Результат интеллектуальной деятельности: Способ комплексной переработки морской травы семейства Zosteraceae

Изобретение относится к фармацевтической и пищевой промышленности и касается технологии комплексной переработки морских трав семейства Zosteraceae с одновременным получением полигидроксифенольных соединений, таких как розмариновая кислота, 7,3'-дисульфат лютеолина и феруловая кислота.

Фитохимические исследования морских трав семейства Zosteraceae выявили в их составе ряд фенольных соединений, которые обладают антиоксидантным, антибиотическим, противовоспалительным действием, а также широким спектром противовирусной активности в отношении различных групп вирусов, таких как вирусы гепатита В и С [TsukamotoY. et al. // PLOSONE. 2018. V. 13(5). P. e0197664.], вирус простого герпеса (HSV-1 и 2) [CN 109771407(A), 21.05.2019], энтеровирус (EVE-1) [Lin W-Y. // Virology J 2019. V. 16(1). P. 94], вирус клещевого энцефалита (ВПГ-1 и 2) [Krylova N.V. et al. //Bul. of Exp.Biology and Med. 2018 V. 165(1). P. 61-63], вирус гриппа H1N1 или H9N2 [WO 2017202113 A1, 30.11.2017; Kim E.B. et al. // Planta Med. 2015. V. 81. P. 06; Hariono M. et al. // Scientific Reports. 2016. V. 6(1). P. 38692].

Недавно обнаружено, что полифенолы обладают активностью против коронавирусов, в частности, тяжелого острого респираторного синдрома SARS-Cov-2 [Paraiso I.L. et al. // Current Opinionin Food Science. 2020. S2214799320300679]. Благодаря своим иммуномодулирующим свойствам, полифенолы могут иметь профилактический эффект против цитокинового шторма, индуцированного вирусной инфекцией.

В состав морских трав семейства Zosteraceae входят такие полигидроксифенолы, как розмариновая кислота, лютеолин и 7,3'-дисульфат лютеолина (водорастворимая форма лютеолина), феруловая кислота [Kim E.B. et al. // Planta Med. 2015. V. 81. P. 06; Enerstvedt K. H. et al. // Planta Sciences. 2016. V. 7. P. 1163-1172; Quackenbush R. C. et al. // Aquatic Botany. 1986. V. 24(1). P. 83-89].

Розмариновая кислота широко используется в фармакологии и парафармацевтике для производства лекарственных средств и биологически активных добавок (БАД). Она проявляет антиоксидантную и противовоспалительную активность [US 2010137433 A1, 03.06.2010], антибактериальную активность [RU 2395204 С2, 27.07.2010], противовирусную активность в отношении вируса клещевого энцефалита [KrylovaN.V. etal. // Bul. of Exp.Biology and Med. 2018 V. 165(1). P. 61-63], энтеровируса [Lin W-Y. // Virology J. 2019. V. 16(1). P. 94; Hsieh C-F. et al. // Emerging Microbes & Infections. 2020. P. 1-37], вируса герпеса и ветряной оспы [CN 109771407(A), 21.05.2019], является ингибитором вируса гепатита В [TsukamotoY. et al. // PLOSONE. 2018. V. 13(5). P. e0197664]. Розмариновая кислота входит в состав лекарственных средств для профилактики и лечения гриппа H1N1 или H9N2 [WO 2017202113 А1, 30.11.2017] и вирусной пневмонии [CN 111202766(A), 29.05.2020].

7,3'-дисульфат лютеолина - это производная водорастворимая форма лютеолина, способная проникать в плазму крови человека через кишечник. Сульфаты лютеолина среди морских растений обнаружены только в морских травах семейства Zosteraceae [Harborne J. В. // Phytochemistry. 1975. V. 14. P. 1147-1155; Enerstvedt K Н. // American Journal of Plant Sciences. 2016. V. 7. P. 1163-172; RU 2432960 CI, 10.11.2011]. Известна антиоксидантная активность производных лютеолина [Lopez- Lazaro М. // Mini-Reviews in Medical Chem. 2009. V. 9. P. 31-59; RU 2432959 C1, 10.11.2011], антибиотическая и противовирусная активность [Jensen P. R. et al. // Applied and Environmental Microbiology. 1998. V. 64(4). P. 1490-1496; Lopez- Lazaro M. // Mini-Reviews in Medical Chemistry. 2009. V. 9. P. 31-59], в том числе против вируса гриппа (H1N1) [Kim E.B. et al. // PlantaMed. 2015. V. 81. P. 06], против вируса герпеса [Lyu S.Y. et al. // Archives of Pharmacal Res. 2005. V. 28(11). P. 1293-1301], вируса клещевого энцефалита [Krylova N.V. et al. // Bul. of Exp.Biology and Med. 2018 V. 165(1). P. 61-63]. Проявляется ингибирующая активность лютеолина и его производных в отношении SARS-Cov-2 [Paraiso I.L. et al. // Cur. Op.In Food Science. 2020.doi:10.1016/j.cofs.2020.08.004].

