Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА КАПСУЛИРОВАННОЙ ФОРМЫ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ПИЩЕВОЙ ДОБАВКИ

Изобретение относится к области биотехнологии, фармацевтики, медицины и представляет собой способ производства капсулированной формы пробиотической добавки на основе лактобактерий, бифидобактерий и пропионовокислых бактерий.

На сегодняшний день потребители все больше задумываются о состоянии своего здоровья и о пользе натуральных продуктов питания.

Значительное влияние на здоровое состояние организма оказывает микробиота желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Нормофлора ЖКТ представляет собой совокупность множества полезных для организма микроорганизмов различных видов. Качественные и количественные изменения в составе нормофлоры приводят к снижению ее метаболической активности [1]. На изменения в составе микрофлоры оказывают влияние такие факторы, как экологическая обстановка, рацион питания, прием лекарственных препаратов (в особенности антибиотиков), стресс, кишечные инфекции и др. [2, 3].

С целью восстановления микрофлоры ЖКТ перспективно включать в рацион питания пробиотические продукты. Согласно ВОЗ, пробиотиками являются «живые организмы, которые при введении в адекватных количествах вызывают пользу для здоровья организма-хозяина» [4]. Большинство пробиотических продуктов разрабатывают с использованием микроорганизмов родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Propionibacterium, Saccharomyces. В профилактике и лечении заболеваний человека и животных наиболее широко изучены такие штаммы лактобактерий, как Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus helveticus. Также часто в научных работах этой тематики встречаются следующие штаммы: Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium jensenii и др. [5-7].

Пробиотики выполняют в организме человека множество функций. Основным их преимуществом является способность оказывать влияние на развитие микрофлоры организма путем подавления развития патогенной микрофлоры и активирования работы облигатной микрофлоры [8, 9]. Подтверждено положительное влияние пробиотиков на процессы пищеварения, лечение пищевой аллергии, кандидозов и кариеса. Многие пробиотические микроорганизмы являются естественными производителями витаминов группы В (В₁, В₂, В₃, В₆, В₈, В₉, В₁₂), органических и аминокислот, ферментов, антибиотикоподобных веществ, лактонов, индолов и др. [10-13].

При введении в организм на пробиотические микроорганизмы оказывает влияние ряд стрессовых факторов (температура, кислоты и желчь, повышенные концентрации определенных ионов или недостаток питательных веществ, воздействие осмотического и окислительного стресса и др.). Таким образом, пробиотики должны быть адаптированы к такой динамической окружающей среде, либо быть защищенными, чтобы принести пользу здоровью организма в адекватных количествах [14].

Одним из способов сохранения свойств пробиотиков в агрессивной среде ЖКТ является их капсулирование. Инкапсуляция пробиотических штаммов увеличивает их стабильность, облегчает обработку и хранение пробиотических культур и защищает чувствительные лактобактерий от действия кислорода, замораживания и кислой среды при производстве, хранении и в ЖКТ [15].

Из существующего уровня техники известен консорциум пробиотических штаммов Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus plantarum для изготовления бактериального препарата и закваски прямого внесения для производства ферментированного молока и ферментированного свекольного сока (патент РФ №2506308, опубл. 10.02.2014). Штаммы Lactobacillus rhamnosus 2166 и Lactobacillus plantarum 2165 выделяют из кисломолочной закваски домашнего приготовления, используемой для получения простокваши на основе козьего молока. Микроорганизмы идентифицируют методом секвенирования гена, кодирующего 16S rRNA. Штаммы Lactobacillus rhamnosus 2166 и Lactobacillus plantarum 2165 выращивают при 37±2°С на жидкой среде МРС или в молоке с 1,5% содержанием жира. Производство свекольного кваса на основе консорциума штаммов лактобактерий в качестве закваски прямого внесения и свекольного сока заключается в следующем. Свеклу сортируют, моют, очищают и измельчают до гомогенной массы, вносят 0,25% аскорбиновой и обрабатывают при 75°С в течение 15 мин. Мезгу охлаждают до 37°С, добавляют лиофилизированный бактериальный препарат, перемешивают. Ферментацию мезги проводят в статических условиях при 37°С в течение 10 часов. Мезгу отделяют от свекольного кваса путем центрифугирования.

К недостаткам вышеизложенного способа следует отнести недостаточную антагонистическую активность консорциума штаммов лактобактерий и специфику органолептических показателей готового свекольного кваса.

