCAGAATATCAAGTAAAGCAAGAGATCCTTCATC GATCCAAATACCTGGAGAACTCTGATTCATTAGGAGTCATGGACCTATAACAATCAC TCTTTTCTCTGCTTTTCTTCTTTCCTCTTTTCTTCTCTCCTCTCCTCTCCTCTCTTCTCCT CTCCTCCCCTCCCCTCTCTGTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTCTTTTTTGTGGCGGAGTTTT GCTCTTGTTGCCCAGGCTGCAGTACAATGGCTCAATCTCGGTTCACTGCAACCTCTG CCTCCAAGGTTCAAGTGATTTTCCTGCCTCAGCCTTCCCGAGTAGCTGGGATTACAG GTACCCGCCACCACGCCCAGCTAATTTTTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTTGC CAAATTGGCCAGGGTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAGGTGATCCACCCACCTCGGCC TCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCAACCACGTCAAGACAACAATCACTTT CTTTAAAGCAAATCCTACAGCTGGTCAACACCCTATTCCATCTGTCATCGAGAAAGA AAATGTTAAAATAGACTTAAAAATATTGCTTTGTTACATATAATAATATGGCATGAT GATGTTATTTTTTTCTTAATACTCAAGAAAAAATATATGGTGGTATCTTTTACAACAC TGGAACAGAAATAAAGTTTCCCTTGAAGGC(SEQ ID NO:1799).

«GFRAL», как применяют в настоящем документе, включает человеческий GFRAL и его варианты, включая в качестве неограничивающих примеров его ортологи, такие как мышиный GFRAL, крысиный GFRAL, GFRAL макаки, и тому подобное. GFRAL не является TGFβ RII (ссылочные последовательности NCBI: NM_001024847.2 (GI:133908632); NM_003242.5 (GI:133908633)) или его ортологами. GFRAL отличается от TGFβ RI (ссылочные последовательности NCBI: NP_001124388.1 (GI:195963412); NP_004603.1 (GI:4759226)) или его ортологов. В определенных вариантах осуществления GFRAL может быть белком с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична SEQ ID NO:1797. Такие примеры белков GFRAL включают шимпанзе (99%), яванского макака (92%), гигантскую панду (82%), собаку (81%), кошку (80%), свинью (77%), быка (75%), мышь (70%), крысу (70%), китайского хомячка (65%) и утконоса (59%), как показано на ФИГ.1.

Аминокислотная последовательность белка GFRAL яванского макака (cyno), научное название Macaca fascicularis, приведена ниже с последовательностью сигнального пептида (подчеркнутые остатки):

mivliflalglsleneytsQTNNCTYLREQCLHDANGCKHAWRIMEDACNDSDPGDPCKM NNSSYCNLSIQYLVESNFRFKECLCTDDFYCTVNKLLGKECVNKSDNMREDKFKWNLT THSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACSANGNPCDVKHCQAAIRFFY QNIPFNIAQMLAFCDCSQSDIPCQQSKEALHSKPCALNMVPPPTCLNVIRSCQNDELCRR HYRTFQSKCWQRVTRKCHEDENCISALSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQVQCNCR TITQSEESLCKIFQHMLHRKSCFNYPTLSNVKSMALYTRKHTNKITLTGFQSPFNGEVIYA AMCMTVTCGILLLVMVKLRTSRISSKARDPSLSQVPGEL (SEQ ID NO:1800).

Кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты белка GFRAL для яванского макака приведена ниже:

ACCCACCAGAAAGAAGGAGCTCCAGACACATCTGAACGTCTGAAGGAAGAA ACTCCCGACACACCATCTTTAAGAAATGTAACTCTCACTGCGAGGGTATGTGGCTTC ATTCTTGAAGTCAGGGAGACCAAGAACCCACCAATTGCAGGCACACAAGGGGTCCT TATTTTATTCAGGTGAACAGCTGTGAGTTGTCCAGCATGATAGTGCTTATTTTCTTGG CTTTGGGGCTAAGCTTGGAAAATGAATACACTTCCCAAACCAATAATTGCACATATT TAAGAGAGCAATGCCTACATGATGCAAATGGATGTAAACATGCTTGGAGAATAATG GAAGATGCCTGCAATGATTCAGATCCAGGTGACCCCTGCAAGATGAATAATTCATC ATACTGTAACCTGAGTATCCAGTACTTAGTGGAAAGCAATTTCCGATTTAAAGAGTG TCTTTGCACTGATGACTTCTATTGTACTGTGAACAAACTGCTTGGAAAAGAATGTGT CAATAAATCAGATAACATGAGAGAGGATAAATTCAAATGGAATCTAACTACACATT CCCATCATGGATTCAAAGGGATGTGGTCCTGTTTGGAAGTGGCAGAGGCATGTGTA GGGGATGTGGTCTGTAATGCACAGTTGGCCTCTTACCTTAAAGCTTGCTCAGCAAAT GGAAATCCGTGTGATGTGAAACACTGCCAAGCAGCCATACGGTTCTTCTATCAAAAT ATACCTTTTAACATTGCCCAGATGTTGGCTTTTTGTGACTGTTCTCAATCTGATATAC CTTGTCAGCAGTCCAAAGAAGCTCTTCACAGCAAGCCATGTGCACTGAACATGGTTC CACCCCCTACTTGCCTCAATGTAATTCGCAGCTGCCAAAATGATGAATTATGCAGGA GGCACTATAGAACATTTCAGTCAAAATGCTGGCAGCGTGTGACTAGAAAGTGCCAT GAAGATGAGAATTGCATTAGCGCCTTAAGCAAACAGGACCTCACATGTTCAGGAAG TGATGACTGCAAAGCTGCTTACATAGATATCCTTGGGACAGTCCTTCAAGTGCAATG TAACTGTAGGACCATTACACAAAGTGAGGAATCTTTGTGCAAGATTTTCCAGCACAT GCTTCATAGAAAATCATGTTTCAATTATCCAACCCTGTCTAATGTCAAAAGCATGGC ATTGTATACAAGAAAACATACAAACAAAATCACTTTAACTGGATTTCAGTCCCCCTT CAATGGAGAAGTAATCTATGCTGCCATGTGCATGACAGTCACCTGTGGAATCCTTCT CTTGGTTATGGTCAAGCTTAGAACTTCCAGAATATCAAGTAAAGCAAGAGATCCTTC ACTGAGCCAAGTACCTGGAGAACTCTGATTCATTAGGAGTCATGGACCCATAACAA TCACTCCCCTTCCCTTCCCTTCCCTTCCCTTCCCTTCCCTTCCCTTCCCTTCCCTTCCCT TCC (SEQ ID NO:1801).

Аминокислотная последовательность белка GFRAL мыши, научное название Mus musculus, приведена ниже с последовательностью сигнального пептида (подчеркнутые остатки):

mlvfiflavtlssenesssQTNDCAHLIQKCLIDANGCEQSWRSMEDTCLTPGDSCKINNSL HCNLSIQALVEKNFQFKECLCMDDLHCTVNKLFGKKCTNKTDNMEKDNKDKWNLTTT PFYHGFKQMQSCLEVTEACVGDVVCNAQLALYLKACSANGNLCDVKHCQAAIRFFYQ NMPFNTAQMLAFCDCAQSDIPCQQSKETLHSKPCALNIVPPPTCLSVIHTCRNDELCRTH YRTFQTECWPHITGKCHEDETCISMLGKQDLTCSGSESCRAAFLGTFGTVLQVPCACRG VTQAEEHVCMIFQHMLHSKSCFNYPTPNVKDISSYEKKNSKEITLTGFNSFFNGELLYVV VCMAVTCGILFLVMLKLRIQSEKRDPSSIEIAGGVIIQ (SEQ ID NO:1802).

Кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты белка GFRAL мыши приведена ниже:

AACAATTGAATTTGAATACAATTAGGAAAGTTCACAGCTCAAAACAAACTGG TGAGGAACAGCTGACACCAGAAGCTGACTCTAATTGGCTGGCTCTTAGGAAGCAAA ACCTTTACACAGAAACTTCAGTTGGGATGTTGGTTGGTGTCAGTTCATCCGCCTTTCT CCCAGGGAGACCATCTTGAGTTGTCCAACATGCTAGTGTTCATTTTCCTGGCTGTTAC GTTAAGCTCAGAAAATGAATCCTCTTCCCAAACAAATGATTGTGCACATTTAATACA GAAATGCTTGATTGATGCAAATGGCTGTGAGCAGTCATGGAGATCAATGGAAGACA CCTGCCTTACTCCAGGTGACTCCTGCAAGATAAATAATTCACTACATTGTAACCTGA GTATCCAGGCTTTGGTGGAAAAAAATTTCCAATTTAAAGAGTGTCTTTGTATGGATG ACCTCCACTGTACAGTAAACAAACTTTTTGGAAAAAAGTGCACCAATAAGACAGAT AACATGGAAAAGGACAATAAAGATAAATGGAATCTAACTACTACTCCTTTCTATCAT GGATTCAAACAGATGCAGTCTTGTTTGGAGGTGACAGAGGCGTGTGTAGGGGATGT GGTTTGTAATGCACAGTTGGCCCTTTACCTTAAAGCATGCTCAGCAAATGGAAATCT GTGTGATGTGAAACACTGCCAAGCAGCCATACGGTTCTTCTATCAAAATATGCCTTT TAACACTGCCCAGATGTTGGCTTTTTGTGACTGTGCTCAATCTGATATACCCTGTCAG CAATCCAAAGAAACTCTTCACAGCAAGCCATGTGCACTGAATATAGTTCCACCCCCC ACTTGCCTCAGTGTAATTCACACTTGCCGAAATGATGAATTATGCAGGACACACTAC CGAACATTCCAGACAGAATGCTGGCCCCACATAACTGGGAAGTGCCATGAAGATGA GACCTGCATTAGCATGTTAGGCAAGCAAGACCTTACTTGTTCTGGGAGTGAGAGCTG CAGGGCTGCCTTCCTAGGAACCTTTGGGACAGTCCTGCAAGTACCCTGTGCTTGCAG GGGCGTTACACAGGCTGAAGAACACGTGTGCATGATTTTCCAGCACATGCTTCATAG CAAATCGTGTTTCAATTACCCAACTCCTAATGTCAAAGACATTTCCTCATATGAAAA AAAGAATTCAAAAGAAATTACTCTGACTGGATTCAATTCTTTCTTCAATGGAGAACT ACTCTATGTTGTTGTGTGCATGGCAGTTACCTGTGGAATTCTTTTCTTGGTGATGCTC AAGTTAAGGATACAAAGTGAAAAAAGAGATCCCTCATCCATCGAAATAGCTGGAGG TGTCATCATTCAGTGAGCTGCAGATCACTTACCAACCACATGTCTGTGTGACTAACC AATGGAAAATTACATTTGCCAATAACGCAATTTAAGATGGATTTGACAATATTTAGT CATTATATGTAACAGTGACTGGTACAGTAATATACCACAATGATCACAGATCTGTTT TTGTTTTTGTTTTTAATGTTTGAGTAAATACTTGTTGTGGTGTCATAACTAGTTGATA ACATTTTCTTTAAAGACAACAGGTGTCATGTAAAATGTGACAAATTTGCTGGAAGAC TATCAATCCACATATCAACTTCTATCTTATGGAACTAATCATAATTAGTGTGTGCAGT TTTCTGAACAAGGTTATAGTTTTCCATTAAGTTGGTAAAATTAAAATGCTAAGTAGA ATATTGAGTATACTTGTTATTTATATATTCTTACTTAGTGTCCAATCATTAAACAAAT TGGTAACATTGAACATATTTAGTTAGATGACTGCTTATGAAAATAAGAACTGACATC TTACAAATTTTATAATTTAAATAGTATTGAATTTTACTTTTTATTTGGTATGTTAAGA TTCATAATATATAAAGCAGCTACATTGGTTGAGAAAAGTCAATGGTTACTCCAGTAA TGATATACTTTGTGAATTTATTTATTTTTGCTAATTAATGATCCTGAATGTAATCATG ATGAAATAAAAAAGACATACTTAAATTGCT (SEQ ID NO:1803).

Аминокислотная последовательность белка GFRAL крысы, научное название Rattus norvegicus, приведена ниже с последовательностью сигнального пептида (подчеркнутые остатки):

mlvfiflavrlssenesssQTNDCAYFMRQCLTDTDGCKQSWRSMEDACLVSGDSCKINN PLPCNLSIQSLVEKHFQFKGCLCTDDLHCTVNKIFGKKCTNKTDSMKKDNKYKRNLTTP LYHDTGFKQMQSCLEVTEACVGDVVCNAQLALYLKACTANGNLCDVKHCQAAIRFFY QNMPFNTAQMLAFCDCAQSDIPCQQSKETLHSKPCALNVVPPPTCLSVIHTCRNDELCR TYYRTFQTECWPHVAGKCREDETCISMLGKQDLTCSGSDSCRAAYLGTFGTVLQVPCA CRSITQGEEPLCMAFQHMLHSKSCFNYPTPNVKDISSYERKHSKEITLTGFNSPFSGELIY VVVCMVVTSGILSLVMLKLRIPSKKRDPAPIEIAGAVIIQ (SEQ ID NO:1804).

Кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты белка GFRAL крысы приведена ниже:

ACAAATGATTGTGCATATTTCATGCGGCAATGCTTGACTGATACAGATGGCT GTAAGCAGTCATGGAGATCAATGGAAGACGCCTGCCTTGTCTCAGGTGACTCCTGCA AGATAAATAATCCATTGCCTTGTAACCTGAGTATCCAGTCTTTGGTGGAAAAACATT TTCAATTTAAAGGGTGTCTTTGCACTGATGATCTCCACTGTACAGTAAACAAAATTT TTGGAAAAAAGTGCACCAATAAGACAGATAGCATGAAAAAAGATAATAAATACAA ACGGAATCTAACTACTCCTTTATATCATGATACAGGATTCAAACAGATGCAGTCTTG TTTGGAAGTGACAGAGGCGTGTGTAGGGGATGTGGTTTGTAATGCACAGTTGGCCCT TTACCTTAAAGCATGCACAGCAAATGGAAATCTGTGTGATGTGAAACACTGCCAAG CGGCCATACGGTTCTTCTATCAAAATATGCCTTTTAACACTGCCCAGATGTTGGCTTT TTGTGACTGTGCTCAATCTGATATACCCTGTCAACAATCCAAAGAAACTCTTCACAG CAAGCCATGTGCACTGAACGTAGTTCCACCCCCCACTTGCCTCAGTGTAATTCACAC TTGCCGAAATGATGAATTATGCAGGACATACTACCGAACATTCCAGACAGAATGCT GGCCCCATGTGGCTGGGAAGTGTCGTGAAGATGAGACCTGCATTAGTATGCTGGGC AAGCAAGACCTTACTTGTTCTGGGAGTGACAGCTGCAGGGCAGCCTACCTAGGAAC CTTCGGGACAGTCCTTCAGGTGCCGTGTGCTTGCAGAAGCATCACACAGGGTGAAG AACCCTTGTGCATGGCTTTCCAGCACATGCTTCACAGCAAATCATGTTTCAATTACC CAACTCCTAATGTCAAAGACATTTCCTCATATGAAAGAAAGCATTCAAAAGAAATT ACCCTGACTGGATTCAATTCTCCCTTCAGTGGAGAACTAATCTATGTTGTTGTGTGCA TGGTAGTTACCAGCGGGATTCTTTCCTTGGTGATGCTCAAGCTAAGGATACCTAGTA AGAAAAGAGACCCCGCGCCCATCGAAATAGCTGGAGCTGTCATCATTCAGTGA (SEQ ID NO:1805).

Белок GFRAL или GFRAL также относится к белку, который имеет одно или несколько изменений в аминокислотных остатках (например, в положениях, которые не являются консервативными между вариантами и/или видами) с одновременным сохранением консервативных доменов и который имеет биологическую активность, аналогичную природному GFRAL. GFRAL может быть кодирован последовательностями нуклеиновой кислоты, которые отличаются на одно или несколько оснований от последовательности природной ДНК, но все еще транслируются в аминокислотную последовательность, которая соответствует природному белку из-за вырожденности генетического кода. Белок GFRAL также относится к белку, который отличается от природных последовательностей GFRAL одной или несколькими консервативными заменами и/или метками и/или конъюгатами.

Термин «GFRAL» или «белок GFRAL» включает «полноразмерный» непроцессированный GFRAL, а также любую форму GFRAL, которая приводит к процессингу в клетке. Термин GFRAL или «белок GFRAL» также включает аллельные варианты (например, варианты с SNP); варианты сплайсинга; изоформы; фрагменты; производные; варианты с заменами, делециями и вставками; слитые полипептиды; и межвидовые гомологи, предпочтительно, которые сохраняют активность GFRAL и/или являются достаточными для получения иммунного ответа к GFRAL. Как очевидно специалистам в данной области, антитело к GFRAL, предлагаемое в настоящем документе, может связываться с белком GFRAL, в том числе с полипептидным фрагментом GFRAL, антигеном GFRAL и/или эпитопом GFRAL. Эпитоп может быть частью более крупного антигена GFRAL, который может быть частью более крупного полипептидного фрагмента GFRAL, который, в свою очередь, может быть частью более крупного белка GFRAL. Белок GFRAL может существовать в нативной или денатурированной форме. Белки GFRAL, описываемые в настоящем документе, можно выделять из ряда таких источников, как типы человеческих тканей или из другого источника, или получать рекомбинантными или синтетическими способами. Белок GFRAL может содержать полипептид с такой же аминокислотной последовательностью, что и у соответствующего полипептида GFRAL, полученного из природы. Белки GFRAL включают укороченные или секретируемые формы полипептида GFRAL (например, последовательность внеклеточного домена), вариантные формы (например, альтернативно сплайсированные формы) и аллельные варианты полипептида. Полипептиды GFRAL, описываемые в настоящем документе (например, человеческого GFRAL), можно выделять из ряда таких источников, как типы человеческих тканей или из другого источника, или получать рекомбинантными или синтетическими способами.

В белке GFRAL может отсутствовать, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, и, по меньшей мере, вплоть до 50 или более аминокислот относительно природного полноразмерного полипептида GFRAL. Например, белок GFRAL может не содержать сигнальную последовательность по сравнению с аминокислотной последовательностью природного полипептида GFRAL. Белок GFRAL может также содержать такие же или аналогичные посттрансляционные модификации, как и природный полипептид GFRAL или может не содержать посттрансляционную модификацию. Например, белок может иметь такой же или аналогичный паттерн гликозилирования, как и природный полипептид GFRAL, или может не содержать гликозилирования. В других вариантах осуществления белок GFRAL включает мутации относительно последовательности природного белка GFRAL, которые вводят участок гликозилирования в положении, отсутствующем в природном белке GFRAL.

В определенных вариантах осуществления белок GFRAL можно экспрессировать в рекомбинантной клетке, которая генетически модифицирована для экспрессии белка GFRAL на клеточной поверхности. Клетка может присутствовать в композиции, которая включает выделенный белок GDF15. В определенных случаях, клетка может дополнительно экспрессировать белок RET, например, клетка может экспрессировать белок RET эндогенно без генетической модификации для включения экзогенной последовательности, кодирующей белок RET. В других вариантах осуществления клетка может не экспрессировать выявляемые уровни белка RET и может быть генетически модифицирована для экспрессии белка RET с экзогенной последовательности.

Также в настоящем документе описаны фрагменты белка GFRAL, такие как фрагменты GFRAL, у которых отсутствует внутриклеточный домен, присутствующий в нативном белке GFRAL, или внутриклеточный домен и трансмембранный домен, присутствующие в нативном белке GFRAL, таком как нативный GFRAL, показанный на ФИГ.1. Как указано выше, во фрагменте белка GFRAL может также отсутствовать сигнальная последовательность, присутствующая в нативном белке GFRAL, и он может содержать или не содержать гетерологичную сигнальную последовательность. Во фрагменте может отсутствовать внутриклеточный домен, присутствующий в нативном белке GFRAL, но присутствует трансмембранный домен.

Термин «внеклеточный домен GFRAL» («GFRAL-ECD») включает полноразмерные внеклеточные домены GFRAL, фрагменты GFRAL-ECD и варианты GFRAL-ECD. Как применяют в настоящем документе, термин «GFRAL ECD» относится к полипептиду GFRAL с наличием или отсутствием сигнального пептида, в котором отсутствуют внутриклеточные и/или трансмембранные домены. В некоторых вариантах осуществления GFRAL ECD относится к белку с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 70% идентична аминокислотной последовательности человеческого полноразмерного GFRAL ECD с аминокислотной последовательностью:

QTNNCTYLREQCLRDANGCKHAWRVMEDACNDSDPGDPCKMRNSSYCNLSIQ YLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNKLLGKKCINKSDNVKEDKFKWNLTTRSHHGFKGM WSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQCQAAIRFFYQNIPFNIAQML AFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCAVNMVPPPTCLSVIRSCQNDELCRRHYRTFQSKCW QRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQVQCTCRTITQSEESLCKI FQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSPFNGE (SEQ ID NO:1806).

Как применяют в настоящем документе термин «полноразмерный GFRAL ECD», относится к GFRAL ECD, который простирается до последней аминокислоты внеклеточного домена, и может включать или не включать N-концевой сигнальный пептид. Однако следует отметить, что «полноразмерный GFRAL ECD» также включает GFRAL-ECD, который расширяется на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислот на C-конце и включает аминокислотные остатки трансмембранного домена, при условии, что полипептид является растворимым. Другими словами, у такого GFRAL ECD отсутствует достаточная длина трансмембранного домена, таким образом, что он не может закрепляться в мембране клетки. Фраза «полноразмерный GFRAL ECD» также включает GFRAL-ECD, который расширяется на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислот на N-конце и включает аминокислотные остатки сигнального пептида. В определенных вариантах осуществления GFRAL ECD относится к непрерывной аминокислотной последовательности, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична непрерывной аминокислотной последовательности, показанной на ФИГ.1 и у которой отсутствует, по меньшей мере, 30, 33, 35, 40, 45, 50, или 55 или более аминокислот на C-конце последовательностей GFRAL, показанных на ФИГ.1.

GFRAL ECD не является ECD TGFβ RII (номера доступа: NM_001024847.2; NM_003242.5) или его ортологом. GFRAL ECD отличается от ECD TGFβ RI (Номера доступа: NP_001124388.1; NP_004603.1) или его ортологов. В определенных вариантах осуществления GFRAL ECD может быть белком с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO:1806.

Как применяют в настоящем документе, термин «фрагмент GFRAL ECD» относится к GFRAL ECD, у которого удалены один или несколько остатков с N- и/или C-конца полноразмерного ECD и который сохраняет способность связываться с GDF15. В некоторых случаях, фрагмент GFRAL ECD может содержать или не содержать N-концевой сигнальный пептид. В некоторых случаях, фрагмент GFRAL ECD представляет собой фрагмент человеческого GFRAL ECD, в котором отсутствуют 1, 5, 10, 15, 16, 17, 18, или 19 остатков, присутствующих на N-конце последовательности:

MIVFIFLAMGLSLENEYTSQTNNCTYLREQCLRDANGCKHAWRVMEDACNDSD PGDPCKMRNSSYCNLSIQYLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNKLLGKKCINKSDNVKEDK FKWNLTTRSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQCQ AAIRFFYQNIPFNIAQMLAFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCAVNMVPPPTCLSVIRSCQ NDELCRRHYRTFQSKCWQRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVL QVQCTCRTITQSEESLCKIFQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSP FNGE (SEQ ID NO:1807)

Другой иллюстративный фрагмент GFRAL ECD содержит следующую аминокислотную последовательность, которая соответствует от Q20 до C316 полноразмерного белка-предшественника человеческого GFRAL:

QTNNCTYLREQCLRDANGCKHAWRVMEDACNDSDPGDPCKMRNSSYCNLSIQ YLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNKLLGKKCINKSDNVKEDKFKWNLTTRSHHGFKGM WSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQCQAAIRFFYQNIPFNIAQML AFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCAVNMVPPPTCLSVIRSCQNDELCRRHYRTFQSKCW QRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQVQCTCRTITQSEESLCKI FQHMLHRKSC (SEQ ID NO:1808)

Еще один иллюстративный фрагмент GFRAL ECD содержит следующую аминокислотную последовательность, которая соответствует от W115 до E351 полноразмерного белка-предшественника человеческого GFRAL:

WNLTTRSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQ CQAAIRFFYQNIPFNIAQMLAFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCAVNMVPPPTCLSVIRSC QNDELCRRHYRTFQSKCWQRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTV LQVQCTCRTITQSEESLCKIFQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHS PFNGE (SEQ ID NO:1809).

Вышеуказанные иллюстративные фрагменты GFRAL ECD применяли в различных способах, как описано в примерах, в том числе для получения кристалла комплекса, содержащего белок GFRAL и белок GDF15 или белок GFRAL и иллюстративное антитело к GFRAL.

В пределах белка GFRAL или GFRAL ECD существуют три домена - домен 1 (D1), домен 2 (D2) и домен 3 (D3). В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность иллюстративного домена D1 представляет собой остатки с Q20 по S130 из SEQ ID NO:1797. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность иллюстративного домена D2 представляет собой остатки с C131 до C210 из SEQ ID NO:1797. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность иллюстративного домена D3 представляет собой остатки с C220 до C316 из SEQ ID NO:1797. Определенные свойства белка GFRAL могут быть отнесены к активности и/или связыванию этих домены, в том числе в пределах ECD. Например, как описано в настоящем документе, аминокислотные остатки внутри D2 идентифицированы как аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия и/или аминокислоты на границе интерфейса взаимодействия для связывания белка GFRAL с белком GDF15. Аналогично, как описано в настоящем документе, аминокислотные остатки внутри D3 идентифицированы как аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия и/или аминокислоты на границе интерфейса взаимодействия для связывания белка GFRAL с белком RET.

Термин «аминокислота в центре интерфейса взаимодействия» или его грамматический эквивалент относится к аминокислотному остатку данного белка, который имеет, по меньшей мере, один атом в пределах менее или равных 4,5 от взаимодействующего белка (например, аминокислота белка GFRAL, который взаимодействует с белком GDF15 или белком RET). Расстояние 4,5 позволяет атомам в пределах радиуса Ван-дер-ваальса плюс возможной опосредованной водой водородной связи образовывать связь с взаимодействующим белком.

Термин «аминокислота на границе интерфейса взаимодействия» или его грамматический эквивалент относится к аминокислотному остатку данного белка, который имеет, по меньшей мере, один атом в пределах менее или равных 5 от аминокислоты в центре интерфейса на данном белке (например, аминокислота белка GFRAL, которая находится в пределах 5 от аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия белка GFRAL, который взаимодействует с белком GDF15 или белком RET). Расстояние равное или менее 5 позволяет белкам связываться с остатками на расстоянии менее чем 5 от аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия на данном белке для того чтобы быть в пределах радиуса Ван-дер-Ваальса взаимодействующего белка.

Как применяют в настоящем документе, термин «варианты GFRAL ECD» относится к GFRAL ECD, которые содержат аминокислотные вставки, делеции или замены и которые сохраняют способность связываться с GDF15. Такие варианты могут быть, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, или 99% идентичны родительскому GFRAL ECD.

«Фактор роста и дифференцировки 15» или «GDF15», также известный в данной области как MIC-1 (макрофагальный ингибиторный цитокин-1), PDF (фактор дифференцировки предстательной железы), PLAB (плацентарный морфогенетический белок кости), NAG-1 (ген, активируемый нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (НПВЛС)), TGF-PL и PTGFB, является членом суперсемейства трансформирующего фактора роста β (TGF-β). GDF15, который синтезируется в виде внутриклеточного белка-предшественника размером 62 кДа, затем расщепляемого фуриноподобной протеазой, секретируется в виде белка с дисульфидными связями размером 25 кДа (см., например, Fairlie et al., J. Leukoc. Biol 65:2-5 (1999)). мРНК GDF15 наблюдают в нескольких тканях, включая печень, почку, поджелудочную железу, толстую кишку и плаценту, и экспрессия GDF15 в печени может быть значительно повышена во время повреждения таких органов, как печень, почки, сердце и легкие.

Предшественник GDF15 представляет собой полипептид из 308 аминокислот (ссылочные последовательности NCBI NP_004855.2; GI:153792495), содержащий сигнальный пептид из 29 аминокислот, про-домен из 167 аминокислот pro-домен, и зрелый домен из 112 аминокислот, который вырезают из про-домена при помощи фуриноподобных протеаз.

Аминокислотная последовательность полипептида-предшественника человеческого GDF15 приведена ниже:

MPGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRE LRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLP EASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSA RPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR EVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGV SLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:1810)

Такой полипептид GDF15 из 308 аминокислот обозначают как "полноразмерный" полипептид GDF15; полипептид GDF15 из 112 аминокислот (аминокислоты 197-308 "полноразмерного" GDF15) представляет собой "зрелый" полипептид GDF15.

«GDF15», как применяют в настоящем документе, включает белок с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 65% идентична аминокислотной последовательности зрелого полипептида человеческого GDF15. Аминокислотная последовательность зрелого полипептида человеческого GDF15 приведена ниже:

ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFR AANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO:1811)

Вышеуказанный иллюстративный зрелый человеческий GDF15 применяли в различных способах, как описано в примерах, в том числе для получения кристалла комплекса, содержащего белок GFRAL и белок GDF15.

Если не указано иначе, термин "GDF15" относится к зрелой человеческой последовательности из 112 аминокислот (например, SEQ ID NO:1811). Кроме того, множество ссылок на конкретные остатки GDF15 относятся к зрелой последовательности из 112 аминокислот (например, остаток 1 является Ala (A), и остаток 112 является Ile (I) из SEQ ID NO:1811). Например, хотя в аминокислотной последовательности предшественника GDF15 предсказаны три сайта вырезания, приводящие к трем предполагаемым формам "зрелого" человеческого GDF15 (например, из 110, 112 и 115 аминокислот), правильной считается зрелая последовательность из 112 аминокислот.

В контексте настоящего изобретения, «GDF15» или «белок GDF15» включает ортологи GDF15 и их модифицированные формы из других видов млекопитающих, и их применение, включая мышь (NP_035949; GI:170784848), шимпанзе (XP_009433302,1; GI:694973734), орангутанга (XP_009251261,1 GI:686757768), макаку резус (EHH29815; GI:355703324), гигантскую панду (XP_002912774; GI:301753921), гиббона (XP_004089328,1; GI:441627981), морскую свинку (XP_003465238; GI:348558868), хорька (AER98997; GI:355689945), корову (NP_001193227; GI:329664989), свинью (NP_001167527; GI:291291599), собаку (XP_541938; GI:57101740) и утконоса (Ornithorhynchus anatinus; AFV61279; GI:410111209). Такие иллюстративные белки GDF15 показаны на ФИГ.2, которая включает выравнивание различных иллюстративных белков GDF15. Зрелая форма человеческого GDF15 имеет приблизительно 67% идентичности аминокислот с мышиным ортологом.

«RET», также известный в данной области как протоонкоген Ret, член 16 семейства, связанного с кадгерином, белок, перегруппирующийся во время трансфекции, рецепторная тирозинкиназа RET, член кадгеринового семейства 12, протонкоген C-Ret, EC 2.7.10,1, CDHF12, CDHR16, RET51, PTC, гидроксиарил-протеинкиназа, трансформирующая последовательность RET, и рецепторная тирозинкиназа, представляет собой одну из рецепторных тирозинкиназ, молекул на клеточной поверхности, которые передают сигналы для клеточного роста и дифференцировки. RET действует как ко-рецептор и известен как первичный сигнальный рецептор для лигандов нейротрофического фактора из линии глиальных клеток (GDNF) (у человека, GDNF, артемин, неуртурин и персефин), когда связан с ко-рецепторами-членами семейства альфа-рецепторов GDNF (GFRα). Белок RET (например, RET-ECD) содержит 4 последовательных кадгерин-подобных домена (CLD1-CLD4), с последующим мембранным проксимальным богатым цистином доменом (CRD). Как описано в настоящем документе, белок RET является ко-рецептором с белком GFRAL и белком GDF15 (например, действующими как ко-рецептор с белком RET). Рецепторный комплекс, как описано в настоящем документе, включает белок GFRAL, такой как комплекс RET/GFRAL, комплекс GFRAL/GDF15 и комплекс RET/GFRAL/GDF15.

Как применяют в настоящем документе, «Ret» или «RET» относится к белку с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 75% идентична, например, на 77%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:1813. RET отличается от TGFβ RI и TGFβ RII. SEQ ID NO:1812 представляет собой последовательность зрелого человеческого RET9 без сигнального пептида:

KVALGLYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPSFRLGQHLYGTY RTRLHENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLKVFLSPTSLREGE CQWPGCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFHQFRLLPVQFLCP NISVAYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALDREQREKYELVAVCTVHAGAREEVVMV PFPVTVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDADVVPASGELVRRY TSTLLPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNRNLSISENRTMQL AVLVNDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFAQIGKVCVENCQ AFSGINVQYKLHSSGANCSTLGVVTSAEDTSGILFVNDTKALRRPKCAELHYMVVATDQ QTSRQAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSPTGRCEWRQGDG KGITRNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPGEPRGIKAGYGTC NCFPEEEKCFCEPEDIQDPLCDELCRTVIAAAVLFSFIVSVLLSAFCIHCYHKFAHKPPISS AEMTFRRPAQAFPVSYSSSGARRPSLDSMENQVSVDAFKILEDPKWEFPRKNLVLGKTL GEGEFGKVVKATAFHLKGRAGYTTVAVKMLKENASPSELRDLLSEFNVLKQVNHPHVI KLYGACSQDGPLLLIVEYAKYGSLRGFLRESRKVGPGYLGSGGSRNSSSLDHPDERALT MGDLISFAWQISQGMQYLAEMKLVHRDLAARNILVAEGRKMKISDFGLSRDVYEEDSY VKRSQЗАЖИМVKWMAIESLFDHIYTTQSDVWSFGVLLWEIVTLGGNPYPGIPPERLFNL LKTGHRMERPDNCSEEMYRLMLQCWKQEPDKRPVFADISKDLEKMMVKRRDYLDLA ASTPSDSLIYDDGLSEEETPLVDCNNAPLPRALPSTWIENKLYGRISHAFTRF (SEQ ID NO:1812)

Далее представлена аминокислотная последовательность полноразмерного предшественника человеческого белка RET, которая включает последовательность сигнального пептида (остатки подчеркнуты и написаны строчными буквами):

makatsgaaglrlllllllpllgkvalgLYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPS FRLGQHLYGTYRTRLHENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLK VFLSPTSLREGECQWPGCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFH QFRLLPVQFLCPNISVAYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALDREQREKYELVAVCTV HAGAREEVVMVPFPVTVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDAD VVPASGELVRRYTSTLLPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNR NLSISENRTMQLAVLVNDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFA QIGKVCVENCQAFSGINVQYKLHSSGANCSTLGVVTSAEDTSGILFVNDTKALRRPKCA ELHYMVVATDQQTSRQAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSP TGRCEWRQGDGKGITRNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPG EPRGIKAGYGTCNCFPEEEKCFCEPEDIQDPLCDELCRTVIAAAVLFSFIVSVLLSAFCIHC YHKFAHKPPISSAEMTFRRPAQAFPVSYSSSGARRPSLDSMENQVSVDAFKILEDPKWEF PRKNLVLGKTLGEGEFGKVVKATAFHLKGRAGYTTVAVKMLKENASPSELRDLLSEFN VLKQVNHPHVIKLYGACSQDGPLLLIVEYAKYGSLRGFLRESRKVGPGYLGSGGSRNSS SLDHPDERALTMGDLISFAWQISQGMQYLAEMKLVHRDLAARNILVAEGRKMKISDFG LSRDVYEEDSYVKRSQЗАЖИМVKWMAIESLFDHIYTTQSDVWSFGVLLWEIVTLGGNP YPGIPPERLFNLLKTGHRMERPDNCSEEMYRLMLQCWKQEPDKRPVFADISKDLEKMM VKRRDYLDLAASTPSDSLIYDDGLSEEETPLVDCNNAPLPRALPSTWIENKLYGRISHAF TRF (SEQ ID NO:1813)

Таким образом, «RET» или «белок RET», как применяют в настоящем документе, включает человеческий RET и его варианты, включая в качестве неограничивающих примеров его ортологи, такие как мышиный RET, RET макаки и тому подобное. В определенных вариантах осуществления RET может быть белком с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична SEQ ID NO:1813.

В определенных вариантах осуществления предлагается выделенный полипептид внеклеточного домена RET (RET-ECD). RET-ECD может быть связан с лигандом, таким как белок GFRAL, который присутствует в выделенном белковом комплексе по настоящему изобретению. Термин «внеклеточный домен RET» («RET-ECD») включает полноразмерные RET ECD, фрагменты RET ECD, и варианты RET ECD. Как применяют в настоящем документе, термин «RET ECD» относится к полипептиду RET с наличием или отсутствием сигнального пептида, в котором отсутствуют внутриклеточные и трансмембранные домены. В некоторых вариантах осуществления RET ECD относится к белку с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 75% идентична аминокислотной последовательности человеческого полноразмерного RET ECD с аминокислотной последовательностью:

KVALGLYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPSFRLGQHLYGTY RTRLHENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLKVFLSPTSLREGE CQWPGCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFHQFRLLPVQFLCP NISVAYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALDREQREKYELVAVCTVHAGAREEVVMV PFPVTVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDADVVPASGELVRRY TSTLLPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNRNLSISENRTMQL AVLVNDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFAQIGKVCVENCQ AFSGINVQYKLHSSGANCSTLGVVTSAEDTSGILFVNDTKALRRPKCAELHYMVVATDQ QTSRQAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSPTGRCEWRQGDG KGITRNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPGEPRGIKAGYGTC NCFPEEEKCFCEPEDIQDPLCDELCR (SEQ ID NO:1814)

В другом иллюстративном варианте осуществления, RET ECD относится к белку с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 75% идентична аминокислотной последовательности человеческого полноразмерного RET ECD с аминокислотной последовательностью:

LYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPSFRLGQHLYGTYRTRLH ENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLKVFLSPTSLREGECQWP GCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFHQFRLLPVQFLCPNISV AYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALDREQREKYELVAVCTVHAGAREEVVMVPFPV TVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDADVVPASGELVRRYTSTL LPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNRNLSISENRTMQLAVLV NDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFAQIGKVCVENCQAFSGI NVQYKLHSSGANCSTLGVVTSAEDTSGILFVNDTKALRRPKCAELHYMVVATDQQTSR QAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSPTGRCEWRQGDGKGIT RNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPGEPRGIKAGYGTCNCFP EEEKCFCEPEDIQDPLCDELCR (SEQ ID NO:1815)

Как применяют в настоящем документе термин «полноразмерный RET ECD», относится к RET ECD, который простирается до последней аминокислоты внеклеточного домена, и может включать или не включать N-концевой сигнальный пептид. Однако следует отметить, что «полноразмерный RET ECD» также включает RET-ECD, который расширяется на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислот на C-конце и включает аминокислотные остатки трансмембранного домена, при условии, что полипептид является растворимым. Другими словами, у RET ECD отсутствует достаточная длина трансмембранного домена, таким образом, что он не может закрепляться в мембране клетки. Фраза «полноразмерный RET ECD» также включает RET-ECD, который расширяется на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 аминокислот на N-конце и включает аминокислотные остатки сигнального пептида. В определенных вариантах осуществления полноразмерный RET относится к непрерывной аминокислотной последовательности, которая, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична непрерывной аминокислотной последовательности RET, описываемой в настоящем документе, и у которой отсутствует, по меньшей мере, 30, 33, 35, 40, 45, 50, или 55 или более аминокислот на C-конце последовательностей RET, описываемых в настоящем документе.

Как применяют в настоящем документе, термин «фрагмент RET ECD» относится к RET ECD, у которого удалены один или несколько остатков с N- и/или C-конца полноразмерного ECD и который сохраняет способность связываться с белком GFRAL. В некоторых случаях, фрагмент RET ECD может содержать или не содержать N-концевой сигнальный пептид. В некоторых случаях, фрагмент RET ECD представляет собой фрагмент человеческого RET ECD, в котором отсутствуют 1, 5, 10, 15, 16, 17, 18, или 19 остатков, присутствующих на N-конце последовательности:

LYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPSFRLGQHLYGTYRTRLH ENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLKVFLSPTSLREGECQWP GCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFHQFRLLPVQFLCPNISV AYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALDREQREKYELVAVCTVHAGAREEVVMVPFPV TVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDADVVPASGELVRRYTSTL LPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNRNLSISENRTMQLAVLV NDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFAQIGKVCVENCQAFSGI NVQYKLHSSGANCSTLGVVTSAEDTSGILFVNDTKALRRPKCAELHYMVVATDQQTSR QAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSPTGRCEWRQGDGKGIT RNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPGEPRGIKAGYGTCNCFP EEEKCFCEPEDIQDPLCDELCR (SEQ ID NO:1816)

Вышеуказанный иллюстративный фрагмент RET ECD применяли в различных способах, как описано в примерах, в том числе для получения модели комплекса, содержащего белок RET, белок GFRAL и белок GDF15.

В альтернативных вариантах осуществления RET ECD, RET-ECD содержит мутацию C64R, N75Q, N166Q, или C183S в последовательности RET ECD из последовательности человеческого полноразмерного RET ECD SEQ ID NO 1814.

Фраза "регулирует активность и/или передачу сигнала" по отношению к связывающему белку, такому как антитело, которое связывается с GFRAL по настоящему изобретению, означает, что связывающий белок (например, антитело) имитирует или регулирует биологический эффект in vitro или in vivo, индуцированный связыванием: (i) белка GFRAL; (ii) белка GDF15 и белка GFRAL; или (iii) белка GDF15, белка GFRAL и белка RET. При оценке связывания и специфичности антитело к GFRAL, например, антитело или его фрагмент, которые связываются с белком GFRAL (например, человеческим белком GFRAL), считаются вызвавшими биологический ответ, когда ответ равен или меньше чем 95%, и предпочтительно равен или менее чем 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% от активности стандарта GFRAL дикого типа (например, зрелой формы белка GFRAL человека). Антитело или его фрагмент, который связывается с GFRAL (например, человеческим GFRAL), также считаются вызвавшими биологический ответ, когда он обладает одним или несколькими из следующих свойств: демонстрирование уровня эффективности, равного или менее чем 95% от стандарта GFRAL, с IC50 равным или менее чем 100 нМ, например, 90 нМ, 80 нМ, 70 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ 0,01 нМ в (1) репортерном анализе с ELK1-люциферазой (см., например, Пример 3); или (2) анализе ERK-фосфорилирования в клетках U2OS (см., например, Пример 4).

Термин "связывающий белок" относится к белку, содержащему часть (например, одну или несколько связывающих областей, таких как CDR), которая связывается с белком GFRAL, в том числе с человеческим белком GFRAL и, необязательно, часть остова или каркасную часть (например, одну или несколько поддерживающих или каркасных областей), которая позволяет связывающей части принять конформацию, способствующую связыванию связывающего белка с полипептидом, фрагментом или эпитопом GFRAL. Примеры таких связывающих белков включают антитела, такие как антитело человека, гуманизированное антитело; химерное антитело; рекомбинантное антитело; одноцепочечное антитело; диатело; триотело; тетратело; Fab-фрагмент; F(ab')₂-фрагмент; антитело IgD; антитело IgE; антитело IgM; антитело IgG1; антитело IgG2; антитело IgG3; или антитело IgG4, и их фрагменты. Связывающий белок может содержать, например, альтернативный белковый каркас или искусственный каркас с привитыми CDR или производными CDR. Такие каркасы в качестве неограничивающих примеров включают, каркасы, полученные из антител и содержащие мутации, которые вводят, например, для стабилизации трехмерной структуры связывающего белка, а также полностью синтетические каркасы, содержащие, например, биосовместимый полимер. См., например, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1):121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog 20:639-654 (2004). Кроме того, можно использовать пептидные антителомиметики ("PAM"), а также каркасы на основе антителомиметиков, с использованием фибронектиновых компонентов в качестве каркаса. В контексте настоящего изобретения, говорят, что связывающий белок специфически связывается или избирательно связывается с GFRAL, например, когда константа диссоциации (K_D) составляет ≤10^-8 M. Связывающий белок (например, антитело) может специфически связываться с GFRAL с высокой аффинностью, когда K_D составляет ≤10^-9 M или K_D составляет ≤10^-10M. В некоторых вариантах осуществления связывающие белки (например, антитела) могут связываться с GFRAL, в том числе с K_D приблизительно от 10^-7 M и приблизительно до 10^-12 M, и в других вариантах осуществления связывающие белки (например, антитела) могут связываться с K_D 1-2×10^-9 M.

