СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано при оптимизации процессов репаративного остеогенеза, таких как замедленное сращение переломов, ложные суставы, асептический некроз кости, а также замещения дефектов костной ткани, полученных в результате травмы или инфекционного процесса.

В настоящее время для лечения дефектов костной ткани используют аутологичные трансплантаты из других частей тела (гребня подвздошной кости или части диафиза малоберцовой кости), так как трансплантат из гребня подвздошной кости богат колониеобразующими клетками, а концентрация этих клеток-предшественников напрямую способствует регенерации костной ткани. Аутотрансплантаты обрели повсеместное клиническое признание, поскольку собственная кость пациента демонстрирует все ключевые биологические характеристики: остеогенность, остеоиндуктивность и остеокондуктивность, но, несмотря на все ее преимущества, обладает существенными недостатками: образуется дефект в месте взятия трансплантата, а его количество всегда ограничено, что не позволяет замещать большие дефекты.

Применение синтетических заменителей костной ткани и ксенотрансплантатов позволяет преодолеть естественные ограничения аутотрансплантата и в настоящее время, также нашли широкое применение. Они представляют собой каркасы, изготавливаемые из различных материалов, включая природные и синтетические полимеры, керамику и композиты, которые предназначены для имитации трехмерных (3D) характеристик ткани аутотрансплантата при сохранении жизнеспособных клеточных популяций.

Костные цементы на основе кальция являются остеокондуктивными, и используются преимущественно для заполнения метафизарных дефектов кости. Они обладают достаточной прочностью на сжатие, но не имеют сопротивления сдвиговым и вращательным усилиям. Другим недостатком является очень высокая цена качественного костного цемента.

Синтетические остеокондуктивные материалы широко используют в ортопедической практике, эта группа включает гидроксиапатит, коралловый гидроксиапатит, а также коллагеновые материалы.

Гидроксиапатит имеет пористую структуру, сравнимую с губчатой костью. Этот материал функционирует в качестве надежного остеокондуктивного каркаса, воспроизводя тем самым биологические свойства экстрацеллюлярного костного матрикса (ЕСМ), в большинстве исследований сообщается, что минерализация и ремоделирование этого материала может привести к образованию зрелой кости.

Коралловый гидроксиапатит представляет собой аналогичное вещество, при производстве которого коралл превращается в чистый кристаллический гидроксиапатит. Он имеет хорошую прочность на сжатие, но низкую прочность на растяжение и ограниченный потенциал ремоделирования.

Подобно синтетическому гидроксиапатиту, коралловый гидроксиапатит функционирует строго остеокондуктивно, но не обладает остеогенными и остеоиндуктивными свойствами.

При замещении дефектов костной ткани данные материалы выступают в качестве каркаса, где под воздействием факторов роста происходит синтез собственной костной ткани, в тоже время, являясь инородным телом.

В травматологии и ортопедии насчитывается несколько методик использования факторов роста, позволяющих повлиять на костеобразование:

• Трансплантация детерминированных остеогенных продромальных клеток (ДОПК), обладающих собственной потенцией остеобластического остеогенеза.

• Воздействие костным морфогенетическим белком (BMP - bone morphogenetic protein), индуцирующим преобразование плюропотентных клеток в остеобласты (остеоиндукция).

• Воздействие факторами, стимулирующими новообразование кости (TGFp, IGF-I, IGF-II, PDGF, pFGF, aFGF, BMPs) присутствующие в большом количестве в тромбоцитах и красном костном мозге, являющиеся медиаторами клеточной пролиферации и дифференцировки, ангиогененза и минерализации.

В основе лежит активирование морфогенетическими белками и/или факторами роста коммитированных клеток предшественников остеобластов. Все перечисленные способы имеют высокую стоимость, в среднем в 10 раз превышающие стоимость стандартного хирургического лечения. При этом реализация перечисленных способов стимуляции остеогенеза не доказала значительной клинической эффективности.

Например, при лечении остеопороза бифосфонатами увеличение плотности костной ткани составляет 8-9% в год, BMP - до 16%.

Однако есть еще пробелы; в частности, до сих пор мало информации о клеточной основе МСК-опосредованного восстановления переломов и регенерации костей in vivo. Дальнейшее понимание в этой области может стать ключом к усовершенствованной и комплексной стратегии восстановления скелета.

Традиционная техника взятия трансплантата из гребня подвздошной кости с помощью долота (Мовшович И.А. Оперативная ортопедия. // М.: Медицина. - 1994. - С. 414), выполняют следующим образом: в проекции гребня до кости выполняют доступ. Широким распатором отделяют мышцы с внутренней и наружной поверхности кости на протяжении, соответствующем величине необходимого трансплантата. Затем долотом сбивают тонкую костную пластинку с верхней поверхности гребня и отворачивают ее в сторону, после чего приступают к взятию, также долотом, трансплантата. В зависимости от поставленной задачи трансплантат берут с одной или обеими кортикальными пластинками крыла подвздошной кости или вообще только из гребня. Трансплантат можно взять единым блоком соответствующей формы и размера или в виде нескольких фрагментов. Недостатками традиционного способа является сложность взятия костного трансплантата единовременно, одним блоком необходимого размера, что приводит к необходимости повторного забора трансплантата, либо взятию трансплантата неоправданно большого размера. Причем применение данного способа приводит к формированию косметического дефекта обусловленного нарушением целостности гребня подвздошной кости (фиг. 1 - дефект крыла подвздошной кости при получении трансплантата с помощью долота).