Феруловая кислота имеет много различных фармакологических свойств. Она проявляет антиоксидантную, холестерин снижающую, тромболитическую, противомикробную и противовоспалительную активность [Shiyi Ouetal. // J. Sci. Food Agric. 2004, 84:1261-1269], ингибирующую активность в отношении роста и размножения вируса гриппа H1N1 [Hariono М. et al. // Scientific Reports. 2016. V. 6(1). P. 38692. doi: 10.1038/srep38692].

Известен способ получения розмариновой кислоты из морской травы семейства Zosteraceae, включающий экстракцию водой при комнатной температуре при добавлении пищевой кислоты с последующей фильтрацией на мембранном фильтре, очисткой экстракта на хроматографической колонке с полихромом 1. Целевой продукт элюируют 5-7% водным раствором этилового спирта, концентрируют и лиофилизуют [RU 2401827 С1, 20.10.2010].

Известен способ получения 7,3'-дисульфата лютеолина из морской травы семейства Zosteraceae, путем экстракции этиловым спиртом, упаривания, растворения концентрата в воде, фильтрования, подкисления 15-20% раствором соляной кислоты, отстаивания при 2-4°С, отделения осадка, хроматографирования на колонке с сорбентом полихром-1 5% раствором этилового спирта, упаривания до полного удаления этилового спирта, лиофильной сушки [RU 2432960 С1, 07.10.2010].

Феруловая кислота встречается во многих наземных растениях. В морских травах она обнаружена в зостере [Shiyi O. et al. // J. Sci. Food Agric. 2004, 84:1261-1269; Vergeer L.H.T. et al. // Aquatic Botany. 1997. V. 58. P. 65-72].

Известен способ получения полифенолов из арктических бурых водорослей [RU 2741634 С1, 28.01.2021]. Способ предусматривает обезжиривание сырья хлороформом, сушку, измельчение, экстрагирование ацетоном, концентрирование экстракта, разбавление дистиллированной водой для получения водного полифенольного экстракта и лиофильную сушку. В результате получают полифенольный комплекс, обладающий антиоксидантными, бактериостатическими и фунгистатическими свойствами. Получение биологически активных индивидуальных полифенольных соединений этот способ не предусматривает.

В качестве прототипа выбран способ комплексной переработки морской травы каспийской семейства Zosteraceae [RU 2302746 С2, 20.07.2007]. Однако в результате его осуществления получают продукты пектиновой природы, такие как зостерин, зостерат натрия и кормовую продукцию. Способ предусматривает обработку сырья 1% раствором соляной кислоты при 50°С, промывку водой до рН 7, 4-х стадийную обработку раствором гидроксида натрия с отделением экстрактов. Экстракт в первом варианте осаждают спиртом для получения зостерата натрия, во втором экстракт осаждают 3% раствором серной кислоты до рН 2,5, получая зостерин. Травяной остаток отделяют от экстракта фильтрованием и используют для получения кормовой продукции.

Способов переработки морской травы с одновременным получением нескольких индивидуальных полигидроксифенольных соединений в доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено.

Задачей предлагаемого технического решения является комплексная переработка морской травы семейства Zosteraceae с одновременным получением нескольких биологически активных полифенольных соединений, таких как розмариновая кислота, 7,3'-дисульфат лютеолина и феруловая кислота.