Термин «антитело» и «иммуноглобулин» или «Ig» используются взаимозаменяемо в настоящем документе, и применяются в самом широком смысле и конкретно включают, например, отдельные моноклональные антитела к GFRAL (в том числе антитела-агонисты, антитела-антагонисты, нейтрализующие антитела, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), композиции антител к GFRAL с полиэпитопной или моноэпитопной специфичностью, поликлональные или моновалентные антитела, поливалентные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела при условии, что они проявляют желательную биологическую активность), образованные, по меньшей мере, из двух интактных антител, одноцепочечные антитела к GFRAL, и фрагменты антител к GFRAL, как описано ниже. Антитело может быть человеческим, гуманизированным, химерным и/или аффинно зрелым, а также антителом из других видов, например, мышиным, кроличьим и тому подобное. Термин «антитело» подразумевает включение в него полипептидного продукта B-клеток в пределах иммуноглобулинового класса полипептидов, который способен связываться со специфическим молекулярным антигеном и состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну тяжелую цепь (приблизительно 50-70 кДа) и одну легкую цепь (приблизительно 25 кДа) и каждая амино-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область приблизительно от 100 до приблизительно 130 или более аминокислот и каждая карбокси-концевая часть каждой цепи включает константную область (См., Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Ed., Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Ed., W.H. Freeman and Company, New York). В конкретных вариантах осуществления, специфический молекулярный антиген, который может связываться с антителом, предлагаемым в настоящем документе, включает полипептид GFRAL, фрагмент GFRAL или эпитоп GFRAL. Антитела также в качестве неограничивающих примеров включают синтетические антитела, моноклональные антитела, рекомбинантно произведенные антитела, полиспецифические антитела (включая би-специфические антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, верблюжьи антитела, химерные антитела, интраантитела, анти-идиотипические (анти-Id) антитела, и функциональные фрагменты (например, антигенсвязывающие фрагменты, такие как GFRAL-связывающие фрагменты) любого из вышеописанных антител, которые относятся к части тяжелой или легкой цепи полипептида антитела, сохраняющей некоторую или всю активность связывания антитела, из которого был получен фрагмент. Неограничивающие примеры функциональных фрагментов (например, антигенсвязывающие фрагменты, такие как GFRAL-связывающие фрагменты) включают одноцепочечные Fv (scFv) (например, в том числе моноспецифические, биспецифические и тому подобное), Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменты, F(ab)₂-фрагменты, F(ab')₂-фрагменты, дисульфид-связанные Fv (sdFv), Fd-фрагменты, Fv-фрагменты, диатело, триотело, тетратело и миниантитело. В частности, антитела предлагаемые в настоящем документе, включают молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов, например, антигенсвязывающие домены или молекулы, которые содержат антигенсвязывающий участок, который связывается с антигеном GFRAL (например, одна или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) антитела к GFRAL). Описание таких фрагментов антител можно найти, например, в Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) and in Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). Антитела, предлагаемые в настоящем документе, могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), или любого подкласса (например, IgG2a и IgG2b) молекулы иммуноглобулина. Антитела к GFRAL могут быть агонистическими антителами или антагонистическими антителами. Антитела, предлагаемые в настоящем документе, включают антагонистические антитела к GFRAL, например, антитела, которые ингибируют передачу сигнала через GFRAL. Иллюстративные антитела к GFRAL включают антитела с CDR, показанные в таблицах 1-24.

Термины «приблизительно» или «примерно» означают в пределах 20%, в пределах 15%, в пределах 10%, в пределах 9%, в пределах 8%, в пределах 7%, в пределах 6%, в пределах 5%, в пределах 4%, в пределах 3%, в пределах 2%, в пределах 1% или меньше от данной величины или диапазона.

«Антиген» представляет собой предопределенный антиген, с которым может селективно связываться антитело. Целевой антиген может быть полипептидом, углеводом, нуклеиновой кислотой, липидом, гаптеном или другим природным или синтетическим соединением. В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой полипептид.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент», «антигенсвязывающий домен», «антигенсвязывающая область» и аналогичные термины относятся к той части антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и наделяющие связывающий агент его специфичностью и аффинностью к антигену (например, определяющие комплементарность области (CDR)).

Термины «связывает» или «связывание» относятся к взаимодействию между молекулами (например, ковалентному или нековалентному), в том числе, например, к образованию комплекса. Комплекс может также включать связывание двух или более молекул, удерживаемых вместе ковалентными или нековалентными связями, взаимодействиями или силами. Взаимодействия могут быть, например, нековалентными взаимодействиями, в том числе водородными связями, ионными связями, гидрофобными взаимодействиями, и/или ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями. Сила полных нековалентных взаимодействий между единичным антигенсвязывающим участком на антителе и единичным эпитопом целевой молекулы, такой как GFRAL, представляет собой аффинность антитела или функционального фрагмента для этого эпитопа. Отношение ассоциации (k1) к диссоциации (k-1) антитела к моновалентному антигену (k1/k-1) представляет собой константу ассоциации K, которая является мерой аффинности. Величина K варьирует для различных комплексов антитела и антигена и зависит как от k1, так и k-1. Константу ассоциации K для антитела, предлагаемого в настоящем документе, можно определять при помощи любого способа, предлагаемого в настоящем документе, или любого другого способа, хорошо известного специалистам в данной области. Аффинность на одном участке связывания не всегда отражает полную силу взаимодействия между антителом и антигеном. Когда сложные антигены, содержащие несколько повторяющихся антигенных детерминант, такие как поливалентный GFRAL, контактируют с антителами, содержащими несколько участков связывания, взаимодействие антитела с антигеном в одном участке будет повышать вероятность реакции во втором участке. Сила таких множественных взаимодействий между поливалентным антителом и антигеном называется авидностью. Авидность антитела может быть лучшей мерой его связывающей способности, чем аффинность его отдельных участков связывания. Например, высокая авидность может компенсировать низкую аффинность, поскольку она иногда может обнаруживаться для пентамерных антител IgM, которые могут иметь более низкую аффинность, чем IgG, но высокая авидность IgM, которая является результатом его мультивалентности, позволяет ему эффективно связывать антиген.

Термины «антитела, которые специфически связываются с GFRAL», «антитела, которые специфически связываются с эпитопом GFRAL» и аналогичные термины также используются взаимозаменяемо в настоящем документе и относятся к антителам, которые специфически связываются с полипептидом GFRAL, таким как антиген, или фрагмент, или эпитоп GFRAL (например, человеческим GFRAL, таким как человеческий полипептид, антиген или эпитоп GFRAL). Антитело, которое специфически связывается с GFRAL (например, человеческим GFRAL), может связываться с внеклеточным доменом или пептидом, полученным из внеклеточного домена GFRAL. Антитело, которое специфически связывается с антигеном GFRAL (например, человеческим GFRAL), может перекрестно реагировать с родственными антигенами (например, GFRAL макаки). В определенных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с антигеном GFRAL, не реагирует перекрестно с другими антигенами. Антитело, которое специфически связывается с антигеном GFRAL, можно выявлять, например, путем иммунологических анализов, анализа Биакор, или другими способами, известными специалистам в данной области. Антитело специфически связывается с антигеном GFRAL, если оно связывается с антигеном GFRAL с более высокой аффинностью, чем с любым перекрестно-реагирующим антигеном, что определено при помощи экспериментальных способов, таких как радиоиммунологические анализы (RIA) и твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA). Как правило, специфическая или селективная реакция будет, по меньшей мере, дважды превышать фоновый сигнал или шум и может более чем в 10 раз превышать фоновый сигнал. См., например, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York, стр. 332-336 для обсуждения, связанного со специфичностью антител. Антитело, «которое связывается» с антигеном, представляющим интерес (например, целевым антигеном, таким как GFRAL), представляет собой антитело, которое связывается с антигеном с достаточной аффинностью, таким образом, что антитело подходит в качестве терапевтического средства для нацеливания на клетку или ткань, экспрессирующую антиген, и не имеет значительного перекрестного реагирования с другими белками. В таких вариантах осуществления степень связывания антитела с «нецелевым» белком будет составлять менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с конкретным целевым белком, например, как определено путем анализа активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) или радиоиммунопреципитацией (RIA). Относительно связывания антитела с целевой молекулой, термин «специфическое связывание» или «специфически связывается с» или является «специфическим к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном целевом полипептиде означает связывание, которое измеримо отличается от неспецифического связывания. Специфическое связывание можно измерять, например, определяя связывание молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая, как правило, представляет собой молекулу сходной структуры, которая не имеет активности связывания. Например, специфическое связывание можно определять путем конкуренции с контрольной молекулой, которая аналогична мишени, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае, специфическое связывание установлено, если связывание меченой мишени с образцом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. Как применяют в настоящем документе, термин «специфическое связывание» или «специфически связывается с» или является «специфическим к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном целевом полипептиде может проявляться, например, молекулой с Kd для мишени, по меньшей мере, приблизительно 10^-4 M, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 10^-5 M, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 10^-6 M, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 10^-7 M, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 10^-8 M, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 10^-9 M, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 10^-10 M, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 10^-11 M, альтернативно, по меньшей мере, приблизительно 10^-12 M, или более. В одном из вариантов осуществления термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде по существу без связывания с каким-либо другим полипептидом или эпитопом полипептида. В определенных вариантах осуществления антитело, которое связывается с GFRAL, имеет константу диссоциации (Kd) менее чем или равную 10 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ или 0,1 нМ. Чем ниже K_D, тем выше аффинность антитела к GFRAL. В определенных вариантах осуществления антитело к GFRAL связывается с эпитопом GFRAL, который является консервативным у GFRAL из различных видов (например, у GFRAL человека и макаки).

Термин "конкурентный" при использовании в отношении антител к GFRAL (например, антагонистических антител и связывающих белков, которые связываются с GFRAL), которые связываются с тем же самым эпитопом или участком связывания на мишени или конкурируют за него, означает конкуренцию между ними, как определено путем анализа, в котором антитело (или его связывающий фрагмент) при исследовании предотвращает или ингибирует специфическое связывание ссылочной молекулы (например, ссылочного лиганда или ссылочного антигенсвязывающиего белка, такого как ссылочное антитело) с общим антигеном (например, GFRAL или его фрагментом). Можно использовать множество типов анализов конкурентного связывания для того, чтобы определить, является ли исследуемое антитело конкурентным для ссылочного антитела при связывании с GFRAL (например, человеческим GFRAL). Примеры анализов, которые можно использовать, включают твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой ферментный иммунологический анализ (EIA), конкурентный анализ типа «сандвич» (см., например, Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253); твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (см., например, Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619) твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой анализ с меткой типа «сандвич» (см., например, Harlow and Lane, (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазный прямой RIA с использованием метки I¹²⁵ (см., например, Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15); твердофазный прямой биотин-авидиновый EIA (см., например, Cheung, et al., (1990) Virology 176:546-552); и прямой RIA с меткой (Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82). Как правило, такой анализ включает использование очищенного антигена (например, GFRAL, такого как человеческий GFRAL), связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих или немеченый исследуемый антигенсвязывающий белок (например, исследуемое антитело к GFRAL) или меченый ссылочный антигенсвязывающий белок (например, ссылочное антитело к GFRAL). Конкурентное ингибирование можно измерять, определяя количество метки, связавшейся с твердой поверхностью или клетками в присутствии исследуемого антигенсвязывающиего белка. Как правило, исследуемый антигенсвязывающий белок присутствует в избытке. Антитела, выявляемые конкурентным анализом (конкурентные антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и ссылочное антитело и/или антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, достаточно близко прилежащим к эпитопу, с которым связываются ссылочные антитела, так что возникает стерическое препятствие. Дополнительные подробности относительно способов определения конкурентного связывания и/или связывания с тем же эпитопом описаны в настоящем документе. Как правило, когда белок конкурентного антитела присутствует в избытке, он будет ингибировать специфическое связывание ссылочных антител с общим антигеном, по меньшей мере, на 23%, например, на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75%. В некоторых случаях, связывание ингибируется, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95%, 96% или 97%, 98%, 99% или более.

Термин «антитело к GFRAL» или «антитело, которое связывается с GFRAL» включает антитело, которо способно связываться с GFRAL с достаточной аффинностью, таким образом, что антитело подгодит в качестве диагностического и/или терапевтического средства, нацеленного на GFRAL. В определенных вариантах осуществления степень связывания антитела к GFRAL с неродственным, не являющимся GFRAL белком составляет менее чем приблизительно 10% отсвязывания антитела с GFRAL при измерении, например, путем анализа активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) или иммунологического анализа, такого как радиоиммунологический анализ (RIA). Антитело, которое «специфически связывается с» или является «специфическим для» GFRAL, проиллюстрировано в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления антитело, которое связывается с GFRAL, как описано в настоящем документе, имеет константу диссоциации (Kd) менее чем или равную 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ, или 0,1 нМ, и/или больше чем или равную 0,1 нМ. В определенных вариантах осуществления антитело к GFRAL связывается с эпитопом GFRAL, который является консервативным у GFRAL из различных видов (например, у GFRAL человека и макаки).

Термины «кристалл» и «кристаллический», как применяют в настоящем документе, относятся к одному или нескольким белкам или их фрагментам, которые существуют в форме кристалла. Кристаллы представляют собой одну из форм твердого состояния материи, которая отличается от остальных форма, таких как аморфное твердое состояние или жидкокристаллическое состояние. Кристаллы состоят из равномерных, повторяющихся трехмерных массивов атомов, ионов, молекул (например, белки, такие как антитела), или молекулярных агрегатов (например, комплексы лиганд/рецептор или антиген/антитело). Эти трехмерные массивы построены в соответствии с конкретными математическими связями, которые хорошо известны в данной области. Фундаментальная единица, или строительный блок, который повторяется в кристалле, называется ассиметричной единицей. Повторение ассиметричной единицы в конфигурации, которая соответствует заданной, четко определенной кристаллографической симметрии создает «элементарную ячейку» кристалла. Повторение элементарной ячейки путем равномерных перемещений во всех трех измерениях создает кристалл. См. Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2^nd ed., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, N.Y., (1999).

«Выделенное» антитело по существу свободно от клеточного материала или других загрязняющих белков из источника клеток или ткани и/или других загрязняющих компонентов, из которых получено антитело, или по существу свободно от химических предшественников или других химических веществ, если оно было синтезировано химически. Фраза «по существу свободно от клеточного материала» включает получение антитела, при котором антитело отделяют от клеточных компонентов из клеток, из которых антитело выделяют или в которых его производят рекомбинантным путем. Таким образом, антитело, которое по существу свободно от клеточного материала, включает препараты антитела, имеющие менее чем приблизительно 30%, 25%, 20%, 15%,10%, 5%, или 1% (по сухой массе) гетерологичного белка (также называемого в настоящем документе как «загрязняющий белок»). В определенных вариантах осуществления, когда антитело производят рекомбинантным путем, оно по существу свободно от среды для культивирования, например, среда для культивирования представляет собой менее чем приблизительно 20%, 15%, 10%, 5%, или 1% от объема белкового препарата. В определенных вариантах осуществления, когда антитело получают путем химического синтеза, оно по существу свободно от химических предшественников или других химических веществ, например, его отделяют от химических предшественников или других химических веществ, которые участвуют в синтезе белка. Таким образом, такие препараты антитела имеют менее чем приблизительно 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, или 1% (по сухой массе) химических предшественников или соединений, иных, чем антитело представляющее интерес. Загрязняющие компоненты могут также в качестве неограничивающих примеров включать материалы, которые могли бы помешать терапевтическим применениям антитела, и могут включать ферменты, гормоны, и другие белковые и небелковые растворенные вещества. В определенных вариантах осуществления антитело будет очищенным (1) до более чем 95% по массе антитела, как определено способом Лоури (Lowry et al. J. Bio. Chem. 193: 265-275, 1951), такое как 96%, 97%, 98%, или 99% по массе, (2) до степени достаточно для получения, по меньшей мере, 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности путем SDS-PAGE при восстановительных или невосстановительные условия с использованием окраски Кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, поскольку, по меньшей мере, один компонент природного окружения антитела будет отсутствовать. Как правило, однако, выделенное антитело готовят путем, по меньшей мере, одного этапа очистки. В конкретных вариантах осуществления, антитела, предлагаемые в настоящем документе, являются выделенными.

Четырехцепочечная единица антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легуих цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (H). В случае IgG, 4-цепочечная единица имеет размер, в основном, приблизительно 150000 Дальтон. Каждая цепь L связана с цепью H одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две цепи H связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями в зависимости от изотипа цепи H. Каждая из цепей H и L также имеет равномерно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая цепь H имеет на N-конце вариабельный домен (VH) с последующими тремя константными доменами (CH) для каждой из α и γ цепей и четыре домена CH для изотипов μ и ε. Каждая цепь L имеет на N-конце вариабельный домен (VL) с последующим константным доменом (CL) на другом конце. VL выравнивается с VH, и CL выравнивается с первым константным доменом тяжелой цепи (CH1). Считают, что отдельные аминокислотные остатки образуют границу между легкой цепью и вариабельными доменами тяжелых цепей. Спаривание VH и VL вместе формирует один антигенсвязывающий участок. Относительно структуры и свойств различных классов антител, см., например, Basic and Clinical Immunology, 8^th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, стр. 71 и Глава 6.

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к части легких или тяжелых цепей антитела, которая, как правило, расположена на амино-конце легкой или тяжелой цепи и имеет длину приблизительно от 120 до 130 аминокислот в тяжелой цепи и приблизительно от 100 до 110 аминокислот в легкой цепи, и используется для связывания и специфичности каждого конкретного антитела с его конкретным антигеном. Вариабельная область тяжелой цепи может быть обозначена как «VH». Вариабельная область легкой цепи может быть обозначена как «VL». Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных областей сильно различаются по последовательности среди антител. V-область опосредует связывание с антигеном и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность распределена неравномерно по 110-аминокислотному диапазону вариабельных областей. Напротив, V-области состоят из менее вариабельных (например, относительно невариабельных) участков, называемых каркасные области (FR) приблизительно из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями более высокой вариабельности (например, крайне вариабельные), называемых «гипервариабельные области», каждая из которых имеет приблизительно 9-12 аминокислот в длину. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат каждая по четыре FR, в значительной степени принимающих конфигурацию β-листа, соединенных тремя гипервариабельными областями, которые формируют петли, соединяющие, и в некоторых случаях, формирующие часть структуры β-листа. Гипервариабельные области в каждой цепи держатся вместе в непосредственной близости при помощи FR и, с гипервариабельными областями с другой цепи, вносят вклад в формирование антигенсвязывающего участка антитела (см., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Константные области не вовлечены напрямую в связывание антитела с антигеном, но демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и обусловленной комплементом цитотоксичности (CDC). Вариабельные области сильно различаются по последовательности между различными антителами. Вариабельность в последовательности сконцентрирована в CDR, в то время как менее вариабельные части в вариабельной области обозначают как каркасные области (FR). CDR легких и тяжелых цепей в первую очередь отвечает за взаимодействие антитела с антигеном. В конкретных вариантах осуществления, вариабельная область представляет собой вариабельную область человека.

Термин «нумерация остатков вариабельной области по Kabat» или «нумерация аминокислотного положения по Kabat» и его вариации, относится к системе нумерации, используемой для вариабельных областей тяжелой цепи или вариабельных областей легкой цепи вариабельные области из компиляции антител в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. С использованием этой системы нумерации, фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или больше аминокислот, что соответствует укорочению или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать вставку одной аминокислоты (остаток 52a согласно Kabat) после остатка 52 H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b, и 82c, и тому подобное, согласно Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat можно определять для заданного антитела путем выравнивания по областям гомологии последовательности антитела со «стандартной», пронумерованной по Kabat последовательностью. Система нумерации по Kabat, в основном, используют при ссылке на остаток в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). «Систему нумерации EU» или «индекс EU», в основном, используют при ссылке на остаток в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, описанный у Kabat et al., выше). «Индекс EU как в Kabat» относится к нумерации остатков человеческого антитела IgG1 EU. Были описаны другие системы нумерации, в том числе, например, AbM, Chothia, Contact, IMGT и AHon. Различные системы нумерации показаны в таблицах 1-24.

«Интактное» антитело представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающий участок, а также константную область легкой цепи CL и, по меньшей мере, константные области тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Константные области могут включать константные области человека или варианты их аминокислотной последовательности. Предпочтительно, интактное антитело имеет одну или несколько эффекторных функций.

«Фрагменты антител» включают часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител в качестве неограничивающих примеров включают, Fab, Fab', F(ab')₂, и Fv-фрагменты; диатела и ди-диатела (см., например, Holliger, P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:6444-8; Lu, D. et al., (2005) J. Biol. Chem. 280:19665-72; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); WO 93/11161; и патенты США №№ 5837242 и 6492123); молекулы одноцепочечного антитела (см., например, патенты США №№ 4946778; 5260203; 5482858 и 5476786); антитела с двойным вариабельным доменом (см., например, патент США № 7612181); антитела с одним вариабельным доменом (SdAbs) (см., например, Woolven et al., Immunogenetics 50: 98-101, 1999; Streltsov et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-12449, 2004); и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

«Функциональный фрагмент» или связывающий фрагмент» или «антигенсвязывающий фрагмент» терапевтического антитела будет демонстрировать, по меньшей мере, одну, несколько или все из биологических функций, относящихся к интактному антителу, функцию, включающую, по меньшей мере, связывание с целевым антигеном, (например, GFRAL-связывающий фрагмент или фрагмент, который связывается с GFRAL).

Как применяют в настоящем документе термин «слитый белок» относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность антитела и аминокислотную последовательность гетерологичного полипептида или белка (например, полипептида или белок, которые в норме не являются частью антитела (например, антитело, связывающееся не с антигеном GFRAL). Термин «слияние» при использовании по отношению к GFRAL или к антителу к GFRAL относится к соединению пептида или полипептида или его фрагмента, варианта и/или производного с гетерологичным пептидом или полипептидом. В определенных вариантах осуществления слитый белок сохраняет биологическую активность GFRAL или антитела к GFRAL. В определенных вариантах осуществления слитый белок содержит область VH антитела к GFRAL, область VL, VH CDR (одну, две или три VH CDR), и/или VL CDR (одну, две или три VL CDR), где слитый белок связывается с эпитопом GFRAL, фрагментом GFRAL и/или полипептидом GFRAL.

Термин «тяжелая цепь» при использовании по отношению к антителу относится к полипептидной цепи размером приблизительно 50-70 кДа, где аминоконцевая часть включает вариабельную область длиной приблизительно от 120 до 130 или более аминокислот и карбоксиконцевая часть включает константную область (например, CH1, CH2, CH3, CH4). Константная область может быть одного из пяти разных типов, (например, изотипов), обозначаемых как альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ), на основании аминокислотной последовательности константных областей тяжелой цепи. Разные тяжелые цепи различаются по размеру: α, δ и γ содержат приблизительно 450 аминокислот, в то время как μ и ε содержат приблизительно 550 аминокислот. В сочетании с легкой цепью, эти определенные типы тяжелых цепей дают пять хорошо известных классов (например, изотипов) антител, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, в том числе четыре подкласса IgG, а именно IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Тяжелая цепь может быть тяжелой цепью человека.

Термин «легкая цепь» при использовании по отношению к антителу относится к полипептидной цепи размером приблизительно 25 кДа, где аминоконцевая часть включает вариабельную область длиной приблизительно от 100 до приблизительно 110 или более аминокислот и карбоксиконцевая часть включает константную область. Приблизительная длина легкой цепи составляет от 211 до 217 аминокислот. Существует два различных типа, обозначаемых как каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности константных доменов. Аминокислотные последовательности легкой цепи хорошо известны в данной области. Легкая цепь может быть легкой цепью человека.

Как применяют в настоящем документе термин «эффективное количество» относится к количеству терапевтического средства (например, антитела к GFRAL или фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем документе; см., например, антитела, содержащие последовательности CDR, VH, и/или VL, как показано в таблицах 1-24), которое является достаточным для снижения тяжести и/или частоты симптомов, устранения симптомов и/или лежащей в их основе причины, предотвращения возникновения симптомов и/или лежащей в их основе причины, и/или улучшения или устранения повреждения, которые являются результатом заболевания, опосредованного GDF15, или ассоциированы с таким заболеванием, нарушением, или состоянием, включая, например, непреднамеренную потерю массы тела, нарушение метаболизма глюкозы или нарушение массы тела. Этот термин также включает количество, необходимое для уменьшения или устранения развития или прогрессирования данного заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, для снижения или устранения рецидива, развития или возникновения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, и/или для улучшения или усиления профилактического или терапевтического эффекта/эффектов другой терапии (например, терапевтического средства, иного, чем антитело к GFRAL, предлагаемое в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления эффективное количество вводят в одной или нескольких дозах, включая интервальное введения доз, где одну или несколько доз дают во время периода лечения с последующим периодом отдыха, когда антитело не вводят (например, за одним циклом периода лечения и периода отдыха могут следовать дополнительные циклы, с одним или несколькими периодами лечения с последующим одним или несколькими периодами отдыха). В некоторых вариантах осуществления эффективное количество антитела, предлагаемого в настоящем документе, составляет приблизительно от 0,1 мг/кг (мг антитела на кг массы индивидуума) до приблизительно 100 мг/кг. В определенных вариантах осуществления эффективное количество антитела, предлагаемого в настоящем документе, составляет приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 25 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 35 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг, приблизительно 45 мг/кг, приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 60 мг/кг, приблизительно 70 мг/кг, приблизительно 80 мг/кг, приблизительно 90 мг/кг, или приблизительно 100 мг/кг (или в данном диапазоне). В некоторых вариантах осуществления эффективное количество, как применяют в настоящем документе, также относится к количеству антитела, предлагаемого в настоящем документе, для достижения указанного результата (например, имитация или регулирование in vitro или in vivo биологического эффекта, вызванного связыванием: (i) GFRAL; (ii) GDF15 и GFRAL; или (iii) GDF15, GFRAL, и RET). Например, эффективное количество включает количество (например, в одной или нескольких дозах) антитела к GFRAL, как описано в настоящем документе, эффективное для: (i) повышения массы тела; (ii) поддержания массы тела; (iii) уменьшения потери массы тела; (iv) увеличения массы тела (например, массы нежировой ткани или массы жировой ткани); (v) поддержание массы тела (например, массы нежировой ткани или массы жировой ткани); или (vi) уменьшения потери массы тела (например, массы нежировой ткани или массы жировой ткани).

Как применяют в настоящем документе термин «клетка-хозяин» относится к конкретной индивидуальной клетке, которая может быть трансфицирована молекулой нуклеиновой кислоты, и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Потомство такой клетки может быть неидентично родительской клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты из-за мутаций или воздействия окружающей среды, которые могут возникать в последующих поколениях или при интеграции молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина.

Как применяют в настоящем документе термин «иммуномодуляторное средство» и его вариации, включая в качестве неограничивающих примеров, иммуномодуляторные средства, относится к средству, которое регулирует иммунную систему хозяина. В определенных вариантах осуществления иммуномодуляторное средство, применяемое в способах комбинированного лечения, предлагаемых в настоящем документе, не включает антитело к GFRAL или антигенсвязывающий фрагмент. Иммуномодуляторные средства в качестве неограничивающих примеров включают низкомолекулярные соединения, пептиды, полипептиды, белки, слитые белки, антитела, неорганические молекулы, миметические средства, и органические молекулы. Термин «низкомолекулярное соединение» и аналогичные термины в качестве неограничивающих примеров включают пептиды, пептидомиметики, аминокислоты, аналоги аминокислот, полинуклеотиды, аналоги полинуклеотидов, нуклеотиды, аналоги нуклеотидов, органические или неорганические соединения (т.е. в том числе гетерорганические и органометаллические соединения) с молекулярной массой, менее чем приблизительно 10000 грамм на моль, органические или неорганические соединения с молекулярной массой, менее чем приблизительно 5000 грамм на моль, органические или неорганические соединения с молекулярной массой, менее чем приблизительно 1000 граммов на моль, органические или неорганические соединения с молекулярной массой, менее чем приблизительно 500 грамм на моль, и соли, сложные эфиры, и другие фармацевтически приемлемые формы таких соединений. В некоторых вариантах осуществления иммуномодуляторное средство представляет собой иммуностимулятор. В некоторых вариантах осуществления иммуномодуляторное средство представляет собой иммуносупрессор. В некоторых вариантах осуществления иммуномодуляторные средства представляют собой средства (например, антитела), которые регулируют (например, ингибируют или стимулируют) белки, известные как молекулы контрольных точек иммунного ответа (например, ко-ингибиторные или ко-стимуляторные), например, C10orf54, CD86, CD80, PDL-1, PDL-2, CTLA-4, PD1, LAG3, BTNL2, B7-H3, B7-H4, бутирофилин, CD48, CD244, TIM-3, CD200R, CD200, CD160, BTLA, HVEM, LAIR1, TIM1, галектин 9, TIM3, CD48, 2B4, CD155, CD112, CD113 и TIGIT (например, ко-ингибиторные), и/или CD154, TNFRSF25, GITR, 4-1BB, OX40, CD27, TMIGD2, ICOS, CD28, CD40, TL1A, GITRL, 41BBL, OX40L, CD70, HHLA2, ICOSL, цитокин, LIGHT, HVEM, CD30, CD30L, B7-H2, CD80, CD86, CD40L, TIM4, TIM1, SLAM, CD48, CD58, CD155, CD112, DR3, GITR, CD2, и CD226 (например, ко-стимуляторные).

Как применяют в настоящем документе, термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, например, отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах, и каждое моноклональное антитело будет, как правило, распознавать один эпитоп на антигене. В конкретных вариантах осуществления, «моноклональное антитело», как применяют в настоящем документе, представляет собой антитело, произведенное одной гибридомой или другой клеткой, где антитело связывается с только с эпитопом GFRAL, как определено, например, путем ELISA или другого антигенсвязывающего анализа или анализа конкурентного связывания, известного в данной области. Термин «моноклональный» не ограничивается каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, моноклональные антитела, подходящие для настоящего изобретения, можно получать при помощи гибридомного способа, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или можно производить с использованием способов рекомбинантной ДНК в бактериальных, эукариотических животных или растительных клетках (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» можно также выделять из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), например. Другие способы для получения клональных клеточных линий и экспрессируемых моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, Глава 11: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5^th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley и Sons, New York). Иллюстративные способы получения моноклональных антител представлены в примерах в настоящем документе.

Термин «нативный» при использовании в связи с биологическими материалами, такими как молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды, клетки-хозяева, и тому подобное, относится к таким материалам, которые встречаются в природе и не были обработаны, модифицированы и/или изменены (например, выделены, очищены, отобраны) человеком.

Антитела, предлагаемое в настоящем документе, может включать «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антитела, в то время как остаток цепи/цепей идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антитела, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют желательную биологическая активность (см., например, патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

«Гуманизированные» формы не принадлежащих человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые включают иммуноглобулины человека (например, реципиентное антитело), в которых нативные остатки CDR замещены остатками из соответствующих CDR из не являющихся человеком видов (например, донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, с желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях, один или несколько остатков области FR иммуноглобулина человека замещены соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не выявляются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации сделаны для дополнительного улучшения свойств антитела. Тяжелая или легкая цепь гуманизированного антитела может содержать по существу все, по меньшей мере, из одной или нескольких вариабельных областей, в которых все или по существу все CDR соответствуют CDR не принадлежащего человеку иммуноглобулина и все или по существу все из FR являются FR из последовательности иммуноглобулина человека. В определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, из иммуноглобулина человека. Более подробно, см., Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Carter et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 89:4285-4289 (1992); и патенты США №№: 6800738 (выдан 5 октября 2004 года), 6719971 (выдан 27 сентября, 2005), 6639055 (выдан 28 октября 2003 года), 6407213 (выдан 18 июня 2002 года), и 6054297 (выдан 25 апреля 2000 года).

«Антитело человека» представляет собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует последовательности антитела, произведенного человеком и/или произведенного с использованием способом для получения антител человека, как описано в настоящем документе. Это определение антитела человека конкретно исключает гуманизированное антитело, содержащее не принадлежащие человеку антигенсвязывающие остатки. Антитела человека можно получать при помощи различных способов, известных в данной области, в том числе библиотек фагового дисплея (Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991) и библиотек дрожжевого дисплея (Chao et al., Nature Protocols 1: 755-768 (2006)). Также для получения моноклональных антител человека доступны способы, описанные в Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). См. также van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Антитела человека можно получать путем введения антигена трансгенному животному, которое было модифицировано для производства таких антител в ответ на введение антигена, но эндогенные локусы которого выключены, например, мыши (см., например, Jakobovits, A., Curr. Opin. Biotechnol. 1995, 6(5):561-6; и Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8(4):455-8; и патенты США №№ 6075181 и 6150584 относительно технологии XENOMOUSE™). См. также, например, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) относительно антител человека, созданных путем гибридомной технологии с человеческими B-клетками.

«CDR» относится к одной из трех гипервариабельных областей (H1, H2 или H3) внутри некаркасной области β-структуры каркаса VH иммуноглобулина (Ig или антитела), одной из трех гипервариабельных областей (L1, L2 или L3) внутри некаркасной области β-структуры каркаса VL антитела. Таким образом, CDR представляют собой последовательности вариабельной области, встроенные в пределах последовательностей каркасной области. Области CDR хорошо известны специалистам в данной области и были определены, например, по Kabat как области с наибольшей гипервариабельностью в пределах вариабельных (V) доменов антитела (Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978)). Последовательности областей CDR также были определены структурно по Chothia как остатки, которые не являются частью консервативной β-структуры каркаса, и, таким образом, способны принимать различные конформации (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Обе терминологии являются общепризнанными в данной области. Последовательности областей CDR также были определены по AbM, Contact и IMGT. Последовательности областей CDR показаны в таблицах 1-24. Положения CDR внутри вариабельной области канонического антитела были определены путем сравнения множества структур (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Поскольку число остатков в гипервариабельной области различается в различных антителах, дополнительные остатки по отношению к каноническим положениям обычно нумеруют a, b, c и тому подобное, рядом с номером остатка в схемеме нумерации канонической вариабельной области (Al-Lazikani et al., выше (1997)). Такая номенклатура хорошо известна специалистам в данной области.

Термин «гипервариабельная область», «HVR», или «HV», при использовании в настоящем документе относится к областям вариабельной области антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности и/или формируют структурно определяемые петли. В основном, антитела содержат шесть гипервариабельных областей; три в VH (H1, H2, H3), и три в VL (L1, L2, L3). Ряд описаний гипервариабельных областей используется и охватывается настоящим документе. Определяющие комплементарность области (CDR) по Kabat основаны на вариабельности последовательности и являются наиболее широко используемыми (см., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia ссылается вместо этого на расположение структурных петель (см., например, Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 loop по Chothia, если он пронумерован с использованием нумерации по правилам Kabat, варьирует от H32 и до H34 в зависимости от длины петли (это потому, что нумерация по схеме Kabat помещает вставки в H35A и H35B; если отсутствуют и 35A, и 35B, петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, петля заканчивается на 33; если присутствуют и 35A, и 35B, петля заканчивается на 34). Гипервариабельные области по AbM представляют собой компромисс между CDR по Kabat и структурными петлями по Chothia, и используются программным обеспечением для моделирования антител Oxford Molecular's AbM (см., например, Martin, в Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag). Гипервариабельные области по «Contact» основаны на анализе доступных сложных кристаллических структур. Остатки каждой из этих гипервариабельных областей или CDR отмечены ниже.

Недавно была разработана и широко применяется универсальная система нумерации, ImMunoGeneTics (IMGT) Information System^® (Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003)). IMGT представляет собой интегрированную информационную систему, специализирующуюся на иммуноглобулинах (IG), T-клеточных рецепторах (TR) и главном комплексе гистосовместимости (MHC) человека и других позвоночных. В настоящем документе, CDR обозначают как в отношении аминокислотной последовательности, так и по расположении в легкой или тяжелой цепи. Поскольку «расположение» CDR внутри структуры вариабельного домена иммуноглобулина является консервативным между видами и присутствует в структурах, называемых петлями, то с использованием систем нумерации, которые выравнивают последовательности вариабельного домена в соответствии со структурными чертами, легко идентифицировать и CDR, и каркасные остатки. Эту информацию можно использовать для пересадки и замещения остатков CDR из иммуноглобулинов из одного вида в акцепторный каркас, как правило, из антитела человека. Дополнительная система нумерации (AHon) была разработана Honegger и J. Mol. Biol. 309: 657-670 (2001). Соответствие между системой нумерации, в том числе, например, нумерации по Kabat и уникальной системой нумерации IMGT, хорошо известно специалисту в данной области (см., например, Kabat, выше; Chothia и Lesk, выше; Martin, выше; Lefranc et al., выше) и таже проиллюстрировано в таблицах 1-24. Иллюстративная система, показанная в настоящем документе, сочетает Kabat и Chothia.

Гипервариабельные области могут включать «расширенные гипервариабельные области» следующим образом: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 или 26-35A (H1), 50-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102, или 95-102 (H3) в VH. Как применяют в настоящем документе, термины «HVR» и «CDR» используют взаимозаменяемо.

Термин «константная область» или «константный домен» относится к карбокси-концевой части легкой и тяжелой цепи, которая непосредственно не участвует в связывании антитела с антигеном, но демонстрирует различные эффекторные функции, такие как взаимодействие с Fc-рецептором. Термины относятся к части молекулы иммуноглобулина с более консервативной аминокислотной последовательностью относительно другой части иммуноглобулина, вариабельной области, которая содержит антигенсвязывающий участок. Константная область может содержать области CH1, CH2 и CH3 тяжелой цепи и область CL легкой цепи.

Термин «каркасные» или «FR» остатки представляют собой остатки вариабельной области, фланкирующие CDR. Остатки FR присутствуют, например, в химерных, гуманизированных, человеческих, доменных антителах, диателах, линейных антителах, и биспецифических антителах. Остатки FR представляют собой остатки вариабельного домена, иные чем остатки гипервариабельной области или остатки CDR.

«Аффинно зрелое» антитело представляет собой антитело с одним или несколькими изменениями (например, вариациями в аминокислотной последовательности, включая замены, вставки и/или делеции) в одной или нескольких HVR, которые приводят к улучшению в аффинности антитела к антигену, по сравнению с родительским антителом, которое не содержит таких изменений. Предпочтительно аффинно зрелые антитела будут иметь наномолярные или даже пикомолярные аффинности к целевому антигену. Аффинно зрелые антитела производят известными в данной области способами. Для обзора, см. Hudson и Souriau, Nature Medicine 9:129-134 (2003); Hoogenboom, Nature Biotechnol. 23: 1105-1116 (2005); Quiroz и Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4: 39-51 (2010).

«Блокирующее» антитело или «антагонистическое» антитело представляет собой антитело, которое ингибирует или снижает биологическую активность антигена, с которым связывается (например, GFRAL, как описано в настоящем документе). Например, блокирующие антитела или антагонистические антитела могут по существу или полностью ингибировать биологическую активность антигена (например, GFRAL, как описано в настоящем документе).

«Агонистическое антитело» представляет собой антитело, которое запускает ответ, например, антитело, которое имитирует, по меньшей мере, одну из функциональных активностей полипептида, представляющего интерес. Агонистическое антитело включает антитело, которое является миметиком лиганда, например, где лиганд связывается с рецептором клеточной поверхности, и связывание вызывает передачу сигнала в клетке или действия через межклеточный путь передачи сигнала, и где антитело вызывает аналогичную передачу сигнала или активацию в клетке.

«Антагонист» GFRAL относится к молекуле (например, антителу), которая способна детектируемо ингибировать или иным образом снижать один или несколько видов биологической активности GFRAL, такой как в клетке, экспрессирующей GFRAL. В некоторых вариантах осуществления антагонист GFRAL (например, агонистическое антитело, как описано в настоящем документе) может, например, действовать путем детектируемого ингибирования или снижения иным образом активации и/или клеточных путей передачи сигнала в клетке, экспрессирующей GFRAL, и, таким образом, детектируемо снижает GFRAL-опосредованную биологическую активность клетки относительно GFRAL-опосредованной биологической активности в отсутствие антагониста. В некоторых вариантах осуществления антитела, предлагаемые в настоящем документе, являются антагонистическими антителами к GFRAL, включая антитела, которые ингибируют передачу сигнала комплексом, включающим GFRAL, GDF15 и/или RET. Ингибирование или уменьшение, вызванное антагонистом GFRAL, не обязательно является полным при условии, что его можно выявить при помощи анализа. Например, можно использовать анализы с клетками, описанные в примерах ниже, для анализа биологической активности GFRAL.

«Аффинность связывания» в основном относится к силе суммарного количества нековалентных взаимодействий между одним участком связывания молекулы (например, связывающего белка, такого как антитело) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иначе, как применяют в настоящем документе, «аффинность связывания» относится к собственной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность связывающей молекулы X для ее партнера по связыванию Y может, в основном, быть представлена путем константы диссоциации (K_D). Аффинность можно измерять при помощи распространенных, известных в данной области способов, включая способы, описываемые в настоящем документе. Низкоаффинные антитела, как правило, связывают антиген медленно и имеют тенденцию к легкой диссоциации, в то время как высокоаффинные антитела, как правило, связывают антиген быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными дольше. В данной области известен ряд способов для измерения аффинности связывания, любой из которых можно использовать в целях настоящего изобретения. Конкретные иллюстративные варианты осуществления включают следующее. В одном из вариантов осуществления «K_D» или «величину K_D» можно измерять при помощи анализов, известных в данной области, например, путем анализа связывания. K_D можно измерять в анализе связывания антигена с радиоактивной меткой (RIA), например, проводимом с Fab-версией интересующего антитела и его антигеном (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). K_D или величину K_D можно также измерять с использованием анализов поверхностного плазмонного резонанса при помощи Биакор, с использованием, например, BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), или путем интерферометрии биослоев, например, с использованием системы OctetQK384 (ForteBio, Menlo Park, CA). «Скорость прямой реакции» или «скорость ассоциации» или «k_on» можно также определять при помощи тех же вышеупомянутых способов поверхностного плазмонного резонанса или интерферометрии биослоев с использованием, например, BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), или системы OctetQK384 (ForteBio, Menlo Park, CA).

Фраза «по существу аналогичный» или «по существу такой же» обозначает достаточно высокую степень сходства между двумя численными величинами (например, одной, ассоциированной с антителом по настоящему изобретению и другой, ассоциированной с ссылочным антителом), таким образом, что специалист в данной области считал бы различие между двумя величинами незначительным или не имеющим биологической и/или статистической значимости в контексте биологической характеристики, измеряемой при помощи величин (например, величины K_D). Например, различие между двумя величинами может быть менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 5%, в виде функции от величины для ссылочного антитела.

Фраза «по существу сниженный» или «по существу различный», как применяют в настоящем документе, обозначает достаточно высокую степень различия между двумя численными величинами (например, одной, ассоциированной с антителом по настоящему изобретению и другой, ассоциированной с ссылочным антителом) таким образом, что специалист в данной области считал бы различие между двумя величинами статистически значимым в контексте биологической характеристики, измеряемой при помощи величин. Например, различие между двумя указанными величинами может быть предпочтительно больше чем приблизительно 10%, больше чем приблизительно 20%, больше чем приблизительно 30%, больше чем приблизительно 40%, больше чем приблизительно 50% в виде функции от величины для ссылочного антитела.

«Эффекторные функции» антитела относятся к видам биологической активности, присущим Fc-области антитела (например, нативной последовательности Fc-области или аминокислотной последовательности вариантной Fc-области), и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q и обусловленную комплементом цитотоксичность, связывание с Fc-рецептором, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, негативную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора) и активацию B-клеток.

Термин «Fc-область» в настоящем документе применяют для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая, например, нативные последовательность Fc-области, рекомбинантные Fc-области, и вариантные Fc-области. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG часто определяют как отрезок от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230, до карбоксиконца. C-концевой лизин (остаток 447 согласно системе нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, во время получения или очистки антитела, или за счет рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Таким образом, композиция интактных антител может содержать популяции антител, в которой удалены все остатки K447, популяции антител с не удаленными остатками K447, и популяции антител, имеющие смесь антител с остатком K447 и без него.