Недостатком известного способа является то, что при его применении возникает дефект гребня крыла подвздошной кости, а объем костного трансплантата не позволяет замещать полости большого размера.

Наиболее близким способом, принятыми за ближайший аналог, является предложенный ранее «Способ стимуляции репаративного остеогенеза на ранних стадиях посттравматического периода» патент РФ 2676659 от 12.02.2018 г.

Способ осуществляют следующим образом на пятые сутки после остеосинтеза у больного проводят забор 10-20 мл. крови, плазму обогащают тромбоцитами путем центрифугирования и непосредственно после этого инъецируют ее в зону перелома в объеме 5-10 мл, в зависимости от размера и площади зоны перелома, причем процедуру повторяют до 5 раз через каждые 2 суток.

Несмотря на множество преимуществ, у данного способа выявлен ряд недостатков:

1. Концентрация факторов роста и их пропорциональное содержание не специфично для репаративного остеогенеза.

2. Представленный способ нельзя применять при восстановлении дефектов костной ткани.

Задачи: получение ауторегенерата с концетрацией и составом факторов роста, наиболее близким к вновь образующейся костной ткани с целью сокращения сроков консолидации переломов костей, в том числе:

- Обеспечить качественное замещение дефектов кости.

- Определить пропорциональное соотношения факторов роста специфичное для оптимизации процессов репаративного остеогенеза.

- Обеспечить возможность совмещения с синтетическими остеокондуктивными материалами.

- Снизить риск инфекционных и неинфекционных осложнений.

- Уменьшить финансовую составляющую процедуры.

- Исключить возможность развития аллергических реакций.

- Снизить сроки лечения на 15-20%.

Технический результат. Предложен способ стимуляции репаративного остеогенеза с помощью получения ауторегенерата костной ткани in vivo, отличающийся тем, что предварительно выполняют остеотомию гребня крыла подвздошной кости, затем через 5-7 суток из остеотомной раны осуществляют забор ауторегенерата в объеме 2-10 мл. и однократно заполняют им зону дефекта, в получаемом регенерате отсутствуют антигенные компоненты, а концентрация факторов роста представлена в оптимальных пропорциях для процесса костеобразования. Предлагаемый способ получения ауторегенерата позволяет совмещать его с синтетическим остеокондуктивным материалом, таким как модель губчатой кости выполненная из гидроксиаппатита. Применение аутоткани позволяет, снизить финансовую составляющую процедуры, связанную с получением цитокинов, а также исключить риск развития аллергических реакций и реакций связанных с отторжением трансплантата. Предложенный способ стимуляции репаративного остеогенеза позволяет сократить сроки консолидации перелома на 15-20%.

Для апробации предложенного способа были отобраны 12 баранов «Романовской» породы в возрасте от 1 до 1,5 лет со средней массой 29,4±3,7 кг.

Все манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и других научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123) Strasbourg, 1986).

Всем животным исследуемой группы, была выполнена остеотомия гребня крыла подвздошной кости следующим образом: после выполнения доступа к гребню крыла подвздошной кости, при помощи долота произведена остеотомия с целью получения костной раны длиной до 50,0 мм, шириной до 5,0 мм и глубиной до 50,0 мм (12500 мм³=12,5 мл), затем в условиях искусственно созданной костной раны в течение 5-7 суток формировался ауторегенерат, который впоследствии был трансплантирован в ту зону, где необходима оптимизация процессов репаративной остеорегенерации, в данном случае модель перелома большеберцовой кости (для создания модели перелома кости нами использовалась проволочная витая пила) с клиновидным дефектом, что является нарушением технологии выполнения накостного остеосинтеза и приводит к замедленному сращению перелома и образованию ложного сустава (для создания дефекта кости в зоне перелома нами использовались костные кусачки Борхардта), фиксация перелома была выполнена при помощи технологии накостного остеосинтеза с применением динамической компрессионной пластины ограниченного контакта (LC-DCP), фиксация пластины осуществлялась кортикальными винтами.

В результате удалось in vivo получить ауторегенерат, представляющий собой гематому в стадии организации, содержащую факторы роста, необходимые для образования костной ткани, у животных опытной группы, которым была выполнена трансплантация ауторегенерата, а именно аутотрансплантат был собран при помощи костной ложки и перемещен в костную полость (клиновидный дефект) в зоне остеотомии на большеберцовой кости, что способствовало заполнению полости костной тканью, а сокращение сроков сращения составило до 18-20% в сравнении с контрольной группой.