Согласно заявляемому способу морскую траву зостеру, свежескошенную или дефростированную, опресняют, экстрагируют 0,1 N раствором соляной кислоты при комнатной температуре, при перемешивании, при соотношении сырье: экстрагент 1: (1,2-2) в течение 8-12 ч, экстракт сливают, фильтруют, концентрируют и наносят на колонку с полихромом-1, колонку отмывают дистиллированной водой и элюируют розмариновую кислоту 5-7% водным раствором этилового спирта, элюат упаривают и лиофильно сушат. Остаток морской травы промывают дистиллированной водой, экстрагируют 0,1 N раствором гидрокарбоната натрия при комнатной температуре или охлаждении, при перемешивании, при соотношении сырье:экстрагент 1:(1,2-2) в течение 8-12 ч, экстракт фильтруют, концентрируют и наносят на колонку с полихромом-1, колонку отмывают дистиллированной водой и элюируют 7,3'-дисульфат лютеолина 10% водным раствором этилового спирта, элюат концентрируют в вакууме и лиофильно сушат.Далее остаток морской травы гидролизуют 1,0 N раствором щелочи при 70-80°С, при перемешивании, при соотношении сырье:экстрагент 1:1 в течение 4-8 ч, гидролизат сливают, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, нейтрализуют 5% серной кислотой до рН 6-7 и оставляют на сутки при комнатной температуре, выпавший осадок феруловой кислоты отделяют центрифугированием или фильтрованием, промывают охлажденной дистиллированной водой и сушат.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в том, что в рамках одного технологического цикла одновременно получают несколько биологически активных продуктов, а именно, розмариновую кислоту, 7,3'-дисульфат лютеолина и феруловую кислоту, которые могут быть использованы как индивидуально, так и в составе полифенольного комплекса в качестве компонента биологически активных добавок к пище, в том числе и противовирусных, функциональных пищевых продуктов, ингредиентов отдельных видов пищевой продукции. Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет рационально использовать ценное морское сырье.

Для подтверждения состава получаемых продуктов проведен анализ образцов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Использован жидкостный хроматограф «LaChrom» (Merck Hitachi), снабженный насосом L-7100, УФ детектором L-7400, термостатом L-7300, интегратором D-7500 и колонкой Agilent Technologies Zorbax Eclipse XDB-C18, 5.0 μm (150 мм × 4.6 мм) с защитной колонкой Hypersil ODS, 5.0 μm (4.0 мм × 4.0 мм). Колонку термостатировали при 30°С. Разделение примесей проводили смесью растворителей: А (вода + 1% ледяной уксусной кислоты) и В (ацетонитрил + 1% ледяной уксусной кислоты) в следующем режиме: 0-5 мин - изократический, 90% А, 10% В; 5-35 мин градиентный, 90-10% А, 10-90% В. Скорость подачи растворителей 0,9 мл/мин. Детектирование проводили при 270 нм.

На фиг. 1 представлена схема предлагаемого способа комплексной переработки морских трав семейства Zosteraceae.

На фиг. 2 (а-б) представлена ВЭЖ хроматограмма розмариновой кислоты, получаемой из зостеры: а - экстракт зостеры, полученный в кислых условиях, рН 2-3; 6 - водно-спиртовый элюат розмариновой кислоты с полихрома-1. По вертикали А - поглощение при 270 нм; по горизонтали - время удерживания (мин); 15,83 - пик, соответствующий времени удерживания розмариновой кислоты.

На фиг. 3 (а-б) представлена ВЭЖ хроматограмма 7,3'-дисульфата лютеолина, получаемого из зостеры: а - экстракт зостеры полученный в щелочных условиях, рН 9-10; 6 - водно-спиртовый элюат 7,3'-дисульфата лютеолина с полихрома-1. По вертикали А - поглощение при 270 нм; по горизонтали - время удерживания (мин); 13.60 - пик, соответствующий времени удерживания 7,3-дисульфата лютеолина.

