Результат интеллектуальной деятельности: ОБЩИЕ НЕОАНТИГЕНЫ

Родственные заявки и включение путем ссылки

Настоящая заявка претендует на приоритет и преимущество от предварительной заявки на патент США за номером 62/179,877, поданной 20 мая 2015 г., и предварительной заявки на патент США за номером 62/389,377, поданной 23 февраля 2016 г.

Вышеуказанные заявки и все документы, приведенные в них или во время их рассмотрения (“приведенные в заявках документы”), и все документы, приведенные или упомянутые в приведенных в заявках документах, а также все документы, приведенные или упомянутые здесь (“приведенные здесь документы”), и все документы, приведенные или упомянутые в приведенных здесь документах, вместе с инструкциями, описаниями, спецификациями изделий и буклетами изготовителей на любые изделия, упомянутые здесь или в любом документе, включенном сюда путем ссылки, настоящим включаются сюда путем ссылки и могут использоваться при практическом применении изобретения. В частности, все приведенные документы включены путем ссылки в той же степени, как если бы каждый отдельный документ был конкретно и индивидуально указан как включенный путем ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается способов и композиций для лечения неоплазий, например, опухолей, в особенности с использованием по меньшей мере одного неоантигенного пептида, пригодного для лечения значительной части субъектов в популяции, страдающей раком.

Уровень техники

Примерно 1,6 миллиона американцев ставится диагноз неоплазии каждый год, и ожидается, что примерно 580 000 человек в США умрут от этой болезни в 2013 г. За последние несколько десятилетий произошли значительные улучшения в области выявления, диагностики и лечения неоплазий, которые существенно повысили выживаемость при многих типах неоплазии. Тем не менее, лишь около 60% людей с диагнозом неоплазии остаются в живых через 5 лет после начала лечения, что делает неоплазию второй ведущей причиной смерти в США.

В настоящее время существует много различных способов лечения рака, включая методы абляции (например, хирургические процедуры, криогенная/термическая обработка, ультразвук, радиочастотная и лучевая терапия) и химические методы (например, фармацевтические средства, цитотоксические/химиотерапевтические средства, моноклональные антитела и различные их комбинации). К сожалению, такие способы лечения часто связаны с серьезным риском, токсическими побочными эффектами и чрезвычайно высокими затратами, а также с неясной эффективностью.

Сейчас растет интерес к такой терапии рака, которая стремится воздействовать на раковые клетки с помощью собственной иммунной системы пациента (например, вакцины против рака), поскольку такие методы лечения могут смягчить или устранить некоторые из вышеописанных недостатков. Как правило, противораковые вакцины состоят из раковых антигенов и иммуностимулирующих молекул (например, цитокинов или лигандов TLR), которые работают вместе и индуцируют антигенспецифичные цитотоксические T-клетки, которые целенаправленно разрушают опухолевые клетки. Существующие противораковые вакцины могут содержать общие (shared) опухолевые антигены, которые являются нативными белками (т.е. это белки, кодируемые ДНК во всех нормальных клетках индивида) и избирательно экспрессируются или гиперэкспрессируются в опухолях, встречающихся у многих индивидов. Хотя такие общие опухолевые антигены полезны для идентификации определенных типов опухолей, однако они не идеальны в качестве иммуногенов, направляющих T-клеточный ответ на определенный тип опухолей, так как они подвержены ослабляющим иммунитет эффектам аутотолерантности. Вакцины, содержащие опухолеспецифичные и специфичные для пациента неоантигены, могут преодолеть некоторые недостатки вакцин, содержащих общие опухолевые антигены. Однако применение специфичных для пациента неоантигенов требует секвенирования геномов отдельныхсубъектов, а также получения персонализованных композиций, содержащих комбинации неоантигенов, присутствующих у данного отдельного субъекта. Соответственно, по-прежнему существует потребность в улучшении способов и композиций для доставки противораковых вакцин.

Цитирование или идентификация любых документов в настоящей заявке не означает признания того, что такой документ существует в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.

Cущность изобретения

Ниже приведены предпочтительные положения (признаки) и воплощения настоящего изобретения. Каждое из приведенных здесь положений и воплощений изобретения может сочетаться с любым другим положением и/или воплощением, если четко не указано обратное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или преимущественный, может сочетаться с любым другим признаком или признаками либо положениями, указанными как предпочтительные или преимущественные. Поэтому настоящее изобретение, в частности, охватывается любым из или комбинацией одного или нескольких приведенных ниже положений и воплощений с любым другим положением и/или воплощением.

Целью изобретения является обеспечить способы и композиции для лечения популяции больных раком путем выработки иммунного ответа, нацеленного на данный рак. В одном аспекте настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, содержащих по меньшей мере один неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый носитель, причем каждый по меньшей мере один неоантигенный пептид содержит опухолеспецифичный неоэпитоп, способный связываться с белком HLA у субъекта, а каждый опухолеспецифичный неоэпитоп содержит опухолеспецифичную мутацию, присутствующую в опухоли. Композиция может включать один неоантигенный пептид. В других воплощениях композиция может включать более 100 неоантигенных пептидов. Предпочтительно композиция включает около 20 неоантигенных пептидов. По меньшей мере один неоантигенный пептид может содержать опухолеспецифичную мутацию. Мутация может представлять собой повторную. Предпочтительно мутация присутствует у значительной части популяции. Повторная мутация может основываться на мутации, которая присутствует в опухолях по меньшей мере 1% субъектов в популяции субъектов, страдающих раком. Композиция может включать по меньшей мере один неоантигенный пептид, содержащий опухолеспецифичный неоэпитоп, который связывается с белком HLA, присутствующим по меньшей мере у 5% субъектов в популяции субъектов, страдающих раком. Кроме того, композиция может содержать по меньшей мере один неоантигенный пептид, способный вызвать иммунный ответ против опухоли, присутствующей по меньшей мере у 5% субъектов в популяции субъектов, страдающих раком. Способность вызывать иммунный ответ означает способность иммунной системы презентировать антиген лимфоцитам. Для того, чтобы иммунная система презентировала антиген, этот антиген должен быть представлен белкам HLA у субъекта. Чтобы вызвать иммунный ответ против опухоли, опухоль должна содержать мутации, ведущие к экспрессии антигена. Для того, чтобы композиция приносила пользу нуждающейся в этом популяции, эта популяция должна включать субъектов, экспрессирующих аллель HLA, способный связываться по меньшей мере с одним неоантигенным пептидом, присутствующим в композиции, и популяция должна включать субъектов, содержащих опухоли с такими мутациями, которые приводят к появлению неоантигенных эпитопов в неоантигенных пептидах.

Композиция может быть специфичной для популяции субъектов, страдающих раковыми заболеваниями, которые имеют один общий признак. У популяции может быть рак или может быть определенный рак. Популяция может иметь общий набор подтипов HLA. У них может быть общий подтип HLA на основе этнической принадлежности. Не ограничиваясь теорией, процент типов HLA в популяции может быть предсказан, исходя из этнической принадлежности без тестирования. Не ограничиваясь теорией, разные популяции экспрессируют разные типы HLA, способные связывать разные неоантигенные пептиды. Поэтому композиция может быть составлена так, чтобы она приносила пользу большой части этой популяции и в то же время не приносила бы пользы другой популяции. Не ограничиваясь теорией, разные виды рака содержат разные мутации, поэтому можно использовать композиции, адаптированные к определенному раку, чтобы обеспечить большую пользу для популяции с одним типом рака по сравнению с популяцией, включающей более одного типа. В одном воплощении популяция страдает от адренокортикальной карциномы (ACC), карциномы уротелия мочевого пузыря (BLCA), инвазивной карциномы молочной железы (BRCA), плоскоклеточной карциномы шейки матки и эндоцервикальной аденокарциномы (CESC), аденокарциномы толстой кишки (COAD), хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL), колоректального рака (CRC), диффузной крупно-B-клеточной лимфомы (DLBCL), мультиформной глиобластомы (GBM), плоскоклеточной карциномы головы/шеи (HNSC), хромофобного рака почек (KICH), светлоклеточной карциномы почек (KIRC), папиллярноклеточной карциномы почек (KIRP), острой миелоидной лейкемии (LAML), гепатоцеллюлярной карциномы печени (LIHC), аденокарциномы легких (LUAD), плоскоклеточной карциномы легких (LUSC), множественной миеломы (ММ), серозной цистаденокарциномы яичников (OV), аденокарциномы поджелудочной железы (PAAD), аденокарциномы простаты (PRAD), аденокарциномы прямой кишки (READ), кожной меланомы (SKCM), аденокарциномы желудка (STAD), опухолей половых клеток яичек (TGCT), аденокарциномы щитовидной железы (THCA), эндометриоидной карциномы стенки матки (UCEC) или карциносаркомы матки (UCS).

В одном воплощении популяция субъектов страдает от CLL; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “CLL”; а по меньшей мере одна из всех шести мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 17,49% субъектов в популяции CLL. Популяция субъектов может страдать от BLCA; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “BLCA”; а по меньшей мере одна из всех шести мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 26,92% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от BRCA; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “BRCA”; а по меньшей мере одна из всех 18 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 36,04% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от COAD; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “COAD”; а по меньшей мере одна из всех трех мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 27,14% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от GBM; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “GBM”; а по меньшей мере одна из всех 14 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 34,36% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от HNSC; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “HNSC”; а по меньшей мере одна из всех 10 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 21,61% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от KIRC; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “KIRC”; а по меньшей мере одна из всех четырех мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 6% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от LAML; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “LAML”; а по меньшей мере одна из всех 11 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 47,45% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от LUAD; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “LUAD”; а по меньшей мере одна из всех 11 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 33,42% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от LUSC; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “LUSC”; а по меньшей мере одна из всех двух мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 7,87% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от OV; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “OV”; а по меньшей мере одна из всех десяти мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 22,78% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от READ; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “READ”; а по меньшей мере одна из всех двух мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 20,51% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от SKCM; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “SKCM”; а по меньшей мере одна из всех 64 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 90,91% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от UCEC; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “UCEC”; а по меньшей мере одна из всех 30 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 67,74% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от ACC; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “ACC”; а по меньшей мере одна из всех 161 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 50% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от CESC; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “CESC”; а по меньшей мере одна из всех четырех мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 23,71% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от CRC; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “CRC”; а по меньшей мере одна из всех 15 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 56,65% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от DLBCL; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “DLBCL”; а по меньшей мере одна из всех 2 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 13,79% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от KICH; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “KICH”; а по меньшей мере одна из всех 24 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 50% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от KIRP; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “KIRP”; а по меньшей мере одна из всех 9 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 42,24% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от LICH; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “LICH”; а по меньшей мере одна из всех 2 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 6,57% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от MM; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “MM”; а по меньшей мере одна из всех 6 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 23,9% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от PRAD; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “PRAD”; а по меньшей мере одна из всех 24 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 39,85% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от STAD; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “STAD”; а по меньшей мере одна из всех 150 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 48,79% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от TGCT; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “TGCT”; а по меньшей мере одна из всех 14 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 51,61% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от THCA; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “THCA”; а по меньшей мере одна из всех пяти мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 69,88% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от UCS; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “UCS”; а по меньшей мере одна из всех двух мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 16,07% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов может страдать от PAAD; причем по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любые комбинации мутаций из табл. 8 при типичном заболевании “PAAD”; а по меньшей мере одна из всех 53 мутаций из числа по меньшей мере одной опухолеспецифичной мутации встречается у 50% субъектов в этой популяции. Популяция субъектов также может страдать от солидных опухолей. Солидные опухоли могут представлять собой светлоклеточную почечно-клеточную карциному (ccRCC), меланому, саркому или рак мочевого пузыря, толстой кишки, головного мозга, молочной железы, головы и шеи, эндометрия, легких, яичников, поджелудочной железы или простаты. Популяция субъектов также может страдать от опухолей жидких тканей. Опухоли жидких тканей могут представлять собой неходжкинскую лимфому или лейкемию.