«Функциональная Fc-область» обладает «эффекторной функцией» нативной последовательности Fc-области. Примеры «эффекторных функций» включают связывание C1q, обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC), связывание с Fc-рецептором, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, негативную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора, BCR) и тому подобное. Такие эффекторные функции, как правило, требуют сочетания Fc-области со связывающей областью или связывающим доменом (например, вариабельной областью или доменом антитела), и их можно оценивать, с использованием различных анализов, как описано в настоящем документе и/или известных в данной области.

«Нативная последовательность Fc-области» включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, встречающейся в природе, и не обработанной, не модифицированной, и/или не измененной человеком (например, выделенной, очищенной, отобранной, включающей другие последовательности или комбинированной с другими последовательностями, такими как последовательности вариабельной области). Нативные последовательности Fc-областей человека включают нативную последовательность Fc-области человеческого IgG1 (не-A и A аллотипы), нативную последовательность Fc-области человеческого IgG2, нативную последовательность Fc-области человеческого IgG3 и нативную последовательность Fc-области человеческого IgG4, а также их природные варианты.

«Вариантная Fc-область» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-области на основании, по меньшей мере, одной аминокислотной модификации (например, замены, вставки или делеции), предпочтительно, одной или нескольких аминокислотных замен. Предпочтительно, вариантная Fc-область имеет, по меньшей мере, одну аминокислотную замену по сравнению с нативной последовательностью Fc-области или Fc-области родительского полипептида, например, приблизительно, от одной до приблизительно десяти замен аминокислот, и предпочтительно приблизительно от одной до приблизительно пяти замен аминокислот в нативной последовательности Fc-области или в Fc-области родительского полипептида. Вариантная Fc-область в настоящем документе предпочтительно обладает, по меньшей мере, приблизительно 80% гомологией с нативной последовательностью Fc-области и/или с Fc-областью родительского полипептида, и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90% гомологией с ними, например, по меньшей мере, приблизительно 95% гомологией с ними. Например, вариант с двумя аминокислотными заменами на аланин в двух положениях в последовательности Fc человеческого IgG1, показанными жирным шрифтом в аминокислотной последовательности, приведен ниже:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ALAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:2001)

Например, вариант с двумя аминокислотными заменами на аланин в двух положениях в укороченной последовательности Fc человеческого IgG1, в которой отсутствует C-концевой остаток лизина (IgG1ΔK Fc), которые показаны жирным шрифтом в аминокислотной последовательности, приведенной ниже:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ALAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:2002)

Например, укороченный вариант последовательности Fc человеческого IgG1, в которой отсутствует C-концевой остаток лизина (IgG1ΔK Fc), показан в аминокислотной последовательности, приведенной ниже:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:2003)

Например, вариант с заменой аминокислоты на пролин в положении в последовательности Fc человеческого IgG4 показан жирным шрифтом в аминокислотной последовательности, приведенной ниже:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:2004)

Например, вариант с заменой аминокислоты на пролин в положении в последовательности Fc человеческого IgG4, в которой отсутствует C-концевой остаток лизина (IgG4ΔK Fc), показан жирным шрифтом в аминокислотной последовательности, приведенной ниже:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:2005)

Например, вариант с заменой аминокислоты на глутамин в положении в последовательности Fc человеческого IgG1, показан жирным шрифтом в аминокислотной последовательности, приведенной ниже:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:2006)

Любой из доменов VH из таблиц 1-24 и на ФИГ.4A, 5A, 5C, 5E, 6A, 7A, 8A, 9A, и 10A можно комбинировать с вариантной Fc-областью, описываемой в настоящем документе. Иллюстративные конструкции тяжелой цепи, содержащие вариантную Fc-область, могут включать следующие конструкции, обозначенные, как показано ниже; последовательность вариабельной области выделена жирным шрифтом, последовательности CDR подчеркнуты:

3P10 Fab Hc:

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYGVIWVKQAPGKALKWMGWINTYT GEPTYADDLKGRFAFSLETSASSASLQINNLKNEDTATYFCARRYGPEDIDYWGQG TTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDEVD (SEQ ID NO:1824)

25M22 Fab Hc:

QVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYTFTSYWVNWMKQRPGKGLEWIGRIYPG DGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARAYLLRLRRTGY YAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDEVD (SEQ ID NO:1826)

8D8 Fab Hc:

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWGFGS TDYNSALKSRLSITKDNSKSQFFLKMNSLQTDDTAMYYCARIHTTAGSYWGQGTL VTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDEVDG (SEQ ID NO:1828)

5F12 Fab Hc:

QVQLKQSGTELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPGN GNTYHNEKFKGKATLTAEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGLYYDYDRYFDY WGQGTALTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDEVDG (SEQ ID NO:1830)

«Константная область легкой цепи» включает константные области каппа и лямбда. Любой из доменов VL из таблиц 1-24 и на ФИГ.4B, 5B, 5D, 5F, 6B, 7B, 8B, 9B, и 10B можно комбинировать с контантной областью каппа или лямбда, описываемой в настоящем документе.

Иллюстративная константная область каппа приведена ниже:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:2007)

Иллюстративная константная область лямбда приведена ниже:

GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPS KQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:2008)

Иллюстративные конструкции легкой цепи, содержащие константную область, могут включать следующие конструкции, обозначенные, как показано ниже; последовательность вариабельной области выделена жирным шрифтом, последовательности CDR подчеркнуты:

3P10 Fab Lc:

DIVLTQSPVSLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMSWFQQKPGQPPKLLIYAASH QGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDSAMYFCLQSKEVPWTFGGGTKLEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:1825)

25M22 Fab Lc:

DVVLTQTPLSLPVNIGDQASISCKSTKSLLNSDEFTYLDWYLQKPGQSPQLLIFLV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQSNYLPYTFGGGTKLEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:1827)

8D8 Fab Lc:

DIVMTQSQKFMSTSIGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALVYSTSYRY SGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCHQYNSYPLTFGAGTKLELKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:1829)

5F12 Fab Lc:

NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDTYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASN LESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCHQNNEDPPAFGGGTKLEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:1831)

Термин «вариант», при использовании по отношению к GFRAL или к антителу к GFRAL может относиться к пептиду или полипептиду, содержащему одну или несколько (например, приблизительно от 1 до приблизительно 25, приблизительно от 1 до приблизительно 20, приблизительно от 1 до приблизительно 15, приблизительно от 1 до приблизительно 10, или приблизительно от 1 до приблизительно 5) замен, делеций и/или вставок в аминокислотной последовательности по сравнению с нативной или немодифицированной последовательностью GFRAL. Например, вариант GFRAL может являться результатом одной или нескольких (например, приблизительно от 1 до приблизительно 25, приблизительно от 1 до приблизительно 20, приблизительно от 1 до приблизительно 15, приблизительно от 1 до приблизительно 10, или приблизительно от 1 до приблизительно 5) замен в аминокислотной последовательности нативного GFRAL. Также в качестве примера, вариант антитела к GFRAL может являться результатом одной или нескольких (например, приблизительно от 1 до приблизительно 25, приблизительно от 1 до приблизительно 20, приблизительно от 1 до приблизительно 15, приблизительно от 1 до приблизительно 10, или приблизительно от 1 до приблизительно 5) замен в аминокислотной последовательности нативного или ранее не модифицированного антитела к GFRAL. Варианты могут быть природными, такими как аллельные варианты или варианты сплайсинга, или могут быть сконструированы искусственно. Полипептидные варианты можно получать из соответствующих молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих варианты. В некоторых вариантах осуществления вариант GFRAL или вариант антитела к GFRAL, по меньшей мере, сохраняет функциональную активность GFRAL или антитела к GFRAL, соответственно. В некоторых вариантах осуществления вариант антитела к GFRAL связывается с GFRAL и/или является антагонистическим по отношению к активности GFRAL. В некоторых вариантах осуществления антитело к GFRAL связывается с GFRAL и/или является агонистическим по отношению к активности GFRAL. В некоторых вариантах осуществления вариант кодируется однонуклеотидным полиморфизмом (SNP) молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует GFRAL или области или подобласти VH или VL антитела к GFRAL, такие как одна или несколько CDR.

Термин «вектор» относится к субстанции, которую применяют для переноса или включения последовательностей нуклеиновой кислоты, в том числе, например, для того чтобы внести последовательность нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Векторы, подходящие для применения, включают, например, экспрессирующие векторы, плазмиды, фаговые векторы, вирусные векторы, эписомы и искусственные хромосомы, которые могут включать селектирующие последовательности или маркеры, подходящие для стабильной интеграции в хромосому клетки-хозяина. Дополнительно, векторы могут включать один или несколько генов селективных маркеров и подходящие последовательности для контроля экспрессии. Гены селективных маркеров, которые можно включать, например, обеспечивают устойчивость к антибиотикам или токсинам, дополняют недостаток веществ для ауксотрофов, или обеспечивают важные питательные вещества, которые отсутствуют в средах для культивирования. Последовательности для контроля экспрессии могут включать конститутивные и индуцибельные промоторы, энхансеры транскрипции, терминаторы транскрипции, и тому подобное, которые хорошо известны в данной области. Когда необходимо совместно экспрессировать две или более молекул нуклеиновой кислоты (например, и тяжелую, и легкую цепь антитела или VH и VL антитела), обе молекулы нуклеиновой кислоты можно вставлять, например, в один экспрессирующий вектор или разные экспрессирующие векторы. Для экспрессии одного вектора, кодирующие нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с одной общей последовательностью контроля экспрессии или связаны с различными последовательностями контроля экспрессии, такими как один индуцибельный промотор и один конститутивный промотор. Введение молекул нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина можно подтверждать с использованием способов, хорошо известных в данной области. Такие способы включают, например, анализ нуклеиновых кислот, такой как Нозерн-блоттинги или полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации мРНК, или иммуноблоттинг для продуктов экспрессии гена, или другие подходящие аналитические способы для исследования экспрессии введенной последовательности нуклеиновой кислоты или ее соответствующего продукта гена. Специалистам в данной области следует понимать, что молекулы нуклеиновой кислоты экспрессируются в достаточном количестве для получения желаемого продукта (например, антитела к GFRAL, как описано в настоящем документе), и дополнительно понятно, что уровни экспрессии можно оптимизировать для получения достаточной экспрессии с использованием способов, хорошо известных в данной области.

«Антителозависимая клеточная цитотоксичность» или «ADCC» относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig связывается с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, клетках-естественных киллерах (NK), нейтрофилах, и макрофагах), позволяя этим клеткам-цитотоксическим эффекторам специфически связываться с клеткой-мишенью, несущей антиген, и затем уничтожать клетку-мишень при помощи цитотоксинов. Антитела «активизируют» цитотоксические клетки и абсолютно необходимы для такого уничтожения. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Известна экспрессия FcR на гематопоэтических клетках (см., например, таблицу 3, страница 464, Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)). Для оценки активности ADCC у интересующей молекулы, можно проводить анализ ADCC in vitro (см., например, патент США № 5500362 или 5821337). Подходящие эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и клетки-естественные киллеры (NK). Альтернативно, или дополнительно, активность ADCC у интересующей молекулы можно оценивать in vivo, например, на модели на животных (см., например, Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998)). Для применения можно выбирать антитела с отсутствием активности ADCC или с незначительной активностью.

«Fc-рецептор» или «FcR» описывает рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительный FcR представляет собой FcR c нативной последовательностью человека. Кроме того, предпочтительным FcR является тот, который связывается с антителом IgG (например, гамма рецептор) и включает подклассы рецепторов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, отличающиеся, в основном, своими цитоплазматическими доменами (см., например, обзор Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Известны FcR (см., например, Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)). Остальные FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, включены в термин «FcR» в настоящем документе. Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за передачу материнских IgG плоду (см., например, Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Были описаны варианты антител с улучшенным или со сниженным связыванием с FcR (см., например, в WO 2000/42072; патентах США №№ 7183387, 7332581 и 7,335,742; Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)).

«Обусловленная комплементом цитотоксичность» или «CDC» относится к лизису клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента запускается связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны со своим распознанным антигеном. Для оценки активации комплемента, можно проводить анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Metods 202:163 (1996)). Были описаны полипептидные варианты с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области (полипептиды с вариантной Fc-областью) и повышенной или сниженной способностью к связыванию с C1q (см., например, патент США № 6194551, WO 1999/51642, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)). Для применения можно выбирать антитела с отсутствием активности CDC или с незначительной активностью.

При расчете процента идентичности сравниваемые последовательности можно выравнивать способом, который дает наибольшее совпадение между последовательностями. Компьютерная программа, которую можно использовать для определения процента идентичности, представляет собой пакет программ GCG, который включает GAP (Devereux et al., (1984) Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). Компьютерный алгоритм GAP использовали для выравнивания двух полипептидов или полинуклеотидов, для которых необходимо определить процент идентичности последовательностей. Последовательности можно выравнивать для оптимального совпадения их соответствующих аминокислот или нуклеотидов ("охват совпадения", как определено алгоритмом). Штраф за внесение делеции в выравнивание (который рассчитывают как трехкратную среднюю диагональ, где "средняя диагональ" представляет собой среднее от диагонали используемой матрицы сравнения; "диагональ" представляет собой оценку или число, которое за каждое полное соответствие аминокислот при помощи конкретной матрицы сравнения) и штраф за продолжение делеции (который как, как правило, составляет 1/10 от штрафа за внесение делеции), а также матрицу сравнения, такую как PAM 250 или BLOSUM 62 применяют в сочетании с алгоритмом. В определенных вариантах осуществления алгоритм также использует стандартную матрицу сравнения (см., Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 для матрицы сравнения PAM 250; Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 для матрицы сравнения BLOSUM 62).

Примеры параметров для определения процента идентичности для полипептидов или нуклеотидных последовательностей с использованием программы GAP, являются следующими: (i) алгоритм: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; (ii) матрица сравнения: BLOSUM 62 из Henikoff et al., 1992, выше; (iii) штраф за делецию: 12 (но без штрафа за пропуски на конце) (iv) штраф за продление пропуска: 4; и (v) порог сходства: 0.

Определенные схемы выравнивания для выравнивания двух аминокислотных последовательностей могут приводить к совпадению только короткой области двух последовательностей, и эта небольшая выровненная область может иметь очень высокую идентичность последовательностей, даже если нет значительного родства между двумя полноразмерными последовательностями. Таким образом, выбранный способ выравнивания (например, программа GAP) можно корректировать при необходимости для получения выравнивания, которое охватывает ряд аминокислот, например, по меньшей мере, 50 смежных аминокислот целевого полипептида.

«Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» в отношении последовательности ссылочного полипептида определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности ссылочного полипептида, после выравнивания последовательностей и введения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и без рассмотрения любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно производить различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.

«Модификация» аминокислотного остатка/положения относится к изменению первичной аминокислотной последовательности по сравнению с исходной аминокислотной последовательности, где изменение происходит в результате изменения последовательности, включающей указанные аминокислотные остатки/положения. Например, типичные модификации включают замену остатка другой аминокислотой (например, консервативная или неконсервативная замена), вставку одной или нескольких (например, в основном, менее чем 5, 4 или 3) аминокислот рядом с указанным остатком/положением, и/или делецию указанного остатка/положения.

«Эпитоп» представляет собой участок на поверхности молекулы антигена, с которым связывается одна молекула антитела, такой как локализованная область на поверхности антигена, такого как полипептид GFRAL, фрагмент полипептида GFRAL или эпитоп GFRAL, который способен связываться с одним или несколькими антигенсвязывающими областями антитела, и который имеет антигенное или иммуногенное действие на животное, такое как млекопитающее (например, человек), который способен вызывать иммунный ответ. Эпитоп с иммуногенной активностью представляет собой часть полипептида, который вызывает антительный ответ у животного. Эпитоп с антигенной активностью представляет собой часть полипептида, с которой связывается антитело, как определяется любым способом, хорошо известным в данной области, в том числе, например, путем иммунологического анализа. Антигенные эпитопы необязательно являются иммуногенными. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и имеют три специфических пространственных структурных характеристики, а также специфические характеристики заряда. Термин «эпитоп» конкретно включает линейные эпитопы и конформационные эпитопы. Область полипептида, относящаяся к эпитопу, может быть смежными аминокислотами полипептида, или эпитоп может состоять из двух или более несмежных областей полипептида. Эпитоп может быть или не быть трехмерной поверхностной характерной чертой антигена. В определенных вариантах осуществления эпитоп GFRAL представляет собой трехмерную поверхностную характерную черту полипептида GFRAL. В других вариантах осуществления эпитоп GFRAL представляет линейную характерную черту полипептида GFRAL. В основном, антиген имеет несколько или много различных эпитопов и может реагировать с множеством различных антител.

Антитело связывается с «эпитопом» или «по существу с тем же эпитопом» или «с тем же эпитопом», что и ссылочное антитело, когда два антитела распознают идентичные, перекрывающиеся или смежные эпитопы в трехмерном пространстве. Наиболее широко используемые и быстрые способы для определения того, связываются ли два антитела с идентичными, перекрывающимися или смежными эпитопами в трехмерном пространстве, представляют собой конкурентные анализы, которые могут быть сконфигурированы в ряд различных форматов, например, с использованием или меченого антигена или меченого антитела. В некоторых анализах, антиген иммобилизован на 96-луночном планшете, или экспрессирован на клеточной поверхности, и способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител измеряют при помощи радиоактивных, флуоресцентных или ферментативных меток.

«Картирование эпитопов» представляет собой способ идентификации участков связывания для антител, или эпитопов, на их целевых антигенах. Антительные эпитопы могут быть линейными эпитопами и конформационными эпитопами. Линейные эпитопы образованы непрерывной последовательностью аминокислот в белке. Конформационные эпитопы образованы аминокислотами, которые не являются соседними в белковой последовательности, но они объединяются при фолдинге белка в его трехмерной структуре. Индуцированные эпитопы образуются, когда трехмерная структура белка приходит в измененную конформацию, например, после активации или связывания другого белка или лиганда.

«Эпитоп-специфическая сортировка» представляет собой способ группировки антител, на основании эпитопов, которые они распознают. Более конкретно, эпитоп-специфическая сортировка включает способы и системы для выделения эпитоп-распознающих свойств различных антител, с использованием конкурентных анализов в сочетании с компьютерными способами для кластеризации антител на основании их свойств распознавания эпитопов и выявления антител с определенной специфичностью связывания.

«Заболевание, опосредованное GFRAL», «нарушение, опосредованное GFRAL» и «состояние, опосредованное GFRAL» используются взаимозаменяемо и относятся к любому заболеванию, нарушению или состоянию, которое полностью или частично вызвано или является результатом GFRAL или взаимодействием GFRAL с GDF15 и/или альтернативно любое заболевание, нарушение, или состояние, при котором желательно ингибировать эффекты GDF15 in vivo. Заболевания, нарушения, или состояния, опосредованные GFRAL, включают заболевания, нарушения, или состояния, опосредованные GDF15.

«Заболевание, опосредованное GDF15», «нарушение, опосредованное GDF15» и «состояние, опосредованное GDF15» используются взаимозаменяемо и относятся к любому заболеванию, нарушению или состоянию, которое: (i) полностью или частично вызвано; или (ii) является результатом белка GDF15 (например, активности белка GDF15, такой как передача сигнала через GDF15 или повышенные уровни белка GDF15) или взаимодействия белка GFRAL с белком GDF15 и/или белком RET, альтернативно любое заболевание, нарушение, или состояние, при котором желательно ингибировать эффекты GDF15 in vivo. Заболевания, нарушения, или состояния, опосредованные GDF15 включают непреднамеренную потерю массы, кахексию, саркопению, мышечную атрофию, атрофию кости, сердечно-сосудистое заболевание, хроническое воспалительное заболевание (например, хроническую почечную недостаточность, хроническое обструктивное заболевание легких), и злокачественную опухоль, в том числе, злокачественную опухоль, которая имеет сниженную чувствительность (например, устойчивость) к химиотерапевтическому средству (например, антителу к опухоли, такому как трастузумаб), которая вызвана или связана с белком GDF15.

Как применяют в настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству средства (например, антитела, описываемого в настоящем документе, или любого другого средства, описываемого в настоящем документе), которое является достаточным для снижения и/или облегчения тяжести и/или длительности указанного заболевания, нарушения или состояния, и/или связанного с ним симптома. Терапевтически эффективное количество средства, в том числе терапевтического средства, может быть количеством, необходимым для (i) уменьшения или устранения распространения или прогрессирования указанных заболеваний, нарушений или состояний, (ii) уменьшения или облегчения рецидива, развития или возникновения указанных заболеваний, нарушений или состояний, и/или (iii) для улучшения или усиления профилактического или терапевтического эффекта другой терапии (например, терапии, иной чем введение антитела, предлагаемого в настоящем документе). «Терапевтически эффективное количество» вещества/молекулы/агента по настоящему изобретению (например, антитела к GFRAL) может различаться в соответствии с такими факторами как состояние болезни, возраст, пол и масса индивидуума, и способности вещества/молекулы/агента вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество включает количество, при котором терапевтически положительное воздействие перевешивает любые токсические или вредные воздействия вещества/молекулы/агента. В определенных вариантах осуществления термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела или другого вещества (например, или лекарственного средства), эффективного для «лечения» заболевания, нарушения или состояния у индивидуума или млекопитающего.

«Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени для достижения желаемого профилактического эффекта. Как правило, но необязательно, поскольку профилактическую дозу применяют у индивидуумов до начала или на ранней стадии заболевания, нарушения или состояния, профилактически эффективное количество может быть меньше чем терапевтически эффективное количество.

«Хроническое» введение относится к введению средства/средств в непрерывном режиме (например, в течение периода времени, такого как сутки, недели, месяцы или годы), в отличие от неотложного режима, для того чтобы поддерживать начальный терапевтический эффект (действие) в течение длительного периода времени. «Периодическое» введение представляет собой лечение, которое происходит не последовательно без перерывов, а скорее является циклическим по своему характеру.

Введение «в комбинации с» одним или несколькими дополнительными средствами включает одновременное (например, сопутствующее) и последовательное введение в любом порядке. Термин «в комбинации» в отношении введения другой терапии (например, других средств) включает применение более чем одной терапии (например, одного средства). Применение термина «в комбинации» не ограничивает порядок, в котором терапию вводят индивидууму. Первую терапию (например, средство) можно вводить до (например, за 1 минуту, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, или 12 недель), одновременно, или после (например, через 1 минуту, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, или 12 недель) введения второй терапии (например, средства) индивидууму, у которого был риск развития, у которого есть риск развития или который предрасположен к развитию заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15.

Любую дополнительную терапию (например, средство) можно вводить в любом порядке с другими дополнительными терапиями (например, средствами). В определенных вариантах осуществления антитела можно вводить в комбинации с одной или несколькими терапиями, такими как средства (например, терапии, включающие средства, которые не являются антителами, вводимыми в настоящее время) для профилактики, лечения, сдерживания развития и/или устранения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, или его симптома. Неограничивающие примеры терапий (например, средств), которые можно вводить в комбинации с антителом, включают, например, анальгетические средства, анестезирующие средства, антибиотики, или иммуномодуляторные средства или любое другое средство, внесенное в Фармакопею США и/или Настольный справочник врача. Примеры средств, подходящих для комбинированного лечения в качестве неограничивающих примеров включают следующие: нестероидное противовоспалительное лекарственное средство (НПВЛС), такое как аспирин, ибупрофен, и другие производные пропионовой кислоты (алминопрофен, беноксапрофен, буклоксовую кислоту, карпрофен, фенбуфен, фенопрофен, флупрофен, флурбипрофен, индопрофен, кетопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пипрофен, пранопрофен, супрофен, тиапрофеновая кислота, и тиоксапрофен), производные уксусной кислоты (индометацин, ацеметацин, алклофенак, клиданак, диклофенак, фенклофенак, фенклозовая кислота, фентиазак, фуирофенак, ибуфенак, изоксепак, окспинак, сулиндак, тиопинак, толметин, зидометацин, и зомепирак), производные фенаминовой кислоты (флуфенамовая кислота, меклофенамовая кислота, мефенамовая кислота, нифлумовая кислота и толфенамовая кислота), производные бифенилкарбоновой кислоты (дифлунизал и флуфенизал), оксикамы (изоксикам, пироксикам, судоксикам и теноксикан), салицилаты (ацетилсалициловая кислота, сульфасалазин) и пиразолоны (апазон, безпиперилон, фепразон, мофебутазон, оксифенбутазон, фенилбутазон). Другие комбинации включают ингибиторы циклооксигеназы-2 (COX-2). Другие средства для комбинации включают стероиды, такие как преднизолон, преднизон, метилпреднизолон, бетаметазон, дексаметазон или гидрокортизон. Такая комбинация может быть особенно благоприятной, поскольку один или несколько побочных эффектов стероида могут уменьшаться или даже исчезать за счет уменьшения дозы стероида, необходимой при лечении индивидуумов в комбинации с настоящими антителами. Дополнительные примеры средств для комбинаций включают цитокиновое супрессивное противовоспалительное лекарственное средство/средства (CSAID); антитела против других цитокинов человека или факторов роста или антагонисты других цитокинов человека или факторов роста, например, TNF, LT, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, или PDGF. Комбинации средств могут включать антагонисты TNF, такие как химерные, гуманизированные или человеческие антитела к TNF, РЕМИКЕЙД, фрагменты антител к TNF (например, CDP870), и растворимые рецепторы TNF p55 или p75, их производные, p75TNFRIgG (ЭНБРЕЛ^®) или p55TNFR1 gG (ЛЕНЕРЦЕПТ^®), растворимый рецептор IL-13 (sIL-13), и также ингибиторы TNFα-конвертирующего фермента (TACE); аналогично могут быть эффективны ингибиторы IL-1 (например, ингибиторы интерлейкин-1-конвертирующего фермента). Другие комбинации включают интерлейкин 11, антитело к P7s и гликопротеиновый лиганд п-селектина (PSGL). Остальные примеры средств, подходящих для комбинированного лечения включают интерферон-β1a (AVONEX); интерферон-β1b (BETASERON^®); копаксон; гипербарический кислород; внутривенный иммуноглобулин; клабрибин; и антитела против других цитокинов человека или факторов роста или антагонисты других цитокинов человека или факторов роста (например, антитела к лиганду CD40 и CD80).

«Носители», как применяют в настоящем документе, включают фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты, или стабилизаторы, которые не токсичны для клетки или млекопитающего, которым их вводят в используемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный раствор с буферным pH. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и других органических кислот; антиоксиданты, в том числе аскорбиновая кислота; низкомолекулярный полипептид (например, менее чем приблизительно 10 аминокислотных остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды, и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; соль-образующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, полиэтиленгликоль (ПЭГ), и ПЛЮРОНИКИ™. Термин «носитель» может также относиться к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному или неполному)), эксципиенту или носителю, с которыми вводят терапевтическое средство. Такие носители, в том числе фармацевтические носители, могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло и тому подобное. Вода представляет собой пример носителя, когда композицию (например, фармацевтическую композицию) вводят внутривенно. В качестве водных носителей можно также использовать физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие эксципиенты (например, фармацевтические эксципиенты) включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерина моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция, при желании, может также содержать незначительные количества увлажняющих средств или эмульгаторов, или средств для буферирования pH. Композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с пролонгированным высвобождением и тому подобное. Пероральные композиции, в том числе составы, могут включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрий, целлюлоза, карбонат магния фармацевтической степени чистоты, и тому подобное. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA. Композиции, в том числе фармацевтические соединения, могут содержать профилактически или терапевтически эффективное количество антитела к GFRAL, например, в выделенной или очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя с тем, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения индивидууму (например, пациенту). Состав должны соответствовать способу введения.

Как применяют в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или государственного управления, или входящий в Фармакопею США, Европейскую Фармакопею или другую общепризнанную фармакопею для применения у животных, и, более конкретно, у людей.

Термин «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить биологическую активность активного ингредиента (например, антитела к GFRAL), и который не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для индивидуума, которому будут вводить состав. Такой состав может быть стерильным.

«Стерильный» состав является асептическим или свободен от всех живых микроорганизмов и их спор.

«Поликлональные антитела», как применяют в настоящем документе, относится к популяции антител, которая получена в иммуногенном ответе на белок с несколькими эпитопами, и, таким образом, включает ряд различных антител, направленных на один и тот же эпитоп и на разные эпитопы в белке. Способы для получения поликлональных антител известны в данной области (См., например, главу 11 в: Short Protocols in Molecular biology, (2002) 5^th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley и Sons, New York).

«Выделенная нуклеиновая кислота» представляет собой нуклеиновую кислоту, например, РНК, ДНК, или смешанный полимер, который, по существу, отделен от других последовательностей геномной ДНК, а также белков или комплексов, таких как рибосомы и полимеразы, которые естественным образом сопровождают нативную последовательность. «Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в природном источнике молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, «выделенная» молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может быть, по существу, свободна от другого клеточного материала, или среды для культивирования, если произведена рекомбинантными способами, или по существу свободна от химических предшественников или других химических веществ, если синтезирована химическим путем. В конкретном варианте осуществления одна или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, описанное в настоящем документе, является выделенной или очищенной. Термин включает последовательности нуклеиновой кислоты, которые были удалены из своего природного окружения, и включает рекомбинантные или клонированные изоляты ДНК и химически синтезированные аналоги или аналоги, синтезированные биологическим путем при помощи гетерологичным систем. По существу, чистая молекула может включать выделенные формы молекулы.

«Полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», как взаимозаменяемо используют в настоящем документе, относится к полимерам из нуклеотидов любой длины, и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями, и/или их аналогами, или любым субстратом, которым может быть вставлен в полимер при помощи ДНК или РНК-полимеразы или путем синтетической реакции. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. «Олигонуклеотид», как применяют в настоящем документе, в основном относится к коротким, в основном, одноцепочечным, в основном, синтетическим полинуклеотидам, которые, как правило, но не обязательно, имеют менее чем приблизительно 200 нуклеотидов в длину. Термины «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» не являются взаимоисключающими. Описание выше для полинуклеотидов в равной степени и полностью применимо к олигонуклеотидам. Клетка, которая производит антитело к GFRAL по настоящему изобретению, может включать родительскую гибридомную клетку, а также бактериальные и эукариотические клетки-хозяева, в которые была введена нуклеиновая кислота, кодирующая антитела. Подходящие клетки-хозяева описаны далее.

Как применяют в настоящем документе, термины «лечить» и «лечение» относятся к уменьшению или улучшению прогрессирования, тяжести и/или длительности заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, в результате введения одного или нескольких терапевтических средств (включая в качестве неограничивающих примеров, введение одного или нескольких профилактических или терапевтических средств, таких как антитело, предлагаемое в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело к GFRAL. Лечение, как применяют в настоящем документе, в качестве неограничивающих примеров включает (i) увеличение массы тела; (ii) поддержание массы тела; (iii) уменьшение потери массы тела; (iv) увеличение массы тела (например, массы нежировой ткани или массы жировой ткани); (v) поддержание массы тела (например, массы нежировой ткани или массы жировой ткани); (vi) уменьшение потери массы тела (например, массы нежировой ткани или массы жировой ткани), или любое их сочетание.

Как применяют в настоящем документе, термин «профилактическое средство» относится к любому веществу, которое может полностью или частично ингибировать развитие, рецидив, возникновение или распространение заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, и/или связанного с ним симптома у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления термин «профилактическое средство» относится к антителу, предлагаемому в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления термин «профилактическое средство» относится к веществу, иному чем антитело, предлагаемое в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления профилактическое средство представляет собой вещество, которое, как известно, использовалось, используется в настоящее время или полезно для профилактики заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, и/или связанного с ним симптома, или препятствует возникновению, развитию, прогрессированию и/или тяжести заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, и/или связанного с ним симптома. В некоторых вариантах осуществления профилактическое средство представляет собой полностью человеческое антитело к GFRAL, такое как полностью человеческое моноклональное антитело к GFRAL.

Термин «профилактическое средство» относится к любому веществу, которое может полностью или частично ингибировать развитие, рецидив, возникновение или распространение заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, и/или связанного с ним симптома у индивидуума. В определенных вариантах осуществления термин «профилактическое средство» относится к антителу к GFRAL, описанному в настоящем документе. В других определенных вариантах осуществления термин «профилактическое средство» относится веществу, иному чем антитело к GFRAL, описанному в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления профилактическое средство представляет собой вещество, которое, как известно, использовалось, используется в настоящее время или полезно для профилактики заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, и/или связанного с ним симптома, или препятствует возникновению, развитию, прогрессированию и/или тяжести заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, и/или связанного с ним симптома. В конкретных вариантах осуществления, профилактическое средство представляет собой гуманизированное антитело к GFRAL, такое как гуманизированное моноклональное антитело к GFRAL.

Термин «вкладыш в упаковку» применяют по отношению к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях к применению, использованию, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно применения таких терапевтических продуктов.

Термины «предотвращать» «предотвращение» и «профилактика» относятся к полному или частичному ингибированию развития, рецидива, возникновения или распространения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, и/или связанного с ним симптома, в результате введения терапевтического средства или комбинации терапевтических средств, предлагаемых в настоящем документе (например, комбинация профилактических или терапевтических средств, таких как антитело, предлагаемое в настоящем документе).

Термин «рекомбинантное антитело» относится к антителу, которое получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами. Рекомбинантные антитела могут быть антителами, которые экспрессируются с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, которым трансфицируют клетку-хозяина, антителами, выделенными из библиотеки рекомбинантных комбинаторных антител, антителами, выделенным у животного (например, мыши или коровы), которое является трансгенным и/или трансхромосомным по генам иммуноглобулина человека (см., например, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антителами, полученными, экспрессированными, созданными или выделенными любыми другими способами, которые включают соединение последовательностей генов иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела могут иметь вариабельные и константные области, включая области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека (См. Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). В определенных вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные антитела можно подвергать мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и являются им родственными, могут не существовать в природе в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

Термин «побочные эффекты» включает нежелательные и неблагоприятные воздействия терапии (например, профилактического или терапевтического средства). Нежелательные эффекты необязательно являются неблагоприятными. Неблагоприятное воздействие от терапии (например, профилактического или терапевтического средства) может быть вредным или дискомфортным, или опасным. Примеры побочных эффектов включают диарею, кашель, гастроэнтерит, обструктивный синдром, тошноту, рвоту, анорексию, спазмы в животе, лихорадку, боль, потерю массы тела, дегидратацию, алопецию, диспению, бессоницу, головокружение, мукозит, нервные и мышечные эффекты, усталость, сухость во рту и потерю аппетита, сыпь или припухлости в месте введения, гриппоподобные симптомы, такие как лихорадка, озноб и усталость, проблемы с желудочно-кишечным трактом и аллергические реакции. Дополнительные нежелательные эффекты, испытанные пациентами, многочисленны и известны в данной области. Многие из них описаны в Настольном справочнике врача (60^th ed., 2006).

Термины «индивидуум» и «пациент» используют взаимозаменяемо в настоящем документе и, в отношении способов, описываемых в настоящем документе, относятся к животному, которое является реципиентом терапии или профилактики. Как применяют в настоящем документе, в определенных вариантах осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее, такое как не-примат (например, коровы, свиньи, лошади, кошки, собаки, крысы, и тому подобное) или примат (например, обезьяна и человек). В конкретных вариантах осуществления, индивидуум является человеком. В одном из вариантов осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее (например, человека) с заболеванием, нарушением или состоянием, опосредованным GDF15. В другом варианте осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее (например, человека) с риском развития заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15.

«По существу, все» относится, по меньшей мере, приблизительно к 60%, по меньшей мере, приблизительно к 65%, по меньшей мере, приблизительно к 70%, по меньшей мере, приблизительно к 75%, по меньшей мере, приблизительно к 80%, по меньшей мере, приблизительно к 85%, по меньшей мере, приблизительно к 90%, по меньшей мере, приблизительно к 95%, по меньшей мере, приблизительно к 96%, по меньшей мере, приблизительно к 97%, по меньшей мере, приблизительно к 98%, по меньшей мере, приблизительно к 99%, или приблизительно к 100%.

Термин «терапевтическое средство» относится к любому средству, которое можно использовать для лечения, профилактики, или облегчения заболевания, нарушения или состояния, в том числе для лечения, профилактики, или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, или их симптома. В определенных вариантах осуществления терапевтическое средство относится к антителу к GFRAL, описанному в настоящем документе. В других определенных вариантах осуществления терапевтическое средство относится к средству, иному чем антитело, предлагаемое в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой средство, которое, как известно, использовалось, используется в настоящее время или полезно для лечения, профилактики, или облегчения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, и/или связанного с ним симптома.

Комбинация терапевтических средств (например, применение профилактических или терапевтических средств), которая более эффективна, чем совокупное воздействие любых двух или более отдельных средств. Например, синергическое действие комбинации профилактических и/или терапевтические средств позволяет использовать более низкие дозировки одного или нескольких средств и/или менее частое введение средств индивидууму с заболеванием, нарушением или состоянием, опосредованным GDF15. Возможность использовать более низкие дозы профилактических или терапевтических средств и/или вводить средства с меньшей частотой снижает токсичность, связанную с введением средств индивидууму без снижения эффективности средств для профилактики, контроля течения, лечения или облегчения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15. Кроме того, синергическое действие может приводить к улучшенной эффективности средств для профилактики, или контроля течения, лечения или облегчения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15. Наконец, синергическое действие комбинации средств (например, профилактических или терапевтических средств) помогает избежать или уменьшить неблагоприятные или нежелательные побочные эффекты, связанные с использованием любого одиночного средства. В некоторых вариантах осуществления комбинированное лечение включает антитело, предлагаемое в настоящем документе, и инсулин (например, введение инсулина). В некоторых вариантах осуществления комбинированное лечение включает антитело к GFRAL и инсулин, где комбинированное лечение включает инсулин в более низкой суточной дозе, чем нормальная суточная доза при терапии только инсулином. В некоторых вариантах осуществления комбинированное лечение включает, например, менее чем, 90%, менее чем, 80%, менее чем, 70%, менее чем, 60%, менее чем, 50%, менее чем, 40%, менее чем, 30%, менее чем, 20%, менее чем, 15%, менее чем, 10%, менее чем, 5%, менее чем, 3%, или менее чем, 1% от нормальной суточной дозы инсулина при терапии только инсулином.

Термин «терапия» относится к любому протоколу, способу и/или средству, которое можно использовать для профилактики, management, лечения и/или облегчения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15 (например, диабета типа 1 или диабета типа 2). В некоторых вариантах осуществления термины «средства» и «терапия» относятся к биологической терапии, поддерживающей терапии, и/или другим средствам, полезным для профилактики, контроля течения, лечения или облегчения заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, известным специалисту в данной области, такому как медицинский сотрудник.

Термин «детектируемый зонд» относится к композиции, которая обеспечивает детектируемый сигнал. Термин в качестве неограничивающих примеров включает, любой флуорофор, хромофор, радиоактивную метку, фермент, антитело или фрагмент антитела, и тому подобное которые обеспечивают детектируемый сигнал за счет своей активности.

Термин «диагностическое средство» относится к веществу, вводимому индивидууму, которое помогает при диагностике заболеваний, нарушений или состояний. Такие вещества можно использовать для выявления, точного определения и/или определения локализации процесса, вызывающего заболевание. В определенных вариантах осуществления диагностическое средство включает вещество, которое конъюгировано с антителом к GFRAL, описанным в настоящем документе, которое при введении индивидууму или при контакте с образцом от индивидуума при диагностике заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15.

Термин «детектируемое средство» относится к веществу, которое можно использовать для выяснения наличия или присутствия желаемой молекулы, такой как антитело к GFRAL, описанной в настоящем документе, в образце или у индивидуума. Детектируемое средство может быть веществом, которое можно визуализировать или веществом, которое можно иным образом обнаружить и/или измерить (например, количественно).

Термин «кодировать» или его грамматические эквиваленты, когда его применяют по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты, относится к молекуле нуклеиновой кислоты в ее нативном состоянии или при манипуляции способами, хорошо известными специалистам в данной области, которая может быть транскрибирована для получения мРНК, которая затем транслируется в полипептид и/или его фрагмент. Антисмысловая цепь является комплементарной такой молекуле нуклеиновой кислоты, и кодирующая последовательность может быть выведена из нее.

Термин «эксципиент» относится к инертному веществу, которое широко используется в качестве разбавителя, носителя, консерванта, связывающего средства, или стабилизирующего средства, и включает, но не ограничивается ими, белки (например, сывороточный альбумин и тому подобное), аминокислоты (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, глицин, гистидин и тому подобное), жирные кислоты и фосфолипиды (например, алкилсульфонаты, каприлат и тому подобное), поверхностно-активные вещества (например, SDS, полисорбат, неионное поверхностно-активное вещество и тому подобное), сахариды (например, сахарозу, мальтозу, трегалозу и тому подобное) и полиoлы (например, маннит, сорбит и тому подобное). См., также, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA, таким образом, включенный в качестве ссылки в полном объеме.

В отношении пептида или полипептида, как применяют в настоящем документе, термин «фрагмент» относится к пептиду или полипептиду, которые содержат меньше чем полноразмерную аминокислотную последовательность. Такой фрагмент может возникать, например, из-за укорочения на амино-конце, укорочения на карбокси-конце, и/или внутренней делеции остатка/остатков в аминокислотной последовательности. Фрагменты, например, могут быть результатом альтернативного сплайсинга РНК или активности протеазы in vivo. В определенных вариантах осуществления фрагменты включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, по меньшей мере, из 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере из 200 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 250, по меньшей мере из 300, по меньшей мере из 350, по меньшей мере из 400, по меньшей мере из 450, по меньшей мере из 500, по меньшей мере из 550, по меньшей мере из 600, по меньшей мере из 650, по меньшей мере из 700, по меньшей мере из 750, по меньшей мере из 800, по меньшей мере из 850, по меньшей мере из 900, или по меньшей мере из 950 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности полипептида GFRAL или антитела, которое связывается с полипептидом GFRAL. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела, которое связывается с полипептидом GFRAL, сохраняет, по меньшей мере, одну, по меньшей мере, две, или, по меньшей мере, три и более функций антитела.

Термины «вести», «ведение» и контроль течения заболевания» относятся к положительному воздействию, которое индивидуум получает от терапии (например, от профилактического или терапевтического средства), которое не приводит к излечению заболевания. В определенных вариантах осуществления индивидууму вводят одно или несколько средств (например, профилактических или терапевтических средств, таких как антитело, предлагаемое в настоящем документе) для «ведения» заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, или его симптома, таким образом, чтобы предотвратить прогрессирование или ухудшение заболевания.

«Вводить» или «введение» относится к инъекции или физической доставке вещества индивидууму иным образом, поскольку оно находится вне тела (например, антитело к GFRAL, как описано в настоящем документе), таким как путем внутрислизистой, чрездермальной, внутривенной, внутримышечной доставки и/или любым другим способом физической доставки, описываемом в настоящем документе или известным в данной области. Если лечат заболевание, нарушение, или состояние, или его симптом, введение вещества, как правило, происходит после начала заболевания, нарушения или состояния, или его симптомов. Если проводят профилактику заболевания, нарушения или состояния, или его симптомов, введение вещества, как правило, происходит до начала заболевания, нарушения или состояния, или его симптомов.

В отношении полипептида, как применяют в настоящем документе, термин «аналог» относится к полипептиду, который обладает сходной или идентичной функцией, что и полипептид GFRAL, фрагмент полипептида GFRAL, или антитело к GFRAL, но не обязательно содержит аминокислотную последовательность, сходную или идентичную с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, или антителом к GFRAL, или обладает сходной или идентичной структурой с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, или антителом к GFRAL. Полипептид, который имеет сходную аминокислотную последовательность, относится к полипептиду, который удовлетворяет, по меньшей мере, одному из следующих условий: (a) полипептид с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности полипептида GFRAL (например, SEQ ID NO:500, фрагменту полипептида GFRAL, или антителу к GFRAL, описываемому в настоящем документе; (b) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид GFRAL, фрагмент полипептида GFRAL, или антитело к GFRAL (или его область VH или VL), описываемое в настоящем документе, по меньшей мере, из 5 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 10 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 15 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 20 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 25 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 40 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 60 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 70 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 80 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 90 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 125 аминокислотных остатков, или, по меньшей мере, из 150 аминокислотных остатков (см., например, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY); и (c) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, или, по меньшей мере, на 99% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид GFRAL, фрагмент полипептида GFRAL, или антитело к GFRAL (или его область VH или VL), описываемое в настоящем документе. Полипептид со сходной структурой с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, или антителом к GFRAL, описываемым в настоящем документе, относится к полипептиду, который имеет сходную вторичную, третичную или четвертичную структуру с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, или антителом к GFRAL, описываемым в настоящем документе. Структуру полипептида можно определять способами, известными специалистам в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров, рентгеноструктурную кристаллографию, ядерный магнитный резонанс, и кристаллографическую электронную микроскопию.