На фиг. 4 (а-б) представлена ВЭЖ хроматограмма феруловой кислоты, получаемой из зостеры: а - гидролизат зостеры; 6 - осадок феруловой кислоты, растворенный в 70% этиловом спирте. По вертикали А - поглощение при 270 нм; по горизонтали - время удерживания (мин); 14.30 - пик, соответствующий времени удерживания феруловой кислоты

Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Морскую траву Zostera marina свежескошенную в количестве 30 кг очищают от посторонних примесей и промывают 30 л питьевой воды от морских солей. Опреснение проводят трижды, причем последний раз траву замачивают на 4 ч дистиллированной водой. Затем траву помещают на фильтр до полного стекания воды и измельчают. Подготовленное сырье загружают в реактор и заливают 36 л 0,1 N водного раствора соляной кислоты при перемешивании. Экстракцию проводят в течение 12 ч при комнатной температуре. Экстракт сливают, фильтруют, концентрируют до объема 5 л и наносят на колонку с 2 кг полихрома-1. Колонку отмывают 5 л дистиллированной воды. Розмариновую кислоту элюируют с полихрома-1 7% водным раствором этилового спирта до истощения. Элюат упаривают для удаления этилового спирта и минимизации объема, лиофильно сушат.

Остаток морской травы промывают 30 л дистиллированной воды для удаления следов кислоты и повторно экстрагируют 36 л 0,1 N водного раствора гидрокарбоната натрия при комнатной температуре при перемешивании. Экстракцию осуществляют в течение 12 ч. Затем экстракт сливают, фильтруют через мембранный фильтр и упаривают в вакууме. Концентрат наносят на колонку с 2 кг полихрома-1, уравновешенного дистиллированной водой. Минеральные соли удаляют промыванием 10 л дистиллированной воды. Элюирование осуществляют 10% водным раствором этилового спирта до истощения. Водно-спиртовый элюат концентрируют в вакууме и лиофильно сушат.

Остаток морской травы после мягкой щелочной экстракции помещают в закрытый реактор с рубашкой и гидролизуют 30 л 1,0 N раствора NaOH при 80°С, при перемешивании в течение 8 ч. Затем гидролизат сливают, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, нейтрализуют 5% серной кислотой до рН 6-7 и оставляют на сутки. Выпавший осадок феруловой кислоты отделяют центрифугированием, промывают охлажденной до 4°С дистиллированной водой и высушивают.

Выход розмариновой кислоты составляет 3% от веса сухого сырья. Чистота продукта 70-80%. Выход 7,3'-дисульфата лютеолина составляет 1,5% от веса сухого сырья. Чистота продукта 75-85%. Выход феруловой кислоты составляет 1,5% от веса сухого сырья. Чистота продукта 70-75%.

Пример 2

Морскую траву Zostera sp. дефростированную в количестве 15 кг очищают от посторонних примесей и промывают 5 л питьевой воды от морских солей. Опреснение проводят трижды, причем последний раз траву замачивают на 2 ч дистиллированной водой. Затем траву помещают на фильтр до полного стекания воды. Подготовленное сырье измельчают, загружают в реактор и заливают 30 л 0,1 N водного раствора соляной кислоты при перемешивании. Экстракцию проводят в течение 8 ч при комнатной температуре. Экстракт сливают, фильтруют, концентрируют до объема 3 л и наносят на колонку с 2 кг полихрома-1. Колонку отмывают 5 л дистиллированной воды. Розмариновую кислоту элюируют с полихрома-1 5% водным раствором этилового спирта до истощения. Элюат упаривают для удаления этилового спирта и минимизации объема, лиофильно сушат.

Далее остаток сырья промывают 20 л дистиллированной воды для удаления следов кислоты, повторно экстрагируют 30 л 0,1 N водного раствора гидрокарбоната натрия при охлаждении до 4°С при перемешивании. Экстракцию осуществляют в течение 8 часов. Экстракт сливают, фильтруют и упаривают в вакууме. Раствор наносят на колонку с 2 кг полихрома-1, уравновешенного дистиллированной водой. Минеральные соли удаляют промыванием 5 л дистиллированной воды. Элюирование 7,3'-дисульфата лютеолина осуществляют 10% водным раствором этилового спирта до истощения. Водно-спиртовый элюат концентрируют в вакууме и лиофильно сушат.

Остаток морской травы после мягкой щелочной экстракции помещают в закрытый реактор с рубашкой и гидролизуют 15 л 1,0 N раствора КОН при 70°С при перемешивании в течение 4 ч. Затем гидролизат сливают, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, нейтрализуют 5% серной кислотой до рН 6-7 и оставляют на сутки. Выпавший осадок феруловой кислоты отделяют фильтрованием, промывают охлажденной до 4°С дистиллированной водой и высушивают.