В другом воплощении такая по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация встречается по меньшей мере у 500 пациентов в год в популяции субъектов, страдающих раком, причем данная по меньшей мере одна мутация может быть представлена мутацией, приведенной для популяции в табл. 9. А по меньшей мере один неоантигенный пептид может быть представлен по меньшей мере одним пептидом, приведенным в табл. 9.

В другом воплощении популяция, страдающая раком, проходит лечение с помощью лекарственного препарата или терапии. Популяция, страдающая раком, ранее могла проходить лечение, в настоящее время проходит лечение или выбрана для лечения ибрутинибом, эрлотинибом, иматинибом, гефитинибом, кризотинибом, трастузумабом, вемурафенибом, RAF/MEK или антиэстрогеновой терапией.

В другом воплощении композиция содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид, способный вызывать иммунный ответ против опухолей, присутствующих по меньшей мере у 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 95% или 99% субъектов в популяции субъектов, страдающих раком.

В другом воплощении по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% субъектов в популяции содержат по меньшей мере одну опухолеспецифичную мутацию, которая присутствует в композиции; и по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% субъектов в популяции содержат по меньшей мере один белок HLA, который связывается с опухолеспецифичным неоэпитопом, присутствующим в композиции.

В одном воплощении опухолеспецифичные мутации включают мутации типа сплайс-вариантов, точечные мутации и/или мутации со сдвигом рамки считывания. В другом воплощении опухолеспецифичные мутации включают мутации типа лекарственной устойчивости. В одном воплощении неоантигенные пептиды включают не только возникающую последовательность мутантного белка неоантигена, но и длинный участок пептида, окружающий и включающий саму мутацию, и охватывают все смежные сегменты внутри него (см. табл. 1-4). В одном воплощении опухолеспецифичные мутации присутствуют в одном или нескольких генах, кодирующих белок, выбранный из группы, состоящей из лиганда-1 запрограммированной смерти клеток (PD-L1), андрогенового рецептора (AR), тирозинкиназы Брутона (BTK), рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), BCR-Abl, c-kit, PIK3CA, HER2, EML4-ALK, KRAS, ALK, ROS1, AKT1, BRAF, MEK1, MEK2, NRAS, RAC1 и ESR1. В одном воплощении опухолеспецифичные мутации присутствуют в одном или нескольких генах, приведенных в любой из представленных здесь таблиц. В одном воплощении по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация получена при альтернативном сплайсинге PD-L1 или AR. В одном воплощении по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация происходит из сплайс-варианта sPD-L1, AR-V1 или AR-V7. В одном воплощении по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация представляет собой мутацию типа лекарственной устойчивости, выбранную из группы, состоящей из BTK/C481S, EGFR/T790M, BCR-Abl/T315I, BCR-Abl/Y253H, BCR-Abl/E255K, BCR-Abl/E255V, c-kit/T670I, PIK3CA/E545K, PIK3CA/E542K, HER2/G776(YVMA), HER2/E545K, EML4-ALK/G1269A, KRAS/G12V/D, ALK/L1196M, ALK/G1202R, ALK/S1206Y, ALK/1151T(ins), ALK/F1174C, ROS1/G2032R, AKT1/E17K, BRAF/V600E, MEK1/Q56P, MEK1/E203K, MEK1/C121S, MEK1/V60E, MEK1/G128V, MEK1/V154I, MEK1/P124S, MEK1/P124L, NRAS/Q61K/L/R, NRAS/T58I, MEK2/C125S, RAC1/P29S, ESR1/S463P, AR/V534E, AR/P535H, AR/L536Q, AR/L536R, AR/Y537C, AR/Y537S, AR/Y537N, AR/D538G и AR/F876L. В одном воплощении мутация типа лекарственной устойчивости индуцируется при лечении ибрутинибом, эрлотинибом, иматинибом, гефитинибом, кризотинибом, трастузумабом, вемурафенибом, RAF/MEK или антиэстрогеновой терапией. В другом воплощении у данного субъекта была мутация типа лекарственной устойчивости еще до лечения.

В другом воплощении композиция включает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 неоантигенных пептидов. Композиция может включать от 15 до 20 неоантигенных пептидов. Композиция может включать более 100, 200 или 300 неоантигенных пептидов. Каждый неоантигенный пептид может содержать от 5 до 50 аминокислот.

В другом воплощении фармацевтическая композиция представляет собой иммуногенную или вакцинную композицию. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать иммуномодулятор или адъювант. Иммунодулятор или адъювант может быть выбран из группы, состоящей из поли-ICLC, ISS 1018, солей алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, циклических динуклеотидов типа STING, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCO Matrix, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel^®, векторных систем, микрочастиц PLGA, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, VEGF Trap, R848, бета-глюкана, Pam3Cys и стимулона QS21 фирмы Aquila.

В другом воплощении фармацевтическая композиция содержит один или несколько неоантигенных пептидов, как определено в табл. 1, 2, 3 или 4.

В одном воплощении каждый опухолеспецифичный неоэпитоп связывается с HLA-A, -B или -C либо с HLA-DRB, HLA-DBM XXXXX со значением K_D менее 500 нМ.

В другом аспекте настоящее изобретение касается способа лечения или профилактики опухолей у нуждающихся в этом субъектов путем введения им любой фармацевтической композиции, как описано здесь.

В одном воплощении предусмотрен способ лечения или профилактики опухолей у нуждающихся в этом пациентов, включающий введение им композиции, содержащей по меньшей мере один неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый носитель, причем каждый по меньшей мере один неоантигенный пептид содержит опухолеспецифичный неоэпитоп, способный связываться с белком HLA у данного субъекта, причем каждый опухолеспецифичный неоэпитоп содержит опухолеспецифичную мутацию, присутствующую в опухоли, при этом композиция содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид, содержащий опухолеспецифичную мутацию, которая присутствует в опухолях по крайней мере у 1% субъектов в популяции субъектов, страдающих раком; композиция содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид, содержащий опухолеспецифичный неоэпитоп, который связывается с белком HLA, присутствующим по меньшей мере у 5% субъектов в популяции субъектов, страдающих раком; и композиция содержит по меньшей мере один неоантигенный пептид, способный вызвать иммунный ответ против опухоли, присутствующей по меньшей мере у 5% субъектов в популяции субъектов, страдающих раком.

В одном воплощении популяция субъектов страдает от адренокортикальной карциномы (ACC), карциномы уротелия мочевого пузыря (BLCA), инвазивной карциномы молочной железы (BRCA), плоскоклеточной карциномы шейки матки и эндоцервикальной аденокарциномы (CESC), аденокарциномы толстой кишки (COAD), хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL), колоректального рака (CRC), диффузной крупно-B-клеточной лимфомы (DLBCL), мультиформной глиобластомы (GBM), плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSC), хромофобного рака почек (KICH), светлоклеточной карциномы почек (KIRC), папиллярноклеточной карциномы почек (KIRP), острой миелоидной лейкемии (LAML), гепатоцеллюлярной карциномы печени (LIHC), аденокарциномы легких (LUAD), плоскоклеточной карциномы легких (LUSC), множественной миеломы (ММ), серозной цистаденокарциномы яичников (OV), аденокарциномы поджелудочной железы (PAAD), аденокарциномы простаты (PRAD), аденокарциномы прямой кишки (READ), кожной меланомы (SKCM), аденокарциномы желудка (STAD), опухолей половых клеток яичек (TGCT), аденокарциномы щитовидной железы (THCA), эндометриоидной карциномы стенки матки (UCEC) или карциносаркомы матки (UCS). В одном воплощении популяция субъектов страдает от солидной опухоли. Солидные опухоли могут представлять собой светлоклеточную почечно-клеточную карциному (ccRCC), меланому, саркому или рак мочевого пузыря, толстой кишки, головного мозга, молочной железы, головы и шеи, эндометрия, легких, яичников, поджелудочной железы или простаты. В одном воплощении популяция субъектов страдает от опухолей жидких тканей. Опухоли жидких тканей могут представлять собой неходжкинскую лимфому или лейкемию.

В одном воплощении популяция, страдающая раком, проходила лечение, проходит лечение или выбрана для лечения ибрутинибом, эрлотинибом, иматинибом, гефитинибом, кризотинибом, трастузумабом, вемурафенибом, RAF/MEK или антиэстрогеновой терапией.

В одном воплощении композиция данный по меньшей мере один неоантигенный пептид способен вызвать иммунный ответ против опухолей, присутствующих по меньшей мере у 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% субъектов в популяции субъектов, страдающих раком. В одном воплощении по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% субъектов в популяции содержат по меньшей мере одну опухолеспецифичную мутацию, которая присутствует в композиции; и по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% субъектов в популяции содержат по меньшей мере один белок HLA, который связывается с опухолеспецифичным неоэпитопом, присутствующим в композиции.

В одном воплощении опухолеспецифичные мутации включают мутации типа сплайс-вариантов, точечные мутации и/или мутации со сдвигом рамки считывания. Опухолеспецифичные мутации могут представлять собой мутации типа лекарственной устойчивости. Опухолеспецифичные мутации могут присутствовать в одном или нескольких генах, кодирующих белок, выбранный из группы, состоящей из лиганда-1 запрограммированной смерти клеток (PD-L1), андрогенового рецептора (AR), тирозинкиназы Брутона (BTK), рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), BCR-Abl, c-kit, PIK3CA, HER2, EML4-ALK, KRAS, ALK, ROS1, AKT1, BRAF, MEK1, MEK2, NRAS, RAC1 и ESR1. Опухолеспецифичные мутации могут присутствовать в одном или нескольких генах, приведенных в любой из представленных таблиц. По меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация может быть получена при альтернативном сплайсинге PD-L1 или AR. По меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация может быть получена из сплайс-варианта sPD-L1, AR-V1 или AR-V7.

В одном воплощении по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация представляет собой мутацию типа лекарственной устойчивости, выбранную из группы, состоящей из BTK/C481S, EGFR/T790M, BCR-Abl/T315I, BCR-Abl/Y253H, BCR-Abl/E255K, BCR-Abl/E255V, c-kit/T670I, PIK3CA/E545K, PIK3CA/E542K, HER2/G776 (YVMA), HER2/E545K, EML4-ALK/G1269A, KRAS/G12V/D, ALK/L1196M, ALK/G1202R, ALK/S1206Y, ALK/1151T(ins), ALK/F1174C, ROS1/G2032R, AKT1/E17K, BRAF/V600E, MEK1/Q56P, MEK1/E203K, MEK1/C121S, MEK1/V60E, MEK1/G128V, MEK1/V154I, MEK1/P124S, MEK1/P124L, NRAS/Q61K/L/R, NRAS/T58I, MEK2/C125S, RAC1/P29S, ESR1/S463P, AR/V534E, AR/P535H, AR/L536Q, AR/L536R, AR/Y537C, AR/Y537S, AR/Y537N, AR/D538G и AR/F876L. Мутация типа лекарственной устойчивости может индуцироваться при лечении ибрутинибом, эрлотинибома, иматинибом, гефитинибом, кризотинибом, трастузумабом, вемурафенибом, RAF/MEK или при антиэстрогеновой терапии.