Известна композиция для профилактики грибковых заболеваний (патент РФ №2744142, опубл. 03.03.2021) в форме капсулы. Оболочка капсулы состоит из следующих компонентов, мг: желатин 144,0, D-сорбит 18,0, глицерин 18,0, колликулит МАЕ 100Р 68,95, пропиленгликоль 45,0, тальк 42,62, поливинилпирролидон 18,95, титана диоксид 2,37, железа оксид красный 0,97, железа оксид желтый 0,5, железа оксид черный 0,71.

Капсулы по описанному изобретению характеризуется сложным составом, и, соответственно, повышенной себестоимостью готовой композиции.

В патенте РФ №2614116, опубл. 22.03.2017 описан способ получения пробиотической композиции для снижения уровня холестерина, содержащей сухую биомассу пробиотических штаммов бактерий В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884, L. fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556, L. acidophilus АСТ-44. Указанный способ включает раздельное культивирование штаммов В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884 на среде Блаурокка, штаммов L. fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556 и L. acidophilus АСТ-44, В. bifidum GG-72 ВКПМ Ас-1884, L. fermentum LFM-2 ВКПМ В-10368, L. rhamnosus LC-52GV ВКПМ В-9475, L. plantarum ГВИ-1 ВКПМ В-8556, L. acidophilus АСТ-44 ВКПМ - В-9647 на MRS-бульоне при 37±1°С до стационарной фазы развития, концентрирование, смешивание с защитной средой, высушивание и смешивание сухой биомассы пробиотических штаммов в равных количествах.

В качестве недостатка данного способа следует отметить отсутствие информации о варианте фасовки полученной пробиотической композиции (капсулы, таблетированная форма, ампулы и др.).

Существует мягкая капсула с лактобактериями (патент РФ №2150269, опубл. 10.06.2000), оболочка которой содержит, мас. %: желатин 14,0-15,0, глицерин 34,0-35,0, хлористоводородную кислоту 5,0-8,5, эмульгатор 1,2-1,7, вода остальное, в которую помещена суспензия лиофилизированных лактобактерий в дисперсионной среде в количестве не менее 1⋅10⁸ бактерий на капсулу. В качестве дисперсионной среды для лактобактерий используют соевое масло. В качестве эмульгатора могут быть использованы моноглицеродистиллят и/или натриевая соль сульфоэфиров высших жирных спиртов серной кислоты.

Существенным недостатком известного способа является отсутствие технологических параметров производства лиофилизированной суспензии микроорганизмов и мягких капсул, а также отсутствие результатов исследований, подтверждающих пробиотическую активность разработанных капсул с лактобактериями.

Известный состав оболочки капсулы принят в качестве ближайшего аналога.

Технической задачей предлагаемого изобретения является расширение ассортимента капсулированных пробиотических пищевых добавок для нормализации микрофлоры ЖКТ и поддержания микроэкологического статуса человека.

Технический результат, достигаемый при реализации заявленного изобретения, состоит в разработке нового способа производства капсулированной формы пробиотической пищевой добавки на основе лактобактерий, бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, для поддержания микроэкологического статуса человека.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ, согласно которому на первом этапе получают консорциумы микроорганизмов. Для этого культивируют лактобактерий, бифидобактерий, пропионовокислые бактерии (консорциум №1 Lactobacillus bifermentans В-9462: Bifidobactrium coryneforme AC-1755: Propionibacterium jensenii B-6085 в соотношении 1:1:1; консорциум №2 Bifidobactrium adolescentis AC-1909: Bifidobactrium infantis AC-1912: Propionibacterium jensenii B-6085: Propionibacterium freudenreichii B-11921 в соотношении 1:1:1:1; консорциум №3 Propionibacterium jensenii B-6085: Propionibacterium freudenreichii B-11921: Lactobacillus bifermentans В-9462 в соотношении 1:1:1) до суммарной концентрации консорциума 1,0⋅10⁸ КОЕ/мл. Затем для каждого консорциума биомассу отделяют центрифугированием и высушивают на сублимационной сушилке. На втором этапе получают капсулированную форму пробиотической добавки. Для этого получают капсульные оболочки на основе растительных полисахаридов (κ-каррагинана и альгината натрия) и глицерина, после чего сухой остаток биомассы инкапсулируют в полученные растительные оболочки.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1.