Пример 1. Экспериментальное животное из исследуемой группы: под общим наркозом выполнен доступ к крылу подвздошной кости и сформирована костная рана размером 50×30×5 мм с целью получения ауторегенерата in vivo (фиг. 2). На 5 сутки выполнена модель перелома с костным дефектом клиновидной формы, фиксация перелома осуществлена пластиной LC-DCP (фиг. 3), в зону костного дефекта трансплантирован полученный ауторегенерат в объеме 2 мл. (фиг. 4 и 5).

Контроль сращения осуществляли при помощи серии рентгенологических исследований: рентгенограммы выполнены в день операции (фиг. 6а), на 7 сутки после выполнения металлостеосинтеза (фиг. 6б), 14 сутки (фиг. 6в) и 21 сутки (фиг. 6г), на представленных рентгенограмма видно заполнение дефекта костной тканью. Кроме рентгенологического контроля животные находились под наблюдением на 2-3 сутки после выполнения металлостеосинтеза, животное начало активно перемещаться по клетке, что свидетельствует о снижении болевого синдрома.

Часть ауторегенерата в момент трансплантации взята для проведения сравнительного иммуноферментного анализа, сравнение проведено с красным костным мозгом, обогащенной тромбоцитами аутоплазмой и нативной плазмой, в результате удалось выявить, что ауторегенерат, получаемый по предложенному способу, содержит максимальное фактор роста фибробластов - FGF1 (фиг. 7) и костный морфогенетический белок 7 - ВМР7 (фиг. 7) или близкое к максимально необходимому (инсулиноподобный фактор роста - IGF1 (фиг. 7), трансформирующий фактор роста бета - TGFb (фиг. 7) и костный морфогенетический белок 6 - ВМР6 (фиг. 7), количество факторов роста, необходимых для процессов репаративной регенерации, а обогащенная тромбоцитами плазма содержит большое количество фактора роста тромбоцитов - PDGFab (фиг. 7).

На 21 сутки отмечено восстановление опороспособности конечности восстановлена, животное выведено из эксперимента, на вскрытии отмечена консолидация перелома, заполнение клиновидного дефекта в зоне модели перелома костной тканью, также костная ткань заполнила полость костномозгового канали (фиг. 8 стрелка 1) и пространство под пластиной (фиг. 8 стрелка 2), таким образом, клинически установлен факт перестройки ауторегенерата в костную ткань.

Пример 2. Экспериментальное животное из исследуемой группы: под общим наркозом выполнен доступ к крылу подвздошной кости и сформирована костная рана размером 40×20×5 мм с целью получения ауторегенерата in vivo. На 7 сутки выполнена модель перелома с костным дефектом клиновидной формы, фиксация перелома осуществлена пластиной LC-DCP, в зону костного дефекта трансплантирован полученный ауторегенерат в объеме 10 мл. Контроль сращения осуществляли при помощи серии рентгенологических исследований: рентгенограммы выполнены в день операции, на 7 сутки после выполнения металлостеосинтеза, 14 сутки и 21 сутки, на представленных рентгенограмма видно заполнение дефекта костной тканью. Кроме рентгенологического контроля животные находились по наблюдением на 2-3 сутки после выполнения металлостеосинтеза, животное начало активно перемещаться по клетке, что, как и в примере 1, свидетельствует о снижении болевого синдрома. На 21 сутки опороспособность конечности восстановлена.

Пример 3. Экспериментальное животное из контрольной группы: под общим наркозом выполнена модель перелома с костным дефектом, фиксация перелома осуществлена пластиной LC-DCP (фиг. 9).

Контроль сращения осуществляли при помощи серии рентгенологических исследований: рентгенограммы выполнены в день операции выполнены (фиг. 10а), на 7 сутки (фиг. 10б, 14 сутки (фиг. 10в) и 21 сутки (фиг. 10г), с учетом преднамеренного нарушения технологии накостного остеосинтеза, на рентгенограммах, ожидаемо, отсутствуют признаки заполнения сформированного дефекта костной тканью. На 21 сутки животное выведено из эксперимента, на вскрытии отмечены признаки сращения перелома в месте контакта костных отломков, заполнение клиновидного дефекта в зоне модели перелома костной тканью не выявлено.

Апробация способа стимуляции репаративного остеогенеза при переломах костей, в сочетании с дефектом костной ткани, показала свою эффективность в эксперименте, а именно консолидация перелома и заполнение костного дефекта новообразованной костной тканью (фиг. 8).

Гистологический анализ костной мозоли также показал влияние трансплантации ауторегенерата на оптимизацию процессов репаративного остеогенеза на гистологическом препарате видно большее количество клеток предшественников костной ткани, формирующиеся кровеносные сосуды, соединительнотканные волокна имеют упорядоченную структуру (фиг. 11а) и в то время как на препарате, полученном от животного, которому не проводилась трансплантация ауторегенерата, таких признаков формирования костной ткани обнаружено в значительно меньшем количестве (фиг. 11б).