Термин «композиция» предназначен для включения продукта, содержащего оговоренные ингредиенты (например, антитело, предлагаемое в настоящем документе) необязательно в указанных количествах, а также любой продукт, который является результатом, прямо или опосредованно, комбинации оговоренных ингредиентов в необязательно указанных количествах.

В отношении полипептида, как применяют в настоящем документе, термин «производное» относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность полипептида GFRAL, фрагмента полипептида GFRAL, или антитела, связывающегося с полипептидом GFRAL, которая была изменена путем введения замен, делеций или вставок аминокислотных остатков. Как применяют в настоящем документе, термин «производное» также относится к полипептиду GFRAL, фрагменту полипептида GFRAL, или антителу, связывающемуся с полипептидом GFRAL, которые были химически модифицированы, например, путем ковалентного присоединения к полипептиду молекулы любого типа. Например, но, не ограничиваясь этим, полипептид GFRAL, фрагмент полипептида GFRAL или антитело к GFRAL можно химически модифицировать, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, модификации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связи с клеточным лигандом или другим белками тому подобное. Производные модифицируют способом, который отличается от природного или исходного пептида или полипептидов, или по типу или по расположению присоединенных молекул. Производные далее включают делецию одной или нескольких химических групп, которые естественным образом присутствуют на пептиде или полипептиде. Производное полипептида GFRAL, фрагмента полипептида GFRAL, или антитела к GFRAL можно модифицировать химическим путем при помощи химических модификаций с использованием способов, известных специалистам в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров специфическое химическое расщепление, ацетилирование, подбор состава, метаболический синтез туникамицина, и тому подобное. Дополнительно, производное полипептида GFRAL, фрагмента полипептида GFRAL, или антитела к GFRAL может содержать одну или несколько неклассических аминокислот. Производное полипептида обладает сходной или идентичной функцией, что и полипептид GFRAL, фрагмент полипептида GFRAL, или антитело к GFRAL, описываемое в настоящем документе.

Термин «непреднамеренная потеря массы тела» относится к непланируемой потере массы тела, которую наблюдают при множестве состояний, таких как кахексия, цирроз печени, гипертиреоз, хроническая почечная недостаточность, болезнь Паркинсона, злокачественная опухоль, пищевое нарушение и саркопения.

Термин «кахексия» относится к синдрому истощения, при котором отмечают потерю массы, мышечную атрофию, усталость, слабость и значительную потерю аппетита у кого-то, кто не пытается активно сбросить вес. Кахексия может в значительной степени способствовать заболеваемости пациентов, страдающих некоторыми хроническими заболеваниями (например, злокачественной опухолью, хронической почечной недостаточностью, хроническим воспалительным заболеванием, мышечной атрофией, такой как миодистрофия, и нервной анорексией). Например, кахексия распространена на поздней стадии злокачественной опухоли (встречаясь у большинства смертельно больных пациентов со злокачественной опухолью), и несет ответственность приблизительно за четверть всех смертей, связанных со злокачественными опухолями.

КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Предлагаются связывающие белки, такие как антитела, которые связываются с GFRAL (например, человеческим GFRAL). Антитела по настоящему изобретению подходят, например, для диагностики или лечения заболеваний, нарушений или состояний, опосредованных GDF15. В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению подходят, для диагностики или лечения заболевания, нарушения или состояния, такого как непреднамеренная потеря массы тела, включая в качестве неограничивающих примеров, непреднамеренную потерю массы тела у индивидуума, страдающего от кахексии или хронического заболевания (например, цирроз печени, гипертиреоз, болезнь Паркинсона, злокачественная опухоль, хроническая почечная недостаточность, хроническое обструктивное заболевание легких, СПИД, туберкулез, хроническое воспалительное заболевание, сепсис, мышечная атрофия и нервная анорексия) или в широком смысле, любое заболевание, нарушение, или состояние, при котором желательно ингибировать эффекты GDF15 in vivo.

В настоящем документе предлагаются антитела (например, моноклональные антитела), которые связываются с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, пептидом GFRAL или эпитопом GFRAL. В некоторых вариантах осуществления антитела к GFRAL связываются с внеклеточным доменом (ECD) GFRAL. Также предлагаются антитела, которые конкурентно блокируют связывание антитела к GFRAL, предлагаемого в настоящем документе, с полипептидом GFRAL. Антитела к GFRAL, предлагаемые в настоящем документе, можно также конъюгировать или соединять рекомбинантным путем с диагностическим средством, средством для детекции или терапевтическим средством. Дополнительно предлагаются композиции, содержащие антитело к GFRAL.

Также в настоящем документе предлагаются выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую цепь иммуноглобулина, легкую цепь, область VH, область VL, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3 антител к GFRAL, которые связываются с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, пептидом GFRAL или эпитопом GFRAL. Дополнительно предлагаются векторы и клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антитела к GFRAL, которые связываются с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, пептидом GFRAL или эпитопом GFRAL. Также предлагаются способы получения антител, которые связываются с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, пептидом GFRAL или эпитопом GFRAL.

В настоящем документе предлагаются способы применения антител к GFRAL. Способы включают лечение, профилактику или облегчение заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, включая лечение, профилактику или облегчение одного или нескольких симптомов заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, у индивидуума (например, пациента). Неограничивающие примеры заболеваний, нарушений или состояний, опосредованных GDF15, включают непреднамеренную потерю массы, дистрофическое заболевание, непреднамеренную потерю массы тела у индивидуума, страдающего от кахексии или хронического заболевания (например, цирроза печени, гипертиреоза, болезни Паркинсона, злокачественной опухоли, хронической почечной недостаточности, хронического обструктивного заболевания легких, СПИДа, туберкулеза, хронического воспалительного заболевания, сепсиса, мышечной атрофии и нервной анорексии). Другие заболевания, нарушения, или состояния, при которых индивидуум может страдать от непреднамеренной потери массы, включают пищевые нарушения, миодистрофию или рассеянный склероз.

Антитела к GFRAL

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает антитела к GFRAL, которые могут найти применение в настоящем документе в качестве терапевтически средств. Примеры антител включают поликлональные, моноклональные, гуманизированные, человеческие, биспецифические, и гетероконъюгированные антитела, а также их варианты с улучшенной аффинностью или другими свойствами.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предлагаются антитела, которые связываются с GFRAL, в том числе с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, пептидом GFRAL или эпитопом GFRAL. В некоторых вариантах осуществления антитела к GFRAL представляют собой гуманизированные антитела (например, содержащие константные области человека), которые связываются с GFRAL, в том числе с полипептидом GFRAL, фрагментом полипептида GFRAL, пептидом GFRAL или эпитопом GFRAL.

В некоторых вариантах осуществления, антитело к GFRAL содержит область VH, область VL, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3 любого из моноклональных антител, описываемых в настоящем документе (например, 1C1, 3P10, 12A3, 5F12, 5A20, 8D8, 17J16, 25M22, 2B8, 22N5, 2I23, 6N16, 1B3, 19K19, 2B3, 8C10, 2A9, 24G2, 6G9, 2B11,1A3, P1B6, P1H8, или P8G4), такие как аминокислотная последовательность, описанная в таблицах 1-24. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его функциональный фрагмент, предлагаемое в настоящем документе, содержит одну, две и/или три CDR тяжелой цепи и/или одну, две и/или три CDR легкой цепи из: (a) антитела, обозначенного 1C1; (b) антитела, обозначенного 3P10; (c) антитела, обозначенного 12A3; (d) антитела, обозначенного 5F12; (e) антитела, обозначенного 5A20; (f) антитела, обозначенного 8D8; (г) антитела, обозначенного 17J16; (h) антитела, обозначенного 25M22; (i) антитела, обозначенного 2B8; (j) антитела, обозначенного 22N5; (k) антитела, обозначенного 2I23; (l) антитела, обозначенного 6N16; (m) антитела, обозначенного 1B3; (n) антитела, обозначенного 19K19; (o) антитела, обозначенного 2B3; (p) антитела, обозначенного 8C10; (q) антитела, обозначенного 2A9; (r) антитела, обозначенного 24G2; (s) антитела, обозначенного 6G9; (t) антитела, обозначенного 2B11; (u) антитела, обозначенного 1A3; (v) антитела, обозначенного P1B6; (w) антитела, обозначенного P1H8; (x) антитела, обозначенного P8G4; или антитела, обозначенного от 1C1 до P8G4, как показано в таблицах 1-24.

Антитело, обозначенное 1C1, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:1, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:2.

Антитело, обозначенное 3P10, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:3, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:4.

Антитело, обозначенное 12A3, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:5, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:6.

Антитело, обозначенное 5F12, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:7, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:8.

Антитело, обозначенное 5A20, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:9, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:10.

Антитело, обозначенное 8D8, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:11, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:12.

Антитело, обозначенное 17J16, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:13, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:14.

Антитело, обозначенное 25M22, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:15, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:16.

Антитело, обозначенное 2B8, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:17, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:18.

Антитело, обозначенное 22N5, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:19, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:20.

Антитело, обозначенное 2I23, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:21, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:22.

Антитело, обозначенное 6N16, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:23, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:24.

Антитело, обозначенное 1B3, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:25, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:26.

Антитело, обозначенное 19K19, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:27, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:28.

Антитело, обозначенное 2B3, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:29, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:30.

Антитело, обозначенное 8C10, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:31, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:32.

Антитело, обозначенное 2A9, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:33, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:34.

Антитело, обозначенное 24G2, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:35, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:36.

Антитело, обозначенное 6G9, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:37, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:38.

Антитело, обозначенное 2B11, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:39, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:40.

Антитело, обозначенное 1A3, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:480, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:481.

Антитело, обозначенное P1B6, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:482, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:483.

Антитело, обозначенное P1H8, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:484, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:485.

Антитело, обозначенное P8G4, содержит последовательность VH, которая представляет собой SEQ ID NO:486, и последовательность VL, которая представляет собой SEQ ID NO:487.

Таблица 22: Последовательности CDR антитела P1B6

Таблица 23: Последовательности CDR антитела P1H8

Таблица 24: Последовательности CDR антитела P8G4

В некоторых вариантах осуществления антитела, предлагаемые в настоящем документе, содержат область VH или домен VH. В других вариантах осуществления антитела, предлагаемые в настоящем документе, содержат область VL или цепь VL. В некоторых вариантах осуществления антитела, предлагаемые в настоящем документе, имеют сочетание (i) домена VH или области VH; и/или (ii) домена VL или области VL.

В некоторых вариантах осуществления антитело, предлагаемое в настоящем документе, содержит шесть CDR или состоит из шести CDR, например, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3, идентифицированные в таблицах 1-24. В некоторых вариантах осуществления антитело, предлагаемое в настоящем документе, может содержать менее чем шесть CDR. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит или состоит из одной, двух, трех, четырех, или пяти CDR, выбранных из группы, состоящей из VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3, идентифицированных в таблицах 1-24. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит или состоит из одной, двух, трех, четырех, или пяти CDR, выбранных из группы, состоящей из VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3 мышиного моноклонального антитела, выбранного из группы, состоящей из: (a) антитела, обозначенного 1C1; (b) антитела, обозначенного 3P10; (c) антитела, обозначенного 12A3; (d) антитела, обозначенного 5F12; (e) антитела, обозначенного 5A20; (f) антитела, обозначенного 8D8; (г) антитела, обозначенного 17J16; (h) антитела, обозначенного 25M22; (i) антитела, обозначенного 2B8; (j) антитела, обозначенного 22N5; (k) антитела, обозначенного 2I23; (l) антитела, обозначенного 6N16; (m) антитела, обозначенного 1B3; (n) антитела, обозначенного 19K19; (o) антитела, обозначенного 2B3; (p) антитела, обозначенного 8C10; (q) антитела, обозначенного 2A9; (r) антитела, обозначенного 24G2; (s) антитела, обозначенного 6G9; (t) антитела, обозначенного 2B11; (u) антитела, обозначенного 1A3; (v) антитела, обозначенного P1B6; (w) антитела, обозначенного P1H8; или (x) антитела, обозначенного P8G4, описываемых в настоящем документе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело содержит или состоит из одной, двух, трех, четырех, или пяти CDR из любой из VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, и/или VL CDR3, идентифицированных в таблицах 1-24.

В некоторых вариантах осуществления антитела, предлагаемые в настоящем документе, содержат или состоят из одной или нескольких (например, одной, двух или трех) VH CDR, перечисленных в таблицах 1-24. В других вариантах осуществления антитела, предлагаемые в настоящем документе, содержат одну или несколько (например, одну, две или три) VL CDR, перечисленных в таблицах 1-24. Еще в одних вариантах осуществления, антитела, предлагаемые в настоящем документе, содержат одну или несколько (например, одну, две или три) VH CDR, перечисленных в таблицах 1-24 и одну или несколько VL CDR, перечисленных в таблицах 1-24. Таким образом, в определенных вариантах осуществления антитела содержат VH CDR1 с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO:57, 49, 57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796, 488-493, 1795, 1796. В другом варианте осуществления антитела содержат VH CDR2 с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO:132-220, 497-514. В другом варианте осуществления антитела содержат VH CDR3 с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO:57, 49, 57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796, 488-493, 1795, 1796. В определенных вариантах осуществления антитела содержат VH CDR1 и/или VH CDR2 и/или VH CDR3, независимо выбранные из VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3 как показано в любой из аминокислотных последовательностей, представленных в таблицах 1-24. В определенных вариантах осуществления антитела содержат VL CDR1 с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO:297-372, 531-546. В другом варианте осуществления антитела содержат VL CDR2 с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO:373-422. В другом варианте осуществления антитела содержат VL CDR3 с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO:423-479, 558-569. В определенных вариантах осуществления антитела содержат VL CDR1 и/или VL CDR2 и/или VL CDR3, независимо выбранные из VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, как показано в любой из аминокислотных последовательностей, представленных в таблицах 1-24.

Также в настоящем документе предлагаются антитела, содержащие одну или несколько (например, одну, две или три) VH CDR и одну или несколько (например, одну, две или три) VL CDR, перечисленные в таблицах 1-24. в частности, в настоящем документе предлагается антитело, содержащее: VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514) и VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546); VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514) и VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422) и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422), и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR1 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422), и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); VH CDR2 (SEQ ID NO:132-220, 497-514), VH CDR3 (SEQ ID NO:57, 49, 221-296, 515-530, 488-493, 1795, 1796), VL CDR1 (SEQ ID NO:297-372, 531-546), VL CDR2 (SEQ ID NO:373-422), и VL CDR3 (SEQ ID NO:423-479, 558-569); или любое сочетание VH CDR (SEQ ID NO:41-296) и VL CDR (SEQ ID NO:297-477), перечисленных в таблицах 1-24.

В определенных вариантах осуществления антитело или его фрагмент, описываемые в настоящем документе, содержат последовательность гуманизированной каркасной области (FR). В определенных вариантах осуществления антитело или его фрагмент, описываемые в настоящем документе, содержат область VH, включающую аминокислотную последовательность VH FR1, VH FR2, VH FR3 и VH FR4, указанную в таблице 25; и/или (b) область VL, включающую аминокислотную последовательность VL FR1, VL FR2, VL FR3 и VL FR4, указанную в таблице 25.

Таблица 25

Примеры каркасных последовательностей для гуманизированных антител к GFRAL

В определенных вариантах осуществления антитело или его фрагмент, описываемые в настоящем документе, содержат область VH, которая содержит: (1) VH FR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:570-578; (2) VH FR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:579-602; (3) VH FR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:603-1726; и/или (4) VH FR4 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1727-1728. Таким образом, в некоторых аспектах, гуманизированное антитело содержит область VH, которая включает VH FR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:570-578. В некоторых аспектах, гуманизированное антитело содержит область VH, которая включает VH FR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:579-602. В некоторых аспектах, гуманизированное антитело содержит область VH, которая включает VH FR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:603-1726. В некоторых аспектах, гуманизированное антитело содержит область VH, которая включает VH FR4 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1727-1728.

В определенных вариантах осуществления антитело или его фрагмент, описываемые в настоящем документе, содержат область VL, которая включает: (1) VL FR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1729-1750; (2) VL FR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1751-1777; (3) VL FR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1778-1792; и/или (4) VL FR4 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1793-1794. Таким образом, в некоторых аспектах, гуманизированное антитело содержит область VL, которая включает VL FR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1729-1750. В некоторых аспектах, гуманизированное антитело содержит область VL, которая включает VL FR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1751-1777. В некоторых аспектах, гуманизированное антитело содержит область VL, которая включает VL FR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1778-1792. В некоторых аспектах, гуманизированное антитело содержит область VL, которая включает VL FR4 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1793-1794.

В определенных вариантах осуществления антитело или его фрагмент, описываемые в настоящем документе, содержат область VH и область VL, где область VH дополнительно содержит: (1) VH FR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:570-578; (2) VH FR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:579-602; (3) VH FR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:603-1726; и/или (4) VH FR4 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1727-1728; и где область VL дополнительно содержит: (1) VL FR1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1729-1750; (2) VL FR2 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1751-1777; (3) VL FR3 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1778-1792; и/или (4) VL FR4 с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO:1793-1794.

Также в настоящем документе предлагаются антитела, содержащие одну или несколько (например, одну, две, три или четыре) VH FR и одну или несколько (например, одну, две, три или четыре) VL FR, перечисленные в таблице 25. В частности, в настоящем документе предлагается антитело, содержащее: VH FR1 (SEQ ID NO:570-578) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792), и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); VH FR1 (SEQ ID NO:570-578), VH FR2 (SEQ ID NO:579-602), VH FR3 (SEQ ID NO:603-1726), VH FR4 (SEQ ID NO:1727-1728), VL FR1 (SEQ ID NO:1729-1750), VL FR2 (SEQ ID NO:1751-1777), VL FR3 (SEQ ID NO:1778-1792) и VL FR4 (SEQ ID NO:1793-1794); или любое сочетание VH FR (SEQ ID NO:478-1636) и VL FR (SEQ ID NO:1637-1702), перечисленных в таблицах 25.

В еще одном аспекте предлагаются антитела, которые конкурируют с одним из иллюстративных антител или функциональными фрагментами за связывание с GFRAL. Такие антитела могут также связываться с тем же эпитопом, что и эпитоп для одного из иллюстративных антител в настоящем документе, или с перекрывающимся эпитопом. Ожидается, что антитела и фрагменты, которые конкурируют за тот же эпитоп или связываются с тем же эпитопом, что и иллюстративные антитела, будут демонстрировать сходные функциональные свойства. Примеры антигенсвязывающих белков и фрагментов включают белки и фрагменты с областями VH и VL, и CDR, предлагаемыми в настоящем документе, включая указанные в таблицах 1-24. Таким образом, в качестве конкретного примера, предлагаются антитела, которые включают антитела, конкурирующие с антителом, которое содержит: (a) 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 из CDR, перечисленных для антитела, указанного в таблицах 1-24; (b) VH и VL, выбранные из областей VH и VL, перечисленных для антитела, указанного в таблицах 1-24; или (c) две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие VH и VL, как указано для антитела в таблицах 1-24.

В определенных вариантах осуществления антитела из композиций и способы применения антител, предлагаемых в настоящем документе, включают моноклональные антитела к GFRAL, описываемые в настоящем документе, например, в разделе Примеры. Любое антитело к GFRAL можно использовать в любом из способов, предлагаемых в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:3, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:5, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:7, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:9, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:11, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:13, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:15, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:17, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:17, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:19, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:21, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:23, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:25, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:27, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:29, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:31, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:33, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:35, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:37, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:39, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:480, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:482, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:484, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:486, или ее гуманизированный вариант.

В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:4, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:6, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:8, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:10, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:12, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:14, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:16, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:18, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:20, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:22, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:24, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:26, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:28, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:30, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:32, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:34, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:36, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:38, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:40, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:481, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:483, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:485, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:487, или ее гуманизированный вариант.

В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:3, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:4, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:5, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:6, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:7, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:8, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:9, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:10, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:11, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:12, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:13, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:14, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:15, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:16, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:17, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:18, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:19, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:20, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:21, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:22, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:23, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:24, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:25, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:26, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:27, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:28, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:29, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:30, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:31, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:32, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:33, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:34, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:35, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:36, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:37, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:38, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:39, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:40, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:480, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:481, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:482, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:483, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:484, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:485, или ее гуманизированный вариант. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:486, или ее гуманизированный вариант, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:487, или ее гуманизированный вариант.

В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:1 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:3 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:5 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:7 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:9 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:11 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:12. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:13 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:15 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:16. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:17 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:18. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:19 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:21 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:22. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:23 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:24. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:25 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:26. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:27 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:28. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:29 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:31 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:32. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:33 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:34. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:35 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:36. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:37 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:38. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:39 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:40. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:480 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:481. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:482 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:483. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:484 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:485. В некоторых вариантах осуществления различных способов, предлагаемых в настоящем документе, антитело содержит VH CDR1, VH CDR2, и VH CDR3 из домена VH с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:486 и VL CDR1, VL CDR2, и VL CDR3 из области VL, содержащей аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:487. Другие перечисленные последовательности домена VH, домена VL, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, описываемые в настоящем документе, также включены для применения в различных способах, предлагаемых в настоящем документе.

1. Поликлональные антитела

Антитела по настоящему изобретению могут содержать поликлональные антитела. Способы получения поликлональных антител известны специалистам в данной области. Поликлональные антитела можно индуцировать у млекопитающего, например, путем одной или нескольких инъекций иммунизирующего агента и, при желании, адъюванта. Как правило, иммунизирующий агент и/или адъювант инъецируют млекопитающему путем нескольких подкожных или внутрибрюшинных инъекций. Иммунизирующий агент может включать полипептид GFRAL или его слитый белок. Может быть полезным конъюгировать иммунизирующий агент с белком, о котором известно, что он является иммуногенным для млекопитающего, которое намереваются иммунизировать, или иммунизировать млекопитающее белком и одним или несколькими адъювантами. Примеры таких иммуногенных белков в качестве неограничивающих примеров включают гемоцианин морского блюдца, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин и ингибитор трипсина соевых бобов. Примеры адъювантов, которые можно использовать, включают Ribi, CpG, Поли 1C, полный адъювант Фрейнда и адъювант MPL-TDM (монофосфорил Липид A, синтетический дикориномиколат трегалозы). Специалист в данной области может выбрать протокол иммунизации без излишнего экспериментирования. У млекопитающего затем можно брать кровь и оценивать сыворотку на титр антитела к GFRAL. При желании, млекопитающее можно дополнительно иммунизировать до тех пор, пока титр антител не повысится или не выйдет на плато. Дополнительно или альтернативно, можно получать лимфоциты от иммунизированного животного для слияния и получения моноклональных антител из гибридомы, как описано ниже.

2. Моноклональные антитела

Антитела по настоящему изобретению могут альтернативно быть моноклональными антителами. Моноклональные антитела можно получать с использованием способа гибридомы, который был впервые описан Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или можно получать способами с рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567).

В гибридомном способе, мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомяк, иммунизируют, как описано выше, для выделения T-лимфоцитов, которые вырабатывают или способны к выработке антител, которые будут специфически связываться с белком, использованным для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro. После иммунизации, лимфоциты выделяют, а затем сливают с клеточной линией миеломы с использованием подходящего агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, для образования гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles и Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают на подходящей среде для культивирования, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых родительских миеломных клеток (также обозначаемых, как партнер по слиянию). Например, если у родительских миеломных клеток отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), селективная среда для культивирования гибридом, как правило, будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), которые предотвращают рост HGPRT-дефицитных клеток.

Предпочтительные в качестве партнера для слияния миеломные клетки представляют собой клетки, которые сливаются эффективно, поддерживают стабильную выработку антител на высоком уровне при помощи селектированных антитело-продуцирующих клеток, и являются чувствительными к селективной среде, которая проводит отбор против неслитых родительских клеток. Предпочтительными клеточными линиями миеломы являются линии мышиной миеломы, такие как SP-2 и производные, например, клетки X63-Ag8-653 клетки, доступные в Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния, США, и клетки, полученные из мышиных опухолей MOPC-21 и MPC-11, доступные в Центре распределения клеток Института Солка, Сан-Диего, Калифорния, США. Клеточные линии человеческой миеломы и гетеромиеломы мышь-человек также были описаны для выработки моноклональных антител человека (Kozbor, J., Immunol., 133:3001 (1984); и Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Среду для культивирования, в которой растут гибридомные клетки, оценивают на выработку моноклональных антител, направленных против антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, производимых гибридомными клетками, определяют путем иммунопреципитации или путем анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунологический анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Аффинность связывания моноклонального антитело, например, можно определять путем анализа Скэтчарда, описанного в Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Как только выявлены гибридомные клетки, которые вырабатывают антитела с желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны можно субклонировать путем серийных разведений и выращивать стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles и Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящие среды для культивирования для этой цели включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей у животного, например, путем внутрибрюшинной инъекции клеток в мышей.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, надлежащим образом выделяют из сред для культивирования, асцитойя жидкости, или сыворотки путем общепринятых способов очистки антител, таких как, например, аффинная хроматография (например, с использованием белка A или белка G-сефарозы) или ионообменная хроматография, хроматография на гидроксиапатите, электрофорез в геле, диализ, и тому подобное.

ДНК, кодирующие моноклональные антитела, легко выделять и секвенировать с использованием общепринятых способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Гибридомные клетки служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК можно помещать в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клеткм E. coli, клетки обезьяны COS, клетки китайского хомячка (CHO), или миеломные клетки, которые иначе не производят белок антитела, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии ДНК, кодирующей антитело, в бактериях включают Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).

В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с эпитопом GFRAL, содержит аминокислотную последовательность из домена VH и/или аминокислотную последовательность из домена VL, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с (1) комплементарной цепью нуклеотидной последовательности, кодирующей любой один из доменов VH и/или VL, описываемых в настоящем документе, при жестких условиях (например, гибридизация с ДНК, связанной на фильтре в 6× хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при приблизительно 45°C с последующим одним или несколькими отмываниями в 0,2×SSC/0,1% SDS при приблизительно 50-65°C), при высоко жестких условиях (например, гибридизация с нуклеиновой кислотой, связанной на фильтре в 6×SSC при приблизительно 45°C с последующим одним или несколькими отмываниями в 0,1×SSC/0,2% SDS при приблизительно 68°C), или при других жестких условиях гибридизации, которые известны специалистам в данной области (см., например, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. и John Wiley & Sons, Inc., New York на страницах 6.3.1-6.3.6 и 2.10.3).

В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается с эпитопом GFRAL, содержит аминокислотную последовательность из CDR VH или аминокислотную последовательность из CDR VL, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с комплементарной цепью нуклеотидной последовательности, кодирующей любую одну из CDR VH и/или CDR VL, перечисленных в таблицах 1-24 при жестких условиях (например, гибридизация с ДНК, связанной на фильтре, в 6×SSC при приблизительно 45°C с последующим одним или несколькими отмываниями в 0,2×SSC/0,1% SDS при приблизительно 50-65°C), при высоко жестких условиях (например, гибридизация с нуклеиновой кислотой, связанной на фильтре, в 6×SSC при приблизительно 45°C с последующим одним или несколькими отмываниями в 0,1×SSC/0,2% SDS при приблизительно 68°C), или при других жестких условиях гибридизации, которые известны специалистам в данной области (см., например, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. и John Wiley & Sons, Inc., New York на страницах 6.3.1-6.3.6 и 2.10.3).

В дополнительном варианте осуществления моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделять фаговых библиотек антител, получаемых с использованием способов, описанных, например, в Antibody Phage Display: Methods and Protocols, P.M. O'Brien и R. Aitken, eds, Humana Press, Totawa N.J., 2002. Как правило, клоны синтетических антител выбраны путем скрининга фаговых библиотек, содержащих фаг, который демонстрирует различные фрагменты вариабельной области антитела (Fv), с оболочечным белком фага. Проводят скрининг таких фаговых библиотек против желаемого антигена. Клоны, экспрессирующие Fv-фрагменты, способные связываться с желаемым антигеном, адсорбируются с антигеном, и, таким образом, отделяются от несвязавшихся клонов в библиотеке. Связавшиеся клоны затем элюируют с антигена, и их можно дополнительно обогащать дополнительными циклами адсобции/элюции с антигеном.

Вариабельные домены можно функционально располагать на фаге, или в виде одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов, в которых VH и VL ковалентно связаны через короткий гибкий пептид, или в виде Fab-фрагментов, в которых каждый из них слит с константным доменом и взаимодействует нековалентно, как описано, например, у Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994).

Репертуары генов VH и VL могут быть клонированы раздельно путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинированы случайным образом в фаговые библиотеки, в которых затем можно производить поиск антигенсвязывающих клонов, как описано в Winter et al., выше. Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают антитела с высокой аффинностью к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. Альтернативно, наивный репертуар можно клонировать для того чтобы обеспечить один источник антител человека к широкому ряду чужих антигенов, и также аутоантигенов без какой-либо иммунизации, как описано у Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки можно также получать синтетическим путем путем клонирования нереарранжированных сегментов V-гена из стволовых клеток, и использования праймеров для ПЦР, содержащих случайную последовательность, для кодирования высоко вариабельных областей CDR3 и проводить реарранжировку in vitro, как описано, например, у Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

Скрининг библиотек можно проводить различными способами, известными в данной области. Например, можно использовать GFRAL, (например, полипептид, фрагмент или эпитоп GFRAL) для покрытия лунок адсорбирующих планшетов, экспрессирующийся на клетках-хозяевах, прикрепленный на адсорбционных планшетах или используемый для сортировки клеток, или конъюгированный с биотином для захвата гранулами, покрытыми стрептавидином, или применяемый в любом другом способе для пэннинга дисплейных библиотек. Отбору антител с медленной кинетикой диссоциации (например, с хорошими аффинностями связывания) может способствовать использование долгих промывок и моновалентный фаговый дисплей, как описано в Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) и в WO 92/09690, и низкая плотность покрытия антигена, как описано в Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Антитела к GFRAL можно получать путем разработки подходящего способа скрининга антигена для отбора интересующего фагового клона с последующим конструированием клона полноразмерного антитела к GFRAL, с использованием последовательностей VH и/или VL (например, последовательностей Fv), или различных последовательностей CDR из последовательностей VH и VL, из интересующего фагового клона и подходящих последовательностей константной области (например, Fc), описанных в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

3. Фрагменты антител

Настоящее изобретение предлагает антитела и фрагменты антител, которые связываются с GFRAL. В определенных обстоятельствах есть преимущества в использовании фрагментов антител, а не целых антител. Меньший размер фрагментов позволяет происходить быстрому клиренсу, и может приводить к улучшенному доступу к клеткам, тканям или органам. Для обзора конкретных фрагментов антител, см. Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.

Разработаны различные техники для получения фрагментов антител. Обычно, эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical и Biophysical Methods 24:107-117 (1992); и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты можно сейчас производить напрямую при помощи рекомбинантных клеток-хозяев. Фрагменты антител Fab, Fv и ScFv, все можно экспрессировать и секретировать в E. coli или дрожжевых клетках, таким образом, делая возможной легкую продукцию больших количеств этих фрагментов. Фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, обсуждавшихся выше. Альтернативно, Fab'-SH фрагменты можно напрямую восстанавливать из E. coli и химически соединять для образования F(ab')₂ фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом, F(ab')₂ фрагменты можно выделять непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры-хозяина. Fab и F(ab')₂ фрагмент с увеличенным полувыведением in vivo, содержащие остатки эпитопа связывания рецептора спасения, описаны, например, в патенте США № 5869046. Другие способы получения фрагментов антител очевидны практикующим специалистам. В определенных вариантах осуществления антитело представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv) (см., например, WO 93/16185; патенты США №№ 5571894; и 5587458). Fv и scFv имеют интактные антигенсвязывающие центры антитела, которые лишены константных областей; таким образом, они могут подходить для уменьшения неспецифического связывания во время использования in vivo. Можно конструировать слитые белки scFv, производя слияние эффекторного белка или по амино- или по карбоксиконцу scFv. (См., например, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, выше). Фрагмент антитела может также быть «линейным антителом», например, как описано, например, в процитированных выше ссылках. Такие линейные антитела могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими, такими как биспецифические.

Более маленькие, полученные из антител, связывающие структуры представляют собой отдельные вариабельные домены (V-домены), которые также называются антитела с одним вариабельным доменом (SdAb). Определенные типы организмов, верблюды и хрящевые рыбы, обладают высокоаффинными одиночными V-подобными доменами на базе доменной структуры, эквивалентной Fc, как часть их иммунной системы. (Woolven et al., Immunogenetics 50: 98-101, 1999; Streltsov et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-12449, 2004). V-подобные домены (называемые VhH у верблюдов и V-NAR у акул), как правило, демонстрируют длинные поверхностные петли, которые позволяют проникать в полости антигенов-мишеней. Они также стабилизируют выделенные домены VH, маскируя гидрофобные участки поверхности.

Эти домены VhH и V-NAR были использованы для разработки sdAbs. Варианты человеческих V-доменов были сконструированы с использованием селекции из фаговых библиотек и других способов, которые привели к стабильным, хорошо связывающимся доменам, полученным из VL и VH.

Антитела, которые связываются с GFRAL, такие как предлагаемое в настоящем документе, в качестве неограничивающих примеров включают, синтетические антитела, моноклональные антитела, рекомбинантно произведенные антитела, полиспецифические антитела (включая биспецифические антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, верблюжьи антитела, химерные антитела, интраантитела, антиидиотипические (анти-Id) антитела, и функциональные фрагменты, (например, GFRAL-связывающие фрагменты) любого из вышеописанных. Неограничивающие примеры функциональных фрагментов (например, фрагментов, которые связываются с GFRAL) включают одноцепочечные Fv (scFv) (например, в том числе моноспецифические, биспецифические и тому подобное), Fab-фрагменты, F(ab') фрагменты, F(ab)₂ фрагменты, F(ab')₂ фрагменты, дисульфид-связанные Fv (sdFv), Fd фрагменты, Fv фрагменты, диатело, триотело, тетратело и миниантитело.

Антитела, предлагаемые в настоящем документе, в качестве неограничивающих примеров включают, молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина, например, молекулы, содержащие антигенсвязывающий участок, который связывается с эпитопом GFRAL. Молекулы иммуноглобулина предлагаемыые в настоящем документе, могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина.

Варианты и производные антител включают функциональные фрагменты антител, которые сохраняют способность связываються с эпитопом GFRAL. Примеры функциональных фрагментов включают Fab-фрагменты (например, фрагмент антитела, который содержит антигенсвязывающий домен и содержит легкую цепь и часть тяжелой цепи, соединенные мостиком из дисульфидной связи); Fab' (например, фрагмент антитела, содержащий один антигенсвязывающий домен, включающий Fab и дополнительную часть тяжелой цепи через шарнирную область); F(ab')2 (например, две Fab' молекулы, соединенные межцепочечными дисульфидными связями в шарнирных областях тяжелых цепей; Fab' молекулы могут быть направлены на одни и те жеили разные эпитопы); биспецифические Fab (например, молекулу Fab с двумя антигенсвязывающими доменами, каждый из которых может быть направлен на разный эпитоп); цепь одноцепочечного Fab, содержащая вариабельную область, также известная как sFv (например, вариабельная антигенсвязывающая детерминантная область одной легкой и тяжелой цепей антитела, связанных вместе цепью из 10-25 аминокислот); дисульфид-связанные Fv, или dsFv (например, вариабельная антигенсвязывающая детерминантная область одной легкой и тяжелой цепей антитела, связанных вместе дисульфидной связью); a камелизированная VH (например, вариабельная антигенсвязывающая детерминантная область одной тяжелой цепи антитела, в которой некоторые аминокислоты на границе VH являются аминокислотами из тяжелой цепи природных антител верблюда); биспецифические sFv (например, молекула sFv или dsFv с двумя антигенсвязывающими доменами, каждый из которых может быть направлен на разный эпитоп); диатело (например, димеризованный sFv, сформировавшийся, когда домен VH первого sFv соединяется с доменом VL второго sFv и домен VL первого sFv соединяется с доменом VH второго sFv; две антигенсвязывающие области диатела могут быть направлены на один и тот же или разные эпитопы); и триотело (например, тримеризованный sFv, образованный тем же способом, что и диатело, но в котором три антигенсвязывающих домена собраны в один комплекс; три антигенсвязывающих домена могут быть направлены на один и тот же или разные эпитопы). Производные антител также включают одну или несколько последовательностей CDR антигенсвязывающего центра антитела. Последовательности CDR могут быть связаны вместе на каркасе, когда присутствуют две или более последовательности CDR. В определенных вариантах осуществления антитело содержит одноцепочечный Fv («scFv»). scFv представляют собой фрагменты антител, содержащие домены VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Полипептид scFv может дополнительно содержать полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать необходимую структуру для связывания антигена. Для обзора scFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg и Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

4. Гуманизированные антитела

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам, которые связываются с GFRAL, в том числе с человеческим GFRAL. Гуманизированные антитела по настоящему изобретению могут содержать одну или несколько CDR, как показано в таблицах 1-24. В данной области известны различные способы гуманизации не принадлежащих человеку антител. Например, гуманизированное антитело может иметь один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не принадлежащит человеку. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки часто обозначают как «импортные» остатки, которые, как правило, взяты из «импортного» вариабельного домена. Гуманизацию можно проводить, например, следующим способом по Winter с коллегами (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), путем замещения последовательностей гипервариабельной области соответствующими последовательностями антитела человека.

В некоторых случаях, гуманизированные антитела конструируют путем пересадки CDR, при которой аминокислотные последовательности шести определяющих комплементарность областей (CDR) родительского не принадлежащего человеку антитела (например, грызуна) пересаживают на каркас антитела человека. Например, Padlan et al. (FASEB J. 9:133-139, 1995) определили, что только приблизительно одна треть остатков в CDR фактически контактируют с антигеном, и и назвали их «остатки, определяющие специфичность» или SDR. В способе пересадки SDR, на каркас антитела человека пересаживают только остатки SDR (см., например, Kashmiri et al., Methods 36: 25-34, 2005).

Выбор вариабельных доменов человека, и с легкой, и с тяжелой цепи, для использования в получении гуманизированных антител может быть важным для снижения антигенности. Например, в соответствии с так называемым способом «наилучшего соответствия», проводят скрининг последовательности вариабельного домена не принадлежащий человеку антитела (например, грызуна) против целой библиотеки известных последовательностей вариабельного домена человека. Последовательность человека, которая наиболее близка к последовательности грызуна, можно выбирать в качестве человеческого каркаса для гуманизированного антитела (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. В другом способе используют конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека из конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623. В некоторых случаях, каркас получают из консенсусных последовательностей наиболее распространенных подклассов человека, V_L6 подгруппа I (V_L6I) и V_H подгруппа III (V_HIII). В другом способе, в качестве источника каркасных областей используют гены зародышевой линии человека.

В альтернативном подходе, основанном на сравнении CDR, который называется супергуманизация, гомология FR не имеет значения. Способ включает сравнение не принадлежащей человеку последовательности с функциональным репертуаром генов зародышевой линии человека. Затем выбирают гены, кодирующие те же самые или близкородственные канонические структуры, что и в мышиных последовательностях. Затем, в пределах генов, имеющих одинаковые канонические структуры с не принадлежащим человеку антителом, выбирают гены с наибольшей гомологией CDR в качетве доноров FR. Наконец, не принадлежащие человеку CDR пересаживают на эти FR (см., например, Tan et al., J. Immunol. 169: 1119-1125, 2002).

Далее, как правило, желательно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением своей аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели, в соответствии с одним способом, гуманизированные антитела получают спосбом анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов обычно доступны и хорошо известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и выводят на экран трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулинов. Эти программы включают, например, WAM (Whitelegg и Rees, Protein Eng. 13: 819-824, 2000), Modeller (Sali и Blundell, J. Mol. Biol. 234: 779-815, 1993), и Swiss PDB Viewer (Guex и Peitsch, Electrophoresis 18: 2714-2713, 1997). Исследование этих изображений позволяет провести анализ вероятной роли остатков в функционировании кандидатной иммуноглобулиновой последовательности, например, анализ остатов, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связываться с антигеном. Таким образом, остатки FR можно выбирать и комбинировать с реципиентными и импортированными последовательностями, таким образом, чтобы получить желаемые характеристики антитела, такие как повышенная аффинность к целевому антигену/антигенам. Как правило, остатки гипервариабельной области непосредственно и в большинстве своем по существу вовлечены в воздействие на связывание антигена.

Другой способ гуманизации антител основан на критерии «человечности» антитела, который называется содержание человеческих последовательностей (HSC). Этот способ сравнивает мышиную последовательность c репертуаром генов зародышевой линии человека, и различия оценивают в виде HSC. Последовательность-мишень затем гуманизируют путем максимального повышения ее HSC, а не с помощью глобальной меры идентичности для создания множества различных гуманизированных вариантов. (Lazar et al., Mol. Immunol. 44: 1986-1998, 2007).

В дополнение к вышеописанным способам, можно использовать эмпирические способы для создания и отбора гуманизированных антител. Эти способы включают способы, которые зависят от создания больших библиотек гуманизированных вариантов и отбора наилучших клонов с использованием обогащающих технологий или высокопроизводительных способов скрининга. Варианты антител можно выделять из библиотек фаговых, рибосомных и дрожжевых дисплеев, а также путем скрининга бактериальных колоний (см., например, Hoogenboom, Nat. Biotechnol. 23: 1105-1116, 2005; Dufner et al., Trends Biotechnol. 24: 523-529, 2006; Feldhaus et al., Nat. Biotechnol. 21: 163-70, 2003; Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 17: 847-60, 2004).

В подходе с библиотекой FR, коллекцию вариантов остатков вводят в конкретные положения в FR с последующим отбором библиотеки для отбора FR, которая наилучшим образом поддерживает пересаженную CDR. Остатки для замещения могут включать некоторые или все из остатков «Вернье», идентифицированных как потенциально вносящих вклад в структуру CDR (см., например, Foote и Winter, J. Mol. Biol. 224: 487-499, 1992), или из более ограниченного набора остатков-мишеней, идентифицированных Baca et al. (J. Biol. Chem. 272: 10678-10684, 1997).

В перетасовке FR, целые FR комбинируют с не принадлежащими человеку CDR вместо создания комбинаторных библиотек выбранных вариантов остатков (см., например, Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60, 2005). Можно проводить скрининг библиотек на связывание в двухэтапном процессе отбора, сначала гуманизируя VL, а затем VH. Альтернативно, можно использовать одноэтапный способ перетасовки FR. Было показано, что такой способ более эффективен, чем двухэтапный скрининг, поскольку полученные в результате антитела демонстрируют улучшенные биохимические и физико-химические свойства, в том числе повышенную экспрессию, повышенную аффинность и температурную стабильность (см., например, Damschroder et al., Mol. Immunol. 44: 3049-60, 2007).

Способ «гуманиринга» основан на экспериментальном выявлении детерминант с необходимой минимальной специфичностью (MSD) и основан на последовательном замещении не принадлежащих человеку фрагментов на библиотеки человеческих FR и оценке связывания. Он начинается с областей CDR3 не принадлежащих человеку цепей VH и VL и постепенно заменяет другие области не принадлежащего человеку антитела на человеческие FR, включая CDR1 и CDR2 как из VH, так и из VL. Этот способ, как правило, приводит к сохранению удержания эпитопа и идентификации антител из множества подклассов с различными CDR V-сегмента человека. Гуманиринг позволяет выделять антитела, которые на 91-96% гомологичны антителам генов зародышевой линии человека (см., например, Alfenito, Cambridge Healthtech Institute's Third Annual PEGS, Protein Engineering Summit, 2007).