Получают три консорциума на основе штаммов лактобактерий, бифидобактерий, пропионовокислых бактерий из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Национального биоресурсного центра (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика. Соотношения микроорганизмов в консорциумах представлены в таблице 1. Культивируют консорциумы при температуре 37°С в течение 16 ч до суммарной концентрации консорциума 1,0⋅10⁸ КОЕ/мл. Состав питательных сред (г/л):

консорциум №1: декстроза - 15,0, мясной экстракт - 10,0, дрожжевой экстракт - 4,0, цитрат аммония - 1,0, сульфат магния - 1,0, пептон - 20,0, ацетат натрия - 3,0, K₂HPO₄ - 1,5, твин 80 - 1,0, сульфат марганца - 0,07, глюкоза - 4,0, натрия хлорид - 5,0, крахмал водорастворимый - 2,0, L-цистеин гидрохлорид - 0,2, триптиназа (BBL) - 0,5, лактат натрия - 0,5, KH₂PO₄ - 0,3, агар бактериологический - 10,0, рН среды 7,0;

консорциум №2: дрожжевой экстракт - 2,5, пептон - 20,0, твин 80 -0,8, сульфат марганца - 0,02, глюкоза - 3,0, натрия хлорид - 3,0, крахмал водорастворимый - 1,0, L-цистеин гидрохлорид - 0,2, триптиназа (BBL) -0,8, лактат натрия - 0,8, KH₂PO₄ - 0,15, агар бактериологический - 10,0, рН среды 6,8;

консорциум №3: декстроза - 15,0, мясной экстракт - 6,0, дрожжевой экстракт - 6,0, цитрат аммония - 1,5, сульфат магния - 0,15, пептон - 12,5, ацетат натрия - 5,5, K₂HPO₄ - 1,5, твин 80 - 0,8, сульфат марганца - 0,04, триптиназа (BBL) - 1,2, лактат натрия - 1,2, KH₂PO₄ - 0,2, агар бактериологический - 15,0, рН среды 7,1.

По окончании культивирования биомассу отделяют от культуральной жидкости путем центрифугирования при 8000 об/мин в течение 10 мин. Полученную биомассу высушивают в сублимационной сушилке при температуре -20°С, вакууме 0,05 мбар.

Для получения растительных оболочек используют κ-каррагинан, альгинат натрия, глицерин, воду при следующем соотношении компонентов, масс. %:

κ-каррагинан - 10,0

альгинат натрия - 2,5

глицерин - 10,0

вода - 77,5.

В необходимый объем воды при комнатной температуре и постоянном перемешивании добавляют κ-каррагинан и альгинат натрия, смесь нагревают до температуры 75°С и продолжают перемешивание в течение 1 ч. После растворения растительных полисахаридов добавляют глицерин. Полученную смесь перемешивают еще в течение 30 мин. По окончании процесса к реактору подключают вакуум на 1,5-2,0 ч для удаления пузырьков воздуха. Далее смесь стабилизируют в течение 2,5 ч при температуре 50°С и подают на этап капсулирования в специальную машину для изготовления капсул.

В процессе изготовления капсул в растительную оболочку подается лиофилизированный консорциум при температуре не выше 28°С. Готовые капсулы с пробиотическим консорциумом поступают на первичную сушку в сушильный барабан при температуре 25°С в течение 20 ч. Далее капсулы укладывают в поддоны и устанавливают в сушильные тоннели, где осуществляется вторичная сушка при температуре 20-25°С и относительной влажности воздуха не более 30% в течение 2-5 сут.

Пример 2.

Аналогичен примеру 1, но для получения растительной оболочки для капсул используют компоненты, мас. %: κ-каррагинан - 2,5; альгинат натрия - 10,0; глицерин - 10,0; вода - 77,5.

Пример 3.

Аналогичен примеру 1, но для получения растительной оболочки для капсул используют компоненты, мас. %: κ-каррагинан - 2,5; альгинат натрия - 2,5; глицерин - 10,0; вода - 85,0.

Результаты определения растворимости полых капсул в воде по истечении 2 ч эксперимента представлены в таблице 2. Результаты определения распадаемости полых капсул в модельной среде, имитирующей кишечный сок, представлены в таблице 3. Результаты определения антагонистической активности капсулированной формы пробиотика представлены в таблице 4. Результаты определения антимикробной активности капсулированных форм пробиотических добавок, которые хранились в течение 6 месяцев при температуре 4°С, представлены в таблице 4.

Из таблицы 2 следует, что капсулы, полученные по примерам 1 и 2, характеризуются устойчивостью к действию воды. По истечении 2 ч структура оболочки сохранена, отмечено набухание внешнего слоя капсулы. Для капсул, полученных по примеру 3 и рецептуре ближайшего аналога, отмечено разрушение структуры оболочки в воде.