В другом воплощении композиция содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 неоантигенных пептидов. В предпочтительном воплощении композиция содержит от 15 до 20 неоантигенных пептидов.

В другом воплощении каждый неоантигенный пептид содержит от 5 до 50 аминокислот.

В другом воплощении фармацевтическая композиция представляет собой иммуногенную или вакцинную композицию. К примеру, фармацевтическая композиция может содержать иммуномодулятор или адъювант. Иммунодулятор или адъювант может быть выбран из группы, состоящей из поли-ICLC, ISS 1018, солей алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, циклических динуклеотидов типа STING, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCO Matrix, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel^®, векторных систем, микрочастиц PLGA, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, VEGF Trap, R848, бета-глюкана, Pam3Cys и стимулона QS21 фирмы Aquila.

В одном воплощении фармацевтическая композиция содержит один или несколько неоантигенных пептидов, как определено в табл. 1, 2, 3 или 4.

В одном воплощении каждый опухолеспецифичный неоэпитоп связывается с HLA-A, -B или -C либо с HLA-DRB, HLA-DBM XXXXX со значением K_D менее 500 нМ.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ профилактики рака, включающий выбор противоракового препарата для нуждающегося в этом пациента, причем препарат выбирают из группы, состоящей из ибрутиниба, эрлотиниба, иматиниба, гефитиниба, кризотиниба, трастузумаба, вемурафениба, RAF/MEK и антиэстрогеновой терапии; и введение его профилактически данному лицу до того, как могут проявиться лекарственно-устойчивые мутации, причем фармацевтическая композиция содержит неоантигенные пептиды, полученные при лекарственно-устойчивых мутациях, связанных с выбранным противораковым препаратом.

Иммуногенная композиция общих неоантигенов может вводиться в виде субкомпозиций, каждая из которых содержит часть неоантигенов, причем субкомпозиции могут вводиться в разные места у данного лица или пациента; к примеру, композиция, содержащая 20 различных неоантигенов, может вводиться в виде четырех (4) субкомпозиций, каждая из которых содержит 5 из 20 различных неоантигенов, причем четыре (4) субкомпозиции могут вводиться таким образом, чтобы каждая субкомпозиция попадала в отдельный комплект дренирующих лимфатических узлов пациента, например, в каждую руку и ногу (например, в бедро или верхнюю часть бедра или вблизи ягодиц либо в нижнюю часть спины на каждой стороне пациента) с тем, чтобы в каждый комплект дренирующих лимфатических узлов данного пациента или лица попадало меньше неоантигенов и тем самым ограничивалась конкуренция между неоантигенами. Разумеется, количество мест и тем самым количество субкомпозиций может варьироваться, например, квалифицированный специалист может рассмотреть возможность введения в селезенку или вблизи нее, чтобы иметь пятую точку введения, причем квалифицированный специалист может менять места с тем, чтобы использовать только одно, два или три (например, каждая рука и нога, каждая нога и одна рука, каждая нога без рук или только обе руки). Иммуногенная композиция общих неоантигенов, которая вводится через различные вышеуказанные интервалы, может представлять собой различные лекарственные формы, а субкомпозиции, которые вводятся в разные места у данного лица или пациента при одном введении, могут быть различными композициями. Например, первое введение может состоять из целой иммуногенной композиции общих неоантигенов, а следующее или более позднее введение может состоять из вектора (например, вирусного вектора или плазмиды), экспрессирующего антиген (антигены) in vivo. Также при введении различных субкомпозиций в разные места у данного пациента или субъекта какие-то субкомпозиции могут содержать целый антиген, а какие-то – вектор (например, вирусный вектор или плазмиду), экспрессирующий антиген (антигены) in vivo. А некоторые композиции и субкомпозиции могут содержать и векторы (например, вирусные векторы или плазмиды), которые обеспечивают экспрессию антигенов in vivo, и целые антигены. Некоторые векторы (например, поксвирусы), которые обеспечивают экспрессию антигенов in vivo, могут оказывать иммуностимулирующее или адъювантное действие, поэтому композиции или субкомпозиции, содержащие такие векторы, могут сами служить адъювантами. Кроме того, изменяя природу того, как антигены презентируются иммунной системе, введение может “запускать”, а затем “усиливать” иммунную систему. В настоящем описании при упоминании “вакцины” подразумевается, что изобретение охватывает иммуногенные композиции, а при упоминании пациентов или субъектов подразумевается, что они являются пациентами или субъектами, нуждающимися в раскрытых здесь способах лечения, введения, композициях и вообще в данном изобретении.

Кроме того, изобретение касается применения экспрессирующих векторов любого типа, как-то вирусных экспрессирующих векторов, например, поксвирусов (например, ортопоксвирусов или авипоксвирусов типа вируса осповакцины, включая модифицированный вирус Ankara или MVA, MVA-BN, NYVAC согласно WO-A-92/15672, вирусов птичьей оспы, например, TROVAX, поксвируса канарейки, например, ALVAC (WO-A-95/27780 и WO-A-92/15672), поксвируса голубей, свиной оспы и т.п.), аденовирусов, AAV, герпесвирусов и лентивирусов; либо плазмид или векторов из молекул ДНК или нуклеиновой кислоты. Предпочтительными могут быть такие векторы, которые являются цитоплазматическими, типа поксвирусных векторов. Однако аденовирусы, AAV и лентивирусы также могут быть предпочтительными для применения в настоящем изобретении.

В готовых для применения, в особенности восстановленных иммуногенных композициях общих неоантигенов вектор, например, вирусный вектор, присутствует в таких количествах, которые устанавливаются специалистами из данного описания и познаний в данной области (типа приведенной здесь патентной и научной литературы).

Полный антиген или вектор, например, рекомбинантные живые вакцины, могут находиться в лиофилизованном виде, позволяющем их хранение и восстановление непосредственно перед использованием в растворителе или эксципиенте, который может включать адъювант, как уже обсуждалось.

Итак, предметом изобретения также является комплект или набор для вакцинации или иммунизации, содержащий в отдельных упаковках лиофилизированную вакцину и раствор, предпочтительно включающий адъювантное соединение, как уже обсуждалось, для восстановления лиофилизованной вакцины.

Предметом изобретения также является способ вакцинации или иммунизации, в основном состоящий или состоящий или включающий введение, например, парентерально, предпочтительно подкожно, внутримышечно или внутрикожно либо мукозально вакцины или иммуногенной композиции по изобретению за один или несколько раз. Необязательно этот способ включает предварительную стадию восстановления лиофилизованной иммуногенной композиции общих неоантигенов (например, если лиофилизирован полный антиген или вектор) в растворе, преимущественно также включающем адъювант.

В одном воплощении иммуногенная композиция общих неоантигенов вводится в дозе от 10 мкг до 1 мг на 70 кг массы индивидуума по каждому неоантигенному пептиду. В другом воплощении иммуногенная композиция общих неоантигенов вводится еженедельно в дозе от 10 мкг до 2000 мкг на 70 кг массы индивидуума по каждому неоантигенному пептиду. В другом соответствующем воплощении введение проводится внутривенно. В одном воплощении иммуногенная композиция общих неоантигенов вводится внутривенно или подкожно.

В другом воплощении способ дополнительно включает: (а) получение образца опухолевой ткани от каждого субъекта; (b) выявление одной или нескольких опухолеспецифичных мутаций в образце; и (c) выбор субъекта из популяции субъектов для лечения с помощью по меньшей мере одного неоантигенного пептида, если в образце от субъекта выявляется по меньшей мере одна из опухолеспецифичных мутаций.

В другом воплощении способ дополнительно включает: (а) определение аллотипов HLA у каждого субъекта; и (b) выбор субъекта из популяции субъектов для лечения с помощью по меньшей мере одного неоантигенного пептида, если у субъекта один или несколько аллотипов HLA связываются с одним или несколькими опухолеспецифичными неоэпитопами, присутствующими по меньшей мере в одном неоантигенном пептиде.

Воплощения настоящего изобретения касаются композиций и способов с использованием таких общих неоантигенов, которые (в отличие от общих нативных (не мутантных) антигенов, полученных из генов, экспрессирующихся дифференцированно в опухолях) обладают требуемыми свойствами, как-то не подверженности ослабляющим иммунитет эффектам центральной толерантности и высокой опухолеспецифичности. Это связано с тем, что неоантигены экспрессируются только в опухолевой ткани, например, они возникают при опухолеспецифичных мутациях или дефектах сплайсинга. Такие варианты сплайсинга или мутации могут генерировать иммуногенные эпитопы по различным аллелям HLA, тем самым охватывая значительную часть популяции. Более того, поскольку эти мутации могут присутствовать у значительной части субъектов, страдающих раком, описанные здесь композиции не требуют секвенирования всего генома субъектов и могут применяться в виде “готового” продукта для лечения многих субъектов. Например, способ может просто включать выявление в образцах опухолей субъектов одной или нескольких конкретных мутаций, присутствующих в композиции, и введение композиции тем субъектам, у которых имеется по меньшей мере одна мутация. Этим он отличается от методов, в которых применяются смеси неонатигенов, специфичные для пациента, которые требуют секвенирования всего генома или всего экзома у каждого субъекта и получения персонализованных лечебных композиций.

Другие воплощения касаются комбинированной терапии, при которой способы лечения с помощью композиций общих неоантигенов по настоящему изобретению применяются в сочетании с текущей схемой приема лекарственных средств. Композиции общих неоантигенов можно вводить профилактически. В одном воплощении нуждающиеся в этом пациенты подвергаются химиотерапии и/или таргетной терапии в сочетании с иммуногенной композицией общих неоантигенов до того, как будет выявлена мутация типа лекарственной устойчивости. Иммуногенная композиция общих неоантигенов может быть адаптирована так, чтобы она включала пептиды неоантигенов, специфичных к мутациям типа резистентности, связанным с выбранной терапией. В другом воплощении композиция общих неоантигенов вводится еще до того, как субъект будет подвергаться химиотерапии и/или таргетной терапии с тем, чтобы вызвать иммунный ответ на клетки, несущие мутацию типа лекарственной устойчивости, еще до того, как возникнут такие клетки. Введение может осуществляться периодически или последовательно либо практически в одно и то же время или практически одновременно. Например, введение иммуногенной композиции общих неоантигенов и проведение противораковой терапии может осуществляться примерно в одно и то же время или практически одновременно. С другой стороны, введение иммуногенной композиции общих неоантигенов может осуществляться по разовой схеме, например, один раз в неделю, в две недели, в три недели, раз в месяц, в два месяца, в квартал (каждые три месяца), каждую треть года (каждые четыре месяца), раз в пять месяцев, два раза в год (каждые шесть месяцев), один раз в семь месяцев, в восемь месяцев, в девять месяцев, в десять месяцев, в одиннадцать месяцев, раз в год и т.д., а проведение противораковой терапии может осуществляться по другой схеме, которая характерна для этой терапии, так что у субъекта или пациента будет две разных схемы лечения одновременно, а введение иммуногенной композиции общих неоантигенов и проведение противораковой терапии может осуществляться периодически или последовательно. В предпочтительных воплощениях субъект может проходить лечение ибрутинибом, эрлотинибом, иматинибом, гефитинибом, кризотинибом, трастузумабом, вемурафенибом, ингибитором RAF/MEK или антиэстрогеновой терапией.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ диагностики для раннего выявления и отслеживания развития рака путем определения присутствия по меньшей мере одного неоантигенного пептида по настоящему изобретению в образцах пациентов. Образцы пациентов могут быть получены из крови, мокроты, слюны, мочи, опухолевой ткани, лимфатической жидкости, спермы или кала.