Способ «конструирования на основе человека» включает изменение не принадлежащего человеку антитела или фрагмента антитела, такого как мышиное или химерное антитело или фрагмент антитела, путем введения конкретных изменений в аминокислотную последовательность антитела, и таким образом, получение модифицированного антитела со сниженной иммуногенностью у человека, которое, тем не менее, сохраняет желаемые свойства связывания исходных не принадлежащих человеку антител. В основном, способ включает классификацию аминокислотных остатков не принадлежащего человеку (например, мышиного) антитела как остатков с «низким риском», «умеренным риском» или «высоким риском». Классификацию проводят с использованием расчета глобального риска/выгоды, который оценивает предсказанные выгоды от сделанной конкретной замены (например, для иммуногенности у людей) по сравнению с риском, что замена повлияет на фолдинг антитела и/или замещают остатками человека. Конкретный аминокислотный остаток человека для замещения в заданном положении (например, с низким или умеренным риском) не принадлежащей человеку (например, мышиной) последовательность антитела можно выбирать путем выравнивания аминокислотной последовательности из не принадлежащих человеку вариабельных областей антитела с соответствующей областью специфической или консенсусной последовательности антитела человека. Аминокислотные остатки в положениях с низким или умеренным риском в не принадлежащей человеку последовательности можно замещать соответствующими остатками в последовательности антитела человека в соответствии с выравниванием. Способы для получения белков, сконструированных на основе человека, более подробно описаны у Studnicka et al., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994), патентах США 5766886, 5770196, 5821123, и 5869619, и публикации заявки PCT WO 93/11794.

5. Антитела человека

Человеческие антитела к GFRAL можно конструировать, комбинируя последовательность/последовательности вариабельного домена клона Fv, выбранные из библиотек фагового дисплея, полученных от человека, с известными последовательностями константного домена человека. Альтернативно, человеческие моноклональные антитела к GFRAL по настоящему изобретению можно производить гибридомным способом. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек для выработки моноклональных антител человека были описаны, например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

Также возможно получать трансгенных животных (например, мышей), которые способны после иммунизации производить полный репертуар антител человека в отсутствие выработки эндогенных иммуноглобулинов. Трансгенные мыши, которые экспрессируют репертуары антител человека, были использованы для создания высокоаффинных моноклональных антител с последовательностью человека к широкому потенциальных мишеней лекарственных средств (см., например, Jakobovits, A., Curr. Opin. Biotechnol. 1995, 6(5):561-6; и Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8(4):455-8; патенты США №№ 6075181 и 6150584; и Lonberg et al., Nature Biotechnol. 23: 1117-1125, 2005).

Альтернативно, антитело человека можно получать путем иммортализации человеческих B-лимфоцитов, вырабатывающих антитело, направленное против антигена-мишени (например, такие B-лимфоциты могут быть получены от индивидуума или могут быть иммунизированы in vitro) (см., например, Cole et al., Monoclonal Antibody and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991); и патент США № 5750373).

Перетасовку генов также можно использовать для получения антител человека из не принадлежащих человеку антител, например, грызуна, при этом антитело человека имеет сходные аффинности испецифичности с исходным, не принадлежащим человеку антителом. В соответствии с этим способом, который также называют «импринтинг эпитопов» или «направленная селекция», фрагмент вариабельной области или тяжелой, или легкой цепи не принадлежащего человеку антитела, полученный способами фагового дисплея, как описано в настоящем документе, замещают репертуаром генов V-домена человека, создавая популяцию scFv или Fab химер с не принадлежащей человеку цепью/человеческой цепью. Отбор по антигену приводит к выделению химерного scFv или Fab с не принадлежащей человеку цепью/человеческой цепью, где человеческая цепь восстанавливает антигенсвязывающий участок, разрушенный после удаления соответствующей не принадлежащий человеку цепи в первичном клоне фагового дисплея (например, эпитоп направляет (запечатлевает) выбор партнера по человеческой цепи). Когда процесс повторяют для того чтобы заместить оставшуюся, не принадлежащую человеку цепь, получают антитело человека (см., например, PCT WO 93/06213; и Osbourn et al., Methods., 36, 61-68, 2005). В отличие от обычной гуманизации не принадлежащих человеку антител путем пересадки CDR, этот способ обеспечивает полностью антитела человека, у которых нет остатков FR или CDR, происходящих не от человека. Примеры направленной селекции для гуманизации мышиных антител к антигенам клеточной поверхности включают фолат-связывающий белок, присутствующий на злокачественных клетках яичника (см., например, Figini et al., Cancer Res., 58, 991-996, 1998), и CD147, который высоко экспрессируется при печеночноклеточной карциноме (см., например, Bao et al., Cancer Biol. Ther., 4, 1374-1380, 2005).

Потенциальным недостатком подхода направленной селекции является то, что перетасовка одной цепи антитела с одновременным сохранением другой цепи постоянной может привести к дрейфу эпитопа. Для того чтобы сохранить эпитоп, который распознавало не принадлежащее человеку антитело, можно применять сохранение CDR (см., например, Klimka et al., Br. J. Cancer., 83, 252-260, 2000; VH CDR2 Beiboer et al., J. Mol. Biol., 296, 833-49, 2000) В этом способе, часто сохраняют не принадлежащую человеку VH CDR3, поскольку эта CDR может находиться в центре антигенсвязывающего участка и может быть наиболее важной областью антитела для распознавания антигена. В некоторых случаях, однако, могут быть сохранены VH CDR3 и VL CDR3, а также VH CDR3, VL CDR3 и VL CFR1 не принадлежащего человеку антитела.

6. Биспецифические антитела

Биспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичность связывания, по меньшей мере, к двум различным антигенам. В определенных вариантах осуществления биспецифические антитела представляют собой человеческие или гуманизированные антитела. В определенных вариантах осуществления одна из специфичностей связывания предназначена для GFRAL и другая - предназначена для другого антигена. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами GFRAL. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')₂ биспецифические антитела).

Способы для получения биспецифических антител, известны в данной области, такие как, например, путем совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи имеют различные специфичности (см., например, Milstein и Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Более подробно о получении биспецифических антител см., например, Bispecific Antibodies, Kontermann, ed., Springer-Verlag, Hiedelberg (2011).

7. Поливалентные антитела

Поливалентное антитело может интернализироваться (и/или катаболизироваться) клеткой, экспрессирующей антиген, с которым связываются антитела, быстрее, чем бивалентное антитело. Антитела по настоящему изобретению могут быть поливалентными антителами (иного класса, чем IgM) с тремя или более антигенсвязывающими участками (например, тетравалентные антитела), которые можно легко производить путем рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Поливалентное антитело может содержать домен димеризации и три или более антигенсвязывающих участка. В определенных вариантах осуществления домен димеризации содержит (или состоит из) Fc-область или шарнирную область. В этом сценарии, антитело будет содержать Fc-область три или более антигенсвязывающих участка с амино-конца по отношению к Fc-области. В определенных вариантах осуществления поливалентное антитело содержит (или состоит из) от трех до приблизительно восьми антигенсвязывающих участков. В одном из таких вариантов осуществления поливалентное антитело содержит (или состоит из) четыре антигенсвязывающих участка. Поливалентное антитело содержит, по меньшей мере, одну полипептидную цепь (например, две полипептидных цепи), где полипептидная цепь/цепи содержат два или более вариабельных доменов. Например, полипептидная цепь/цепи могут содержать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, Fc представляет собой одну полипептидную цепь Fc-области, X1 и X2 представляют собой аминокислоту или полипептид, и n составляет 0 или 1. Например, полипептидная цепь/цепи могут содержать: цепь VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-Fc-область или цепь VH-CH1-VH-CH1-Fc-область. Поливалентное антитело в настоящем документе может дополнительно содержать, по меньшей мере, два (например, четыре) полипептида вариабельного домена легкой цепи. Поливалентное антитело в настоящем документе может, например, содержать приблизительно от двух до приблизительно восьми полипептидов вариабельного домена легкой цепи. Полипептиды вариабельного домена легкой цепи, рассматриваемые в настоящем документе, содержат вариабельный домен легкой цепи и, необязательно, дополнительно содержат домен CL.

8. Конструирование Fc

Может быть желательным модифицировать антитело к GFRAL пуетм конструирования Fc, в том числе, в отношении эффекторной функции, например, таким образом, чтобы снизить или убрать антигензависимую опосредованную клеткой цитотоксичность (ADCC) и/или обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC) антитела. Этого можно достигнуть путем введения одной или нескольких замен аминокислот в Fc-область антитела. Например, было показано, что замены в IgG1 человека с использованием остатков IgG2 в положениях 233-236 и остатков IgG4 в положениях 327, 330 и 331 значительно снижают ADCC и CDC (см., например, Armour et al., Eur. J. Immunol. 29:(8):2613-24 (1999); Shields et al., J. Biol.Chem. 276(9): 6591-604 (2001).

Для увеличения времени полувыведения антитела из сыворотки, можно ввести эпитоп связывания рецептора спасения в антитело (особенно, в фрагмент антитела), например, как описано в патенте США 5739277. Термин «эпитоп связывания рецептора спасения» относится к эпитопу Fc-области молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3, или IgG4), который отвечает за увеличение времени полувыведения молекулы IgG из сыворотки in vivo.

9. Альтернативные связывающие средства

Настоящее изобретение охватывает неиммуноглобулиновые связывающие средства, которые специфически связываются с тем же самым эпитопом, что и антитело к GFRAL, описываемое в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления неиммуноглобулиновое связывающее средство идентифицируют как средство, которое вытесняет антитело или вытесняется антителом к GFRAL по настоящему изобретению в конкурентном анализе связывания. Эти альтернативные связывающие средства могут включать, например, любой из сконструированных белковых каркасов, известный в данной области. Такие каркасы могут содержать одну или несколько CDR, показанных в таблицах 1-24. Такие каркасы включают, например, антикалины, которые основываются на липокалиновом каркасе, белковую структуру, характеризующуюся жесткой бета-бочкой, которая поддерживает четыре гипервариабельные петли, формирующие участок связывания лиганда. Новая специфичность связывания может быть сконструирована путем направленного случайного мутагенеза в петлевых областях, в комбинации с функциональным дисплеем и направленной селекцией (см., например, Skerra (2008) FEBS J. 275: 2677-2683). Другие подходящие каркасы могут включать, например, аднектины или монотела, на основе десятого внеклеточного домена человеческого фибронектина III (см., например, Koide и Koide (2007) Methods Mol. Biol. 352: 95-109); аффитела, на основе Z-домена белка A стафиллококка (см., например, Nygren et al. (2008) FEBS J. 275: 2668-2676)); дарпины, на основе белков с анкириновыми повторами (см., например, Stumpp et al. (2008) Drug. Discov. Today 13: 695-701); финомеры, на основе домена SH3 человеческой протеинкиназы Fyn (Grabulovski et al. (2007) J. Biol. Chem. 282: 3196-3204); аффитины, на основе Sac7d из Sulfolobus acidolarius (см., например, Krehenbrink et al. (2008) J. Mol. Biol. 383: 1058-1068); аффилины, на основе человеческого y-B-кристаллина (см., например, Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372: 172-185); авимеры, на основе A-доменов мембранных рецепторных белков (см., например, Silverman et al. (2005) Biotechnol. 23: 1556-1561); цистеин-богатые ноттин-пептиды (см., например, Kolmar (2008) FEBS J. 275: 2684-2690); и сконструированные ингибиторы типа Кунитца (см., например, Nixon и Wood (2006) Curr. Opin. Drug. Discov. Dev. 9: 261-268). Для обзора, см., например, Gebauer и Skerra (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13: 245-255.

Варианты антител

В некоторых вариантах осуществления рассматривается модификация/модификации аминокислотной последовательности антител, которые связываются с GFRAL и описываются в настоящем документе. Например, может быть желательным улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела, включая в качестве неограничивающих примеров специфичность, термостабильность, уровень экспрессии, эффекторные функции, гликозилирование, сниженную иммуногенность или растворимость. Предполагается, что в дополнение к антителам к GFRAL, описываемым в настоящем документе, можно получать варианты антител к GFRAL. Например, варианты антител к GFRAL можно получать путем введения подходящих нуклеотидных замен в кодирующую ДНК, и/или путем синтеза желаемого антитела или полипептида. Специалистам в данной области будет понятно, что аминокислотные замены могут изменить пострансляционные процессы антитела к GFRAL, такие как изменение числа или положения участков гликозилирования или изменения характеристик закрепления на мембране.

В некоторых вариантах осуществления антитела, предлагаемые в настоящем документе, химически модифицированы, например, путем связи, в том числе, ковалентного присоединения, с любым типом молекулы с антителом. Производные антител могут включать антитела, которые были химически модифицированы, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, получения производных путем известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связи с клеточным лигандом или другим белком и тому подобное. Можно проводить любые из множества химических модификаций с использованием известных способов, включая в качестве неограничивающих, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, разработку состава, метаболический синтез туникамицина, и тому подобное. Дополнительно, антитело может содержать одну или несколько неклассических аминокислот.

Вариации могут быть заменой, делецией или вставкой одного или нескольких кодонов, кодирующих антитело или полипептид, что приводит к изменению в аминокислотной последовательности по сравнению с нативной последовательностью антитела или полипептида. Замены аминокислот могут быть результатом замены одной аминокислоты другой аминокислотой со сходными структурными и/или химическими свойствами, такие как замена лейцина серином, например, консервативные аминокислотные замены. Вставки или делеции могут необязательно находиться в диапазоне приблизительно от 1 до 5 аминокислот. В определенных вариантах осуществления замена, делеция или вставка включает менее чем 25 замен аминокислот, менее чем 20 замен аминокислот, менее чем 15 замен аминокислот, менее чем 10 замен аминокислот, менее чем 5 замен аминокислот, менее чем 4 замены аминокислот, менее чем 3 замены аминокислот, или менее чем 2 замены аминокислот по сравнению с исходной молекулой. В конкретном варианте осуществления замена представляет собой консервативную аминокислотную замену, сделанную по одному или нескольким предсказанным несущественным аминокислотным остаткам. Разрешенные вариации можно определять путем системного получения вставок, делеций или замен аминокислот в последовательности и исследования полученных вариантов на активность, которую демонстрирует полноразмерная или зрелая нативная последовательность.

Вставки в аминокислотную последовательность включают слияния с амино- и/или карбоксильного конца, в диапазоне длины от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело N-концевым остатком метионина. Другие варианты вставок в молекулу антитела включают слияние N- или C-конца антитела с ферментом (например, для антитело-направленной терапии ферментативным пролекарством) или полипептидом, который увеличивает время полувыведения антитела из сыворотки.

Существенные модификации в биологических свойствах антитела проводят путем выбора замен, которые значительно по своему воздействию на поддержание (a) структуры полипептидного остова в области замены, например, такой как конформация листа или спирали, (b) заряда или гидрофобности молекулы в участке-мишени, или (c) объема боковой цепи. Альтернативно, можно производить консервативные замены (например, внутри группы аминокислот со сходными свойствами и/или боковыми цепями), для поддержания или незначительного изменения свойств. Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии со сходством свойств их боковых цепей (см., например, A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2^nd Ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) кислые: Asp (D), Glu (E); и (4) основные: Lys (K), Arg (R), His(H).

Альтернативно, природные остатки можно разделить на группы на основании общих свойств боковых цепей: (1) гидрофобные: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) кислые: Asp, Glu; (4) основные: His, Lys, Arg; (5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены влекут за собой обмен члена одного из этих классов на другой класс. Такие замещенные остатки также можно вводить в участки консервативных замен или в оставшиеся (неконсервативные) участки. Таким образом, в одном из вариантов осуществления антитело или его фрагмент, которое связывается с эпитопом GFRAL, содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности из моноклонального антитела мыши, описываемого в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления антитело или его фрагмент, которое связывается с эпитопом GFRAL, содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности, описанной в таблицах 1-24. В еще одном варианте осуществления антитело или его фрагмент, которое связывается с эпитопом GFRAL содержит аминокислотную последовательность VH CDR и/или VL CDR, которая, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности VH CDR, описанной в таблицах 1-24, и/или аминокислотной последовательности VL CDR, описанной в таблицах 1-24. Изменения можно производить с использованием известных в данной области способов, таких как олигонуклеотид-опосредованный (сайт-направленный) мутагенез, аланиновое сканирование, и мутагенез при помощи ПЦР. Сайт-специфический мутагенез (см., например, Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), кассетный мутагенез (см., например, Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), мутагенез с рестрикционным отбором (см., например, Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) или другие известные способы можно проводить на клонированной ДНК для получения ДНК для варианта антитела к GFRAL.

Также может быть замещен любой цистеиновый остаток, не участвующий в поддержании надлежащей конформации антитела к GFRAL, например, другой аминокислотой, такой как аланин или серин, для улучшения устойчивости к окислению молекулы и предотвращения аберрантного перекрестного связывания. И наоборот, цистеиновую связь/связи можно добавлять к антителу к GFRAL для улучшения его стабильности (например, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент).

В некоторых вариантах осуществления молекула антитела к GFRAL по настоящему изобретению представляет собой «деиммунизованное» антитело. «Деиммунизованное» антитело к GFRAL представляет собой антитело, полученное из гуманизированного или химерного антитела к GFRAL, которое имеет одно или несколько изменений в своей аминокислотной последовательности, приводящих к снижению иммуногенности антитела, по сравнению с соответствующим исходным не деиммунизованным антителом. Один из способов для создания таких мутантов антитела включает идентификацию и удаление T-клеточных эпитопов молекулы антитела. На первом этапе, иммуногенность молекулы антитела можно определять несколькими способами, например, путем определения T-клеточных эпитопов in vitro или предсказание таких эпитопов in silico, как известно в данной области. Как только определены важные остатки для функции T-клеточного эпитопа, можно производить мутации для удаления remove иммуногенности и сохранения активности антитела. Для обзора, см., например, Jones et al., Methods in Molecular Biology 525: 405-423, 2009.

1. Созревание аффинности in vitro

В некоторых вариантах осуществления варианты антител с улучшенным свойством, таким как аффинность, стабильность, или уровень экспрессии по сравнению с родительским антителом, можно получать путем созревания аффинности in vitro. Как и у природного прототипа, созревание аффинности in vitro основано на принципах мутации и отбора. Библиотеки антитела представлены в виде Fab, scFv или фрагментов V-домена или на поверхности организма (например, фага, бактерий, дрожжей или клетки млекопитающего) или связанные (например, ковалентно или нековалентно) со своими кодирующими мРНК или ДНК. Выбор аффинности представленных антител позволяет выделять организмы или комплексы, несущие генетическую информацию, кодирующую антитела. Два или три раунда мутации и отбора с использованием способов дисплея, такого как фаговый дисплей, как правило, приводят к фрагментам антител с аффинностями в низком наномолярном диапазоне. Предпочтительно аффинно зрелые антитела будут иметь наномолярные или пикомолярные аффинности к антигену-мишени.

Фаговый дисплей представляет собой широкораспространенный способ для представления и отбора антител. Антитела демонстрируются на поверхности бактериофагов Fd или M13 в виде слияний с поверхностным белком бактериофага. Отбор включает представление антигену для того чтобы позволить расположенным на фагах антителах связаться с их мишенями, способ, обозначаемый как «пэннинг». Фаг, связавшийся с антигеном, восстанавливают и заражают бактерии для получения фага для дальнейших раундов отбора. Для обзора, см., например, Hoogenboom, Methods. Mol. Biol. 178: 1-37, 2002; Bradbury и Marks, J. Immuno. Methods 290: 29-49, 2004).

В системе дрожжевого дисплея (см., например, Boder et al., Nat. Biotech. 15: 553-57, 1997; Chao et al., Nat. Protocols 1:755-768, 2006), антитело может быть представлено в виде одноцепочечных вариабельных слияний (scFv), в которых тяжелые и легкие цепи соединены гибким линкером. scFv сливают с субъединицей адгезии дрожжевого белка Aga2p, которая присоединена к стенке дрожжевой клетки через дисульфидные связи с Aga1p. Представление белка через Aga2p выдвигает белок наружу от клеточной поверхности, минимизируя потенциальные взаимодействия с другими молекулами на стенке дрожжевой клетки. Для скрининга библиотеки имспользуют магнитную сепарацию и проточную цитометрия для отбора антител с улучшенной аффинностью или стабильностью. Связывание с растворимым интересующим антигеном определяют путем мечения дрожжей биотинилированным антигеном и вторичным реагентом, таким как стрептавидин, конъюгированный с флуорофором. Вариации в экспрессии антитела на поверхности можно измерять при помощи иммунофлуоресцентного мечения или гемагглютинином, или эпитопной меткой c-Myc, фланкирующей scFv. Было показано, что экспрессия коррелирует со стабильностью представленного белка, и, таким образом, антитела можно выбирать по улучшенной стабильности, а также аффинности (см., например, Shusta et al., J. Mol. Biol. 292: 949-956, 1999). Дополнительным преимуществом дрожжевого дисплея представляемые белки проиходят фолдинг в эндоплазматическом ретикулуме эукариотических дрожжевых клеток, получая преимущество шаперонов эндоплазматического ретикулума и аппарата контроля качества. Как только созревание завершено, аффинность антитела можно удобно «титровать», пока оноо расположено на поврехности дрожжей, устраняя необходимость в экспрессии и очистке каждого клона. Теоретическое ограничение дисплея поврехности дрожжей - это потенциально более маленький функциональный размер библиотеки, чему у других способов дисплея; однако, в недавнем подходе использовалась система размножения дрожжевых клеток для создания комбинаторного разнообразия, которое оценивается как 10¹⁴ по размеру (см., например, патентную публикацию США 2003/0186,374; Blaise et al., Gene 342: 211-218, 2004).

В рибосомном дисплее, получают комплексы антитело-рибосома-мРНК (ARM) для отблора в бесклеточной системе. Библиотеку ДНК, кодирующую конкретную библиотеку антител, генетически сливают со спейсерной последовательностью без стоп-кодона. Эта спейсерная последовательность, при трансляции, все еще остается присоединенной к пептидил тРНК и занимает рибосомальный тоннель, и, таким образом, дает возможность интересующему белку высунуться наружу из рибосомы и свернуться и. Полученный комплекс мРНК, рибосома, и белок моежт связываться с поверхностно-связанным лигандом, позволяя одновременно выделять антитело и его кодирующую мРНК через аффинный захват лигандом. мРНК, связанная с рибосомой, затем подвергают обратной транскрипции в кДНК, с которой потом проводят мутагенез и используют в следующем раунде отбора (см., например, Fukuda et al., Nucleic Acids Res. 34, e127, 2006). В мРНК дисплее, ковалентную связь между антителом и мРНК устанавливают с использованием пуромицина в качестве адапторной молекулы (Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98 USA 3750-3755, 2001).

Поскольку эти способы проводят полностью in vitro, они обеспечивают два основвных преимущества по сравнению со всеми остальными способами. Первое, разнообразие библиотеки не ограничено эффективностью трансформации бактериальных клеток, а только числом рибосом и различных молекул мРНК, присутствующих в тестовой пробирке. Второе, можно легко вводить случайные мутации после каждого раунда отбора, например, при помощи полимераз без корректирующей активности, поскольку библиотеку не надо трансформировать после любого этапа создания разнообразия.

Разнообразие можно вводить в CDR или в целые V-гены бибиотек антител целенаправленно или путем случайного введения. Первый подход включает в себя последовательное нацеливание на все CDR антитела путем мутагенеза с низким или высоким уровнем или нацеливание на выделенные горячие точки соматического гипермутирования (см., например, Ho, et al., J. Biol. Chem. 280: 607-617, 2005) или на остатки, предположительно влияющие на аффинность на основе экспериментов или по структурным причинам. Случайные мутации можно вводить на всем протяжении целого V-гена с использованием мутирующих штаммов E. coli, устойчивой к ошибкам репликации с ДНК-полимеразами (см., например, Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896, 1992) или РНК-репликазами. Разнообразие можно также вводить путем замещения областей, которые разнобразны в природе, путем перетасовки ДНК или аналогичных способов (см., например, Lu et al., J. Biol. Chem. 278: 43496-43507, 2003; патент США № 5565332; патент США № 6989250). Альтернативные способы нацелены на гипервариабельные петли, расширяющиеся на остатки каркасной области (см., например, Bond et al., J. Mol. Biol. 348: 699-709, 2005), используют делеции и и вставки в петлях в CDR или используют создание разнообразия на основе гибридизации (см., например, патентную публикацию США No. 2004/0005709). Дополнительные способы создания разнообразия в CDR описаны, например, в патенте США № 7985840.

Скрининг библиотек можно осуществлять различными способами, известными в данной области. Например, GFRAL можно иммобилизовать на твердых подложках, колонках, стержнях или целлюлозных/поливинилиденфторидных мембранах/других фильтрах, экспрессировать на клетках-хозяевах, прикрепленных к адсорбционым планшетам или использовать при сортировке клеток, или конъюгировать с биотином для захвата гранулами, покрытыми стрептавидином, или использовать в любом другом способе для пэннинга дисплейных библиотек.

Для обзора способов созревания аффинности in vitro, см., например, Hoogenboom, Nature Biotechnology 23: 1105-1116, 2005 и Quiroz и Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4: 39-51, 2010 и ссылки в них.

2. Модификации антител к GFRAL

Ковалентные модификации антител к GFRAL включены в объем настоящего изобретения. Ковалентные модификации включают реагирование целевых аминокислотных остатков антитела к GFRAL с органически полученным веществом, которое способно реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками антитела к GFRAL. Другие модификации включают деамидирование глутаминовых и аспарагиновых остатков до соответствующих глутамильных и аспартильных остатков, соответственно, гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп сериновых или треониновых остатков, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (см., например, T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), ацетилирование N-концевого амина, и амидирование любой C-концевой карбоксильной группы.

Другие типы ковалентной модификации антитела к GFRAL, включенные в объем настоящего изобретения, включают изменение паттерна природного гликозилирования антитела или полипептида (см., например, Beck et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 9: 482-501, 2008; Walsh, Drug Discov. Today 15: 773-780, 2010), и связывание антитела с одним из ряда небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), полипропиленгликолем, или полиоксиалкиленами, способом, описанным, например, в патентах США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337.

Антитело к GFRAL по настоящему изобретению могут также быть модифицированы с образованием химерных молекул, содержащих антитело к GFRAL, слитое с другим гетерологичным полипептидом или аминокислотной последовательностью, например, эпитопной меткой (см., например, Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 523-533, 2003) или Fc-областью молекулы IgG (см., например, Aruffo, "Immunoglobulin fusion proteins" в Antibody Fusion Proteins, S.M. Chamow и A. Ashkenazi, eds., Wiley-Liss, New York, 1999, pp. 221-242).

Также в настоящем документе предлагаются слитые белки, содержащие антитело, предлагаемое в настоящем документе, которое связывается с антигеном GFRAL, и гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид, с которым слито антитело, подходит для нацеливания антитела на клетки с GFRAL, экспрессированным на клеточной поверхности.

Также в настоящем документе предлагаются панели антител, которые связываются с антигеном GFRAL. В конкретных вариантах осуществления, панели антител имеют различные константы ассоциации, различные константы диссоциации, различные аффинности к антигену GFRAL и/или различные специфичности к антигену GFRAL. В некоторых вариантах осуществления панели содержат или состоят из приблизительно 10, приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 125, приблизительно 150, приблизительно 175, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950, или приблизительно 1000 антител или больше. Панели антител можно использовать, например, 96-луночных или 384-луночных планшетах, таких как планшеты для анализов, таких как ELISA.

Получение антител к GFRAL

Антитела к GFRAL можно получать путем культивирования клеток, трансформированных или трансфицированных вектором, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело к GFRAL. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные компоненты антитела по настоящему изобретению, можно получать с использованием стандартных рекомбинантных способов. Желаемые полинуклеотидные последовательности можно выделять и секвенировать из клеток, продуцирующих антитела, таких как клетки гибридомы. Альтернативно, полинуклеотиды можно синтезировать с использованием нуклеотидного синтезатора или способов ПЦР. После получения, последовательности, кодирующие полипептиды, вставляют в рекомбинантный вектор, способный реплицироваться и экспрессировать гетерологичные полинуклеотиды в клетках-хозяевах. Можно использовать множество векторов, которые доступны и известны в данной области, для целей настоящего изобретения. Выбор подходящего вектора будет зависеть, в основном, от размера нуклеиновых кислот, которые надо вставить в вектор, и конкретной клетки-хозяина, которую необходимо трансформировать вектором. Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии антител по настоящему изобретению, включают прокариот, таких как Archaebacteria и Eubacteria, в том числе грамотрицательные или грамположительные организмы, эукариотические микроорганизмы, такие как нитевидные грибы или дрожжи, клетки позвоночных, такие как клетки насекомых или растительные клетки, и клетки позвоночных, такие как клеточные линии млекопитающих. Клетки-хозяева трансформируют вышеописанными экспрессирующими векторами и культивируют в общепринятых питательных средах, при необходимости модифицированных для индукции промоторов, отбора трансформантов, или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности. Антитела, производимые клетками-хозяевами, очищают с использованием стандартных способов очистки белков, известных в данной области.

Способы для выработки антител, включая конструкцию вектора, экспрессию и очистку далее описаны в et al., (1996) в Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation (McCafferty, J., Hoogenboom, H. R., and Chiswell, D. J., eds), 1 Ed., pp. 203-252, IRL Press, Oxford; Kwong, K. & Rader, C., E. coli expression and purification of Fab antibody fragments, Current protocols in protein science editorial board John E Coligan et al., Chapter 6, Unit 6.10 (2009); Tachibana and Takekoshi, "Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia coli," in Antibody Expression and Production, M. Al-Rubeai, Ed., Springer, New York, 2011; Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (ed Z. An), John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA.

Разумеется, предусматривается, что альтернативные способы, которые хорошо известны в данной области, можно использовать для получения антител к GFRAL. Например, соответствующую аминокислотную последовательность, или ее части, можно получать путем прямого пептидного синтеза с использованием твердофазных способов (см., например, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)). Синтез белка in vitro можно проводить с использованием ручных техник или автоматически. Различные части антитела к GFRAL можно синтезировать химическим путем раздельно и комбинировать с использованием химических или ферментативных способов для получения желаемого антитела к GFRAL. Альтернативно, антитела можно очищать из клеток или жидкостей организма, таких как молоко, трансгенного животного, сконструированного для экспрессии антител, как описано, например, в патенте США № 5545807 и патенте США № 5827690.

Иммуноконъюгаты

Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, содержащим любое из антител к GFRAL по настоящему изобретению, ковалентно связанное, втом числе при помощи синтетического линкера, с одним или несколькими веществами, не являющимися антителами.

Ряд радиоактивных изотопов доступен для получения радиоконъюгатов антител. Примеры включают At²¹¹, I4, I4, Y4, Re4, Re4, Sm4, Bi4, P4, Pb4 и радиоактивные изотопы Lu. Если конъюгат применяют для детекции, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например tc4 или I4, или спиновую метку для визуализации для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнитно-резонансная визуализация, MRI), такую как йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо. Радиоактивные изотопы могут быть включены в конъюгат известными способами, как описано, например, у Reilly, «The radiochemistry of monoclonal antibodies and peptides» в Monoclonal Antibody and Peptide-Targeted Radiotherapy of Cancer, R.M. Reilly, ed., Wiley, Hoboken N.J., 2010.

В некоторых вариантах осуществления антитела, предлагаемые в настоящем документе, конъюгированы или рекомбинантно слиты с диагностическим, детектируемым или терапевтическим средством или любой другой молекулой. Конъюгированные или рекомбинантно слитые антитела можно использовать, например, для мониторинга или прогнозирования начала, развития, прогрессирования и/или тяжести заболевания, нарушения или состояния с поврежденными β-клетками, в качестве части клинической процедуры исследования, такой как определение эффективности конкретной терапии.

Такую диагностику и детекцию можно производить, например, связывая антитело с детектируемыми веществами, включая в качестве неограничивающих примеров, различные ферменты, в качестве неограничивающих примеров, такие как, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, или ацетилхолинэстераза; простетические группы, в качестве неограничивающих примеров, такие как стрептавидин/биотин и авидин/биотин; флуоресцентные вещества, в качестве неограничивающих примеров, такие как умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; люминесцентные вещества, в качестве неограничивающих примеров, такие как люминол; биолюминесцентные вещества, в качестве неограничивающих примеров, такие как люцифераза, люциферин, и экворин; хемилюминесцентное вещество, в качестве неограничивающих примеров, соединение на основе акридиния или HALOTAG; радиоактивные вещества, в качестве неограничивающих примеров, такие как йод (¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, и ¹²¹I,), углерод (¹⁴C), сера (³⁵S), тритий (³H), индий (¹¹⁵In, ¹¹³In, ¹¹²In, и ¹¹¹In,), технеций (⁹⁹Tc), таллий (²⁰¹Ti), галлий (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), палладий (¹⁰³Pd), молибден (⁹⁹Mo), ксенон (¹³³Xe), фтор (¹⁸F), ¹⁵³Sm, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁵Yb, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁴⁷Sc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁴²Pr, ¹⁰⁵Rh, ⁹⁷Ru, ⁶⁸Ge, ⁵⁷Co, ⁶⁵Zn, ⁸⁵Sr, ³²P, ¹⁵³Gd, ¹⁶⁹Yb, ⁵¹Cr, ⁵⁴Mn, ⁷⁵Se, ¹¹³Sn, и ¹¹⁷Sn; и позитронно-активные металлы с использованием различных способов позитронно-эмиссионной томографии, и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов.

Также в настоящем документе предлагаются антитела, которые конъюгированы или рекомбинантно слиты с терапевтическим компонентом (или одним или несколькими терапевтическими компонентами), а также их применение. Антитело может быть конъюгировано или рекомбинантно слито с терапевтическим компонентом, включая цитотоксин, такой как цитостатическое или цитотоксическое средство, терапевтическим средством или радиоактивным ионом металла, таким как источники альфа-излучения. Цитотоксин или цитотоксическое средство включает в себя любое средсво, которое губительно для клеток.

Дополнительно, антитело, предлагаемое в настоящем документе, может быть конъюгировано или рекомбинантно слито с терапевтическим компонентом или лекарственным компонентом, который модифицирует заданный биологический ответ. Терапевтические компоненты или лекарственные компоненты не подразумеваются как ограничивающие классические химические терапевтические средства. Например, лекарственный компонент может быть белком, пептидом или полипептидом, обладающим желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин A, экзотоксин синегнойной палочки, холерный токсин, или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли, γ-интерферон, α-интерферон, фактор роста нервов, фактор роста тромбоцитов, тканевой активатор плазминогена, апоптотический агент, например, TNF-γ, AIM I (см., например, международную публикацию №. WO 97/33899), AIM II (см., например, международную публикацию №. WO 97/34911), Fas-лиганд (см., например, Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574), и VEGF (см., например, международную публикацию №. WO 99/23105), антиангиогенное средство, в том числе, например, ангиостатин, эндостатин или компонент пути свертывания (например, тканевой фактор); или модификатор биологического ответа, такой как, например, лимфокин (например, интерферон гамма, интерлейкин-1 («IL-1»), интерлейкин-2 («IL-2»), интерлейкин-5 («IL-5»), интерлейкин-6 («IL-6»), интерлейкин-7 («IL-7»), интерлейкин 9 («IL-9»), интерлейкин-10 («IL-10»), интерлейкин-12 («IL-12»), интерлейкин-15 («IL-15»), интерлейкин-23 («IL-23»), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор («GM-CSF»), и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор («G-CSF»)), или фактор роста (например, гормон роста («GH»)), или свертывающий агент (например, кальций, витамин K, тканевые факторы, без ограничений, такие как, фактор Хагемана (фактор XII), высокомолекулярный кининоген (HMWK), прекалликреин (PK), свертывающие белки-фактор II (протромбин), фактор V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, фосфолипид, и мономер фибрина).

Также в настоящем документе предлагаются антитела, которые рекомбинантно слиты или химически конъюгированы (ковалентная или нековалентная конъюгация) с гетерологичным белком или полипептидом (или его фрагментом, например, с полипептидом приблизительно из 10, приблизительно из 20, приблизительно из 30, приблизительно из 40, приблизительно из 50, приблизительно из 60, приблизительно из 70, приблизительно из 80, приблизительно из 90 или приблизительно из 100 аминокислот) для получения слитых белков, а также их применение. В частности, в настоящем документе предлагаются слитые белки, содержащие антигенсвязывающий фрагмент антитела, предлагаемого в настоящем документе (например, Fab-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент, домен VH, VH CDR, домен VL или VL CDR) и гетерологичный белок, полипептид, или пептид. В одном из вариантов осуществления гетерологичный белок, полипептид, или пептид, с которым слито антитело, подходит для нацеливания антитела на конкретный тип клеток, такой как клетка, которая экспрессирует GFRAL. Например, антитело, которое связывается с рецептором клеточной поверхности, экспрессируемым конкретным типом клеток (например, иммунной клеткой) может быть слито или конъюгировано с модифицированным антителом, предлагаемым в настоящем документе.

Кроме того, антитело, предлагаемое в настоящем документе, может быть конъюгировано с терапевтическим компонентом, таким как радиоактивный ион металла, такой как источники альфа-излучения, такие как ²¹³Bi или макроциклические хелаторы, подходящие для конъюгации радиоактивных ионов металлов, включая в качестве неограничивающих примеров, ¹³¹In, ¹³¹Lu, ¹³¹Y, ¹³¹Ho, ¹³¹Sm, с полипептидами. В определенных вариантах осуществления макроциклический хелатор представляет собой 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусную кислоту (DOTA), которая может быть присоединена к антителу через линкерную молекулу. Такие линкерные молекулы широко известны в данной области и описаны, например, у Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; и Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.

Кроме того, антитела, предлагаемые в настоящем документе, можно сливать с последовательностями маркера или «метки», такими как пептид для облегчения очистки. В конкретных вариантах осуществления, аминокислотная последовательность маркера или метки представляет собой гекса-гистидиновый пептид, такой как метка, предлагаемая в векторе pQE (см., например, QIAGEN, Inc.), среди прочих, многие из которых коммерчески доступны. Например, как описано в Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, гекса-гистидин обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другие пептидные метки, полезные для очистки в качестве неограничивающих примеров включают, гемагглютининовую («HA») метку, которая соответствует эпитопу, полученному из белка гемагглютинина гриппа (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), и метку «FLAG».

Способы для слияния или конъюгации терапевтических компонентов (включая полипептиды) с антителами хорошо известны (см., например, Arnon et al., «Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy», в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., «Antibodies For Drug Delivery», в Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, «Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review», в Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); «Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy», в Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; патенты США №№ 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5723125, 5783181, 5908626, 5844095, и 5112946; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; публикации PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, и WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992).

Слитые белки можно получать, например, способами перетасовки генов, перетасовки мотивов, перетасовки экзонов, и/или перетасовки кодонов (в совокупности обозначаемых как «перетасовка ДНК»). Перетасовку ДНК можно использовать для изменения активности антител к GFRAL, предлагаемых в настоящем документе, включая, например, антитела с более высокими аффинностями и более низкими скоростями диссоциации (см., например, патенты США №№ 5605793, 5811238, 5830721, 5834252, и 5837458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; и Lorenzo и Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313). Антитела, или кодируемые антитела, можно изменять, подвергая их мутагенезу путем устойчивой к ошибкам ПЦР, случайной нуклеотидной вставки или другими способами перед рекомбинацией. Полинуклеотид, кодирующий антитело, предлагаемое в настоящем документе, можно рекомбинировать с одним или несколькими компонентами, мотивами, разделами, частями, доменами, фрагментами, и тому подобное, одной или нескольких гетерологичных молекул.

Антитело, предлагаемое в настоящем документе, можно также конъюгировать со вторым антителом для образования гетероконъюгата антител, как описано, например, в патенте США № 4676980.

Терапевтический компонент или лекарственное средство, конъюгированные или рекомбинантно слитые с антителом, предлагаемым в настоящем документе, которое связывается с GFRAL (например, полипептидом, фрагментом, эпитопом GFRAL), следует выбирать для достижения желаемого профилактического или терапевтического эффекта/эффектов. В определенных вариантах осуществления антитело представляет собой модифицированное антитело. Врач или другой медицинский персонал может рассмотреть, например, следующее при принятии решения о том, какой терапевтический компонент или лекарственное средство конъюгировать или рекомбинантно сливать с антителом, предлагаемым в настоящем документе: характер заболевания, тяжесть заболевания и состояние индивидуума.

Антитела, которые связываются с GFRAL, такие как предлагаемое в настоящем документе, можно также присоединять к твердым подложкам, которые особенно подходят для иммунологических анализов или очистки целевого антигена. Такие твердые подложки в качестве неограничивающих примеров включают стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен.

Линкер может быть «расщепляемым линкером», облегчающим высвобождение конъюгированного средства в клетке, но нерасщепляемые линкеры также рассматриваются в настоящем документе. Линкеры для применения в конъюгатах по настоящему изобретению в качестве неограничивающих примеров включают линкеры, чувствительные к кислотам (например, гидразоновые линкеры), дисульфид-содержащие линкеры, линкеры, чувствительные к пепптидазе (например, пептидные линкеры, содержащие аминокислоты, например, валин и/или цитруллин, такие как цитруллин-валин или фенилаланин-лизин), фотолабильные линкеры, диметильные линкеры (см., например, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); патент США № 5208020), тиоэфирные линкеры, или гидрофильные линкеры, разработанные, чтобы избежать резистентности, опосредованной мультилекарственным транспортером (см., например, Kovtun et al., Cancer Res. 70: 2528-2537, 2010).

Конъюгаты антитела и вещества можно производить с использованием ряда бифункциональных средств для связывания белков, таких как BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат). Настоящее изобретение дополнительно предполагает, что конъюгаты антител и веществ можно получать с использованием любых подходящих способов, описанных в данной области, (см., например, в Bioconjugate Techniques, 2^nd Ed., G.T. Hermanson, ed., Elsevier, San Francisco, 2008).

Общепринятые стратегии конъюгации антител и веществ были основаны на химии случайной конъюгации, включающей ε-аминогруппу остатков Lys или тиоловую группу остатков Cys, которая приводила к гетерогенным конъюгатам. Недавно разработанные техники дают возможность сайт-специфической конъюгации с антителами, приводя к гомогенной загрузке и устраняя субпопуляции конъюгатов с измененным связыванием с антигеном или фармакокинетикой. Эти способы включают конструирование «thiomab», содержащих цистеиновые замены в положениях тяжелых и легких цепей, которые обеспечивают реактивные тиоловые группы и не нарушают фолдинг и сборку иммуноглобулина или связывание с антигеном (см., например, Junutula et al., J. Immunol. Meth. 332: 41-52 (2008); Junutula et al., Nat. Biotechnol. 26: 925-932, 2008). В другом способе, селеноцистеин котрансляционно вставляют в последовательность антитела для перекодирования стоп-кодона UGA из кодона терминации в селеноцистеиновую вставку, давая возможность сайт-специфической ковалентной конъюгации по нуклеофильной селеновой группе селеноцистеина в присутствии других природных аминокислот (см., например, Hofer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 12451-12456 (2008); Hofer et al., Biochemistry 48(50): 12047-12057, 2009).

Фармацевтические составы

Антитела к GFRAL по настоящему изобретению можно вводить любым путем, подходящим для заболевания, нарушения или состояния, которое лечат. Антитело, как правило, вводят парентерально, например, путем инфузии, подкожно, внутримышечно, внутривенно, интрадермально, интратекально и эпидурально. Доза антитела будет варьировать в зависимости от характера и/или тяжести заболевания или нарушения, а также от состояния индивидуума, и может включать дозы от 1 мг до 100 мг. Дозы также могут включать дозы от 1 мг/кг и до 15 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет приблизительно от 5 мг/кг и приблизительно до 7,5 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет приблизительно 5 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет приблизительно 7,5 мг/кг. Базовые дозы выбраны из группы, состоящей из: (a) 375-400 мг каждые две недели и (b) 550-600 мг каждые три недели. В некоторых вариантах осуществления базовая доза составляет 375-400 мг каждые две недели. В некоторых вариантах осуществления базовая доза составляет 550-600 мг каждые три недели. В некоторых вариантах осуществления базовая доза составляет 400 мг каждые две недели. В некоторых вариантах осуществления базовая доза составляет 600 мг каждые три недели. В некоторых вариантах осуществления последовательного дозирования, первая доза и вторая доза каждая составляют от 1 мг/кг и до 15 мг/кг, и вторая доза следует за первой дозой в интервале от одной до четырех недель. В некоторых вариантах осуществления первая доза и вторая доза каждая составляют от 5 мг/кг и до 7,5 мг/кг, вторая доза следует за первой дозой в интервале от 2 до 3 недель. В некоторых вариантах осуществления первая доза и вторая доза каждая составляют 5 мг/кг, и вторая доза следует за первой дозой через 2 недели. В некоторых вариантах осуществления первая доза и вторая доза каждая составляют 7,5 мг/кг, и вторая доза следует за первой дозой через 3 недели.