По результатам, приведенным в таблице 3, сделали вывод, что распадаемость капсул в условиях модельной среды продолжительность распадаемости больше 30 минут у образца, полученного по примеру 3 (35,4±1,8 мин), что не соответствует требованиям ОФС.1.4.1.0005.15. Оптимальная продолжительность распадаемости отмечена для капсулы, полученной по примеру 2 (14,4±0,7 мин).

Антимикробная активность капсулированных пробиотических добавок определена по отношению к штаммам Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans. Наибольшей антимикробной активностью обладают пробиотические консорциумы, полученные по примеру 2 (таблица 4).

Таким образом, техническим результатом заявленного способа является разработка нового способа производства капсулированной формы пробиотической пищевой добавки на основе лактобактерий, бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, для поддержания микроэкологического статуса человека.

Список литературы

1 Microbiome and allergic diseases / M. Pascal, M. Perez-Gordo, T. Caballero, M.M. Escribese, et al. // Frontiers in immunology. - 2018. - 9. - P. 1584.

2 Дисбиоз кишечника и возможности его коррекции функциональными продуктами питания / P.M. Газиева, В.В. Крючкова, С.Н. Белик, П.В. Скрипин // Вестник Донского государственного аграрного университета. - 2017. - 1-1(23). - С.121-130.

3 Impact of nutritional and environmental factors on inflammation, oxidative stress, and the microbiome / Md.A.K. Azad, M. Sarker, T. Li, J. Yin // BioMed Research International. - 2018. - V. 2018. - 8 p.

4 FAO. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food: Report of a Joint FAO (FAO, Rome, Italy, 2013).

5 Probiotic species in the modulation of gut microbiota: an overview / A.K. Azad, M. Sarker, T. Li, J. Yin // BioMed Research International. - 2018. - V. 2018.-8 p.

6 Семенихина, В.Ф. Пробиотические культуры и их свойства / В.Ф. Семенихина // Актуальные вопросы молочной промышленности, межотраслевые технологии и системы управления качеством. - 2020. - №1 (1). -С. 481-484.

7 Молочнокислые и пропионовокислые бактерии: формирование сообщества для получения функциональных продуктов с бифидогенными и гипотензивными свойствами / А.В. Бегунова, И.В. Рожкова, Е.А. Зверева, О.А. Глазунова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2019. - Т. 55, №6. - С. 566-577.

8 Oelschlaeger, Т.А. Mechanisms of probiotic actions - A review / T.A. Oelschlaeger // International journal of medical microbiology. - 2010. - 300(1). -P. 57-62.

9 Recent Advances and Future Perspective in Microbiota and Probiotics / H. Kitazawa, S. Alvarez, A. Suvorov, V. Melnikov, J. Villena, B. Sanchez // BioMed Research International. - 2015. - V. 2015. - 2 p.

10 Thomas, D.W. American Academy of Pediatrics Committee on Nutrition, & American Academy of Pediatrics Section on Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition / D.W. Thomas, F.R. Greer // Probiotics and prebiotics in pediatrics. Pediatrics. - 2010. - 126(6). - P. 1217-1231.

11 Evaluation of efficacy of probiotics in prevention of Candida colonization in a PICU-a randomized controlled trial / S. Kumar, A. Bansal, A. Chakrabarti, S. Singhi // Critical care medicine. - 2013. - 41(2). - P. 565-572.

12 Enhancing vitamin В12 content in soy-yogurt by Lactobacillus reuteri / Q. Gu, C. Zhang, D. Song, P. Li, X. Zhu // International journal of food microbiology. - 2015. - 206. - P. 56-59.

13 Chugh, B. Bioactive compounds produced by probiotics in food products / B. Chugh, A. Kamal-Eldin // Current Opinion in Food Science. - 2020. - V. 32. -P. 76-82.

14 Mohammadi, R. Review Article: Technological Aspects of Prebiotics in Probiotic Fermented Milks / R. Mohammadi and A.M. Mortazavian // Food Reviews International. - 2011. - 27. - P. 192-212.

15 The viability of probiotic Lactobacillus rhamnosus (non-encapsulated and encapsulated) in functional reduced-fat cream cheese and its textural properties during storage / D.W. Ningtyas, B. Bhandari, N. Bansal, S. Prakash //Food Control. - 2019.- 100.-P. 8-16.