Для лечения заболеваний, нарушений или состояний антитело в некоторых вариантах осуществления вводят путем внутривенной инфузии. Дозировка, вводимая путем инфузии, находится в диапазоне приблизительно от 1 мкг/м² до приблизительно 10000 мкг/м² на дозу, как правило, одна доза в неделю, в общей сложности одна, две, три или четыре дозы. Альтернативно, диапазон доз составляет приблизительно от 1 мкг/м² до приблизительно 1000 мкг/м², приблизительно от 1 мкг/м² до приблизительно 800 мкг/м², приблизительно от 1 мкг/м² до приблизительно 600 мкг/м², приблизительно от 1 мкг/м² до приблизительно 400 мкг/м²; альтернативно, приблизительно от 10 мкг/м² до приблизительно 500 мкг/м², приблизительно от 10 мкг/м² до приблизительно 300 мкг/м², приблизительно от 10 мкг/м² до приблизительно 200 мкг/м², и приблизительно от 1 мкг/м² до приблизительно 200 мкг/м². Дозу можно вводить раз в сутки, раз в неделю, несколько раз в неделю, но меньше, чем раз в сутки, несколько раз в месяц, но меньше, чем раз в сутки, несколько раз в месяц, но меньше, чем раз в неделю, раз в месяц или с перерывами для облегчения или смягчения симптомов заболевания, нарушения или состояния. Введение можно продолжать в любом из описанных интервалов до облегчения заболевания, нарушения или состояния, или облегчения симптомов заболевания, нарушения или состояния, которое лечат. Введение можно продолжать после того как достигнута ремиссии или облегчение симптомов, если такая ремиссия или облегчение продлеваются за счет продолжения введения.

В одном из аспектов, настоящее изобретение дополнительно предлагает фармацевтические составы, содержащие, по меньшей мере, одно антитело к GFRAL по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит 1) антитело к GFRAL, и 2) фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит 1) антитело к GFRAL и/или его иммуноконъюгат, и необязательно, 2) по меньшей мере, одно дополнительное терапевтическое средство.

Фармацевтические составы, содержащие антитело получают для хранения путем смешивания антитела желаемой степени чистоты с необязательными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме водных растворов или лиофилизированных или другиг сухих составов. Составы в настоящем документе могут также содержать более чем одно активное соединение по мере необходимости для конкретного заболевания, нарушения или состояния (например, для конкретного показания), которое предполагается лечить, предпочтительно, такие активные соединения, чьи дополнительные активности не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. Например, в дополнение к антителу к GFRAL, может быть желательным включить в этот же состав, дополнительное антитело, например, второе антитело к GFRAL, которое связывается с другим эпитопом на полипептиде GFRAL, или антитело к какой-то другой мишени. Альтернативно, или дополнительно, композиция может дополнительно содержать другое средство, в том числе, например, химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, цитокин, ингибирующее рост средство, противогормональное средство, и/или кардиопротектор. В некоторых вариантах осуществления состав включает алкилирующее средство (например, хлорамбуцил, бендамустина гидрохлорид или циклофосфамид) аналог нуклеозидов (например, флудурабин, пентостатин, кладрибин или цитарабин) кортикостероид (например, преднизон, преднизолон или метилпреднизолон), иммуномодуляторное средство (например, леналидомид), антибиотик (например, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин или митоксентрон), синтетический флавон (например, флавопиридол), антагонист Bcl2 (например, облимерсен или ABT-263), гипометилирующее средство (например, азацитидин или децитабин), ингибитор FLT3 (например, мидостаурин, сорафениб и AC220). Таким молекулам целесообразно присутствовать в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемых целей.

Антитела по настоящему изобретению можно формулировать в любой подходящей форме для доставки к клетке/ткани-мишени, например, в виде микрокапсул или микроэмульсий (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980); Park et al., Molecules 10: 146-161 (2005); Malik et al., Curr.Drug. Deliv. 4: 141-151 (2007)); в виде составов с пролонгированным высвобождением (Putney и Burke, Nature Biotechnol. 16: 153-157, (1998)) или в липосомах (Maclean et al., Int. J. Oncol. 11: 235-332 (1997); Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 8: 39-45 (2006)).

Антитело, предлагаемое в настоящем документе, может также быть заключено в микрокапсулу, приготовленную, например, способами коацервации или путем интерфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозную или желатиновую микрокапсулу и полиметилметацилатную микрокапсулу, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в микроэмульсиях. Такие способы описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.

Известны различные системы доставки, и можно использовать для введения профилактического или терапевтического средства (например, антитела, которое связывается с GFRAL, как описано в настоящем документе), включая в качестве неограничивающих примеров, инкапсуляцию в липосомах, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu и Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), конструкцию нуклеиновой кислоты, как часть ретровирусного или другого вектора, и тому подобное. В другом варианте осуществления профилактическое или терапевтическое средство, или композицию, предлагаемую в настоящем документе, можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением или пролонгированным высвобождением. В одном из вариантов осуществления можно использовать помпу для достижения контролируемого или пролонгированного высвобождения (см., например, Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). В другом варианте осуществления можно использовать полимерные материалы для достижения контролируемого или пролонгированного высвобождения профилактического или терапевтического средства (например, антитела, которое связывается с GFRAL, как описано в настоящем документе) или композиции по изобретению (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); патент США № 5679377; патент США № 5916597; патент США № 5912015; патент США № 5989463; патент США № 5128326; публикацию PCT № WO 99/15154; и публикацию PCT № WO 99/20253). Примеры полимеров, используемых в составах с пролонгированным высвобождением, в качестве неограничивающих примеров включают, поли(2-гидрокси этил метакрилат), поли(метил метакрилат), поли(акриловую кислоту), поли(этилен-co-винилацетат), поли(метакриловую кислоту), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), поли(лактид-ко-гликолиды) (PLGA), и полиортоэфиры. В одном из вариантов осуществления полимер, используемый в составе с пролонгированным высвобождением, является инертным, без выщелачиваемых примесей, стабильным при хранении, стерильным, и биоразлагаемым.

В еще одном варианте осуществления систему с контролируемым или пролонгированным высвобождением можно размещать в непосредственной близости от терапевтической мишени, например, в носовых проходах или легких, таким образом, необходима только часть системной дозы (см., например, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, выше, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Системы с контролируемым высвобождением обсуждаются, например, у Langer (1990, Science 249:1527-1533). Любой способ, известный специалисту в данной области, можно использовать для производства составов с пролонгированным высвобождением, содержащих одно или несколько антител, которые связываются с GFRAL, как описано в настоящем документе. (См., например, патент США № 4526938, публикацию PCT WO 91/05548, публикацию PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, «Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179- 189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760).

Дополнительные системы доставки можно использовать для введения профилактического или терапевтического средства (например, антитела, которое связывается с GFRAL, как описано в настоящем документе) включая в качестве неограничивающих примеров, инъекционные средства доставки лекарственных средств. Инъекционные средства доставки лекарственных средств для антител к GFRAL включают, например, портативные устройства или надеваемые устройства. Портативные устройства, подходящие для антител к GFRAL, включают автоинъекторы, такие как автоинъекторы FLEXIQ-DV (Elcam Medical) или PRO-JECT (Aptar Pharma). Надеваемые устройства, подходящие для антител к GFRAL, включают, например, нательные системы доставки лекарственных средств, такие как набор для доставки лекарственных средств NEULASTA (Amgen). Инъекционные средства доставки лекарственных средств для антител к GFRAL могут содержать антитело в качестве профилактического или терапевтического средства, например, в предварительно заполненных шприцах, картриджах или ампулах. Инъекционные средства доставки лекарственных средств (например, автоинъекторы) и/или их контейнеры (например, шприцы, картриджи или ампулы) для антител к GFRAL могутт быть одноразовыми. Примеры инъекционных устройств, подходящих для антител к GFRAL, описаны в WO2014/081780.

В некоторых вариантах осуществления можно использовать дополнительные системы доставки лекарственных средств для введения профилактического или терапевтического средства (например, антитела, которое связывается с GFRAL, как описано в настоящем документе), включая в качестве неограничивающих примеров, осмотические насосы. Можно использовать различные типы систем осмотических насосов для антител к GFRAL, включая, например, однокамерные системы, двухкамерные системы и многокамерные системы. Примеры систем осмотических насосов, подходящих для антител к GFRAL, описаны, например, у Herrlich et al. (2012) Advanced Drug Delivery Reviews, 64, 1617-1627. В некоторых вариантах осуществления осмотический насос для антитела к GFRAL может включать имплантируемые осмотические насосы с распределением препарата, такие как помпа DUROS.

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ

Антитело к GFRAL по настоящему изобретению можно использовать, например, в терапевтических способах.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способы лечения или профилактики заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, где способ включает введение антитела к GFRAL или его фрагмента, описываемого в настоящем документе, индивидууму, страдающему от заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15. Дополнительно, индивидууму можно вводить фармацевтическую композицию, содержащую антитело к GFRAL или его фрагмент, описываемые в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ лечения индивидуума, страдающего от непреднамеренной потери массы. Примером подходящего индивидуума является индивидуум, которому диагностировано атрофическое заболевание или кахексия. Подходящие пациенты включают пациентов, страдающих от цирроза печени, гипертиреоза, хронической почечной недостаточности, болезни Паркинсона, злокачественной опухоли, пищевого нарушения (например, нервной анорексии), хронического воспалительного заболевания (например, ревматоидного артрита), сепсиса или других форм системного воспаления, хронического обструктивного заболевания легких, СПИДа, туберкулеза, и мышечной атрофии, такой как миодистрофия или рассеянный склероз), или саркопении.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к способам профилактики непреднамеренной потери массы у индивидуума, который может иметь риск непреднамеренной потери массы из-за хронического заболевания, такого как цирроз печени, гипертиреоз, хроническая почечная недостаточность, болезнь Паркинсона, злокачественная опухоль, пищевое нарушение (например, нервная анорексия), хроническое воспалительное заболевание (например, ревматоидный артрит), сепсис или другие формы системного воспаления, хроническое обструктивное заболевание легких, СПИД, туберкулез, и мышечная атрофия, такая как миодистрофия или рассеянный склероз), или саркопения. Такие индивидуумы могут включают индивидуумов с повышенными уровнями GDF15, проходящих лечение от злокачественной опухоли, и тому подобное.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ лечения индивидуума, страдающего от кахексии. Примером подходящего индивидуума является индивидуум, которому диагностирована кахексия. Настоящее изобретение также относится к способам для профилактики непреднамеренной потери массы у индивидуума, который может иметь риск непреднамеренной потери массы из-за начала кахексии. Такие индивидуумы включают индивидуумов с повышенными уровнями GDF15, со злокачественной опухолью, проходящих лечение от злокачественной опухоли, имеющих пищевое нарушение, и тому подобное.

Также предлагается способ для снижения активности GDF15 у пациента с повышенной активностью GDF15. Как применяют в настоящем документе, «повышенная активность GDF15» относится к повышенной активности или количеству GDF15 в биологической жидкости индивидуума по сравнению со здоровым индивидуумом. Ряд состояний ассоциирован с повышенным уровнем GDF15 в сыворотке, где повышенный GDF15 приводит к ряду симптомов, таких как потеря аппетита, потеря массы, и тому подобное. Примеры состояний, ассоциированных с повышенным уровнем GDF15 в сыворотке, включают злокачественную опухоль, например, меланому, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы; аутоиммунные заболевания, такие как, артрит и воспаление; сердечно-сосудистые заболевания, такие как атеросклероз, сердечная недостаточность, гипертензия, инфаркт миокарда, стенокардия, и сердечно-сосудистые события; метаболические заболевания, такие как анемия, кахексия, анорексия, заболевание почек, и талассемия, и тому подобное.

Индивидуум с любым из вышеуказанных заболеваний, нарушений или состояний является подходящим кандидатом для получения антитела к GFRAL или его фрагмента, описываемого в настоящем документе, или комбинации терапевтического средства и антитела к GFRAL или его фрагмента.

Введение индивидууму антитела к GFRAL или его фрагмента может уменьшать или предотвращать у такого индивидуума один или несколько симптомов, ассоциированных с заболеванием, нарушением или состоянием, опосредованным GDF15. Например, введение антитела к GFRAL или его фрагмента по настоящему изобретению может повышать массу тела и/или аппетит у индивидуума. В качестве другого примера, введение антитела к GFRAL или его фрагмента по настоящему изобретению может поддерживать массу тела у индивидуума или уменьшать потерю массы тела у индивидуума.

В одном из аспектов, предлагаются способы для лечения заболевания, нарушения или состояния, включающие введение индивидууму эффективного количества антитела к GFRAL или его фрагмента. В определенных вариантах осуществления способ лечения заболевания, нарушения или состояния включает введение индивидууму эффективного количества фармацевтического состава, содержащего антитело к GFRAL и, необязательно, по меньшей мере, одно дополнительное терапевтическое средство, такое как описываемые в настоящем документе.

Антитело к GFRAL или его фрагмент можно вводить человеку с терапевтическими целями. Кроме того, антитело к GFRAL или его фрагмент можно вводить не являющемуся человеком млекопитающему, экспрессирующему GFRAL, с которым антитело перекрестно реагирует (например, примату, свинье, крысе или мыши) для ветеринарных целей или как животной модели человеческого заболевания. Что касается последнего, такие модели на животных могут быть полезны для оценки терапевтической эффективности антител по настоящему изобретению (например, для тестирования дозировок и периода действия введения).

Антитела по настоящему изобретению можно использовать или отдельно, или в комбинации с другими композициями в терапии. Например, антитело к GFRAL по настоящему изобретению можно вводить совместно, по меньшей мере, с одним дополнительным терапевтическим средством и/или адъювантом. В некоторых вариантах осуществления дополнительное соединение представляет собой терапевтическое антитело, иное чем антитело к GFRAL.

Такие вышеупомянутые способы комбинированного лечения включают комбинированное введение (когда два или более терапевтических средств включены в один и тот же или раздельные составы), и раздельное введение, в случае которого, введение антитела к GFRAL или его фрагмента по настоящему изобретению может происходить до, одновременно, и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или адъюванта. Антитела по настоящему изобретению также можно использовать в комбинации с дополнительными схемами лечения, включая, без ограничений, описываемые в настоящем документе.

Антитело к GFRAL по настоящему изобретению (и любое дополнительное терапевтическое средство или адъювант) можно вводить любыми подходящими способами, включая парентеральное, подкожное, интраперитонеальное, внутрилегочное, и интраназальное, и, при желании для местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные вливания включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное, или подкожное введение. Кроме того, антитело или конъюгат удобно вводить путем периодического вливания, в частности, с понижающимися дозами антитела или его фрагмента. Дозирование можно проводить любым подходящим путем, например, путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, что частично зависит от того, является ли введение кратким или хроническим.

Антитела по настоящему изобретению можно формулировать, дозировать и вводить в соответствии с добросовестной медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в этом контексте включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного индивидуума, причину нарушения, место доставки препарата, способ введения, схему введения, и другие факторы, известные врачам-терапевтам. Антитело к GFRAL нет необходимости, но можно необязательно формулировать с одним или несколькими средствами, в настоящее время применяемыми для профилактики или лечения обсуждаемого нарушения. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антитела или иммуноконъюгата, присутствующих в составе, типа нарушения или лечения, и других вышеописанных факторов. Эти средства, в основном, применяют в тех же самых дозах и со способами введения, как описано в настоящем документе, или приблизительно от 1 до 99% от доз, описываемых в настоящем документе, или в любой дозировке и путем любого пути введения, который эмпирически/клинически определен как подходящий.

Для заболевания, нарушения или состояния подходящая дозировка антитела к GFRAL или его фрагмента по настоящему изобретению при использовании отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами, такими как, средства, описываемые в настоящем документе) будет зависеть от типа заболевания, нарушения или состояния, которое лечат, типа антитела, тяжести и течения заболеваня, нарушения или состояния, с профилактическими или терапевтическими целями вводят антитело, предшествующей терапии, истории болезни индивидуума и ответа на антитело, и заключения лечащего врача. Антитело к GFRAL или его фрагмент подходящим образом вводят индивидууму одноразово или в течение серии лечений. В зависимости от типа и тяжести заболевания начальная кандидатная доза антитела или его фрагмента для введения индивидууму, составляет приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг (например, 0,1мг/кг-20мг/кг, 1мг/кг-15мг/кг, и тому подобное), например, вводят ли его путем одного или нескольких раздельных введений, или путем непрерывного вливания. Одно типичное суточное дозирование может находиться в диапазоне приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторных введений в течение нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение будут, как правило, поддерживать до тех пор, пока не произойдет желаемого подавления симптомов заболевания. Примеры дозировок антитела или его фрагмента могут находиться в диапазоне приблизительно от 0,05 мг/кг до приблизительно 10,0 мг/кг. Таким образом, индивидууму можно вводить одну или несколько доз антитела приблизительно по 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 3,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 7,0 мг/кг, 8,0 мг/кг, 9,0 мг/кг или 10,0 мг/кг (или любое их сочетание). Такие дозы можно вводить с перерывами, например, раз в неделю или раз в три недели (например, таким образом, что индивидуум получает приблизительно от двух до приблизительно двадцати, или, например, приблизительно шесть доз антитела). Можно вводить начальную более высокую ударную дозу с последующей одной или несколькими более низкими дозами. Пример схемы дозирования включает введение начальной ударной дозы с последующей поддерживающей дозой (например, раз в неделю) антитела или его фрагмента. Начальная ударная доза иожет быть больше, чем поддерживающая доза. Однако могут быть полезны другие режимы дозирования. Прогресс этой терапии легко контролировать при помощи общепринятых способов и анализов.

В некоторых вариантах осуществления способ, описываемый в настоящем документе, включает введение указанного антитела к GFRAL или его фрагмента пациенту, у которого есть непреднамеренная потеря массы тела или риск развития непреднамеренной потери массы тела. Указанные способы включают введение антитела к GFRAL или его фрагмента, описываемого в настоящем документе, индивидууму с повышенными уровнями GDF15 в сыворотке. В определенном варианте осуществления антитело или его фрагмент представляет собой антитело к GFRAL, которое конкурирует с GDF15 за связывание с внеклеточным доменом GFRAL. В определенных вариантах осуществления антитело или его фрагмент связывается с внеклеточным доменом белка GFRAL, но не активирует RET. Например, антитело или его фрагмент представляет собой антитело к GFRAL, которое конкурирует с GDF15 за связывание с внеклеточным доменом GFRAL, но не активирует RET после связывания с GFRAL. Такое антитело описано в настоящем документе.

В способах по настоящему изобретению, антитела к GFRAL или их фрагменты, описываемые в настоящем документе, или фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела или их фрагменты, можно вводить индивидууму (например, пациенту-человеку), например, для достижения целевой массы тела и/или поддержания массы тела; достижения целевого индекса массы тела (BMI) и/или поддержания BMI; повышения аппетита; и тому подобное. Нормальный взрослый человек имеет BMI в диапазоне 18,5-24,9 кг/м²_. Указанные способы лечения могут повысить массу тела, BMI, мышечную массу, и/или потребление пищи у пациента, по меньшей мере, приблизительно на 5%, например, на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или больше.

Способы, относящиеся к лечению или профилактике заболевания, нарушения или состояния, опосредованного GDF15, (например, непреднамеренной потере массы), описываемые в настоящем документе, включают, например, применение антитела к GFRAL или его фрагмента, описываемого в настоящем документе для терапии/профилактики отдельно или в комбинации с другими типами терапии. Способ включает введение индивидууму антитела к GFRAL или его фрагмента и другоо средства.

В некоторых вариантах осуществления средство вводят пациенту с потерей мышечной массы, например, с потерей мышечной массы, связанной с основным заболеванием. Основные заболевания, связанные с кахексией, в качестве неограничивающих примеров включают, злокачественную опухоль, хроническую почечную недостаточность, хроническое обструктивное заболевание легких, СПИД, туберкулез, хронические воспалительные заболевания, сепсис и другие формы системного воспаления, мышечную атрофию, такую как миодистрофия, и пищевое нарушение, известное как нервная анорексия. В некоторых вариантах осуществления средство ингибирует потерю массы нежировой ткани (например, мышечной массы) и/или массы жировой ткани, по меньшей мере, на 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, или 100%.

В некоторых вариантах осуществления потеря массы нежировой ткани (например, мышечной массы) сопровождается потерей массы жировой ткани. В некоторых вариантах осуществления средство может ингибировать потерю массы жировой ткани, по меньшей мере, на 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, или 100%.

В некоторых вариантах осуществления средство вводят пациенту с диагнозом потери массы тела (например, непреднамеренной потери массы). В некоторых вариантах осуществления средство может обратить вспять потерю массы тела (например, непреднамеренную потерю массы), по меньшей мере, на 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% или 35%.

В некоторых вариантах осуществления средство вводят пациенту с диагнозом потери органной массы, например, потери органной массы, связанной с основным заболеванием. Основные заболевания, связанные с кахексией, в качестве неограничивающих примеров включают, злокачественную опухоль, хроническую почечную недостаточность, хроническое обструктивное заболевание легких, СПИД, туберкулез, хронические воспалительные заболевания, сепсис и другие формы системного воспаления, мышечную атрофию, такую как миодистрофия, и пищевое нарушение, известное как нервная анорексия. В некоторых вариантах осуществления средство может ингибировать потерю органной массы, по меньшей мере, на 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, или 100%. В некоторых вариантах осуществления потерю органной массы наблюдают в сердце, печени, почке, и/или селезенке. В некоторых вариантах осуществления потеря органной массы сопровождается потерей мышечной массы, потерей массы жировой ткани и/или непреднамеренной потерей массы.

Саркопения, мышечная атрофия и существенная потеря мышечной массы могут возникать в отсутствие кахексии, сниженного аппетита или потери массы тела. В некоторых вариантах осуществления средство можно использовать для лечения индивидуума с диагнозом саркопения, мышечная атрофия и/или существенная потеря мышечной массы, независимо от того, диагностированы ли у пациента или были ли диагностированы кахексия или сниженный аппетит. Такой способ включает введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких средств, нуждающемуся в этом индивидууму.

Любое из широкого ряда лекарственных средств, направленных на лечение или профилактику кахексии можно комбинировать с композицией или терапевтическим способом с указанными белками.

Когда белок GFRAL-ECD вводят в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, комбинацию можно вводить в любое место одновременно вплоть до 5 часов или более, например, 10 часов, 15 часов, 20 часов или более, до или после введения заявленного белка. В определенных вариантах осуществления заявленный белок и другое терапевтическое вмешательство вводят или применяют последовательно, например, когда заявленный белок вводят до или после другого терапевтического лечения. Еще в других вариантах осуществления, заявленный белок и другую терапию вводят одновременно, например, когда заявленный белок и вторую терапию вводят в одно и то же время, например, когда вторая терапия представляет собой лекарственное средство, его можно вводить вместе с заявленным белком в виде двух раздельных составов или комбинировать в одной композиции, которую вводят индивидууму. Независимо от того происходит введение последовательно или одновременно, как проиллюстрировано выше, считают, что лечение вводят вместе или в комбинации для целей настоящего изобретения.

Цитокины, которые участвуют в кахексии, включают активин A и IL-6. Повышенные уровни активина были ассоциированы с кахексией, связанной со злокачественной опухолью, и опухолями половых желез. См., например, Marino et al. (2013) CYTOKINE & GROWTH FACTOR REV. 24:477-484. Активин A является членом семейства TGF-бета и лигандом рецептора активина, типа 2, ActRIIB. См., например, Zhou et al. (2010) Cell 142:531-543. Было поазано, что уровни циркулирующего IL-6 коррелируют с потерей массы у пациентов со злокачественными опухолями, а также со сниженной выживаемостью. См., например, Fearon et al. (2012) CELL METABOLISM 16: 153-166.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления один или несколько ингибиторов активина-A или рецептора активина-A, ActRIIB, IL-6 или рецептора IL-6 (IL-6R) можно вводить в комбинации с антителом к GFRAL или его фрагментом, описываемым в настоящем документе (например, вводить в одно и то же время, вводить до или вводить после). Примеры ингибиторов активина A или ActRIIB, включают, например, антитело к активину-A или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело к ActRIIB или его антигенсвязывающий фрагмент, низкомолекулярный ингибитор активина-A, низкомолекулярный ингибитор ActRIIB, и рецептор-ловушку ActRIIB, такой как растворимый рецептор ActRIIB и слияние растворимого рецептора ActRIIB с молекулой Fc (ActRIIB-Fc). См., например, Zhou et al. (2010), выше. Подходящие ингибиторы IL-6 или IL-6R, включают антитело к IL-6 или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело к IL-6R или его антигенсвязывающий фрагмент, низкомолекулярный ингибитор IL-6, низкомолекулярный ингибитор IL-6R, и рецептор-ловушку IL-6R, такой как растворимый рецептор IL-6 и слияние растворимого рецептора IL-6 с молекулой Fc (IL6R-Fc). См., например, Enomoto et al. (2004) BIOCHEM. AND BIOPHYS. RES. COMM. 323: 1096-1 102; Argiles et al. (2011) EUR. J. PHARMACOL. 668:S81-S86; Tuca et al. (2013) ONCOLOGY/HEMATOLOGY 88:625-636. Подходящие ингибиторы IL-6 или IL-6R могут включать, например, Тосилизумаб (Actemra^®, Hoffmann-LaRoche), гуманизированное моноклональное антитело к IL-6R, одобренное для лечения ревматоидного артрита, и Сарилумаб/REGN88 (Regeneron), гуманизированное антитело к IL6R в клинических исследованиях для лечения ревматоидного артрита; и Селуметиниб/AZD6244 (AstraZeneca), аллостерический ингибитор MEK, для которого было показано ингибирование выработки IL-6. Prado et al. (2012) BRITISH J. CANCER 106: 1583-1586.

TNFα и IL-1 представляют собой цитокины, известные участием в регуляции провоспалительного ответа, которые также участвуют в мышечном истощении, анорексии и кахексии. Повышенные уровни циркулирующего TNFα, по-видимому, ингибируют миогенез. TNFα, также известный как "кахектин", стимулирует секрецию интерлейкина-1 и участвует в индукции кахексии. IL-1 является мощным триггером острой фазы воспалительного ответа, и показано, что вливание IL-1 может приводить к заметной потере массы и потере аппетита. Было показано, что IL-1 вносит вклад в начало кахексии при злокачественной опухоли у мышей, несущих мышиную аденокарциному-26 (Strassmann et al. (1993) J. IMMUNOL. 150:2341). См. также, Mathys и Billiau (1997) NUTRITION 13:763-770; Fong et al. (1989) AM. J. PHYSIOL.-REGULATORY, INTEGRATIVE AND COMPARATIVE PHYSIOL., 256:R659-R665. Таким образом, ингибиторы TNFα и ингибиторы IL-1, которые применяют для лечения ревматоидного артрита, могут также быть полезны при лечении кахексии.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления один или несколько ингибиторов TNFα или IL-1 можно вводить в комбинации с антителом к GFRAL или его фрагментом, описываемым в настоящем документе (например, вводить в одно и то же время, вводить до или вводить после). Подходящие ингибиторы TNFα или IL-1 включают антитело к TNFα или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело к IL-1 или его антигенсвязывающий фрагмент, низкомолекулярный ингибитор TNFα или IL-1, и рецептор-ловушку TNFα или IL-1, такой как растворимый рецептор TNFα или рецептор IL-1 и слияние растворимой формы TNFα или IL-1 с молекулой Fc. Подходящие ингибиторы TNFα включают, например, этанерцепт (Энбрел^®, Pfizer/Amgen), инфликсимаб (Ремикейд^®, Janssen Biotech), адалимумаб (Humira^®, Abbvie), голимумаб (Simponi^®, Johnson & Johnson/Merck), и цертолизумаб пегол (Cimzia^®, UCB). Подходящие ингибиторы IL-1 включают, например, Xilonix^®, антитело, которое нацелено на IL-1a (XBiotech), аникинра (Kinaret^®, Amgen), канакинумаб (Ilaris^®, Novartis), и рилонацепт (Arcalyst^®, Regeneron). В определенных вариантах осуществления ингибитор TNFα или ингибитор IL-1, который, как правило, вводят системно для лечения ревматоидного артрита, можно вводить местно и непосредственно в опухоль.

Миостатин, также известный как GDF-8, является членом семейства пептидов TGF-β, который является негативным регулятором мышечной массы, что было показано увеличением мышечной массы у млекопитающих, дефицитных по миостатину. Миостатин является лигандом рецептора активина типа 2, ActRIIB.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления один или несколько ингибиторов миостатина или его рецептора можно вводить в комбинации с антителом к GFRAL или его фрагментом, описываемым в настоящем документе (например, вводить в одно и то же время, вводить до или вводить после). Подходящие ингибиторы миостатина или ActRIIB, включают антитело к миостатину или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело к ActRIIB или его антигенсвязывающий фрагмент, низкомолекулярный ингибитор миостати, низкомолекулярный ингибитор ActRIIB, и рецептор-ловушку ActRIIB, такой как растворимый рецептор ActRIIB и слияние растворимого рецептора ActRIIB с молекулой Fc. См., например, Lokireddy et al. (2012) BlOCHEM. J. 446(l):23-26. Ингибиторы миостатина, которые могут подходить для настоящих способов, включают REGN1033 (Regeneron); см. Bauerlein et al. (2013) J. CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE: Abstracts of the 7th Кахексия Conference, Kobe/Osaka, Japan, December 9-11, 2013, Abstract 4-06; LY2495655 (Lilly), гуманизированное антитело к миостатину в клинических исследованиях у Eli Lilly; см. также "A PHASE 2 STUDY OF LY2495655 IN PARTICIPANTS WITH PANCREATIC CANCER", доступное в сети Интернет на clinicaltrials.gov/ct2/NCT01505530; идентификатор NML: NCT01505530; ACE-031 (Acceleron Pharma); и стамулумаб (Pfizer).

Вещества, такие как грелин или миметики грелина, или другие стимуляторы секреции гормона роста (GHS), которые способны активировать рецептор GHS (GHS-Rla), также известный как рецептор грелина, могут быть полезны для увеличения потребления пищи и массы тела у людей. См. Guillory et al. (2013) в VITAMINS AND HORMONES vol. 92, chap.3; и Steinman и DeBoer (2013) VITAMINS AND HORMONES vol. 92, chap. 8. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления один или несколько из грелина и миметиков грелина, или других стимуляторов секреции гормона роста (GHS) можно вводить в комбинации с антителом к GFRAL или его фрагментом, описываемым в настоящем документе (например, вводить в одно и то же время, вводить до или вводить после). Подходящие миметики грелина включают анаморелин (Helsinn, Lugano, CH); см. Temel et al. (2013) J. CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE: Abstracts of the 7th Кахексия Conference, Kobe/Osaka, Japan, December 9-11, 2013, Abstract 5-01. Другие подходящие молекулы GHS можно идентифицировать, например, с использованием конкурентного анализа со стимулятором секреции гормона роста рецептором грелина, описанного в публикациях PCT №№. WO201 1/1 17254 и WO2012/1 13103.

Агонисты андрогенового рецептора, в том числе низкомолекулярные соединения и другие селективные модуляторы рецептора андрогенов (SARM) могут быть полезны при лечении кахексии и/или саркопении. См., например, Mohler et al. (2009) J. MED. CHEM. 52:3597-3617; Nagata et al. (2011) BlOORGANIC AND MED. CHEM. LETTERS 21: 1744-1747; и Chen et al. (2005) MOL. INTERV. 5: 173-188. В идеале, SARM должны действовать как полные агонисты, подобно тестостерону, в анаболических тканях-мишенях, таких как мышца и кость, но должны демонстрировать только частичную или полностью антагонистическую активность по отношению к рецептору андрогенов в ткани предстательной железы. См., например, Bovee et al. (2010) J. STEROID BIOCHEM. & MOL. BIOL. 118:85-92. Подходящие SARM можно идентифицировать, например, с использованием способов и анализов, описанных в Zhang et al. (2006) BIOORG. MED. CHEM. LETT. 16:5763-5766; и Zhang et al. (2007) BIOORG. MED. CHEM. LETT. 17:439-443.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления один или несколько агонистов андрогенового рецептора можно вводить в комбинации с антителом к GFRAL или его фрагментом, описываемым в настоящем документе (например, вводить в одно и то же время, вводить до или вводить после). Подходящие SARM включают, например, GTx-024 (энобосарм, Ostarine^®, GTx, Inc.), SARM в фазе II клинических исследований у GTx, Inc. См. также, Дальтон et al. (2011) J. CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2: 153-161. Другие подходящие SARMs включают 2-(2,2,2)-трифторэтил-бензимидазолы (Ng et al. (2007) BIOORG. MED. CHEM. LETT. 17: 1784-1787) и JNJ-26146900 (Allan et al. (2007) J. STEROID BlOCHEM. & MOL. BIOL. 103:76-83).

Блокаторы β-адренергических рецепторов, или бета-блокаторы, были исследованы на их воздействие на массу тела у индивидуумов с кахексией, и были ассоциированы с частичной обратимостью кахексии у пациентов с застойной сердечной недостаточностью. См., например, Hryniewicz et al. (2003) J. CARDIAC FAILURE 9:464-468. Бета-блокатор MT-102 (PsiOxus Therapeutics, Ltd.) оценивали в фазе 2 клинического испытания для индивидуумов с кахексией при злокачественной опухоли. См. Coats et al. (2011) J. CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2:201-207. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления один или несколько блокаторов β-адренергических рецепторов, или бета-блокаторы, можно вводить в комбинации с антителом к GFRAL или его фрагментом, описываемым в настоящем документе (например, вводить в одно и то же время, вводить до или вводить после).

Мыши, нокаутные по рецептору меланокортина, с генетическим дефектом в передаче сигнала меланокортина демонстрируют фенотип, противоположный кахексии: повышенный аппетит, повышенная масса нежировой ткани и сниженный метаболизм. Таким образом, антагонизм к меланокортину наметился в качестве потенциального лечения для кахексии, ассоциированной с хроническим заболеванием (DeBoer и Marks (2006) TRENDS IN ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM 17: 199-204).

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления один или несколько ингибиторов пептида меланокортина или рецептора меланокортина можно вводить в комбинации с антителом к GFRAL или его фрагментом, описываемым в настоящем документе (например, вводить в одно и то же время, вводить до или вводить после). Подходящие ингибиторы меланокортинов или рецепторов меланокортина включают антитело к пептиду меланокортина или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело к рецептору меланокортина или его антигенсвязывающий фрагмент, низкомолекулярный ингибитор пептида меланокортина, низкомолекулярный ингибитор рецептора меланокортина, и рецептор-ловушка меланокортинового рецептора, такой как растворимый рецептора меланокортина и слияние растворимого рецептора меланокортина с молекулой Fc. Подходящие ингибиторы рецептора меланокортина включают, например, антагонист рецептора меланокортина агути-связанный пептид (AgRP(83-132)), для которого было показано предотвращение симптомов, связанных с кахексией на мышиной модели кахексии, связанной со злокачественной опухолью (Joppa et al. (2007) PEPTIDES 28:636-642).

Противоопухолевые средства, особенно те, которые вызывают кахексию и повышают уровни GDF15, такие как цисплатин, можно использовать в способах по настоящему изобретению в комбинации с антителом к GFRAL или его фрагментом, описываемым в настоящем документе (например, вводить в одно и то же время, вводить до или вводить после). Многие пациенты со злокачественными опухолями ослаблены суровыми курсами лучевой терапии и/или химиотерапии, что может ограничить способность пациента переносить эти терапии, и таким образом, ограничить режим дозирования. Определенные противоопухолевые средства сами по себе, такие как фторурацил, адриамицин, метотрексат и цисплатин, вносят вклад в кахексию, например, вызывая тяжелые желудочно-кишечные осложнения. См., например, Inui (2002) CANCER J. FOR CLINICIANS 52:72-91. В способах по настоящему изобретению, в которых противоопухолевое средства вводят в комбинации с антителом к GFRAL по изобретению, возможно снизить частоту возникновения и/или тяжесть кахексии, и в конечном счете повысить максимально переносимую дозу такого противоопухолевого средства. Таким образом, эффективность лечения противоопухолевыми средствами, которые могут вызвать кахексию, может быть улучшена за счет снижения частоты возникновения кахексии как ограничивающего дозу неблагоприятного воздействия, и за счет возможности введения более высоких доз указанного средства против злокачественных опухолей.

Таким образом, в настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции, содержащие антитело к GFRAL или его фрагмент, описываемые в настоящем документе, в комбинации со средством, выбранным из группы, состоящей из ингибитора активина-A, ингибитора ActRIIB, ингибитора IL-6 или ингибитора IL-6R, грелина, миметика грелина или агониста GHS-R1a, SARM, ингибитора TNFα, ингибитора IL-1α, ингибитора миостатина, бета-блокатора, ингибитора пептида меланокортина, ингибитора рецептора меланокортина и противоопухолевого средства. Настоящее изобретение также включает способы лечения, профилактики или минимизации кахексии и/или саркопении у млекопитающего, включающие введение нуждающемуся в этому млекопитающему фармацевтической композиции или композиций, содержащих эффективное количество антитела к GFRAL по изобретению в комбинации с эффективным количеством ингибитора активина-A, ингибитора ActRIIB, ингибитора IL-6 или ингибитора IL-6R, грелина, миметика грелина или агониста GHS-R1a, SARM, ингибитора TNFα, ингибитора IL-1α, ингибитора миостатина, бета-блокатора, ингибитора пептида меланокортина или ингибитора рецептора меланокортина.

В другом аспекте в настоящем документе предлагается способ ингибирования потери мышечной массы, связанной с основным заболеванием, включающий введение нуждающемуся в этому млекопитающему фармацевтической композиции или композиций, содержащих эффективное количество антитела к GFRAL по изобретению в комбинации с эффективным количеством ингибитора активина-A, ингибитора ActRIIB, ингибитора IL-6 или ингибитора IL-6R, грелина, миметика грелина или агониста GHS-R1a, SARM, ингибитора TNFα, ингибитора IL-1α, ингибитора миостатина, бета-блокатора, ингибитора пептида меланокортина или ингибитора рецептора меланокортина, для профилактики или уменьшения или потери мышечной массы. Основное заболевание может быть выбрано из группы, состоящей из злокачественной опухоли, хронической сердечной недостаточности, хронической почечной недостаточности, хронического обструктивного заболевания легких, СПИДа, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, сепсиса и туберкулеза. Дополнительно, в некоторых вариантах осуществления потеря мышечной массы сопровождается потерей массы жировой ткани.

В другом аспекте в настоящем документе предлагается способ ингибирования или снижения непреднамеренной потере массы у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этому млекопитающему фармацевтической композиции или композиций, содержащих эффективное количество антитела к GFRAL по изобретению в комбинации с эффективным количеством ингибитора активина-A, ингибитора ActRIIB, ингибитора IL-6 или ингибитора IL-6R, грелина, миметика грелина или агониста GHS-R1a, SARM, ингибитора TNFα, ингибитора IL-1α, ингибитора миостатина, бета-блокатора, ингибитора пептида меланокортина или ингибитора рецептора меланокортина.

Определенные противоопухолевые средства, такие как цисплатин, имеют одно или несколько нежелательных неблагоприятных воздействий, которые включают возникновение или усиление одного или нескольких синдромов, таких как кахексия, саркопения, мышечная атрофия, атрофия кости или непреднамеренная потеря массы тела. Таким образом, в другом аспекте в настоящем документе предлагается способ лечения злокачественной опухоли, с одновременной профилактикой, минимизацией или уменьшением возникновения, частоты и тяжести кахексии, саркопении, или мышечной атрофии, атрофии кости или непреднамеренной потери массы тела у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этому млекопитающему фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество антитела к GFRAL или его фрагмента, описываемого в настоящем документе, в комбинации с одним или несколькими противоопухолевыми средствами. В некоторых вариантах осуществления способ лечения злокачественной опухоли, с одновременной профилактикой, минимизацией или уменьшением возникновения, частоты и тяжести кахексии, саркопении, или мышечной атрофии, атрофии кости или непреднамеренной потери массы тела у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этому млекопитающему фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество антитела к GFRAL или его фрагмента, описываемого в настоящем документе, в комбинации с одним или несколькими противоопухолевыми средствами, которые известны как вызывающие или усиливающие возникновение, частоту или тяжесть кахексии, саркопении, или мышечной атрофии, атрофии кости или непреднамеренной потери массы тела у млекопитающего.

ДИГНОСТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ И СПОСОБЫ ДЕКТЕЦИИ

В одном из аспектов, антитела к GFRAL и их фрагменты по настоящему изобретению подходят для детекции присутствия GFRAL в биологическом образце. Такие антитела к GFRAL могут включать антитела, которые связываются с человеческим GFRAL. Как применяют в настоящем документе, термин «детекция» включает количественную или качественную детекцию. В определенных вариантах осуществления биологический образец содержит клетку или ткань.

В одном из аспектов, настоящее изобретение предлагает способ детекции присутствия GFRAL в биологическом образце. В определенных вариантах осуществления способ включает контакт биологического образца с антителом к GFRAL в условиях, позволяющих связывание антитела к GFRAL с GFRAL, и детекцию того, сформировался ли комплекс между антителом к GFRAL и GFRAL.

В одном из аспектов, настоящее изобретение предлагает способ диагностики нарушения, ассоциированного с экспрессией GFRAL. В определенных вариантах осуществления способ включает контакт исследуемой клетки с антителом к GFRAL; определение уровня экспрессии (количественного или качественного) GFRAL исследуемой клеткой путем детекции связывания антитела к GFRAL с GFRAL; и сравнение уровня экспрессии GFRAL исследуемой клеткой с уровнем экспрессии GFRAL контрольной клеткой (например, нормальной клеткой, происходящей из той же самой ткани, что и исследуемая клетка, или клеткой, которая экспрессирует GFRAL на уровнях, сравнимых с таковыми у нормальной клетки), где более высокий уровень экспрессии GFRAL исследуемой клеткой по сравнению с контрольной клеткой указывает на присутствие нарушения, связанного с повышенной экспрессией GFRAL. В определенных вариантах осуществления исследуемую клетку получают от индивидуума, у которого подозревают наличие заболевания, нарушения или состояния, связанного с экспрессией GDF15 и/или заболевания, нарушения или состояния, при котором желательно ингибировать эффекты GDF15 in vivo. В определенных вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой, например, непреднамеренную потерю массы. Такие примеры заболеваний, нарушений или состояний можно диагностировать с использованием антитела к GFRAL по настоящему изобретению.

В определенных вариантах осуществления способ диагностики или детекции, такой как описанные выше, включает детекцию связывания антитела к GFRAL с GFRAL, экспрессированным на поверхности клетки или в препарате мембраны, полученном из клетки, экспрессирующей GFRAL на своей поверхности. В определенных вариантах осуществления способ включает контакт клетки с антителом к GFRAL в условиях, позволяющих связывание антитела к GFRAL с GFRAL, и детекцию того, сформировался ли комплекс между антителом к GFRAL и GFRAL. Примером анализа для детекции связывания антитела к GFRAL с GFRAL, экспрессированным на поверхности клетки, является анализ «FACS» (флуоресцентная сортировка клеток).

Другие определенные способы можно использовать для детекции связывание антител к GFRAL с GFRAL. Такие способы в качестве неограничивающих примеров включают, антигенсвязывающие анализы, которые хорошо известны в данной области, такие как вестерн-блоттинги, радиоиммунологические анализы, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), иммунологические анализы типа «сэндвич», анализы иммунопреципитации, флуоресцентные иммунологические анализы, иммунологические анализы с белком A и иммуногистохимию (ИГХ).

В определенных вариантах осуществления антитела к GFRAL являются мечеными. Метки в качестве неограничивающих примеров включают, метки или составные группы, которые детектируются напрямую (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также компоненты, такие как ферменты или лиганды, которые детектируются опосредованно, например, путем ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Примеры меток в качестве неограничивающих примеров включают радиоактивные изотопы ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, и ¹³¹I, флуорофоры, такие как редкоземельные хелаты или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза светляков и бактериальная люцифераза (см., например, патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу, и глюкоза-6-фосфат дегидрогеназу, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, связанные с ферментом, который вырабатывает пероксид водорода для окисления предшественника краски, таким как HRP, лактопероксидазу, или микропероксидазу, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы, и тому подобное.

В определенных вариантах осуществления антитела к GFRAL иммобилизованы на нерастворимой матрице. Иммобилизация предполагает отделение антитела к GFRAL от любого GFRAL, который остается свободным в растворе. Отделение обычно проводят или путем нерастворимости антитела к GFRAL перед процедурой анализа, например, путем адсорбции на нерастворимой в воде матрице или поверхности (см., например, Bennich et al., U.S. 3720760), или путем ковалентной связи (например, с использованием глутаральдегидного перекрестного связывания), или путем нерастворимости антитела к GFRAL после образования комплекса между антителом к GFRAL и GFRAL, например, путем иммунопреципитации.

Любые из вышеописанных вариантов осуществления диагностики или детекции можно проводить с использованием иммуноконъюгата по настоящему изобретению вместо или в дополнение к антителу к GFRAL.

Анализы

Антитела к GFRAL по настоящему изобретению можно характеризовать по их физическим/химическим свойствам и/или видам биологической активности путем различных анализов, известных в данной области.

1. Анализы активности

В одном из аспектов, предлагаются анализы для выявления антител к GFRAL, имеющих биологическую активность. Биологическая активность может включать, например, анализы, которые измеряют воздействие на глюкозу и/или липидный метаболизм. Например, можно использовать анализ глюкозы в крови. Глюкозу в крови (например, в кусочке мышиного хвоста или в образце крови человека) можно измерять с использованием активных тестовых полосок ACCU-CHEK, которые читает ACCU-CHEK Active meter (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), по инструкциям производителя. Кроме того, например, можно использовать анализ липидного профиля. Цельную кровь (например, из кусочка мышиного хвоста или образца крови человека) можно собирать в плоские капиллярные трубки (BD Clay Adams SurePrep, Becton Dickenson и Co. Sparks, MD). Сыворотку и клетки крови можно разделять путем вращения трубок в Autocrit Ultra 3 (Becton Dickinson и Co. Sparks, MD). Образцы сыворотки можно оценивать на липидный профиль (триглицерид, общий холестерин, ЛПВП, и не-ЛПВП) с использованием анализатора Integra 400 Clinical (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) по инструкциям производителя.

2. Анализы связывания и другие анализы

В одном из аспектов, антитело к GFRAL тестируют на его антигенсвязывающую активность. Например, в определенных вариантах осуществления антитело к GFRAL тестируют на его способность связываться с экзогенным или эндогенным GFRAL, экспрессирующимся на поверхности клетки. Для такого исследования можно использовать анализ FACS.

Панель моноклональных антител, индуцированных против GFRAL, можно группировать в зависимости от эпитопов, которые они распознают, способом, известным как сортировка эпитопов. Сортировку эпитопов, как правило, проводят с использованием конкурентных анализов, которые оценивают способность антитела связываться с антигеном в присутствии другого антитела. В иллюстративном конкурентном анализе, иммобилизованный GFRAL инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с GFRAL и второе немеченое антитело, которое исследуют на его способность конкурировать с первым антителом за связывание с GFRAL. Второе антитело может присутствовать в гибридомном супернатанте. В качестве контроля, иммобилизованный GFRAL инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело без второго немеченого антитела. После инкубации в условиях, позволяющих связывание первого антитела с GFRAL, избыток несвязавшегося антитела удаляют, и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным GFRAL. Если количество метки, связанной с иммобилизованным GFRAL, по существу, уменьшилось в исследуемом образце по сравнению с контрольным образцом, это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с GFRAL. В определенных вариантах осуществления иммобилизованный GFRAL присутствует на поверхности клетки или в препарате мембраны, полученном из клетки, экспрессирующей GFRAL на своей поверхности.

Высокопроизводительные способы сортировки эпитопов также известны в данной области (см., например, Jia et al., J. Immunol. Methods 2004, 288(1-2):91-98, описывающую способ мультиплексной конкурентной сортировки антител для характеристики моноклональных антител; и Miller et al., J. Immunol. Methods 2011, 365(1-2):118-25, описывающую сортировку эпитопов мышиных моноклональных антител путем мультиплексного анализа спаривания).

3. Картирование эпитопов

Картирование эпитопов представляет собой способ выявления участков связывания, или эпитопов антитела на антигене его белка-мишени (например, эпитопов антитела к GFRAL на GFRAL). Эпитопы антитела могут быть линейными эпитопами или конформационными эпитопами. Линейные эпитопы образованы непрерывной последовательностью аминокислот в белке. Конформационные эпитопы образованы аминокислотами, которые не являются соседними в белковой последовательности, но они объединяются при фолдинге белка в его трехмерной структуре.

В данной области известен ряд способов для картирования эпитопов антитела на антигенах белка-мишени. Эти способы включают способы мутагенеза, способы пептидного сканирования, способы дисплея, способы, включающие и масс-спектроскопию, и определение структуры.

Способ сайт-направленного мутагенеза включает направленный сайт-специфический мутагенез, в котором существенно важные аминокислоты идентифицируют путем систематического введения замен в последовательность белка, а затем определения влияния каждой замены на связывание антитела. Это можно производить путем «мутагенеза аланиновым сканированием», как описано, например, у Cunningham и Wells (1989) Science 244: 1081-1085, или некоторыми другими формами точечного мутагенеза аминокислотных остатков в человеческом GFRAL. Исследования с мутагенезом, однако, могут также выявить аминокислотные остатки, которые существенно важны для трехмерной структуры GFRAL в целом, но которые напрямую не вовлечены в контакты антитело-антиген, и, таким образом, могут быть необходимы другие способы для подтверждения функционального эпитопа, определенного с использованием этого способа.

Картирование при помощи мутагенеза методом «дробовика» использует всеобъемлющую библиотеку плазмид с мутациями для гена-мишени, где каждый клон в библиотеке несет уникальную аминокислотную мутацию, и библиотека целиком покрывает каждую аминокислоту в белке-мишени. Клоны, которые составляют мутационную библиотеку, в индивидуальном порядке располагаются в микропланшетах, экспресссируются в живых клетках млекопитающих, и тестируются на иммунореактивность с антителами, представляющими интерес. Аминокислоты, важные для эпитопов антител, идентифицируют путем потери реактивности и затем картируют на структуру белка для визуализации эпитопов. За счет автоматизации анализа, новые эпитопные карты можно получать в промежутке от суток до недель. Поскольку способ использует нативную структуру белков в клетках млекопитающих, способ позволяет картировать и линейные, и конформационные эпитопные структуры на сложные белки. (См., например, Paes et al., J. Am. Chem. Soc. 131(20): 6952-6954 (2009); Banik и Doranz, Genetic Engineering и Biotechnology News 3(2): 25-28 (2010)).

Эпитоп, связывающийся с антителом к GFRAL, можно также определять с использованием способов пептидного сканирования. При пептидном сканировании, библиотеки коротких пептидных последовательностей из перекрывающихся сегментов белка-мишени, GFRAL, тестируют на их способность связываться с интересующими антителами. Пептиды синтезируют и тестируют на связывание, например, с использованием ELISA или BIACORE, или на чипе путем любого из множества способов для твердофазного скрининга (см., например, Reineke et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12: 59-64, 2001), как в способах «pepscan» (см., например, WO 84/03564; WO 93/09872). Такие способы скрининга пептидов могут быть неспособны выявлять некоторые прерывистые функциональные эпитопы, т.е. функциональные эпитопы, которые содержат аминокислотные остатки, не являющиеся смежными в первичной последовательности полипептидной цепи GFRAL.

Недавно разработанную технологию под названием CLIPS (химическое связывание пептидов на остовах) можно использовать для картирования конформационных эпитопов. Свободные концы пептидов прикрепляют на синтетические остовы, таким образом,что прикрепленный пептид может спобен принимать такую же пространственную структуру, как и соответствующая последовательность в интактном белке. Технологию CLIPS применяют для фиксации линейных пептидов в циклические структуры (формат «одна петля»), и объединения различных частей участка связывания белка («двойная петля», «тройная петля», и тому подобный формат), таким образом, чтобы создать конформационные эпитопы, которые можно оценивать на связывание с антителом (см., например, патент США № 7972993).

Эпитопы, связывающиеся с антителом к GFRAL, можно также картировать с использованием способов дисплея, в том числе, например, фагового дисплея, микробного дисплея, и дисплея рибосома/мРНК, как описано выше. В эти способах, библиотеки пептидных фрагментов расположены на поврехности фага или клетки. Эпитопы затем картируют путем скрининга антител против этих фрагментов с использованием селективных анализов связывания. Был разработан ряд вычислительных средств, которые позволяют предсказывать конформационные эпитопы в зависимости от выбранных по аффинности линейных пептидов, полученных с использованием фагового дисплея (см., например, Mayrose et al., Bioinformatics 23: 3244-3246, 2007). Также доступны способы для детекции конформационных эпитопов при помощи фагового дисплея. Системы микробных дисплеев также можно использовать для экспрессии надлежащим образом свернутых антигенных фрагментов на клеточной поверхности для выявления конформационных эпитопов (см., например, Cochran et al., J. Immunol. Meth. 287: 147-158, 2004; Rockberg et al., Nature Methods 5: 1039-1045, 2008).

Для определения эпитопов антитела также можно использовать способы, включающие протеолиз и масс-спектроскопию (см., например, Baerga-Ortiz et al., Protein Sci. 2002 June; 11(6): 1300-1308). В ограниченном протеолизе, антиген расзепляют различными протеазами, в присутствии и в отсутствие антитела, и фрагменты идентифицируют масс-спектрометрией. Эпитоп представляет собой область антигена, которая будет защищена от протеаз после связывания с антителом (см., например, Suckau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9848-9852, 1990). Дополнительные способы на основе протеолиза включают, например, избирательную химическую модификацию (см., например, Fiedler et al., Bioconjugate Chemistry 1998, 9(2): 236-234, 1998), вырезание эпитопа (см., например, Van de Вода et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 1997, 85(3): 229-235, 1997), и недавно разработанный способ водород-дейтериевого (H/D) обмена (см., например, Flanagan, N., Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2): 25-28, 2010).

Эпитоп, связывающийся с антителом к GFRAL, можно также определять с использованием структурных способов, таких как рентгенографическое определение кристаллической структуры (см., например, WO 2005/044853), молекулярное моделирование и спектроскопия с ядерным магнитным резонансом (ЯМР), в том числе определение путем ЯМР скоростей обмена H-D в лабильных амидных водородах, когда они свободны и когда связаны в комплекс с интересующим антителом (см., например, Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884-6891).

Дополнительные антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитело к GFRAL по настоящему изобретению, можно получать, например, путем скрининга антител, индуцированных против GFRAL или для связывания с эпитопом, путем иммунизации животного пептидом, содержащим фрагмент человеческого GFRAL с эпитопной последовательностью, или путем отбора антител с использованием фагового дисплея по связыванию с эпитопной последовательностью. Можно ожидать, что антитела, которые связываются с тем же функциональным эпитопом, демонстрируют сходные виды биологической активности, такие как блокирование биологической активности GFRAL, и такие активности можно подтверждать функциональными анализами антител.

4. Дополнительные анализы активности

В одном из вариантов осуществления антитело к GFRAL по настоящему изобретению представляет собой антагонистическое антитело, которое ингибирует биологическую активность GFRAL. Антитела к GFRAL по настоящему изобретению можно оценивать, чтобы определить, ингибируют ли они биологическую активность GFRAL.

В одном из аспектов, очищенные антитела к GFRAL можно дополнительно характеризовать путем серии анализов, включая в качестве неограничивающих примеров, N-концевое секвенирование, аминокислотный анализ, неденатурирующую гель-фильтрационную высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), масс-спектрометрию, ионообменную хроматографию и расщепление папаином.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение рассматривает измененное антитело, которое обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, которые делают его желательным кандидатом для множества применений, в которых время полужизни антитела in vivo важно, в то же время определенные эффекторные функции (такие как комплемент и ADCC) необязательны или вредны. В определенных вариантах осуществления измеряют Fc-активности антитела, чтобы убедиться, что сохранены только желаемые свойства. Можно проводить анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo, чтобы подтвердить снижение/удаление активностей CDC и/или ADCC. Например, можно проводить анализы связывания с Fc-рецептором (FcR), чтобы убедиться, что антитело утратило связывание с FcγR (таким образом, вероятно, утратило активность ADCC), но сохранило способность связываться с FcRn. Анализ для оценки активности ADCC интересующей молекулы in vitro описан, например, в патенте США № 5500362 или 5821337. Подходящие эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и клетки-естественные киллеры (NK). Альтернативно, или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы можно оценивать in vivo, например, на модели на животных, такой как описанная у Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Можно также проводить анализы связывания C1q, чтобы подтвердить, что антитело неспособно связываться с C1q и, таким образом, утратило активность CDC. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Определения связывания с FcRn и клиренса/времени полужизни in vivo можно также проводить с использованием известных в данной области способов.

Хотя вышеуказанное настоящее изобретение было описано в некоторых подробностях путем иллюстрации и примера с целью облегчить понимание, описания и примеры не предназначены для ограничения объема по настоящему изобретению. Описания всех патентов и научной литературы, процитированные в настоящем документе, несомненно включены в полном объеме посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

Далее следуют примеры способов и композиций по настоящему изобретению.

ПРИМЕР 1: СОЗДАНИЕ АНТИТЕЛ

Антитела к белку GFRAL получали, например, путем иммунизации мышей клетками, экспрессирующими белок GFRAL, совместно экспрессирующими белок RET и белок GFRAL, или перекрестно связывающими белок GDF15 на клетках, совместно экспрессирующих белок RET и белок GFRAL. Мышей также иммунизировали GFRAL ECD, комплексом GDF15:GFRAL ECD и/или комплексом слитый белок GFRAL ECD-Fc/слитый белок RET EC-Fc.

Например, клетки, применяемые для иммунизаций, получали следующим образом. Клетки 293EXPI (Invitrogen) временно трансфицировали последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими белок GFRAL (SEQ ID NO:1797), или совместно трансфицировали последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими белок GFRAL и белок RET (SEQ ID NO:1797 и 1813). Клетки анализировали на экспрессию GFRAL и RET при помощи соответствующих специфических антител путем FACS. Клетки отмывали 2 раза в PBS, осаждали посредством центрифугирования и получали препараты мембран. Животных 129/B6 или NZBW иммунизировали препаратами мембран с адъювантами. Животных повторно иммунизировали для индуцирования подходящего титра. Титры определяли путем ELISA и/или FACS. Отдельные клеточные суспензии лимфоцитов получали из селезенки и дренирующих лимфоузлов животных с подходящими титрами. Клетки сливали с миеломными клетками SP2/0 в соотношении 1:12 путем электрослияния. Слитые клетки высевали в планшеты в присутствии селекционной среды HAT. Через 10-14 суток культивирования, супернатанты собирали и подвергали скринингу путем визуализации клеток при помощи CellnSight с использованием клеток 293EXPI, сверхэкспрессирующих GFRAL, или GFRAL и RET, или путем ELISA с использованием белка GFRAL-Fc или Fc-гетеродимеров с RET и GFRAL для подтверждения связывания. Положительные клоны подвергали далее селекции и субклонированию.

В нескольких кампаниях иммунизаций и слияний был проведен скрининг более чем ста тысяч гибридомных клонов и более чем две тысячи клонов были выбраны по связыванию GDF15, передаче сигнала, индуцированного GDF15, на основе клеток и передаче сигнала, независимого от GDF15, на основе клеток. Сотни клонов (например, 250) выбирали для дополнительного исследования, включая анализы на аффинность связывания, картирование доменов и специфичность эпитопов. Тысячи гибридомных супернатантов были также исследованы в функциональных анализах, включая анализы агонистической и антагонистической активности. Сотни клонов очищали для дальнейшего исследования.

ПРИМЕР 2: СКРИНИНГ И ОТБОР АНТИТЕЛ

После двух недель культивирования, гибридомные супернатанты подвергали скринингу на связывание моноклональных антител с белком GFRAL при помощи визуализации клеток путем CellnSight с использованием клеток 293EXPI, сверхэкспрессирующих GFRAL, или GFRAL и RET, или путем ELISA с использованием белка GFRAL-Fc или Fc-гетеродимеров RET и GFRAL. В кратком изложении, в скрининге при помощи визуализации клеток, клетки 293EXPI временно трансфицировали последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими GFRAL, или совместно трансфицировали последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими GFRAL и RET. Трансфицированные клетки высевали на 384-луночные планшеты с прозрачным дном. Среду заменяли через 24 часа после трансфекции. Через 48 часов, удаляли среду из планшетов, добавляли к лункам гибридомные супернатанты и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем добавляли в лунки антитело A647 к мышиному Fc и инкубировали при комнатной температуре еще 30 минут. Клетки, положительные по Dapi, анализировали по сигналу в канале A647, и положительный сигнал A647 указывал на агенты, связывающие GFRAL.

В кратком изложении, в скрининге путем ELISA, белок GFRAL-Fc или Fc-гетеродимеры RET и GFRAL захватывали реагентами против человеческого Fc, которыми были покрыты планшеты для ELISA. Планшеты блокировали с использованием PBS/1%BSA. В лунки добавляли 15 мкл гибридомных супернатантов и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трех промывок, 15 мкл вторичного антитела против мышиного Fc, конъюгированного с HRP, добавляли в лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трех промывок, использовали 15 мкл TMB для проявки планшетов. Положительный сигнал указывал на агенты, связывающие GFRAL.

Из этих анализов, тысячи антител были идентифицированы как связывающие средства для GFRAL. Эти антитела подвергали дополнительному исследованию, которое включало оценку аффинности связывания, картирование доменов, специфичность эпитопов, и агонистическую и антагонистическую функцию. Сотни антител очищали для дальнейшего исследования.

Кроме того, измеряли аффинность связывания антител с человеческим и мышиным GFRAL. Например, антитела были выстроены в ряд на основании их аффинности связывания с человеческим GFRAL и мышиным GFRAL путем измерения K_D с низким разрешением при помощи Биакор. В кратком изложении, антитело против мышиного Fc (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) было иммобилизовано во всех четырех проточных ячейках на чипе CM5 с использованием аминсвязывающих реагентов (GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ). Очищенные антитела захватывались (~100 УЕ) на проточных ячейках 2, 3 и 4 с использованием проточной ячейки 1 в качестве ссылочной. Затем следовала инъекция человеческого или мышиного GFRAL (25 нМ в буфере PBS-P) со скоростью потока 70 мкл/мин и мониторинг кинетики связывания при 25°C.

Измерения аффинности связывания также проводили в дополнительных анализах на основе Биакор. Например, проводили измерения равновесной константы диссоциации (K_D) с очищенными антителами для оценки их связывания с человеческим GFRAL или мышиным GFRAL. Как указано выше, антитело против мышиного Fc (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) было иммобилизовано во всех четырех проточных ячейках на чипе CM5 с использованием аминсвязывающих реагентов (GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ). Очищенные антитела захватывались (~100 УЕ) на проточных ячейках 2, 3 и 4 с использованием проточной ячейки 1 в качестве ссылочной. Затем следовала инъекция человеческого или мышиного GFRAL в буфере PBS-P со скоростью потока 70 мкл/мин, и кинетику связывания оценивали при 25°C.

Типичные результаты для аффинности связывания (например, K_D (нМ)) с человеческим и мышиным GFRAL показаны в таблице 26 ниже. Кроме того, типичные результаты для скорости диссоциации связывания (например, K_off (1/s)) показаны в таблице 26 ниже для иллюстративных антител.

Таблица 26.

NA=не применяли; ND=связывание не выявлено.

Для иллюстративных антител 1C1 и 3P10, аффинность присутствует, в основном, за счет очень медленной скорости диссоциации (см., например, ФИГ.3). Антитела, которые связываются с GFRAL, как показано в таблице 26 выше, не распознают (например, не связываются с) GNFR альфа 1, наиболее близкородственным гомологом GFRAL.

ПРИМЕР 3: ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ

Созданные антитела к GFRAL, например, такие как описано в примере 1, тестировали на их функциональную активность в репортерных анализах на основе клеток.

Например, репортерные анализы с ELK1-люциферазой, которые измеряют индуцированную человеческим GDF15 (hGDF15) передачу сигнала через человеческие GFRAL/RET, проводили с использованием временно трансфицированных HEK293T. Трансфицирующие плазмиды состояли из двух репортерных плазмид, Gal4-Elk1 и 5×UAS-Luc (Agilent Technologies PathDetect Elk1 транс-репортерная система, кат. № 219005), и плазмид, кодирующих человеческий GFRAL (hGFRAL), GFRAL яванского макака GFRAL (cynoGFRAL), мышиный GFRAL (mGFRAL), или крысиный GFRAL (rGFRAL), и человеческий RET (hRET), RET яванского макака (cynoRET), мышиный RET (mRET) или крысиный RET (rRET). В этих анализах, hGDF15-индуцированная активация рекомбинантно экспрессированного рецепторного комплекса GFRAL/RET в клетках запускает трансдукцию внутриклеточного сигнала, которая приводит к фосфорилированию ERK, а затем и Elk1. После фосфорилирования Gal4-Elk1, Gal4-Elk1 связывается с промоторной областью 5×UAS и запускает транскрипцию репортерного гена люциферазы. Активность люциферазы затем измеряют в ферментативных анализах с люциферазой.

Характерные результаты для ингибирования антителами к GFRAL передачи сигнала человеческим GFRAL/RET показаны в таблице 27 ниже.

Таблица 27

ND=блокирование не выявлено в анализе

NP=анализ не проводили

WB=в анализе выявлено слабое блокирование.

Для некоторых экспериментов, вышеупомянутыми четырьмя плазмидами (например, двумя репортерными плазмидами, GFRAL, RET) трансфицировали свежесобранные клетки в суспензии с использованием реагента для трансфекции FuGene6 (Promega). Соотношение ДНК GFRAL и RET в трансфекции было оптимизировано для каждой пары рецепторов из указанных видов и варьировало от 12:1 до 60:1. Трансфицированные клетки высевали в 384-луночный планшет (7500 клеток/25 мкл/лунку) в обычную среду для выращивания. После инкубации в течение ночи при 37°C, добавляли смесь серийных разведений антитела и hGDF15 с фиксированной концентрацией. После 6 часов инкубации при 37°C с антителами, добавляли равный объем реагента Bright-Glo (Promega) и считывали сигнал люминесценции с использованием ридера Enspire (Perkin Elmer).

Одновременное добавление антител, противодействующих эффекту hGDF15, блокировало передачу сигнала hGDF15 дозо-зависимым образом, предотвращая экспрессию репортерного гена люциферазы.

ПРИМЕР 4: ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ

Антитела к hGFRAL тестировали на их антагонистическую активность к hGDF15 в дополнительном анализе на основе клеток, таком как анализ U2OS, стабильно экспрессирующих hGFRAL и hRET. За сутки до анализа, клетки высевали в 90 мкл DiscoveRx Assay Complete Cell Plating 16 Reagent (DiscoveRx, кат. № 93-0563R16B) по 20000/каждую лунку 96-луночного планшета. Через сутки клетки обрабатывали смесью серийных разведений антитела и hGDF15 с фиксированной концентрацией в течение 10 минут при 37°C. Использовали набор для анализа Cis-bio Cellul'erk (кат. № 64ERKPEH) для анализа уровня фосфорилирования ERK согласно протоколу производителя. Аналогично репортерному анализу с Hek293T и Elk1, антагонистические антитела к hGDF15 были способны предотвращать hGDF15-индуцированное фосфорилирование дозо-зависимым образом.

Типичные результаты для антител к GFRAL, предотвращающих hGDF15-индуцированное фосфорилирование, показаны в таблице 28 ниже.

Таблица 28

NP=анализ не проводили.

ПРИМЕР 5: КОНКУРЕНЦИЯ ЛИГАНДОВ, КАРТИРОВАНИЕ ДОМЕНОВ И СОРТИРОВКА ЭПИТОПОВ

Антитела, которые выбирали по связыванию с GFRAL, оценивали в анализах связывания с конкуренцией лигандов, и экспериментах с доменами и сортировкой эпитопов.

В кратком изложении, анализы связывания с конкуренцией лигандов проводили путем захвата белка GFRAL-Fc или Fc-гетеродимеров RET и GFRAL на планшеты для ELISA при помощи антитела к человеческому Fc. Планшеты блокировали с использованием PBS/1%BSA. 15 мкл титруемой дозы антитела добавляли к лункам, начиная с 10 мкг/мл с 3× разведением, и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Без отмывания, добавляли биотинилированный GDF15 (лиганд GFRAL) в лунки на дополнительный один час. После трех промывок, 15 мкл вторичного антитела с HRP-стрептавидином добавляли к лункам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трех промывок, использовали 15 мкл TMB для проявки планшетов. Положительный сигнал указывал на то, что биотинилированный GDF15 все еще связывается с GFRAL, захваченным на планшете, и антитело не конкурирует с лигандом. Отрицательный сигнал указывает на то, что биотинилированный GDF15 больше не связывается с GFRAL, захваченным на планшете, и антитело конкурирует с лигандом.

В кратком изложении, анализы картирования доменов проводили путем временной трансфекции клеток 293EXPI последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими GFRAL (SEQ, GFRAL домен 1, GFRAL домен 2, GFRAL домен 1+2, GFRAL домен 1+3, GFRAL домен 2+3, или GFRAL домен 3).

Тестировали семь делеционных конструкций GFRAL (конструкции от 1 до 7), которые включают следующие отличительные черты непрерывно от N-конца к C-концу: сигнальная последовательность IgK (показана прописными буквами и подчеркнута в последовательностях далее), последовательность метки FLAG (показана прописными буквами и курсивом в последовательностях далее) и последовательности белка GFRAL с различными комбинациями внеклеточного домена (домен 1 показан заглавными буквами жирным шрифтом; домен 2 показан подчеркнутыми заглавными буквами; домен 3 показан подчеркнутыми буквами жирным шрифтом). Конструкция 1 (IgK-2Flag-GFRAL; SEQ ID NO:1817) содержала полипептид человеческого GDF15 (остатки с Q20 по L394), в котором присутствуют домены 1, 2 и 3. Конструкция 2 (IgK-2Flag-GFRAL домен 1; SEQ ID NO:1818) содержала GFRAL-ΔD2,ΔD3 (остатки от Q20 до S130 и от F317 до L394), в которой удалены домены 2 и 3. Конструкция 3 (IgK-2Flag-GFRAL домен 2; SEQ ID NO:1819) содержала GFRAL-ΔD1,ΔD3 (остатки от S121 до C210 и от F317 до L394), в которой удалены домены 1 и 3. Конструкция 4 (IgK-2Flag-GFRAL домен 1+2; SEQ ID NO:1820) содержала GFRAL-ΔD3 (остатки от Q20 до C210 и от F317 до L394), в которой удален домен 3. Конструкция 5 (IgK-2Flag-GFRAL домен 1+3; SEQ ID NO:1821) содержала GFRAL-ΔD2 (остатки от Q20 до S130 и от C220 до L394), в которой удален домен 2. Конструкция 6 (IgK-2Flag-GFRAL домен 2+3; SEQ ID NO:1822) содержала GFRAL-ΔD1 (остатки от S121 до L394), в которой удален домен 1. Конструкция 7 (IgK-2Flag-GFRAL домен 3; SEQ ID NO:1823) содержала GFRAL-ΔD1,ΔD2 (остатки от A211 до L394), в которой удалены домены 2 и 3.

Конструкция 1 (IgK-2Flag-GFRAL; SEQ ID NO:1817)

mdmrvpaqllgllllwlrgarcdykddddksaggdykddddkggQTNNCTYLREQCLRDANGCKHA WRVMEDACNDSDPGDPCKMRNSSYCNLSIQYLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNKLLGK KCINKSDNVKEDKFKWNLTTRSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACS ANGNPCDLKQCQAAIRFFYQNIPFNIAQMLAFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCAVNMV PPPTCLSVIRSCQNDELCRRHYRTFQSKCWQRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDC KAAYIDILGTVLQVQCTCRTITQSEESLCKIFQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRK HANKITLTGFHSPFNGEVIYAAMCMTVTCGILLLVMVKLRTSRISSKARDPSSIQIPGEL

Конструкция 2 (IgK-2Flag-GFRAL домен 1; SEQ ID NO:1818)

mdmrvpaqllgllllwlrgarc dykddddksaggdykddddkgg QTNNCTYLREQCLRDANGCKH AWRVMEDACNDSDPGDPCKMRNSSYCNLSIQYLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNK LLGKKCINKSDNVKEDKFKWNLTTRSHHGFKGMWSFNYPTLSNVKGMALYTRKHA NKITLTGFHSPFNGEVIYAAMCMTVTCGILLLVMVKLRTSRISSKARDPSSIQIPGEL

Конструкция 3 (IgK-2Flag-GFRAL домен 2; SEQ ID NO:1819)

mdmrvpaqllgllllwlrgarc dykddddksaggdykddddkggSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDV VCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQCQAAIRFFYQNIPFNIAQMLAFCDCAQSDIPCQQS KEALHSKTCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSPFNGEVIYAAMCMTVTCGIL LLVMVKLRTSRISSKARDPSSIQIPGEL

Конструкция 4 (IgK-2Flag-GFRAL домены 1+2; SEQ ID NO:1820)

mdmrvpaqllgllllwlrgarcdykddddksaggdykddddkggQTNNCTYLREQCLRDANGCKHA WRVMEDACNDSDPGDPCKMRNSSYCNLSIQYLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNKLLGK KCINKSDNVKEDKFKWNLTTRSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACS ANGNPCDLKQCQAAIRFFYQNIPFNIAQMLAFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCFNYPTL SNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSPFNGEVIYAAMCMTVTCGILLLVMVKLRTSRISSK ARDPSSIQIPGEL

Конструкция 5 (IgK-2Flag-GFRAL домены 1+3; SEQ ID NO:1821)

mdmrvpaqllgllllwlrgarc dykddddksaggdykddddkgg QTNNCTYLREQCLRDANGCKH AWRVMEDACNDSDPGDPCKMRNSSYCNLSIQYLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNK LLGKKCINKSDNVKEDKFKWNLTTRSHHGFKGMWSCLSVIRSCQNDELCRRHYR TFQSKCWQRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQVQCTCR TITQSEESLCKIFQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSPFNGEVI YAAMCMTVTCGILLLVMVKLRTSRISSKARDPSSIQIPGEL

Конструкция 6 (IgK-2Flag-GFRAL домен 2+3; SEQ ID NO:1822)

mdmrvpaqllgllllwlrgarc dykddddksaggdykddddkggSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDV VCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQCQAAIRFFYQNIPFNIAQMLAFCDCAQSDIPCQQS KEALHSKTCAVNMVPPPTCLSVIRSCQNDELCRRHYRTFQSKCWQRVTRKCHEDEN CISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQVQCTCRTITQSEESLCKIFQHMLHRK SCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSPFNGEVIYAAMCMTVTCGILLLVMVK LRTSRISSKARDPSSIQIPGEL

Конструкция 7 (IgK-2Flag-GFRAL домен 3; SEQ ID NO:1823)

mdmrvpaqllgllllwlrgarc dykddddksaggdykddddkggAVNMVPPPTCLSVIRSCQNDELC RRHYRTFQSKCWQRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQV QCTCRTITQSEESLCKIFQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKITLTGFHSP FNGEVIYAAMCMTVTCGILLLVMVKLRTSRISSKARDPSSIQIPGEL

Клетки инкубировали с 1 мкг/мл антитела в течение 30 минут при 4°C. После отмывания, клетки инкубировали с вторичным антителом A488 или A647 к мышиному Fc, меченому флуорохромом, 30 минут при 4°C. После отмывания, клетки анализировали путем FACs. Положительный сигнал указывает на то, что антитело связывается с доменом, сверхэкспрессированным трансфицированными клетками 293EXPI. Отрицательный сигнал указывает на то, что антитело не связывается с доменом, сверхэкспрессированным трансфицированными клетками 293EXPI.

В кратком изложении, анализы сортировки эпитопов проводили при помощи планшетов непосредственно покрытых 2 мкг/мл антитела (mAb1). Планшеты блокировали с использованием PBS/1%BSA. 2 мкг/мл антитела (mAb2) предварительно инкубировали с 50нг/мл белка GFRAL-Fc в течение 30 минут перед добавлением в лунки при комнатной температуре в течение 1 часа. После трех промывок, 15 мкл вторичного антитела к человеческому Fc с HRP добавляли к лункам и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После трех промывок, использовали 15 мкл TMB для проявки планшетов. Положительный сигнал указывал на то, что белок GFRAL-Fc все еще связывается с захваченным на планшете антителом (mAb1), и антитело (mAb2) находится не в той же самой эпитопной группе, что и захваченное антитело (mAb1). Отрицательный сигнал указывает на то, что белок GFRAL-Fc белок больше не связывается с захваченным на планшете антителом (mAb1), и антитело (mAb2) находится в той же самой эпитопной группе, что и захваченное антитело (mAb1).

Типичные результаты для ингибирования связывания GDF15 с GFRAL, картирования доменов GFRAL и сортировки эпитопов показаны в таблице 29 ниже.

Таблица 29

NA=не применяли; ND=не выявлено связывания.

Как показано выше в таблице 29, по меньшей мере, были идентифицированы три класса антител к GFRAL, включая антитела, которые блокировали связывание GDF15 (например, конкурентные антагонисты), антитела, которые не блокировали связывание GDF15 (например, неконкурентные антагонисты), и частичные блокаторы связывания GDF15. Антитела были также идентифицированы по связыванию с доменом 1, доменом 2 или доменом 3 GFRAL. Было обнаружено, что антитела, которые связывались с доменом 2, или ингибируют связывание GDF15 с GFRAL или, по меньшей мере, частично ингибируют это связывание. Антитела, которые связывались с доменами 1 или 3 не ингибируют связывание GDF15 с GFRAL.

Выравнивание иллюстративных антител к GFRAL, которые оценивались в примерах 2-4 и описаны выше, показаны на ФИГ.4A-4B.

Выравнивания доменов VH и VL для антител, которые связывались с доменом 1, доменом 2 или доменом 3, показаны на ФИГ.5A-5F, соответственно.

ПРИМЕР 6: ГУМАНИЗАЦИЯ

Гуманизированные антитела к GFRAL получали, в том числе из антител, отобранных, как описано в примерах 1-5. Иллюстративные гуманизированные антитела получают с одной или несколькими CDR из таблиц 1-24, включая, например, CDR для антитела, обозначенного 1C1 (см., например, таблицу 1), для антитела, обозначенного 25M22 (см., например, таблицу 8), для антитела, обозначенного 17J16 (см., например, таблицу 7), для антитела, обозначенного 5F12 (см., например, таблицу 4), и для антитела, обозначенного 3P10 (см., например, таблицу 2). Последовательности областей VH и VL для иллюстративных гуманизированных антител 1C1, 25M22, 17J16, 5F12 и 3P10 показаны на ФИГ.6A-6B, 7A-7B, 8A-8B, 9A-9B, и 10A-10B.

Ряд антител к GFRAL выбирали для секвенирования и затем для гуманизации. Поиск blastp в NCBI для последовательностей иммуноглобулинов (Ig) проводили для выявления последовательностей зародышевой линии человека со значительным сходством с мышиными последовательностями VH и VL. Примеры потенциальных каркасных последовательностей человека приведены в таблице 30. Учитывая сходство последовательностей, биофизические свойства и потенциальную иммуногенность, в качестве человеческих каркасных последовательностей были выбраны последовательности зародышевой линии для IGH и IGK. Последовательности зародышевой линии, которые были выбраны, выделены жирным шрифтом в таблице 30. Для того чтобы выявить наилучшим образом совпадающую последовательность каркаса 4, аналогичный подход был использован для выбора последовательностей JH и JK зародышевой линии, и эти выбранные последовательности также выделены жирным шрифтом в таблице 30.

Таблица 30

Последовательности CDR мышиных антител затем перенесли (например, пересадили) в соответствующие положения человеческого IGH и IGK и добавили остатки J-области, соответствующие Каркасу 4. Полученную последовательность белка транслировали обратно в последовательность ДНК, проводили оптимизацию кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих и синтезировали (GeneArt/LifeTechnologies). Затем, синтезированный фрагмент ДНК клонировали с использованием технологии In-Fusion (Clontech) в вектор pTT5 (NRC Biotechnology Research Institute) для создания готовых к экспрессии конструкций, которые содержали последовательность Козак, сигнальный пептид hIgK с последующей гуманизированной вариабельной областью желаемого антитела плюс константную область антитела (hIgG1/hIgK). Одновременно отдельные остатки в каркасных областях выбирали для обратной мутации в мышиные остатки для того чтобы сохранить аффинности связывания. Особое внимание было уделено остаткам зоны Вернье. Такие варианты были созданы или путем сайт-направленного мутагенеза (QuickChange, Agilent) или путем синтеза ДНК de-novo. Такие экспрессирующие конструкции затем использовали для временной экспрессии белка в клетках Expi293 (Thermo Fischer), секретируемые антитела очищали от супернатанта тканевой культуры и исследовали на аффинности связывания. Для того чтобы оптимизировать аффинность связывания при наименьшем числе необходимых обратных мутаций, проводили, как правило, второй раунд разработки конструкций с последующей экспрессией антитела, очисткой и оценкой аффинностей связывания.

Примеры гуманизированных антител к GFRAL включают антитело, содержащее: VH, которая представляет собой SEQ ID NO:1982 (HC-344e), и VL, которая представляет собой SEQ ID NO:1997 (LC-344h), VH, которая представляет собой SEQ ID NO:1978 (HC-344a), и VL, которая представляет собой SEQ ID NO:1992 (LC-344c); VH, которая представляет собой SEQ ID NO:1978 (HC-344a), и VL, которая представляет собой SEQ ID NO:1997 (LC-344h); VH, которая представляет собой SEQ ID NO:1985 (HC-344h), и VL, которая представляет собой SEQ ID NO:1997 (LC-344h); VH, которая представляет собой SEQ ID NO:1961 (HC-375d), и VL, которая представляет собой SEQ ID NO:1976 (LC-375j); VH, которая представляет собой SEQ ID NO:1962 (HC-375e), и VL, которая представляет собой SEQ ID NO:1976 (LC-375j); VH, которая представляет собой SEQ ID NO:1964 (HC-375g), и VL, которая представляет собой SEQ ID NO:1967 (LC-375a); или VH, которая представляет собой SEQ ID NO:1964 (HC-375g) и VL, которая представляет собой SEQ ID NO:1976 (LC-375j).

ПРИМЕР 7: ОТБОР ГУМАНИЗИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ

Примеры гуманизированных антител к GFRAL, идентифицированные в Примере 6, оценивали на их аффинность связывания с человеческим GFRAL. Измерения аффинности связывания проводили в анализах на основе Биакор. Например, измерения равновесной константы диссоциации (K_D) проводили с очищенными антителами для оценки их связывания с человеческим GFRAL. С использованием способов, описанных в примере II, антитело против мышиного Fc (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) было иммобилизовано во всех четырех проточных ячейках на чипе CM5 с использованием аминсвязывающих реагентов (GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ). Очищенные гуманизированные антитела к GFRAL захватывались (~100 УЕ) на проточных ячейках 2, 3 и 4 с использованием проточной ячейки 1 в качестве ссылочной. Затем следовала инъекция человеческого GFRAL в буфере PBS-P со скоростью потока 70 мкл/мин, и кинетику связывания оценивали при 25°C.

Типичные результаты для аффинности связывания (например, K_D (нМ)) примеров гуманизированных антител к GFRAL (например, гуманизированного 3P10 и гуманизированного 5F12) с человеческим GFRAL показаны в таблицах 31 и 32 ниже.

Таблица 31

Таблица 32

ПРИМЕР 8: ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ ГУМАНИЗИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ

Примеры гуманизированных антител к GFRAL, описанные в примерах 6 и 7, тестировали на их функциональную активность в репортерных анализах на основе клеток, аналогичных тем, что описаны в примере 3.

Например, репортерные анализы с ELK1-люциферазой, которые измеряют индуцированную человеческим GDF15 (hGDF15) передачу сигнала через человеческие GFRAL/RET, проводили с использованием трансфицированных U20S и HEK293T. Трансфицирующие плазмиды состояли из двух репортерных плазмид, Gal4-Elk1 и 5×UAS-Luc (Agilent Technologies PathDetect Elk1 транс-репортерная система, кат. № 219005), и плазмид, кодирующих человеческий GFRAL (hGFRAL) и человеческий RET (hRET). В этих анализах, hGDF15-индуцированная активация рекомбинантно экспрессированного рецепторного комплекса GFRAL/RET в клетках запускает трансдукцию внутриклеточного сигнала, которая приводит к фосфорилированию ERK, а затем и Elk1. После фосфорилирования Gal4-Elk1, Gal4-Elk1 связывается с промоторной областью 5×UAS и запускает транскрипцию репортерного гена люциферазы. Активность люциферазы затем измеряют в ферментативных анализах с люциферазой.

Типичные результаты для ингибирования примерами гуманизированных антител к GFRAL (например, 3P10 и 5F12) передачи сигнала человеческим GFRAL/RET показаны в таблице 33 и 34 ниже и на ФИГ.11.

Таблица 33

Таблица 34

Для некоторых экспериментов, вышеупомянутыми четырьмя плазмидами (например, двумя репортерными плазмидами, GFRAL, RET) трансфицировали свежесобранные клетки в суспензии с использованием реагента для трансфекции FuGene6 (Promega). Соотношение ДНК GFRAL и RET в трансфекции было оптимизировано для каждой пары рецепторов из указанных видов и варьировало от 12:1 до 60:1. Трансфицированные клетки высевали в 384-луночный планшет (7500 клеток/25 мкл/лунку) в обычную среду для выращивания. После инкубации в течение ночи при 37°C, добавляли смесь серийных разведений антитела и hGDF15 с фиксированной концентрацией. После 6 часов инкубации при 37°C с антителами, добавляли равный объем реагента Bright-Glo (Promega) и считывали сигнал люминесценции с использованием ридера Enspire (Perkin Elmer).

Одновременное добавление гуманизированных антител к GFRAL, противодействующих эффекту hGDF15, блокировало передачу сигнала hGDF15 дозо-зависимым образом, предотвращая экспрессию репортерного гена люциферазы.

ПРИМЕР 9: ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ ГУМАНИЗИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ

Примеры гуманизированных антител к hGFRAL тестировали на их антагонистическую активность к hGDF15 в дополнительном анализе на основе клеток, таком как анализ U2OS, стабильно экспрессирующих hGFRAL и hRET, как описано в примере 4. За сутки до анализа, клетки высевали в 90 мкл DiscoveRx Assay Complete Cell Plating 16 Reagent (DiscoveRx, кат. № 93-0563R16B) по 20000/каждую лунку 96-луночного планшета. Через сутки клетки обрабатывали смесью серийных разведений антитела и hGDF15 с фиксированной концентрацией в течение 10 минут при 37°C. Использовали набор для анализа Cis-bio Cellul'erk (кат. № 64ERKPEH) для анализа уровня фосфорилирования ERK согласно протоколу производителя.

Аналогично репортерному анализу с Hek293T и Elk1, описанному в примере 4, гуманизированные антитела к hGFRAL (например, гуманизированное 3P10) были способны предотвращать hGDF15-индуцированное фосфорилирование дозо-зависимым образом.

Типичные результаты для гуманизированных антител к GFRAL, предотвращающих hGDF15-индуцированное фосфорилирование, показаны в таблице 35 ниже и на ФИГ.12.

Таблица 35

В контрольном эксперименте, GFRα1 (связанный на поверхности чипа) показал связывание со своим природным лигандом GDNF (в растворе, 50 нМ) (см. ФИГ.13C).

Примеры гуманизированных антител к GFRAL (например, HC-344e+LC-344h) не связываются с рецептором GFRα1, но показали высокую аффинность связывания с hGFRAL (FIGS. 13A и 13B), что указывает на специфичность к GFRAL.

ПРИМЕР 10: ИССЛЕДОВАНИЯ НА ЖИВОТНЫХ

Эффекты антител к GFRAL оценивали в нескольких исследованиях на животных.

A: Антитела к GFRAL ингибируют индуцированную GDF15 потерю массы у мышей DIO (Кратковременное)

Чтобы определить, способно ли антитело к GFRAL нейтрализовать индуцированный GDF15 эффект снижения массы у мышей с ожирением, вызванным диетой (DIO), использовали самцов мышей C57BL/6J DIO в возрасте 17 недель (Jackson Labs West, Sacramento, CA). Мышам (41,3 г±0,4 г) случайным образом назначали получение иллюстративных антител к GFRAL (например, 1C1, 3P10, 17J16, 5A20, 25M22, 5F12, 8D8 и 12A3) или антител к GDF15 (например, 1MO3). В каждой группе было шесть мышей. Каждая группа лечения имела свою собственную контрольную группу с PBS. Доза антитела составила 20 мг/кг. Через сутки после инъекций или PBS, или антитела, мыши затем получали 3 последовательных ежедневных инъекции белка GDF15 (например, с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:1811) в дозе 0,5 мг/кг. Массу тела и потребление пищи записывали ежедневно (сутки 1-3 и сутки 7). Для взвешивания использовали весы Sartorius balance LE5201. Использовали автоматическую программу для записи веса (Sartorius YSW05 Software Wedge, Sartorius Mechatronics Corporation, 5 Orville Drive, Suite 200 Bohemia, NY 11716) для автоматического переноса данных по массе в электронную таблицу Microsoft Excel.

Данные представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего относительно измеренной массы тела, дельты изменений массы тела и процента изменения массы тела (т.е.,% дельты изменений массы тела по сравнению с исходной массой тела). Использовали критерий Стьюдента (двухсторонний, двухвыборочный). В этих экспериментах, P<0,05 считали статистически значимым.

Иллюстративные антитела к GFRAL, 1C1, 3P10, 17J16, 5A20, 25M22, 5F12, 8D8 и 12A3, были способны обращать вспять индуцированные GDF15 потерю массы тела и снижение потребления пищи (ФИГ.14A и 14B). Антитело к GDF15 также обращало вспять индуцированные GDF15 потерю массы тела и снижение потребления пищи у этой модели.

Чтобы определить неконкурентное антитело к GFRAL или конкурентное антитело к GFRAL блокирует экзогенный эффект снижения массы, индуцированный GDF15, дозозависимым образом, использовали самцов мышей C57BL/6J DIO в возрасте 19 недель. Исходно мышей (43,1 г±0,3 г) случайным образом распределяли в группы с PBS (8 мышей в группе) или с белком GDF15 (например, с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:1811) (0,1 мг/кг, 1,0 мг/кг, или 10 мг/кг, 24 мыши на группу). Было подтверждено, что белок GDF15 снижает массу тела и потребление пищи дозозависимым образом на следующие сутки. Кроме того, группы с обработкой GDF15 (0,1 мг/кг, 1,0 мг/кг, или 10 мг/кг) случайным образом распределяли для получения PBS, или иллюстративного антитела к GFRAL (например, 1C1 или 3P10) (8 мышей на группу). Массу тела и потребление пищи записывали ежедневно (сутки 1-3 и сутки 7).

Иллюстративные антитела к GFRAL обращали вспять индуцированные GDF15 потерю массы тела и снижение потребления пищи (ФИГ.15 и 16).

B: Антитела к GFRAL способствуют набору массы тела у мышей DIO (Хроническое)

Для того чтобы определить, способно ли иллюстративное антитело к GFRAL повышать массу тела независимо от экзогенного белка GDF15 у модели DIO, использовали самцов мышей C57BL/6J DIO в возрасте 14 недель (Jackson Labs West, Sacramento, CA). Мышей (34,5 г±0,8 г) случайным образом распределяли для получения или PBS, или иллюстративных антител к GFRAL (например, 1C1 или 3P10) по 10 мг/кг еженедельно. В каждой группе было 10 мышей. Массу тела и потребление пищи записывали ежедневно в течение 28 суток. Для взвешивания использовали весы Sartorius balance LE5201. Использовали автоматическую программу для записи веса (Sartorius YSW05 Software Wedge, Sartorius Mechatronics Corporation, 5 Orville Drive, Suite 200 Bohemia, NY 11716) для автоматического переноса данных по массе в электронную таблицу Microsoft Excel. Состав тела также оценивали при помощи EchoMRI.

Иллюстративные антитела к GFRAL повышают массу тела (на 6% и 7%, соответственно) и потребление пищи (на 3,4% и 3,7%, соответственно) у мышей DIO (ФИГ.17 и 18). Повышение массы тела идллюстративными антитела к GFRAL, в основном, относилось к повышению массы жировой ткани (ФИГ.19).

C: Антитела к GFRAL обращают вспять индуцированную GDF15 потерю массы тела у мышей DIO

Для того чтобы определить, способно ли иллюстративное антитело к GFRAL нейтрализовать индуцированный GDF15 эффект снижения массы у мышей DIO, использовали самцов мышей C57BL/6J DIO в возрасте 17 недель (Jackson Labs West, Sacramento, CA) и конструировали рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV), экспрессирующий GDF15.

Конструирование rAAV проводили следующим образом: наборы реагентов для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с высокоточной ДНК-полимеразой Phusion^® приобретали у New England BioLabs (F-530L, Ipswich, MA). Реакции ПЦР проводили согласно инструкции производителя. Амплифицированные фрагменты ДНК, содержащие сигнальный пептид Igk с последующей кодирующей последовательностью GDF15 расщепляли ферментами рестрикции SpeI и NotI (участки рестрикции были включены на 5'- или 3'-конце ПЦР-праймеров, соответственно) и затем лигировали с трансгенными AAV-векторами, которые были расщеплены этими же самыми ферментами рестрикции. Вектор, применяемый для экспрессии, содержал селектируемый маркер и экспрессирующую кассету, состоящую из сильного эукариотического промотора в положении 5' от вставки клонируемой кодирующей последовательности, с последующей 3'-нетранслируемой областью и хвостом полиаденилирования бычьего гормона роста.

Мышей DIO кормили диетой с высоким содержанием жиров (HFD) (Research Diets, каталожный № D12492NI). Диета с высоким содержанием жиров содержала 60 ккал% жира, 20 ккал% белка и 20 кккал% углевода. Мышам вводили однократно в хвостовую вену инъекцию вышеописанного rAAV или контрольного вектора AAV, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP). Через 42 для после инъекции rAAV, экспрессирующего GDF15, в количестве 1×10¹⁰, мышам вводили иллюстративное антитело к GFRAL (3P10) или контрольное антитело (антитело к KLH) в дозе 3 мг/кг. Было по 20 мышей на группу. Массу тела, массу жировой и нежировой ткани, потребление энергии и потребление пищи у мышей контролировали в течение 12 недель.

Как показано на ФИГ.20, иллюстративное антитело к GFRAL (3P10) обращало вспять индуцированную GDF15 потерю массы тела и потерю жировой и нежировой ткани у мышей DIO. Дополнительно, как показано на ФИГ.21, иллюстративное антитело к GFRAL обращало вспять индуцированное GDF15 повышение потребления энергии и индуцированное GDF15 снижение потребление пищи.

D: Антитела к GFRAL обращают вспять индуцированную GDF15 потерю массы тела у худых мышей (хроническое)

Для того чтобы определить, способно ли иллюстративное антитело к GFRAL нейтрализовать индуцированный GDF15 эффект снижения массы у худых мышей, использовали самцов мышей C57BL/6J в возрасте 15 недель (Jackson Labs West, Sacramento, CA). Мышей помещали на диету Chow. Как описано в примере 11, часть c, мышам вводили однократно в хвостовую вену инъекцию rAAV, экспрессирующего GDF15, в количестве 1×10¹⁰ или контрольного вектора AAV, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP). Через 28 дней после инъекции rAAV, экспрессирующим GDF15, мышам вводили иллюстративное антитело к GFRAL (3P10) или контрольное антитело (антитело к KLH) в дозе 3 мг/кг. Было по 20 мышей на группу. Массу тела, массу жировой и нежировой ткани, потребление энергии и потребление пищи у мышей контролировали в течение 12 недель.

Как показано на ФИГ.22, иллюстративное антитело к GFRAL обращало вспять индуцированную GDF15 потерю массы тела, что включало возвращение потери массы жировой ткани и потери массы нежировой ткани у худых мышей. Дополнительно, как показано на ФИГ.23, иллюстративное антитело к GFRAL обращало вспять индуцированное GDF15 изменение в дыхательном коэффициенте (RER) и индуцированное GDF15 снижение потребление пищи у худых мышей.

E: Антитела к GFRAL не повышают массу тела независимо от индуцированной GDF15 потери массы у худых мышей

Для того чтобы определить, способно ли иллюстративное антитело к GFRAL повышать массу тела независимо от экзогенного белка GDF15 у худых мышей, использовали самцов мышей C57BL/6J в возрасте 15 недель (Jackson Labs West, Sacramento, CA). Мышей (26,1 г ± 0,3 г) случайным образом распределяли для получения или PBS, или иллюстративного антитела к GFRAL (например, 1C1 или 3P10) по 10 мг/кг еженедельно. В каждой группе было 10 мышей. Массу тела и потребление пищи записывали ежедневно в течение первой недели, а потом раз в неделю в течение следующих трех недель. Для взвешивания использовали Sartorius balance LE5201.

Повторяющиеся дозы иллюстративного антитела к GFRAL 1C1 и 3P10 не изменяли значительно массу тела и потребление пищи у худых мышей, хотя антитело 3P10 показало слабую тенденцию к повышению массы тела (ФИГ.24 и 25).

F: Антитела к GFRAL обращают вспять потерю массы тела и повышенное потребление энергии у мышей с хронической почечной недостаточностью

Для того чтобы определить, способно ли иллюстративное антитело к GFRAL обратить вспять потерю массы тела и повышенное потребление энергии у мышей DIO с хронической почечной недостаточностью, использовали самцов мышей C57BL/6J в возрасте 15 недель (Jackson Labs West, Sacramento, CA). Через 5 недель на диете HFD+аденин (0,3% в индукционной фазе в течение 10 суток, затем снижение до 0,1% в поддерживающей фазе в течение следующих трех недель), мышей DIO (26,1 г±0,3 г) случайным образом распределяли для получения или контрольного антитела (анти-KLH) или иллюстративных антител к GFRAL (например, 3P10) по 1 мг/кг еженедельно. В каждой группе было 12 мышей. Массу тела записывали ежедневно в течение первой недели, а затем записывали раз в неделю в течение следующих восьми недель. Для взвешивания использовали Sartorius balance LE5201.

Как показано на ФИГ.26A, для того чтобы подтвердить эффект аденина на функцию почек, было показано, что 10-суточная обработка пищевым аденином (0,25% аденин с HFD) индуцировал повреждение почки у мышей. Пищевой аденин также повысил уровни GDF15 в сыворотке (см. ФИГ.26B) и способствовал потере массы (см. ФИГ.26C). Дополнительно, пищевой аденин повысил потребление энергии у мышей (см. ФИГ.27A).

Как показано на ФИГ.27B, иллюстративное антитело к GFRAL обращало вспять повышенное потребление энергии у мышей с хронической почечной недостаточностью. Дополнительно, как показано на ФИГ.28, иллюстративное антитело к GFRAL обращало вспять потерю массы тела и потерю жировой и нежировой ткани у мышей с хронической почечной недостаточностью.

G: Гуманизированные антитела к GFRAL ингибируют индуцированную GDF15 потерю массы дозозависимым образом

Для того чтобы определить, способно ли гуманизированное антитело к GFRAL нейтрализовать индуцированный GDF15 эффект снижения массы у мышей с ожирением, вызванным диетой (DIO), использовали самцов мышей C57BL/6J DIO в возрасте 17 недель (Jackson Labs West, Sacramento, CA). Исходно мыши (42 г ± 0,4 г) случайным образом распределяли в группы с PBS (8 мышей на группу) или белком GDF15 (56 мышей на группу). Было подтверждено, что белок GDF15 снижает массу тела и потребление пищи дозозависимо на следующие сутки. Кроме того, по 8 мышей на группу были случайным образом распределены для получения или носителя (анти-KLH) или иллюстративного мышиного антитела к GFRAL (например, m3P10) в дозе 1,0 мг/кг, или иллюстративного гуманизированного антитела к GFRAL (например, h3P10=HC-344e+LC-344h) в дозах 0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг, 1,0 мг/кг, 3 мг/кг или 10 мг/кг. Массу тела записывали ежедневно (сутки 1-7). Для взвешивания использовали Sartorius balance LE5201. Использовали автоматическую программу для записи веса (Sartorius YSW05 Software Wedge, Sartorius Mechatronics Corporation, 5 Orville Drive, Suite 200 Bohemia, NY 11716) для автоматического переноса данных по массе в электронную таблицу Microsoft Excel.

Данные представлены в виде среднего±стандартная ошибка среднего относительно дельты изменений массы тела. Использовали критерий Стьюдента (двухсторонний, двухвыборочный).

Иллюстративное гуманизированное антитело к GFRAL HC-344e+LC-344h способно ингибировать индуцированную GDF15 потерю массы тела дозозависимым образом (ФИГ.29).

ПРИМЕР 11: КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА КОМПЛЕКСА GFRAL/GDF15

A: Формирование комплекса и кристаллизация

Комплекс белка GFRAL и белка GDF15 получали путем смешивания 1,2-молярного избытка белка GFRAL (W115-E351) с одномолярной субъединицей белка GDF15 а (0,5 молярный GDF15, который является гомодимером двух субъединиц GDF15, соединенных парой дисульфидных связей). Комплекс очищали гель-фильтрационной хроматографией для удаления избытка GFRAL. Комплекс GFRAL/GDF15 был кристаллизован путем смешивания 1 мкл белка с концентрацией 5 мг/мл с 0,5 мкл резервуарного раствора и 0,5 мкл высевали в кристаллизационную каплю, с резервуарным раствором, содержащим 1,0 мл 0,1 M Bis-Tris pH 6,0, 1,5 M (NH₄)₂SO₄ и 10% этиленгликоля. Затравочные кристаллы получали при условии кристаллизации, включающем резервуарный раствор из 0,1 M Bis-Tris pH 6,0 и 1,5 M (NH₄)₂SO₄. Систему кристаллизации сохраняли при комнатной температуре в 24-луночном планшете Rigaku, имеющем форму клеверного листа. Кристаллизационная капля показала малые игольчатые кристаллы через трое суток инкубирования.

Примеры малых игольчатых кристаллов комплекса белка GFRAL и белка GDF15 показаны на ФИГ.30.

Для GFRAL была недоступна молекулярная модель, таким образом, использовали смачивание NaBr для определения фазирования кристалла. Кристалл GFRAL/GDF15, полученный, как описано выше, смачивали 0,5 M NaBr и 0,75 M NaBr, содержащим резервуарный раствор. Через 30 минут, кристаллы, смоченные 0,5 M NaBr, находились в хорошем состоянии, в то время как смачивание 0,75 M NaBr привело к растрескиванию кристаллов. Кристаллы из смоченных и неочищенных кристаллов устанавливали с 30% этиленгликолем в качестве криопротектора.

Модель, описываемая в настоящем документе, предлагает первую структурную информацию для белка GFRAL и связывания белка GFRAL с белком GDF15.

B: Сбор данных и определение структуры

Кристаллы комплекса GFRAL/GDF15 получали и собирали из резервуарных условий 0,1 M Bis-Tris pH 6,0, 1,5 M (NH₄)₂SO₄ и 10% этиленгликоля, в то время как смоченные и неочищенные кристаллы из смачиваний 0,5 M и 0,7 M NaBr. Кристаллы обрабатывали маточным раствором, дополненным 20% этиленгликолем в качестве криопротектора, и быстро замораживали в жидком азоте. Эти кристаллы затем исследовали на рентгеновскую дифракцию под пучком синхротронного излучения IMCA-CAT, Advanced Photon Source, Argonne National Lab (ALS). Кристалл диффрагировал вплоть до разрешения 2,28-2,20 .

Статистические данные рентгеновской дифракции для иллюстративных кристаллов комплекса GFRAL/GDF15 показаны в таблице 36.

Таблица 36

Сбор статистических данных Кристалл I Длина волны 0,9786 Пространственная группа P21 Базисная клетка () a=75,352 b=88,768 c=121,293 Разрешение ()† 50-2,20 (2,28-2,20) Число измерений 118,710 Число уникальных отражений 20,379 R sym (%)† 0,09 (0,58) Полнота (%)† 97,4 (85,4) I/σ† 18,9(2,2) Перенасыщение† 5,8 (4,9) Молекулы в A.U. 1 GFRAL 1 GDF15

†Скобки для оболочки с наивысшим разрешением в .

Молекулярное замещение GFRAL/GDF15 проводили с использованием шкалированного набора данных с ранее решенным комплексом GFRAL/GDF15 с разрешениями при 3,2 в качестве начальной модели и уточнения твердого тела (См. Vagin, A. A., et al., (2004) «REFMAC5 dictionary: Organization of prior chemical knowledge and guidelines for its use» Acta Crystallogr. D 60:2284-2295) и начальное позиционное уточнение было завершено в REFMAC5, тогда как реализовано в CCP4. Несколько раундов перестройки модели привели к созданию структур комплекса GFRAL/GDF15.

Примеры структур комплекса белка GFRAL и белка GDF15 показаны, например, на ФИГ.31-39B.

Проверка исходных карт электронной плотности показала четкую плотность для GFRAL и GDF15. После уточнения твердого тела, проводили несколько раундов перестройки модели и ограниченного уточнения с использованием COOT (См. Emsley, P. и Cowtan, K. (2004) «COOT: model-building tools for molecular graphics.» Acta Crystallogr. D 60:2126-2132). После размещения молекул растворителя окончательное уточнение было завершено.

Координаты атомов из паттернов рентгеновской диффракции для комплекса GFRAL/GDF15 находятся в таблице 49.

Статистические параметры для уточнения для иллюстративных кристаллов показаны в таблице 37.

Таблица 37

Статистики уточнения Диапазон уточнения () 35,82-2,20 R cryst (%) 20,1 R free (%) 26,2 Молекулы GDF15, GFRAL; молекулы воды 1,1; 132 Длина связей () 0,019 Углы связей (°) 1,943 Средние B-факторы (2) Полностью Атомы главной цепи (GDF15, GFRAL) 43,9, 57,6 Атомы боковой цепи (GDF15, GFRAL) 51,2, 66,8 Молекулы воды 56,7 График Рамачандрана (%) Полностью Предпочитаемые 96,3 Разрешенные 2,7 Недопустимые 1,0

Наглядная электронная плотность для GFRAL в иллюстративном кристалле комплекса GFRAL/GDF15 показана на ФИГ.31. ФИГ.31 показывает карту электронной плотности (2fo-fc) для молекулы GFRAL, рассчитанную с данными при разрешении 2,20 и очерченную на уровне 1σ. Остатки GFRAL ясно видны.

C: Кристаллическая структура комплекса GFRAL/GDF15

Определяли кристаллическую структуру комплекса белка GFRAL и белка GDF15.

Аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия определяли как аминокислотные остатки (на белке, таком как GFRAL), по меньшей мере, с одним атомом на расстоянии менее чем или равным 4,5 от белков, взаимодействующих с GFRAL (таких как GDF15). Расстояние 4,5 было выбрано в качестве порогового расстояния центральной области, чтобы атомы могли находиться в пределах радиуса Ван-дер-Ваальса плюс возможной водородной связи, опосредованной водой.

Аминокислоты на границе интерфейса взаимодействия определяли как аминокислотные остатки (на белке, таком как GFRAL) по меньшей мере, с одним атомом на расстоянии менее чем или равным 5 от аминокислот в центре интерфейса взаимодействия на GFRAL, которые взаимодействуют с белками, взаимодействующими с GFRAL (такими как GDF15). Расстояние, менее чем или равное 5 , было выбрано в качестве порогового расстояния граничной области, поскольку белковое связывание с остатками, менее чем в 5 от аминокислот в центре интерфейса взаимодействия на GFRAL, будет в пределах радиуса Ван-дер-Ваальса белков, взаимодействующих с GFRAL.

Аминокислоты, которые отвечали этим критериям расстояния, рассчитывали при помощи программы Молекулярная операционная среда (MOE) из CCG (Chemical Computing Group).

ФИГ.32 показывает примерную иллюстрацию гетеродимерного комплекса GFRAL/GDF15, обнаруженного в ассиметричной единице белкового кристалла GFRAL/GDF15. Димерная молекула GDF15 имеет одну межмолекулярную дисульфидную связь, которая была признана слабой из-за радиационного повреждения. Одна сторона молекулы GDF15 может формировать димер в ассиметричной единице. ФИГ.33 показывает примеры димерной перестройки гетеродимеров GFRAL/GDF15 в кристалле GFRAL/GDF15.

ФИГ.34A-34B иллюстрируют степень белок-белковых контактов в интерфейсе GFRAL-GDF15. Область контакта на GFRAL указана светло-серыми стрелками; область контакта на GDF15 указана черными стрелками.

ФИГ.35 показывает, что три α-спирали GFRAL участвуют в интерфейсе GFRAL/GDF15. Множественные дисульфидные мостики, по-видимому, стабилизируют структурную конфигурацию трех α-спиралей GFRAL.

ФИГ.36A-36D иллюстрируют различные аспекты интерфейса GFRAL/GDF15 и аминокислотные остатки центра и границы для белка GFRAL и для белка GDF15, участвующие в формировании интерфейса GFRAL/GDF15. Белок GFRAL и белок GDF15 представлены в виде ленточных диаграмм с остатками в интерфейсе GFRAL/GDF15, показанными в пространственной модели поверхности. ФИГ.36A-36C показывают аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия белка GFRAL и белка GDF15. ФИГ.36D показывает аминокислоты на границе интерфейса взаимодействия.

Аминокислотная последовательность полноразмерного предшественника белка GFRAL человека показана ниже:

SEQ ID NO:1797

Аминокислоты GFRAL в интерфейсе комплекса GFRAL/GDF15 показаны в таблице 38.

*Нумерация аминокислот GFRAL в соответствии с SEQ ID NO:1797.

Аминокислотная последовательность зрелого человеческого GDF15 показана ниже:

ARNGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQ VTMCIGACPS

QFRAANMHAQ IKTSLHRLKP DTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT

YDDLLAKDCH CI (SEQ ID NO:1811)

Остатки GDF15 в интерфейсе комплекса GFRAL/GDF15 показаны в таблице 39.

*Нумерация аминокислот GDF15 в соответствии с SEQ ID NO:1811.

D: Модель комплекса GFRAL/RET/GDF15

Третичный комплекс RET/GFRα1/GDNF, описанный Goodman et al. (2014) CELL REPORTS 8, 1894-1904 (PDB 4UX8), использовали в качестве матрицы для построения модели комплекса GFRAL/GDF15 /RET (из структуры GFRAL/GDF15, см., например, примеры 11-13). Матрица RET/GFRα1/GDNF получена из реконструкции при помощи электронной микроскопии восстановленного третичного комплекса RET(ECD)-GDNF-GFRα1 млекопитающего (Goodman et al., выше).

Для сравнения структурного сходства кристаллической структуры GFRAL/GDF15 из примера 12 и структуры GFRα1/GDNF в матрице RET/GFRα1/GDNF, структуру GFRAL в кристалле GFRAL/GDF15 накладывали на GFRα1 в модели GFRα1/GDNF/RET (PDB 4UX8) с использованием MOE из CCG. Высокое качество наложения, и, таким образом, структурное сходство комплексов GFRAL/GFRα1 и GFRAL/GDF15 было продемонстрировано путем среднеквадратического отклонения (RMSD) остатков остова GFRAL/GFRα1 в 2,21 . Эту модель третичного комплекса, включающую структуру GFRAL/GDF15 и структуру RET, применяли для картирования взаимодействий между GFRAL и RET.

ФИГ.37A-37B иллюстрируют примеры аспектов наложения GFRAL и GFRα1 в 4XU8. RMSD остатков остова составило 2,21 .

ФИГ.38A-38D иллюстрируют примеры аспектов взаимодействия белка GFRAL с белком RET в модели RET/GFRAL/GDF15. На ФИГ.38A, взаимодействующие остатки GFRAL и GDF15 в интерфейсе GFRAL/GDF15, как было смоделировано, представлены в виде стержневых моделей. На ФИГ.38B, остатки на GFRAL, взаимодействующие с RET, показаны в пространственной модели поверхности. На ФИГ.38C, пространственная модель поверхности остатков в центре интерфейса выделена на GFRAL и RET. На ФИГ.38D, пространственная модель поверхности остатков на границе интерфейса выделена на GFRAL и RET.

ФИГ.39A-39B иллюстрируют центральные и граничные аминокислотные остатки на белке GFRAL, идентифицированные в пространственных моделях поверхности в смоделированном интерфейсе RET. На ФИГ.39A, центральные остатки на GFRAL, как было смоделировано, показаны темно-серым на пространственной модели поверхности. НА ФИГ.39B, граничные остатки на GFRAL, как было смоделировано, показаны светло-серым на пространственной модели поверхности.

На основании этого моделирования, был идентифицирован ряд остатков GFRAL для взаимодействия с остатками RET, как показано в таблице 40A. Дополнительно, был идентифицирован ряд остатков RET для взаимодействия с остатками GFRAL, как показано в таблице 40B.

ПРИМЕР 12: КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСОВ GFRAL/АНТИТЕЛО

A1: Образование комплекса и кристаллизация комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab

Комплекс белка GFRAL, 3P10 Fab и 25M22 Fab (комплекс GFRAL/3P10/25M22 Fab) формировали путем смешивания GFRAL(W115-E351) с Fab из 3P10 и 25M22 в молярном соотношении 1:1,2:1,2 GFRAL:3P10Fab:25M22Fab. Комплекс очищали от избытка молекул Fab на хроматографической колонке для гель-фильтрации. Комплекс GFRAL/3P10/25M22 Fab концентрировали и кристаллизовали следующим образом.

Образец комплекса 3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab объемом 1,5 мл концентрировали посредством центрифугирования до приблизительно 6,6 мг/мл с использованием концентратора 10000 MWCO Centricon^®. Концентрированный образец сразу же подвергали скринингу на кристаллизацию с использованием 1 мкл белка плюс резервуар на 1 мкл на эксперимент. Была создана первая партия из 96 условий кристаллизации, которые охватывали состав образца на основе факторов для содержимого резервуара. Реакции кристаллизации инкубировали при комнатной температуре. Применяли скрининг кристаллизации при помощи индекса Хэмптона и PegRx на начальных раундах кристаллизации. Скрининг при помощи индекса Хэмптона не выявил никаких потенциальных успехов, в то время как скрининг PegRx выявил кристаллы при следующих трех условиях кристаллизации B11, D11, и H8:

B11: 0,1 M MES pH 6,0, 20% PEGMME 2000

D11: 0,1 M Имидазол pH 7,0, 12%, PEG 20,000

H8: 0,1 M TRIS pH 8,0, 16% PEG 10,000, 0,2 M ацетат аммония.

Примеры кристаллов комплексов GFRAL/3P10/25M22 Fab, полученных после кристаллизационных состояний B11, D11, и H8 показаны на ФИГ.40.

Для дополнительной оптимизации кристаллов для рентгеновской диффракции, комплекс GFRAL/3P10/25M22 концентрировали до 5,0 мг/мл и устанавливали для кристаллизации и дополнительной оптимизации, которая привела к улучшенным кристаллам. Некоторые улучшенные кристаллы имели форму трапеции. Некоторые из улучшенных кристаллов собирали, обрабатывали совместимым криопротектором, и быстро замораживали в жидком азоте. Идентификация и применение совместимого криопротектора была важной для поддержания кристалличности образца и для сбора высококачественного набора данных при рентгеновской дифракции. Улучшенные кристаллы, полученные при условии кристаллизации, включающем 0,1 M Имидазол pH 7,0, 12% ПЭГ 20000 (D11), обрабатывали 35% этиленгликолем. Несколько кристаллов были заморожены в жидком азоте, и данные рентгеновской дифракции собирали на синхротроне (ALS). Один кристалл диффрактировал приблизительно до разрешения 2,9 . Полный набор данных рентгеновской дифракции собирали при помощи этого кристалла.

Определяли кристаллическую структуру комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab. Положение компонента GFRAL было четко идентифицировано путем молекулярного замещения на основании более высокого содержания α-спиралей в GRAL по сравнению с 3P10 и 25M22 Fab. В иллюстративных кристаллах, описанных в настоящем документе, один GFRAL и два компонента Fab (один 3P10 Fab и один 25M22 Fab) формировали третичный комплекс в ассиметричной кристаллической единице.

Молекулярное замещение применяли для выявления Fabs в комплексе GFRAL/3P10/25M22 Fab. PDB 1F8T, был ближайшим гомологом GFRAL, доступным для анализа молекулярного замещения (~54% идентичности и ~79% сходства с GFRAL). Решение структуры ясно показало все аминокислотные положения Fab и GFRAL. Гомолог структуры GFRAL, 1F8T, применяли как ступеньку на пути решения компонентов Fab и GFRAL в кристаллической структуре третичного комплекса GFRAL/3P10/25M22. В этой структуре, стехиометрия комплекса была определена как 1:1:1 для 3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab.

A2: Образование комплекса и кристаллизация комплекса GFRAL/8D8/5f12 Fab

Комплекс белка GFRAL, 8D8 Fab и 5F12 Fab (комплекс GFRAL/8D8/5F12 Fab) формировали путем смешивания GFRAL(W115-E351) с Fab из 8D8 и 5F12 в молярном соотношении 1:1,2:1,2 для GFRAL: 8D8 Fab: 5F12 Fab. Комплекс очищали от избытка молекул Fab на хроматографической колонке для гель-фильтрации. Комплекс GFRAL/8D8/5F12 Fab концентрировали и кристаллизовали следующим образом.

Комплекс GFRAL/5F12/8D8 Fab концентрировали посредством центрифугирования с использованием концентратора 10000 MWCO Centricon^®. Концентрированный образец сразу же подвергали скринингу на кристаллизацию с использованием 1 мкл белка плюс резервуар на 1 мкл на эксперимент. Была создана первая партия из 96 условий кристаллизации, которые охватывали состав образца на основе факторов для содержимого резервуара. Реакции кристаллизации инкубировали при комнатной температуре. Положительные результаты от исходных скринингов были дополнительно оптимизированы для получения кристаллов высокого качества, которые бы поддавались дифракционному анализу.

Образец комплекса 5F12 Fab::GFRAL::8D8 Fab объемом 1,5 мл концентрировали посредством центрифугирования до приблизительно 7,8 мг/мл с использованием концентратора 10000 MWCO Centricon^®. Сразу после завершения образец подвергали скринингу на кристаллизацию с использованием 1 мкл белка плюс резервуар на 1 мкл на эксперимент. Была создана первая партия из 96 условий кристаллизации, которые охватывали состав образца на основе факторов для содержимого резервуара. Эти реакции инкубировали при комнатной температуре. Исходно, применяли скрининг кристаллизации при помощи индекса Хэмптона и PegRx для кристаллизации, индекс и PegRx выявили кристаллы при следующих трех условиях кристаллизации C6, E11, и C2:

C6: 0,1 M Bis-Tris pH 6,5, 14% ПЭГ 3350

E11: 1,7 M AmSO4, 0,1 M Bis-Tris pH 6,5, 3% ПЭГ MME 550

C2: 0,1 M Имидазол pH 7,0, 20% Jeffamine 2001.

Предварительные кристаллы получали, как показано на ФИГ.41.

Оптимизацию кристаллизирующих условий C6 и C2 PegRx проводили при помощи способа микропосева, который приводит к подходящим для дифракции монокристаллам. Эти подходящие для дифракции монокристаллы имеют шестиугольную бипирамидальную форму, полученную в 10% этиленгликоле с 0,1 M Имидазолом, pH 7,0, 20% Jeffamine 2001 pH 7,0. Некоторые из этих кристаллов собирали, обрабатывали совместимым криопротектором и замораживали в жидком азоте. Применение совместимого криопротектора является важным для поддержания кристалличности образца, что в результате приводит к работоспособному набору данных. Кристаллы обрабатывали 20% MPD, полученным из 0,1 M имидазола, pH 7,0, 20% Jeffamine 2001, pH 7,0.

B1: Сбор данных и определение структуры комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab

Данные рентгеновской дифракции собирали для 20 кристаллов комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab на синхротроне (ALS). От первых десяти кристаллов получили один полный набор данных с разрешением 3,17 . Десять дополнительных кристаллов, которые были дополнительно оптимизированы, диффрактировали с разрешением вплоть до 2,9 , и этот набор данных применяли для определения и уточнения структуры. Данные рентгеновской дифракции были проиндексированы с использованием DENZO и затем их интегрировали и шкалировали при помощи SCALEPACK из программной оболочки HKL2000. См. Otwinowski Z. и Minor W. "Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode" Methods in Enzymology, Volume 276: Macromolecular Crystallography, part A, p.307-326, 1997, C.W. Carter, Jr. & R. M. Sweet, Eds., Academic Press (New York). Рентгеновская дифракция выбранного кристалла была идентифицирована как имеющая ромбическую симметрию решетка Браве. Пространственную группу определяли как P2₁2₁2₁ на основании систематического погасания вдоль осей (h, 0, 0), (0, k, 0), и (0, 0, l). Анализ коэффицента Мэтью дает основания предполагать, что ассиметричная единица кристалла может вмещать одну сборку приблизительно 124,4 кДа и содержанием соответствующего растворителя 56%.

Статистические данные рентгеновской дифракции для иллюстративных кристаллов комплекса GFRAL/3P10/25M22 показаны в таблице 41.

Таблица 41 Сбор статистических данных Кристалл I Длина волны 0,9774 Пространственная группа P212121 Базисная клетка () a=52,500 b=116,045 c=227,048 Разрешение ()† 50-2,91 (3,01-2,91) Число измерений 227,808 Число уникальных отражений 31,548 R sym (%)† 0,11 (0,86) Полнота (%)† 100 (100) I/σ† 17,8 (2,7) Перенасыщение† 7,2 (7,2) Молекулы в A.U. 2 Fab 1 GFRAL

^† Скобки для оболочки с наивысшим разрешением в .

Молекулярное замещение комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab проводили с использованием шкалированного набора данных с ранее решенным GFRAL (см. Пример 12, часть C) и 1F8T, со структурой на 79% гомологичной структуре GFRAL, в качестве стартовых моделей в программе PHASER. Расширение данных от разрешений 40-3,5 дало GFRAL и один Fab. Молекулярное замещение дало еще один Fab в решении структуры. Решение имело комплекс из одного GFRAL и двух Fab в ассиметричной единице. Решение уточняли с использованием REFMAC. Для построения модели применяли COOT. Уточнение плотности ясно указывает на потерянные петли в Fabs и GFRAL. После размещения нескольких молекул растворителя финальное уточнение было завершено.

Координаты атомов из паттернов рентгеновской диффракции для комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab находятся в таблице 50.

Иллюстративные статистические параметры для уточнения для кристаллической структуры комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab показаны в таблице 42.

Таблица 42 Статистики уточнения Диапазон уточнения () 47,7-2,9 R cryst (%) 23,6 R free (%) 31,0 Молекулы 3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab 1,1,1 Длина связей () 0,011 Углы связей (°) 1,651 Средние B-факторы (2) Полностью Атомы главной цепи (GFRAL) 66,3 Атомы боковой цепи (GFRAL) 71,6 Атомы главной цепи (3P10) Hc:Lc 92,7; 75,5 Атомы боковой цепи (3P10) Hc:Lc 89,8; 78,5 Атомы главной цепи (25M22) Hc:Lc 85,5; 101,9 Атомы боковой цепи (25M22)Hc:Lc 83,4; 101,2 Молекулы воды 67,1 График Рамачандрана (%) Полностью Предпочитаемые 78,3 Разрешенные 20,6 Недопустимые 1,2

Ясные электронные плотности областей CDR в каждой цепи 3P10 и 25M22 Fab-фрагментов в комплексе GFRAL/3P10/25M22 Fab показаны на ФИГ.42 (взвешенная электронная плотность 2mFo-DFc, уровень контурирования 1,0σ). Цепи 3P10 и 25M22 были четко идентифицированы в электронной плотности, за исключением области 131-137 в тяжелой цепи 3P10 (цепь-H), где несколько концевых остатков не были идентифицированы в электронной плотности.

B2: Сбор данных и определение структуры комплекса GFRAL/8D8/5F12 Fab

Кристаллы исследовали на синхротроне при APS (усовершенствованной установке синхротронного излучения). Двадцать пять таких кристаллов исследовали на рентгеновскую дифракцию. Шестнадцать кристаллов были сначала отправлены на синхротрон, который дал дифракцию >5 и второй раунд оптимизированных кристаллов диффрактировал вплоть до разрешения 3,5 , которое применяют для определения и уточнения стуктуры. Данные рентгеновской дифракции были проиндексированы с использованием DENZO и затем их интегрировали и шкалировали при помощи SCALEPACK из программной оболочки HKL2000 (Otwinowski и Minor, 1997). Рентгеновская дифракция выбранного кристалла была идентифицирована как имеющая ромбическую симметрию решетка Браве. Пространственную группу определяли как P6₅22 на основании систематического погасания вдоль осей (h, 0, 0). Анализ коэффицента Мэтью дает основания предполагать, что ассиметричная единица кристалла может вмещать одну сборку приблизительно 246,6 кДа и содержанием соответствующего растворителя 61%. Решение структуры проверили при помощи энантиомерной пространственной группы P6₁22, которая дала очень плохие R_фактор и R_{свободный} во время уточнения твердого тела и ограниченного уточнения.

Статистические данные рентгеновской дифракции для кристаллов комплекса GFRAL/8D8/5F12 показаны в в таблице 43.

Таблица 43 Сбор статистических данных Кристалл I Длина волны 0,9787 Пространственная группа P6522 Базисная клетка () a=133,021 b=133,021 c=564,819 γ=120 Разрешение ()† 50-3,55 (3,68-3,55) Число измерений 524,288 Число уникальных отражений 37,081 R sym (%)† 0,13 (1,00) Полнота (%)† 100 (100) I/σ† 22,0 (3,4) Перенасыщение† 14,1 (14,6) Молекулы в A.U. 4 Fab 2 Рецептора

†Скобки для оболочки с наивысшим разрешением в .

Молекулярное замещение Fabs/рецептор проводили с использованием шкалированного набора данных с ранее решенным fab pdb:3IU4, использованным для 8D8 (89% гомологии) и pdb:4M7K, использованным для 5F12 (84% гомологии), которые были использованы как начальные модели в программе PHASER с использованием расширения данных от разрешений 40-3,5 , что дало две сборки из одного рецептора и двух Fab. Решение имело комплекс из двух рецепторов и четырех Fab в ассиметричной единице. Решение уточняли с использованием REFMAC, и Coot применяли для построения моделей.

Решение структуры проверили при помощи энантиомерной пространственной группы P6₁22. Молекулярное замещение комплекс из двух рецепторов и четырех Fab. Модель молекулярного замещения дополнительно загружали в Refmac для завершения уточнения с очень плохими R_фактор и R_{свободный} во время уточнения твердого тела и ограниченного уточнения, что подтвердило, что настоящей пространственной группой является P6₅22.

Координаты атомов из паттернов рентгеновской диффракции для комплекса GFRAL/8D8/5F12 Fab находятся в таблице 51.

Иллюстративные статистические параметры для уточнения для кристаллической структуры комплекса GFRAL/8D8/5F12 Fab Complex показаны в таблице 44.

Таблица 44 Уточненная статистика Уточненный диапазон () 49,2-3,55 R крист (%) 25,1 R свободный (%) 35,8 Молекулы 3P10 Fab::GFRAL::25M22 2, 2, 2 Длины связей () 0,011 Углы связей (°) 1,63

Четкая электронная плотность одного белка GFRAL 8D8 и 5F12 Fab-фрагментами (две цепи Fab) в комплексе GFRAL/8D8/5F12 Fab показана на ФИГ.43 (взвешенная электронная плотность 2mFo-DFc, уровень контурирования 1,0σ). Уточнение плотности ясно указало большинствво петель в молекуле Fab и рецептора. Цепи 5F12 и 8D8 были четко идентифицированы в электронной плотности, за исключением области между аминокислотами 139-142 в цепи-I (5F12 vH), 132-136 в цепи-R (8D8 vH) и 131-136 в цепи-U (8D8 vL), а также несколько концевых остатков не были идентифицированы в плотности.

C1: Кристаллическая структура комплекса GFRAL/3P10/25M22 Fab

Определяли кристаллическую структуру комплекса 3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab.

Аминокислотные последовательности 3P10 Fab и 25M22 Fab показаны ниже, последовательности VH и VL выделены жирным шрифтом, области CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

ФИГ.44 иллюстрирует аспект комплекса 3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab путем ленточной диаграммы. Fab-фрагменты взаимодействуют с асимметричной единицей GFRAL в кристалле комплекса 3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab. Кристаллическая структура также показала, что остатки эпитопа GFRAL 290-312 были презентированы антителу 3P10 и N-концевые остатки эпитопа GFRAL 130-157 были презентированы областям CDR тяжелой цепи антитела 25M22.

ФИГ.45 иллюстрирует области CDR 3P10 и 25M22 Fab с взаимодействующими остатками GFRAL и Fab, выделенными в рамках.

ФИГ.46-48 иллюстрируют аспекты взаимодействий GFRAL с 3P10 и 25M22L Fab на ленточных диаграммах с выбранными аминокислотными остатками, показанными в виде стержневых моделей. Например, ФИГ.46 иллюстрирует аспекты эпитопа GFRAL в непосредственной близости от области CDR тяжелой цепи 3P10. Последовательности CDR 3P10 Hc показаны на ФИГ.45. В качестве другого примера, ФИГ.47 иллюстрирует аспекты эпитопа GFRAL в непосредственной близости от области CDR легкой цепи 3P10. Последовательности CDR 3P10 Lc показаны на ФИГ.45. В качестве другого примера, ФИГ.48 иллюстрирует эпитопа GFRAL в непосредственной близости от области CDR тяжелой цепи 25M22. Последовательности CDR 25M22 Lc показаны на ФИГ.45.

Анализ эпитопа GFRAL, презентированного 25M22 Fab в кристаллической структуре комплекса 3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab, показал, что по механизму действия 25M22 представляет собой конкурентный ингибитор GDF15 и включает блокирование связывания GDF15 с GFRAL. Примеры аминокислот в центре интерфейса взаимодействия на белке GFRAL и на CDR для тяжелых и легких цепей 25M22 Fab показаны на ФИГ.49.

ФИГ.50A и 50B иллюстрируют центральные аминокислотные остатки в интерфейсе взаимодействия GFRAL/25M22 Fab. ФИГ.50A иллюстрирует структуру GFRAL с аминокислотами 25M22 в центре интерфейса взаимодействия (связывание эпитопа) на GFRAL, выделенными в пространственной модели поверхности. Аминокислоты в центре интерфейса на CDR 25M22 для GFRAL также выделены в пространственной модели поверхности. ФИГ.50B иллюстрирует структуру GFRAL в ленточной диаграмме с центральными аминокислотами 25M22 Fab в интерфейсе взаимодействия на GFRAL (эпитопные остатки GFRAL), выделенными в пространственной модели поверхности.

ФИГ.51 иллюстрирует аминокислоты на границе интерфейса взаимодействия на GFRAL для связывания GFRAL/25M22 Fab. Границы аминокислот в интерфейсе взаимодействия на GFRAL (для связывания 25M22 Fab связывание), выделены в виде пространственных моделей поверхности.

ФИГ.52-53 иллюстрируют перекрывание эпитопов GFRAL для 25M22 Fab и связывание GDF15 на GFRAL. Ленточная диаграмма GFRAL с двух сторон показана в левой и правой панелях на ФИГ.52. ФИГ.53 показывает вид сверху перекрывающихся эпитопов GFRAL для 25M22 Fab и связывание GDF15.

Аминокислотные остатки на GFRAL в центре интерфейса взаимодействия для 25M22 Fab и связывания GDF15 выделены в пространственной модели поверхности. Светло-серое затемнение поверхности отражает поверхность GFRAL, покрытую 25M22 Fab, в то время как темно-серое затемнение (выделено черными стрелками) показывает поверхность GFRAL, покрытую GDF15.

Аминокислоты GFRAL в интерфейсе комплекса GFRAL/25M22 Fab показаны в таблице 45. Для сравнения аминокислот в интерфейсе взаимодействия в комплексах GFRAL/25M22 Fab и GFRAL/GDF15, в таблице 45 дополнительно перечислены аминокислоты GFRAL в интерфейсе комплекса GFRAL/GDF15, которые также показаны в таблице 38. Таблица 45 иллюстрирует, что все аминокислотные остатки в центре интерфейса взаимодействия на GFRAL, которые связываются с GDF15, также представляют собой аминокислоты в центре интерфейса взаимодействия при взаимодействии GFRAL/25M22 Fab.

Аминокислотная последовательность полноразмерного предшественника белка GFRAL человека показана ниже (см. также пример 12, часть C):

SEQ ID NO:1797