В одном воплощении способ диагностики применяется до введения композиции общих неоантигенов, как описано здесь. Способ диагностики может включать в себя сравнение содержания мутаций совмещенных неоантигенов в серии из по меньшей мере двух образцов, взятых во время проведения противораковой терапии и/или лечения с помощью композиции общих неоантигенов. Не ограничиваясь теорией, повышение или уменьшение содержания мутаций общих неоантигенов может использоваться для определения эффективности лечения.

В одном воплощении мутантные гены выявляются с помощью методов на основе ПЦР или секвенирования. Можно использовать ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) для выявления мутаций в транскрибируемых генах неоантигенов. Кроме того, для выявления наличия мутаций можно использовать любые методы секвенирования. В предпочтительном воплощении используется пиросеквенирование. Настоящим изобретением также предусмотрены наборы, который включают праймеры, специфичные для последовательностей, охватывающих неоантигенные мутации.

В другом воплощении мутантные гены выявляются методами иммунологического обнаружения. Для выявления мутаций можно использовать антитела, специфичные для мутаций общих неоантигенов. Антитела могут быть связаны на матрице. Матрица может включать антитела для выявления более чем одной мутации общих неоантигенов настоящего изобретения. Антитела могут быть приспособлены для использования в методе ELISA. Следовательно, может предусматриваться композиция или набор, который включает антитела, специфически распознающие общие неоантигены настоящего изобретения.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или профилактики опухолей в популяции нуждающихся в этом субъектов, включающий введение субъектам средства, содержащего внеклеточный лиганд-связывающий домен, распознающий опухолеспецифичный неоэпитоп, содержащий опухолеспецифичную мутацию, которая встречается по меньшей мере у 1% субъектов в популяции. Средство может представлять собой антитело, фрагмент антитела, конъюгат антитело-препарат, аптамер, CAR или T-клеточный рецептор. Антитела или фрагменты антител могут быть гуманизированными, полностью человеческими или химерными. Фрагменты антител могут представлять собой наночастицы, Fab, Fab′, (Fab′)₂, Fv, scFv, диатела, триатела, тетратела, bis-scFv, минитела, Fab₂- или Fab₃-фрагменты. Опухолеспецифичные мутации могут представлять собой мутации, приведенные для любых популяций в табл. 9. Опухолеспецифичные мутации могут находиться внутри генов, содержащих внеклеточные домены. Опухолеспецифичные мутации могут быть представлены FGFR3 S249C, ERBB3 V104M, EGFR L858R, MUC4 H4205Q, PDGFRA R483fs, TMEM52 23_26LLPL>L или PODXL 28_30PSP>P. Опухолеспецифичные мутации могут находиться во внеклеточных доменах. Опухолеспецифичные мутации включают FGFR3 S249C или ERBB3 V104M. Не ограничиваясь теорией, наличие неоэпитопа у белка с внеклеточным доменом позволяет этому неоэпитопу презентироваться на поверхности клетки. Не ограничиваясь теорией, наличие неоэпитопа во внеклеточном домене позволяет неоэпитопу презентироваться на поверхности клетки.

Далее изобретение будет описано при помощи следующих пронумерованных пунктов.

1. Выделенный неоантигенный пептид, включающий опухолеспецифичный неоэпитоп, приведенный в табл. 1-9, причем выделенный неоантигенный пептид не является нативным полипептидом.

2. Выделенный неоантигенный пептид длиною в 100 аминокислот или меньше, который включает опухолеспецифичный неоэпитоп, приведенный в табл. 1-9.

3. Выделенный неоантигенный пептид по п. 1 или 2, длина которого составляет от 5 до 50 аминокислот.

4. Выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 1-3, длина которого составляет от 15 до 35 аминокислот.

5. Выделенный неоантигенный пептид по п. 4, длина которого составляет около 15 аминокислот или меньше.

6. Выделенный неоантигенный пептид по п. 5, длина которого составляет от 8 до 11 аминокислот.

7. Выделенный неоантигенный пептид по п. 6, длина которого составляет 9 или 10 аминокислот.

8. Выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 1-7, который связывается с главным комплексом гистосовместимости (MHC) класса I.

9. Выделенный неоантигенный пептид по п. 8, который связывается с MHC класса I со сродством связывания менее 500 нМ.

10. Выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 1-3, длина которого составляет около 30 аминокислот или меньше.

11. Выделенный неоантигенный пептид по п. 10, длина которого составляет от 6 до 25 аминокислот.

12. Выделенный неоантигенный пептид по п. 11, длина которого составляет от 15 до 24 аминокислот.

13. Выделенный неоантигенный пептид по п. 11, длина которого составляет от 9 до 15 аминокислот.

14. Выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 1-3 и 10-13, который связывается с MHC класса II.

15. Выделенный неоантигенный пептид по п. 14, который связывается с MHC класса II со сродством связывания менее 1000 нМ.

16. Выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 1-15, дополнительно содержащий фланкирующие аминокислоты.

17. Выделенный неоантигенный пептид по п. 16, при этом фланкирующие аминокислоты не являются нативными фланкирующими аминокислотами.

18. Выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 1-17, который соединяется по меньшей мере со вторым неоантигенным пептидом.

19. Выделенный неоантигенный пептид по п. 18, при этом пептиды соединяются с помощью полиглицинового или полисеринового линкера.

20. Выделенный неоантигенный пептид по п. 18 или 19, при этом второй неоантигенный пептид связывается с MHC класса I или класса II со сродством связывания менее 1000 нМ.

21. Выделенный неоантигенный пептид по п. 20, при этом второй неоантигенный пептид связывается с MHC класса I или класса II со сродством связывания менее 500 нМ.

22. Выделенный неоантигенный пептид по п. 20 или 21, при этом оба неоэпитопа связываются с человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA) -A, -B, -C, -DP, -DQ или ‑DR.

23. Выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 20-22, при этом выделенный неоантигенный пептид и второй неоантигенный пептид связываются с HLA класса I или же выделенный неоантигенный пептид и второй неоантигенный пептид связываются с HLA класса II.

24. Выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 20-22, при этом выделенный неоантигенный пептид связывается с HLA класса II, а второй неоантигенный пептид связывается с HLA класса I, или же выделенный неоантигенный пептид связывается с HLA класса I, а второй неоантигенный пептид связывается с HLA класса II.

25. Выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 1-24, дополнительно включающий модификации, которые увеличивают период полужизни in vivo, клеточный таргетинг, поглощение антигена, процессинг антигена, сродство к MHC, устойчивость к MHC или презентирование антигена.

26. Выделенный неоантигенный пептид по п. 25, при этом модификация представляет собой конъюгирование с белком-носителем, конъюгирование с лигандом, конъюгирование с антителом, ПЭГилирование, полисиалилирование, HESилирование, рекомбинантные PEG-миметики, слияние с Fc, слияние с альбумином, присоединение к наночастицам, инкапсулирование в наночастицах, присоединение холестерина, включение железа, ацилирование, амидирование, гликозилирование, окисление боковой цепи, фосфорилирование, биотинилирование, присоединение поверхностно-активного вещества, добавление аминокислотных миметиков или добавление неприродных аминокислот.

27. Выделенный неоантигенный пептид по п. 25, при этом клетки, которые подвергаются таргетингу, представлены антиген-презентирующими клетками.

28. Выделенный неоантигенный пептид по п. 27, при этом антиген-презентирующие клетки представлены дендритными клетками.

29. Выделенный неоантигенный пептид по п. 29, при этом дендритные клетки подвергаются таргетингу с помощью маркера CD141, DEC205 или XCR1.

30. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один неоантигенный пептид и фармацевтически приемлемый носитель, причем каждый по меньшей мере один неоантигенный пептид содержит опухолеспецифичный неоэпитоп, способный связываться с белком HLA у субъекта, а каждый опухолеспецифичный неоэпитоп содержит опухолеспецифичную мутацию, присутствующую в опухоли, при этом:

(a) композиция включает по меньшей мере один неоантигенный пептид, содержащий опухолеспецифичную мутацию, присутствующую в опухоли по меньшей мере у 1% лиц в популяции субъектов, страдающих раком;

(b) композиция включает по меньшей мере один неоантигенный пептид, содержащий опухолеспецифичный неоэпитоп, который связывается с белком HLA, присутствующим по меньшей мере у 5% лиц в популяции субъектов, страдающих раком; или

(c) композиция включает по меньшей мере один неоантигенный пептид, способный вызвать иммунный ответ против опухоли, присутствующей по меньшей мере у 5% лиц в популяции субъектов, страдающих раком.

31. Фармацевтическая композиция по п. 30, при этом популяция субъектов страдает от адренокортикальной карциномы (ACC), карциномы уротелия мочевого пузыря (BLCA), инвазивной карциномы молочной железы (BRCA), плоскоклеточной карциномы шейки матки и эндоцервикальной аденокарциномы (CESC), аденокарциномы толстой кишки (COAD), хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL), колоректального рака (CRC), диффузной крупно-B-клеточной лимфомы (DLBCL), мультиформной глиобластомы (GBM), плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSC), хромофобного рака почек (KICH), светлоклеточной карциномы почек (KIRC), папиллярноклеточной карциномы почек (KIRP), острой миелоидной лейкемии (LAML), гепатоцеллюлярной карциномы печени (LIHC), аденокарциномы легких (LUAD), плоскоклеточной карциномы легких (LUSC), множественной миеломы (ММ), серозной цистаденокарциномы яичников (OV), аденокарциномы поджелудочной железы (PAAD), аденокарциномы простаты (PRAD), аденокарциномы прямой кишки (READ), кожной меланомы (SKCM), аденокарциномы желудка (STAD), опухолей половых клеток яичек (TGCT), аденокарциномы щитовидной железы (THCA), эндометриоидной карциномы стенки матки (UCEC) или карциносаркомы матки (UCS).

32. Фармацевтическая композиция по п. 30 или 31, при этом популяция, страдающая раком, проходила лечение, проходит лечение или выбрана для лечения противораковым средством, необязательно ибрутинибом, эрлотинибом, иматинибом, гефитинибом, кризотинибом, трастузумабом, вемурафенибом, ингибитором RAF/MEK или антиэстрогеновой терапией.

33. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-33, при этом опухолеспецифичные мутации включают мутации типа сплайс-вариантов, точечные мутации и/или мутации со сдвигом рамки считывания.

34. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-33, при этом по меньшей мере один неоантигенный пептид включает по меньшей мере один неоантигенный пептид, полученный из длинного участка пептида, фланкирующего и включающего в себя опухолеспецифичную мутацию, в который входят все смежные сегменты в пределах длинного пептида.

35. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-34, при этом опухолеспецифичные мутации присутствуют в одном или нескольких генах, представленных в табл. 1-9.

36. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-35, при этом композиция включает по меньшей мере один неоантигенный пептид, приведенный в любой из таблиц 1-9.

37. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом опухолеспецифичные мутации присутствуют в одном или нескольких генах, кодирующих белок, выбранный из группы, состоящей из лиганда-1 запрограммированной смерти клеток (PD-L1), андрогенового рецептора (AR), тирозинкиназы Брутона (BTK), рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), BCR-Abl, c-kit, PIK3CA, HER2, EML4-ALK, KRAS, ALK, ROS1, AKT1, BRAF, MEK1, MEK2, NRAS, RAC1 и ESR1.

38. Фармацевтическая композиция по п. 37, при этом по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация возникла при альтернативном сплайсинге PD-L1 или AR.

39. Фармацевтическая композиция по п. 38, при этом по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация возникла из сплайс-варианта sPD-L1, AR-V1 или AR-V7.

40. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-39, при этом опухолеспецифичные мутации включают мутации типа лекарственной устойчивости.

41. Фармацевтическая композиция по п. 40, при этом по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация представляет собой мутацию типа лекарственной устойчивости, выбранную из группы, состоящей из BTK/C481S, EGFR/T790M, BCR-Abl/T315I, BCR-Abl/Y253H, BCR-Abl/E255K, BCR-Abl/E255V, c-kit/T670I, PIK3CA/E545K, PIK3CA/E542K, HER2/G776(YVMA), HER2/E545K, EML4-ALK/G1269A, KRAS/G12V/D, ALK/L1196M, ALK/G1202R, ALK/S1206Y, ALK/1151T(ins), ALK/F1174C, ROS1/G2032R, AKT1/E17K, BRAF/V600E, MEK1/Q56P, MEK1/E203K, MEK1/C121S, MEK1/V60E, MEK1/G128V, MEK1/V154I, MEK1/P124S, MEK1/P124L, NRAS/Q61K/L/R, NRAS/T58I, MEK2/C125S, RAC1/P29S, ESR1/S463P, AR/V534E, AR/P535H, AR/L536Q, AR/L536R, AR/Y537C, AR/Y537S, AR/Y537N, AR/D538G и AR/F876L.

42. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-41, при этом по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация встречается по меньшей мере у 500 пациентов в год в популяции лиц, страдающих раком, причем данная по меньшей мере одна мутация включает мутации, приведенные для популяции в табл. 9.

43. Фармацевтическая композиция по п. 42, при этом по меньшей мере один неоантигенный пептид включает по меньшей мере один пептид, приведенный в табл. 9.

44. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от CLL; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из SF3B1:p.K700E, MYD88:p.L273P, NOTCH1:p.P2514fs, ABCA11P:p.E901D, AHNAK:p.D3823E, ZNF814:p.E348D, AHNAK:p.V1220I, AHNAK:p.H1203N, ANKRD30A:p.A232V, APOOL:p.I138L, EGR2:p.H397N, MKI67:p.H2213D, NRAS:p.Q61R, PLIN4:p.M691V, XPO1:p.E571K, ZCRB1:p.L76F, ZNF700:p.N652H, ZNF700:p.Q654R, ZNF844:p.D458H, AHNAK:p.A4046V, ANKRD36:p.P337R, C1orf170:p.T203I, CAST:p.D639E, EGR2:p.E369K, GPR123:p.L630P, IKZF3:p.L162R, MUC4:p.P4224R, OR9Q1:p.M34L, PKD2:p.Y486F, PRAMEF11:p.R104Q, SYNJ1:p.I681F, TP53:p.R248Q, TP53:p.R248W, TRPV2:p.L627del, ZNF254:p.S498A, ZNF732:p.A459T, ZNF749:p.E530Q, ZNF845:p.M423I, ABCA11P:p.G900E, ACRC:p.E243D, ACRC:p.A244V, ACSL3:p.T188S, ADAMTS2:p.D948N, AGAP6:p.S127I, AHNAK:p.A2114G, ANKRD36:p.D1014Y, ARID3A:p.G550fs, ARID4A:p.D1154E, ATP2B4:p.R183H, ATRNL1:p.L1244F, BNC1:p.Y937N, BRAF:p.K601N, BTLA:p.Q86K, C14orf177:p.G90V, C2orf44:p.N456K, C3orf15:p.R552Q, CACNA2D1:p.Y376N, CALD1:p.E340K, CCDC15:p.P488H, CCDC79:p.N440T, CCNB3:p.A932T, CD109:p.L470Q, CD209:p.Q189L, CKAP2:p.*684K, CMA1:p.I81K, CMIP:p.A230T, CNTNAP4:p.I12F, CRYM:p.*315K, DICER1:p.E1705K, DPCR1:p.L716P, EIF3A:p.M1093L, EIF4G3:p.R8H, ETFDH:p.I281F, EWSR1:p.Y656C, F5:p.L1332P, F5:p.L1253F, FAM50A:p.H317R, FBXL13:p.S102R, FBXW7:p.R465H, FHL1:p.D184E, FILIP1:p.I522K, FRG1B:p.Q39K, GNB1:p.I80T, GPR110:p.R443G, GPR98:p.Y6152F, HDGFL1:p.188_189insA, IGF2BP2:p.T186S, IL1R2:p.L364fs, KIAA1109:p.L4680P, KRAS:p.G13D, KRTAP19-1:p.G61S, MAF:p.G53fs, MAGEC1:p.L609H, MAP2K1:p.K57N, MED12:p.L36R, MED12:p.G44S, METAP2:p.Y137N, METTL9:p.Y57F, MGP:p.V15L, MKI67:p.R2222K, MUC16:p.T11005I, MUC4:p.S3941N, MUC4:p.S3941G, MUC4:p.V3091L, MUC4:p.S2951Y, MUC4:p.A2841S, MUC4:p.S2760A, MUC4:p.T2335M, MUC4:p.T1627K, MUC4:p.T1547S, MUC4:p.H1133Q, MYD88:p.M240T, NEDD4L:p.P194del, NEFH:p.S704T, NRG4:p.G21fs, OR2A25:p.S105C, OR4C16:p.Y63F, OR4N4:p.L150fs, PABPC1:p.K254fs, PIWIL1:p.P372fs, PLCD3:p.E499fs, PLEKHB1:p.S146P, PPIL4:p.S382R, PRDM4:p.*802K, PRG4:p.N675H, PRKAB1:p.P104H, R3HDM2:p.S592G, R3HDM2:p.S588N, R3HDM2:p.R206W, RPS2:p.R200G, RPTN:p.G364S, SF3B1:p.K666E, SF3B1:p.N626Y, SF3B1:p.Y623C, SIX3:p.I27L, SLC39A7:p.L456fs, SLC6A9:p.R94K, TFG:p.A382V, TGOLN2:p.K83R, TGOLN2:p.T80S, TLR2:p.D327V, TNKS2:p.T619fs, TP53:p.R273H, TP53:p.C242F, TP53:p.R175H, TWISTNB:p.H306Q, UBXN7:p.A276V, WDR78:p.N110K, XIRP2:p.V3008E, ZNF382:p.H186Q, ZNF578:p.R306H, ZNF578:p.G311S, ZNF578:p.H334R, ZNF700:p.S649C, ZNF705A:p.D298N, ZNF836:p.K608Q и ZNF836:p.I571N.

45. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от BLCA; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из PIK3CA:p.E545K, FGFR3:p.S249C, TP53:p.R248Q, PIK3CA:p.E542K, RXRA:p.S427F, ZNF814:p.D404E, FBXW7:p.R505G, NOTCH2:p.P6fs, TP53:p.E285K, ANKRD30A:p.A353P, C3orf70:p.S6L, EFCAB6:p.R379K, ERCC2:p.N238S, FAM47C:p.Q225E, FOXQ1:p.S135L, HLA-A:p.Q78R, MUC4:p.H4205Q, OTUD4:p.T909I, SLAMF1:p.S277fs, SPRED3:p.S128del, TMCO2:p.S15fs, TP53:p.R280T, TP53:p.E271K, TP53:p.A159V, ZNF706:p.I8N, ZNF706:p.R3P, ACACB:p.E2318Q, ACPP:p.E321K, ACRC:p.A264V, ADAMTS2:p.23_24insL, AFF3:p.E919K, AHNAK:p.S4150F, AHNAK:p.D2889H, AHNAK:p.V1940A, ALX4:p.R126Q, ANKRD12:p.E627K, ANKRD32:p.T999N, ARID1A:p.S614L, ASXL2:p.117_118SS>S, ATP12A:p.R858C, ATP9A:p.R519Q, BCAS3:p.T214M, BPI:p.M255I, CACNG8:p.V146G, CAMSAP1:p.T466fs, CDC27:p.I91fs, CDKN1A:p.E44fs, CEP192:p.S2058L, CGB8:p.T18A, CHRNA3:p.L23del, CHST4:p.D352N, CLIP1:p.S1018fs, COX6A1:p.S8L, CREBBP:p.D1435H, CRIPAK:p.M48fs, CSPG5:p.D119N, CUL1:p.E485K, DLC1:p.S741T, DLL3:p.D318H, DOPEY2:p.E1196K, ECM1:p.E266K, EEF1A2:p.Y418S, EEF2K:p.E673K, EMILIN1:p.R27G, ERBB2:p.S310F, ERBB3:p.M91I, ERBB3:p.V104L, ERBB3:p.D297Y, ERCC2:p.Y14C, FAM155A:p.Q86del, FAM43B:p.E272del, FASTKD3:p.Q625E, FBXW7:p.S546L, FGFR3:p.R248C, FGFR3:p.G380R, FGFRL1:p.H479fs, GBE1:p.M587I, GIMAP1-GIMAP5:p.S311C, GNA13:p.R200G, H1FOO:p.A214fs, HEATR7B2:p.E1109K, HIST1H1D:p.I81M, HRAS:p.G12D, HRCT1:p.H92P, ILF3:p.E484K, KCNK2:p.S6W, KIAA0907:p.Q446P, KIF23:p.E350K, KLF5:p.S118L, KLHL15:p.D185G, LAMA4:p.E639K, LILRA1:p.H410Y, LILRB1:p.L479del, LLGL2:p.P955fs, LPIN1:p.S974L, LRRC16A:p.D227N, LRTM2:p.S139L, LURAP1L:p.55_56insGGG, MAGEC1:p.P553del, MCL1:p.E171del, MN1:p.S472L, MUC7:p.A191V, MVP:p.E412K, NBPF10:p.E3455K, NFE2L2:p.E79K, NFE2L2:p.R34G, NOS1AP:p.Q306del, OR2T35:p.V319fs, OR4N2:p.L150fs, PABPC3:p.K333fs, PAX3:p.S197L, PBX2:p.E70K, PBXIP1:p.H729del, PCDP1:p.E537K, PEX1:p.I370fs, PHLDA3:p.E82K, PLEKHM2:p.S459L, PLVAP:p.A321V, POLR3B:p.L372F, POTEC:p.R477Q, PPL:p.H326Y, PPP1R15A:p.E196K, PRDM16:p.E271Q, PRIC285:p.E1289Q, PRMT8:p.S31P, PUF60:p.S396L, RAB11FIP4:p.S596L, RAD51C:p.D167N, RAD51C:p.Y224H, RALGPS1:p.R381Q, RARS2:p.R6C, RBM26:p.P644A, RERE:p.K176N, RXRA:p.S427Y, SERPINA12:p.R211G, SF3B1:p.E902K, SLC6A9:p.R243W, SLC9A5:p.L447F, SPESP1:p.F121L, SRPRB:p.G14S, SYN2:p.A34del, SYTL2:p.I440M, TAB3:p.R211T, TAF1B:p.R292C, TAOK2:p.L981del, TAS1R3:p.E525K, TAS2R9:p.E163Q, TBC1D1:p.S71F, TBC1D2B:p.R920Q, TFPI2:p.R222C, TM6SF1:p.S15W, TMEM131:p.K640fs, TMEM19:p.G331fs, TP53:p.R273C, TP53:p.R248W, TP53:p.R175H, TP53:p.K132N, TRAM1:p.E41Q, TSKS:p.E513K, TTN:p.C20935G, UBOX5:p.S417L, UGP2:p.D262H, VGF:p.E433K, XAB2:p.E782K, XYLB:p.S87F, ZC3H4:p.E798K, ZNF208:p.K852E, ZNF208:p.I647S, ZNF626:p.G198E, ZNF749:p.Q457E, ZNF761:p.H373R, ZNF799:p.T43A, ZNF799:p.W41G, ZNF799:p.E589G, ZNF844:p.P503R, ZNF845:p.M423T, ZNF845:p.T479M, ZNF860:p.H464R, ZNF878:p.S181R, ZNF91:p.R333H и ZNF91:p.H305R.

46. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-43, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от BRCA; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из GATA3:p.L328fs, GATA3:p.N334fs, GATA3:p.L344fs, GATA3:p.H400fs, GATA3:p.S408fs, GATA3:p.S430fs, GATA3:p.H434fs, GATA3:p.H435fs и GATA3:p.S408fs.

47. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от BRCA; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из PIK3CA:p.H1047R, PIK3CA:p.E545K, PIK3CA:p.E542K, AKT1:p.E17K, TP53:p.R175H, PIK3CA:p.N345K, PIK3CA:p.H1047L, SF3B1:p.K700E, GATA3:p.S408fs, PIK3CA:p.E726K, TP53:p.Y220C, TP53:p.H193R, PIK3CA:p.Q546R, TP53:p.R273C, TP53:p.R248W, TP53:p.R273H, TP53:p.I195T, TP53:p.H179R, FGFR2:p.N549K, NUP93:p.E14K, PIK3CA:p.C420R, PIK3CA:p.E453K, PIK3CA:p.Q546K, TP53:p.V216M, TP53:p.C176F, CDH1:p.E243K, ERBB2:p.L755S, KRAS:p.G12V, PIK3CA:p.E545A, TBL1XR1:p.I141fs, TP53:p.G266E, TP53:p.R248Q, TP53:p.Y163C, TP53:p.C141Y, TP53:p.G108fs, ACPP:p.R43W, AKT2:p.I289M, ARHGAP9:p.R137C, C9orf174:p.R136W, CDC42BPA:p.P675T, COL12A1:p.S395L, CRISPLD1:p.R222W, CT47B1:p.234_243EKLTEEATEE>E, CYP1A2:p.V483M, DAB2IP:p.E161K, DGKB:p.S13L, DMD:p.K1772N, DPEP1:p.V11L, ERBB2:p.S310F, ERBB2:p.D769Y, ERBB3:p.E928G, ESYT1:p.R816W, FAM179A:p.A831T, FAM58BP:p.A70T, FMN2:p.S751F, GALNTL6:p.K567del, GATA3:p.L328fs, GATA3:p.N334fs, GATA3:p.L344fs, GATA3:p.H400fs, GATA3:p.S408fs, GATA3:p.S430fs, GATA3:p.H434fs, GATA3:p.H435fs, GDAP1:p.T307A, GRB14:p.A300T, GUCY2C:p.G549C, IL17B:p.R34W, KCNB2:p.R231H, KIF1B:p.R1320W, KIF26B:p.V1113M, KLF4:p.K434Q, LY9:p.I69L, MAP2K4:p.S184L, MAP2K4:p.S251I, MAP2K4:p.T261fs, MAP3K1:p.L318fs, MAP3K1:p.I761fs, MAP3K1:p.V1346del, MAP3K1:p.L1384fs, MAPK13:p.E315K, MAPK4:p.V100M, MARCH5:p.R170C, MBP:p.E120K, MEFV:p.R377H, METTL15:p.Q53E, MS4A4A:p.V99M, MUC17:p.R4415H, MYH6:p.T847M, MYO5B:p.A405V, NARS2:p.P240R, NLGN4X:p.D382N, NLRC4:p.R288W, OR13G1:p.R258H, OR2AK2:p.V45I, OTOF:p.T388M, PACSIN2:p.Q331H, PALM2-AKAP2:p.A299T, PCDH19:p.R286C, PCDHGC5:p.D664N, PIK3CA:p.R88Q, PIK3CA:p.E110del, PIK3CA:p.K111del, PIK3CA:p.PVPHGLEDL447del, PIK3CA:p.L455fs, PIK3CA:p.M1004I, PIK3CA:p.M1043I, PIK3CA:p.N1044Y, PIK3R1:p.KPDL567del, PREX2:p.R363Q, PRRX1:p.A196V, PTEN:p.V317fs, RGSL1:p.V222I, RUNX1:p.R142fs, RUNX1:p.D96fs, SCN2A:p.R36K, SLC25A32:p.Q83E, SLC25A45:p.G106C, STRA6:p.Q68R, STX6:p.H153D, TBX3:p.H187Y, TFPT:p.S252C, TINAG:p.R332W, TMEM71:p.R63Q, TP53:p.E286K, TP53:p.R282W, TP53:p.V272M, TP53:p.S241fs, TP53:p.C238fs, TP53:p.C238F, TP53:p.C238Y, TP53:p.Y234C, TP53:p.Y220S, TP53:p.R209fs, TP53:p.G199V, TP53:p.L194R, TP53:p.H193L, TP53:p.H193Y, TP53:p.V173L, TP53:p.V173M, TP53:p.K132N, TP53:p.R110fs, TUBD1:p.A200V, VLDLR:p.R231H, VWA3A:p.V955I, VWF:p.K1720N, XPO1:p.E571K и ZNF268:p.F901del.

48. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от COAD; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из KRAS:p.G12D, BRAF:p.V600E, KRAS:p.G12V, ACVR2A:p.K435fs, GRB14:p.KKK295del, SEC63:p.L532fs, TGFBR2:p.E125fs, ATR:p.K771fs, ICA1:p.N204fs, KRAS:p.G12C, TP53:p.R175H, ABCA8:p.R842Q, ACTL7B:p.R354H, ACVR2A:p.K435fs, AIM2:p.K340fs, ALG2:p.S302Y, ANKIB1:p.K144fs, ARSG:p.V131I, ATP10D:p.R311H, AXIN2:p.W663fs, C5orf30:p.D4N, CACNG3:p.V134I, CASP5:p.K78fs, CC2D2A:p.R1284C, CDH10:p.E349K, DNMT1:p.E432K, DOCK2:p.G170R, DOCK5:p.E177K, EGR2:p.R390H, ERBB3:p.V104M, FAM135B:p.R884H, FBXW7:p.R505C, FBXW7:p.R465H, FHDC1:p.R254W, FOXL1:p.N89K, HCN4:p.R525H, HLA-DMA:p.E84K, HTR3B:p.R236C, ITGA4:p.T673M, KIF18A:p.R17C, KIF20B:p.E991K, KLHL5:p.R326C, KRAS:p.A146T, KRAS:p.G13D, LPHN3:p.R1183Q, MAP2K4:p.R287H, MAPK8IP1:p.L217fs, MFSD5:p.R280Q, MUC16:p.R8606H, MYO6:p.D1180N, NAA25:p.S807Y, NBPF14:p.V44L, NRAS:p.Q61K, NRAS:p.G13R, PAX3:p.T424M, PGAM1:p.R240H, PHF3:p.R1410I, PIK3CA:p.R88Q, PIK3CA:p.E545K, PIK3CA:p.H1047R, PLXNA3:p.V14fs, POSTN:p.R508C, PTPRU:p.D1434N, PYGO2:p.Q150fs, RBBP7:p.E274K, SFPQ:p.R611Q, SGSM1:p.F1117L, SLC25A40:p.R96Q, SLC8A1:p.R431H, SLITRK3:p.S298L, SPATA22:p.S150L, SUN3:p.E128K, TGFBR1:p.S241L, TP53:p.R273H, TP53:p.R273C, TP53:p.R248W, TRPV5:p.R492H, USP40:p.S851L, VPS13C:p.D1359Y, ZBTB24:p.L607I, ZNF434:p.R306C, ZNF443:p.R301I, ZNF484:p.R138C и ZNF770:p.S441P.

49. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от GBM; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из HSD17B7P2:p.N175S, IDH1:p.R132H, EGFR:p.A289V, EGFR:p.G598V, WASH3P:p.G175S, ZNF814:p.D404E, RPSA:p.Q111E, NBPF10:p.E3455K, TP53:p.R248Q, BRAF:p.V600E, EGFR:p.A289T, PRB2:p.N230del, RGPD5:p.P1760A, TP53:p.R175H, CHEK2:p.K373E, EGFR:p.R108K, EGFR:p.R222C, PIK3CA:p.E545K, PIK3R1:p.G376R, POTEC:p.K507E, SDHAP2:p.V195E, SLC6A10P:p.K88N, TP53:p.R282W, TP53:p.R273H, CD3EAP:p.K219del, DST:p.R146C, EGFR:p.A289D, EGFR:p.H304Y, FRG1B:p.S71N, GOLGA8DP:p.A116E, KRTAP4-11:p.R121K, KRTAP4-11:p.S48R, MAP3K1:p.P324L, OGDH:p.I78fs, PODXL:p.S162fs, PSPH:p.V145I, SPINT1:p.A316V, TP53:p.R248W, TP53:p.G245S, TP53:p.Y220C, TP53:p.R158H, TSHZ2:p.A222T, UBC:p.L149R, ZDHHC4:p.R300H, ZNF844:p.R447P, AASS:p.T878fs, ABCC10:p.R570W, ADAM29:p.V205I, ADAMTS8:p.V524M, AGAP3:p.R766W, AICDA:p.Y144F, AK7:p.A159V, AK8:p.D243A, ANO2:p.R334C, AOX1:p.A507V, ARHGAP5:p.M691L, CALN1:p.V231I, CARM1:p.A202V, CD163L1:p.V721M, CD1D:p.L25fs, CD209:p.A283T, CDH18:p.A195T, CILP2:p.V553M, CIZ1:p.L89P, CLOCK:p.L123fs, COL6A5:p.T2224M, CSF2RB:p.G298S, CSMD3:p.E171K, CYP2D6:p.H352R, DCAF12L1:p.R335H, DCAF12L2:p.R246H, DPP10:p.V183I, DPY19L2P1:p.R378Q, DQX1:p.R505H, DRD5:p.S275R, DVL2:p.V66G, EFCAB6:p.R379K, EGFR:p.L62R, EGFR:p.R252C, EGFR:p.P596S, EGFR:p.P596L, EGFR:p.G598A, EGFR:p.E709K, EPHA1:p.A184T, ERC2:p.R20H, ESPNP:p.R627Q, FAM126B:p.R382H, FBN3:p.V886I, FGF14:p.T229M, FLG2:p.H1901fs, FLG:p.R2886H, FLNA:p.V1240M, FOXG1:p.H57del, FPR2:p.R54Q, FRG1B:p.K13N, FRG1B:p.A53T, GABRA6:p.V314I, GJB3:p.R160H, GLT8D2:p.A178V, GRM3:p.R183C, HERC1:p.R2330H, HNF1B:p.T417M, HTRA3:p.Q403R, IDH1:p.R132G, IFNA10:p.L80F, IFNA10:p.V79A, JHDM1D:p.R313H, JPH1:p.A395T, KEL:p.V411M, KIAA0907:p.R516fs, KIAA1704:p.D88del, KLK6:p.R120H, KRAS:p.G12D, KRTAP4-7:p.L121V, KRTAP4-7:p.L148V, KRTAP5-4:p.S131C, LAT2:p.L18W, LIMK2:p.R203H, LUM:p.R330C, MCOLN3:p.V141I, MGAT4B:p.T444P, MUC17:p.V77M, MUC17:p.3204_3205insP, MYO1D:p.T109M, MYO6:p.Q914fs, NAP1L5:p.140_141EE>E, NF1:p.F1658fs, NHP2L1:p.R84C, NLRP5:p.R737W, NPTX1:p.A263T, NUFIP2:p.Q29del, ODF4:p.R61C, OR11H12:p.H154P, OR2A7:p.V18I, OR2H1:p.V287I, OR2T12:p.R184H, OR5D13:p.R236C, OR5P2:p.A100V, OR6N2:p.R293C, PASD1:p.A236del, PCDH11X:p.T486M, PCDHB13:p.P221L, PDGFRA:p.E229K, PDGFRB:p.S650L, PHC3:p.T35del, PIK3C2B:p.R287fs, PIK3CA:p.M1V, PIK3CA:p.R88Q, PIK3CA:p.M1043V, PIK3CA:p.H1047R, PIK3R1:p.K379N, PODNL1:p.A150V, POTEE:p.V166M, POTEG:p.R136H, PRKCD:p.G432fs, PROKR2:p.V297I, PTEN:p.C136Y, PTEN:p.S170N, PTEN:p.R173H, PTEN:p.T277I, PTEN:p.V317fs, PTPN14:p.E716del, R3HDM2:p.412_413QQ>Q, RAB11FIP5:p.R170H, RASAL3:p.R82H, RB1:p.N316fs, RDH8:p.A198V, REN:p.15_16LL>L, RIMBP2:p.R830H, SCAF11:p.E926fs, SCN7A:p.R1358H, SCNN1G:p.R564H, SDHAP2:p.R31C, SDHAP3:p.A66T, SEMG2:p.R292C, SH3RF2:p.R318C, SHB:p.A460T, SIGLEC10:p.T250M, SLC13A5:p.Q273P, SLC17A9:p.V324I, SLC22A9:p.R407Q, SLC26A3:p.V88I, SLC5A3:p.A302fs, SLC9A4:p.R631H, SPAM1:p.R346Q, SPEN:p.E803fs, SPTA1:p.A2011V, SUSD5:p.T513M, SYNE1:p.R8468H, TARSL2:p.G366D, TAS2R41:p.A255T, TAT:p.R367H, TFPI2:p.R206C, THSD7B:p.R90C, TMEM147:p.A92V, TMEM156:p.R81C, TMPRSS6:p.V302I, TNFSF9:p.A232T, TP53:p.C238F, TP53:p.C238Y, TP53:p.Y234C, TP53:p.V216M, TP53:p.H179R, TP53:p.T155N, TRAPPC10:p.K133fs, TTN:p.R21402W, TTN:p.V16403M, TUBBP5:p.V102M, TYRP1:p.T352fs, UBC:p.R73L, UGT2B28:p.P289H, USH2A:p.R3719H, WASH6P:p.L211V, ZFP42:p.V227I, ZFP42:p.T264M, ZNF181:p.V305G, ZNF280B:p.E400K, ZNF534:p.N583K, ZNF563:p.W208fs, ZNF844:p.F487L и ZPBP:p.R154C.

50. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от HNSC; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из PIK3CA:p.E545K, PIK3CA:p.E542K, TP53:p.R175H, PIK3CA:p.H1047R, TP53:p.R282W, TP53:p.R248Q, TP53:p.R273H, TP53:p.R248W, TP53:p.G245S, RHOA:p.E40Q, EP300:p.D1399N, HRAS:p.G13V, MB21D2:p.Q311E, NFE2L2:p.E79Q, TP53:p.H179Y, FBXW7:p.R505G, HIST1H2BF:p.E77K, HRAS:p.G12D, MAPK1:p.E322K, NFE2L2:p.D29H, TP53:p.P278S, TP53:p.C242F, TP53:p.Y220C, TP53:p.H193L, TP53:p.H179R, TP53:p.V157F, TP53:p.R110L, AKNAD1:p.K620R, ANXA6:p.R231Q, AP1G2:p.D243N, ATAD5:p.D441N, ATP6AP2:p.E119Q, B2M:p.M1I, BCL11A:p.E579K, C1orf172:p.Y30fs, C7orf57:p.E30K, CCDC135:p.E313K, CDH12:p.P706T, CDH7:p.Q225K, CDK11B:p.E79del, CDKN2A:p.H83Y, CHCHD4:p.T79M, CIRH1A:p.S250I, CLSTN2:p.P759L, CRB1:p.L628fs, DENND5B:p.G1023E, DNAH5:p.Q1797E, DSP:p.R160G, EDA:p.L58F, EFCAB6:p.E1002K, ELF4:p.S415L, EP300:p.C1164Y, EPHA3:p.T802R, EPHA6:p.D952H, ERBB2:p.M916I, ESRRA:p.D219N, FAM101A:p.I89del, FBXO24:p.M553V, FCAR:p.V233M, GPANK1:p.Y351fs, GPR20:p.V300I, GPRASP1:p.S706L, GPRIN3:p.R633fs, GRID2:p.T649fs, GRM3:p.F682L, GUCY2F:p.S404L, HCRTR2:p.D100Y, HIST1H3C:p.K37M, HIST1H4C:p.R68P, HLX:p.S12T, HOXD10:p.Y151C, HPS3:p.K812N, HRAS:p.G12A, HRAS:p.G12S, IFT140:p.E664K, INPPL1:p.T493M, ITGA10:p.R669Q, ITGB1:p.D158N, KIAA1429:p.D1526N, KIAA1429:p.S138F, KPRP:p.E553fs, KSR2:p.T555M, LINGO2:p.P410T, LPCAT1:p.V187del, MAGEB3:p.V75A, MAP3K7:p.E524Q, MAP4K3:p.P657fs, MAP9:p.K485N, MARS2:p.R481Q, MBOAT7:p.R424W, MUC16:p.R12774H, MUC5B:p.T4388M, MYH11:p.E993K, MYOCD:p.T493M, MYOM1:p.R63Q, NANOS3:p.S183L, NCOR1:p.R1561Q, NCOR1:p.Q169E, NCR1:p.D213N, NFE2L2:p.E79K, ODZ1:p.R366M, OPN1MW:p.A285T, OR2M2:p.A95fs, OR2M3:p.M273I, OR2T33:p.R120S, OR6V1:p.I248fs, PABPC5:p.P58L, PACSIN1:p.E359K, PIK3CA:p.M1043V, PIK3CA:p.H1047L, PIWIL1:p.V699M, PLIN5:p.430_431insNG, PLXNA3:p.P58S, PRB1:p.R274fs, PRSS1:p.D107N, RAC1:p.A159V, RGS7:p.L21fs, RPA1:p.R31H, RPL18:p.R178fs, SFI1:p.R821Q, SLC35D3:p.*417S, SLC5A7:p.G336C, SMARCA4:p.P913L, STAT3:p.D661V, SYCP2:p.K474N, SYT6:p.R249H, TBX21:p.E494K, THSD7A:p.R1046C, THSD7A:p.C728F, TMC3:p.R934S, TMTC2:p.T409R, TP53:p.E285K, TP53:p.C275F, TP53:p.R273C, TP53:p.G266E, TP53:p.G262V, TP53:p.R249S, TP53:p.G245V, TP53:p.C238F, TP53:p.M237I, TP53:p.Y236C, TP53:p.Y236D, TP53:p.R196P, TP53:p.PHHERC177del, TP53:p.V173L, TP53:p.V173M, TP53:p.Y163C, TP53:p.P151T, TP53:p.V143M, TP53:p.P58fs, URI1:p.S13fs, ZNF177:p.K384N, ZNF750:p.S96fs и ZZZ3:p.R5Q.

51. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от KIRC; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из WASH3P:p.G175S, VHL:p.L89H, VHL:p.S111N, WDR52:p.V1227G, KRT1:p.552_559YGSGGSSY>Y, KRTAP1-1:p.S34C, PALM2-AKAP2:p.1075_1076insEA, ZNF814:p.D404E, DOPEY2:p.Y2048S, KAT2B:p.W111fs, PABPC1:p.E156fs, PCDHGC5:p.G599V, PIK3CA:p.E545K, RRAD:p.A278E, SIRPA:p.D131del, UQCRFS1:p.I83V, VHL:p.P45L, VHL:p.V74D, VHL:p.R82P, VHL:p.L116fs, VHL:p.L158V, VHL:p.L169P, WDR73:p.DGTRSQ315del, ABCA3:p.E95D, ABCC5:p.L1090fs, ACADS:p.R330H, ACAN:p.G952E, ACSM2A:p.L402fs, ADAM23:p.K380M, ADH1A:p.D154V, AFF3:p.SA620del, AGAP6:p.D69fs, AGAP7:p.E71fs, AHNAK:p.5_6insE, AIDA:p.K247M, ALAS1:p.G302R, ANAPC16:p.R95fs, ANK2:p.N453S, ANKRD36:p.K378R, ARHGEF5:p.E487G, ARSD:p.AGV234del, ARSD:p.A234G, ATP2A1:p.G704C, ATP7A:p.Q990fs, AVIL:p.G299fs, AXDND1:p.EQ991del, BAP1:p.N78S, BAP1:p.M1I, BLM:p.H660Q, BMPER:p.RIAL444del, BRK1:p.K70Q, BTRC:p.I416M, C16orf55:p.D118A, C19orf33:p.K102E, C20orf132:p.E382D, C2orf71:p.1225_1226insS, C6orf132:p.173_182PPPLLLEPPP>P, CASP5:p.R23fs, CATSPER4:p.T425M, CCDC120:p.I8V, CCR5:p.S185I, CCZ1:p.E214D, CD7:p.P174fs, CDAN1:p.L646fs, CDH23:p.F1132Y, CDK5RAP2:p.H1592Q, CENPB:p.E410V, CERCAM:p.A85fs, CHEK2:p.K373E, CHIT1:p.P284fs, CLCN2:p.645_645R>RR, CLUL1:p.G463R, CNTNAP4:p.Y436S, CUL9:p.D1726E, CWC25:p.K364E, CXorf51B:p.V43I, DDX39B:p.F149fs, DIRAS1:p.G79C, DISP2:p.F1021S, DNMBP:p.T78P, DOCK8:p.A177fs, DPCR1:p.H383N, DPCR1:p.L768del, EGFR:p.L838M, ENPEP:p.F289C, ESPNP:p.W122fs, FAM105A:p.H126N, FAM186A:p.IPPQAQELEIPL1556del, FAM194B:p.EEEEYL135del, FAM22F:p.S691del, FAM22F:p.P690fs, FAM47A:p.LRPEPPETGVSH235del, FAM47C:p.P388S, FAM78A:p.W192L, FBXO34:p.Q294fs, FGFR3:p.R571fs, FGFR3:p.P716H, FMN2:p.AIPPPPPLPGA956del, FOXD4L4:p.C405fs, FUT6:p.S140fs, GJA1:p.A311fs, GOLGA5:p.L492I, GPM6A:p.A50V, GPRIN1:p.231_239RKEDPGSLR>R, GRAMD1B:p.P356H, GREB1:p.S344Y, GRM6:p.A718fs, GUSB:p.L501V, GUSB:p.C500R, HBB:p.F86C, HDAC6:p.G977D, HEXDC:p.T482P, HNF1B:p.N302K, HNRPLL:p.M327V, HRC:p.P439fs, HSFX2:p.D92E, IL1RAP:p.F50C, IVL:p.EQQEGQLKHP167del, KANK4:p.S253P, KCNJ18:p.E378K, KIAA1751:p.K97N, KRT1:p.SSYGSGG557del, KRT2:p.L299W, KRT4:p.F154fs, KRTAP10-6:p.49_49P>PSCCAP, KRTAP5-7:p.C120Y, KRTAP9-2:p.CCQP140del, LARS:p.P185fs, LCP1:p.P445fs, LOC338651:p.PHRSHSPPWS102del, LRCH2:p.D717G, LTA4H:p.F107L, LYST:p.Q710H, MAFA:p.207_208HH>H, MAGEC1:p.P239del, MAP2K5:p.Q445R, MAPKAPK2:p.T214fs, MARCKS:p.K152fs, MED12L:p.P2071S, MEGF6:p.A582fs, MGST3:p.G143fs, MLXIPL:p.S790R, MOCOS:p.S849P, MST1R:p.M464V, MTOR:p.C1483F, MTOR:p.L1460P, MUC16:p.P11260A, MUC17:p.R1227fs, MUC17:p.H1228fs, MUC2:p.1480_1481insI, MUC6:p.P1569fs, MYO3A:p.N525S, NBPF3:p.D491V, NCOR1P1:p.L52P, NDUFA4L2:p.G3fs, NEFH:p.651_651K>KAKSPEK, NES:p.V611L, NFAT5:p.Q906E, NOXO1:p.G3fs, NR2C1:p.S270I, NSMCE2:p.Q31fs, NUDT21:p.W13fs, ODZ2:p.W628fs, ONECUT1:p.L424M, OR10A3:p.F73V, OR4F4:p.E15G, OR4N2:p.L150fs, OR51B5:p.A66fs, OR7C1:p.F104fs, PABPC1:p.Y408F, PABPC1:p.K333fs, PABPC1:p.A181T, PABPC3:p.P191T, PALLD:p.A996T, PALM2-AKAP2:p.G1118fs, PARD6A:p.G84fs, PASK:p.T62I, PCDH15:p.C1713F, PCNT:p.G136S, PGM5:p.G426fs, PGPEP1L:p.R164fs, PIK3C2B:p.F1473L, PIK3CA:p.N1044K, PIK3R5:p.L371R, PITRM1:p.P816T, PLIN4:p.T347I, PODXL:p.28_30PSP>P, POLR1C:p.K332Q, POTED:p.I214V, PPM1E:p.R311W, PRKCE:p.Q157fs, PROX1:p.V225D, PRRC2C:p.P1883T, PRX:p.P549L, PSD3:p.T563P, PTCH1:p.P689H, RANBP3:p.L386W, RASGEF1C:p.A188T, RGPD6:p.F946L, RHEB:p.Y35N, RIMBP3:p.A396del, RIN3:p.L449V, RLIM:p.S501L, RNF17:p.S351C, RUNX2:p.P466H, SCAF1:p.P208fs, SDK1:p.K508fs, SECISBP2:p.D608E, SERPINB3:p.S209C, SESTD1:p.I306M, SFRP4:p.P325fs, SH3KBP1:p.P563fs, SIPA1L3:p.G777A, SLC13A2:p.L493fs, SLC16A9:p.CVLLGG470del, SLC25A5:p.A118T, SLC44A5:p.V70F, SLC4A8:p.N229K, SLC52A1:p.G370del, SLC52A2:p.G399fs, SLC6A10P:p.K88N, SLC6A14:p.A85fs, SLC9B1:p.V446fs, SON:p.VLESSAVT1359del, SP8:p.G165del, SPAG1:p.353_354insD, SPATA9:p.C189F, SPEG:p.A992fs, SPTB:p.T1864I, SRA1:p.V110L, STAT6:p.P354fs, STK11IP:p.A155E, STXBP3:p.E279G, SVIL:p.M93T, SYNE1:p.R8468S, SYNJ2:p.K832T, SYNPO:p.G619fs, TAOK2:p.Q899fs, TAS2R38:p.I311T, TBC1D12:p.F608Y, TBC1D1:p.H277R, TBC1D3:p.A556fs, TBC1D3C:p.A495fs, TBC1D3F:p.A556fs, TCF7:p.H140P, TDRD10:p.W276C, THRAP3:p.K551R, TMEM102:p.A110P, TMEM161B:p.L142P, TMEM230:p.D140G, TMEM47:p.G87S, TRDN:p.*730Y, TTBK1:p.T1065S, UBE2O:p.R1118fs, UBR5:p.T1306fs, UPK3A:p.G272fs, VHL:p.G39S, VHL:p.S65L, VHL:p.N78D, VHL:p.R79P, VHL:p.W88L, VHL:p.L89P, VHL:p.R107P, VHL:p.S111R, VHL:p.H115N, VHL:p.D121Y, VHL:p.G123fs, VHL:p.D126fs, VHL:p.L128H, VHL:p.L135F, VHL:p.I151T, VHL:p.L153P, VHL:p.L158P, VHL:p.Q164fs, VHL:p.L184P, VHL:p.L188P, WASH6P:p.315_316insAPP, WASH6P:p.T201M, WWP2:p.G458A, ZCCHC6:p.K937N, ZFAND2B:p.I149T, ZFR2:p.Y107N, ZNF273:p.N319K, ZNF462:p.S650T, ZNF516:p.A256D, ZNF519:p.H431Y, ZNF687:p.F858C, ZNF732:p.E227Q, ZNF880:p.Q406R, ZP3:p.V362fS и ZRANB1:p.*735fs.

52. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от LAML; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из NPM1:p.W288fs, DNMT3A:p.R882H, NPM1:p.L287fs, IDH2:p.R140Q, IDH1:p.R132C, FLT3:p.D835Y, DNMT3A:p.R882C, FLT3:p.600_601insFREYEYD, IDH1:p.R132H, NRAS:p.G13D, U2AF1:p.S34F, KIT:p.D816V, FLT3:p.D835E, IDH2:p.R172K, NRAS:p.G12D, WT1:p.S381fs, ABTB1:p.L249fs, DNMT3A:p.R736H, FLT3:p.D835H, KRAS:p.G12D, NPM1:p.L287fs, NRAS:p.Q61H, NRAS:p.Q61K, PHACTR1:p.V251fs, RBBP4:p.E330K, RUNX1:p.R135G и U2AF1:p.S34Y.

53. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от LUAD; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из KRAS:p.G12C, KRAS:p.G12V, EGFR:p.L858R, U2AF1:p.S34F, KRAS:p.G12A, TP53:p.R158L, KRAS:p.G12D, PIK3CA:p.E545K, TP53:p.R273L, EGFR:p.ELREA746del, KRAS:p.G13D, A2ML1:p.S654fs, BRAF:p.G469V, CTNNB1:p.S37F, EGFR:p.G719A, KRAS:p.G13C, MYOF:p.G165fs, EGFR:p.S768I, FAM47C:p.G948W, KRAS:p.Q61L, MYH10:p.L1091fs, NRAS:p.Q61L, OR4C3:p.H130fs, PI15:p.V22F, RAD50:p.D69Y, RIT1:p.M90I, TP53:p.C275F, TP53:p.R249M, TP53:p.R249G, TP53:p.R248P, TP53:p.R175H, TP53:p.Y163C, TP53:p.A159P, TP53:p.V157F, TP53:p.G154V, ABCB1:p.R467L, ACBD3:p.R224L, ACTA1:p.G275C, ACTN2:p.D893Y, ADAM30:p.Q741H, ADAMTS14:p.G238C, ADAMTS20:p.R1251S, ADAMTS20:p.R541L, ADAMTS5:p.L549M, ADAMTS9:p.G659W, ADCY2:p.P1016T, ADCY5:p.G623C, AFP:p.A182G, AHDC1:p.P155Q, AKAP1:p.LDRNEEG317del, ALKBH1:p.K137E, ANK2:p.Q3076L, ANKRD44:p.G339C, ANO3:p.A41S, AP1G1:p.R723L, APBB2:p.T243fs, APOB:p.L973M, APOBR:p.R840L, AQP10:p.Q261L, ARAP3:p.R1226L, ARFIP2:p.R86L, ARHGAP36:p.P16H, ARL13B:p.R358L, ASCC2:p.R365L, ASPM:p.S240F, ASXL3:p.P1470Q, ATRN:p.P197Q, AVIL:p.G64W, AXDND1:p.W101R, B3GAT1:p.R125L, BARX2:p.R68P, BCL9L:p.G980C, BCOR:p.N1459S, BEND2:p.P536Q, BMS1:p.G455V, BRAF:p.V600E, BRAF:p.G466V, BRD9:p.G330W, BRF1:p.V469L, BRWD3:p.H160N, BTRC:p.G260W, C11orf68:p.V135L, C15orf2:p.V753F, C15orf2:p.G906W, C18orf8:p.M61I, C1GALT1:p.G299V, C1orf173:p.G1454S, C1orf173:p.S688Y, C1orf87:p.R541L, C2orf53:p.P272H, C3orf20:p.R740L, C7:p.R687S, C7orf58:p.G140W, C7orf58:p.R238L, CACNA1A:p.S772Y, CACNA1D:p.R1073L, CACNA1E:p.R2089Q, CACNA2D1:p.A352E, CACNG3:p.R232W, CADPS:p.R959S, CALB2:p.R258C, CAMK2B:p.G131V, CARD11:p.I1065M, CCDC111:p.R417L, CCDC141:p.E1204V, CCDC19:p.R279L, CCDC19:p.R207L, CCKAR:p.L271M, CD1B:p.W41L, CDH10:p.S577R, CDH10:p.R472C, CDH10:p.R128S, CDH18:p.A721S, CDH20:p.P433H, CDH6:p.Q237K, CDK13:p.R880S, CDK4:p.R24L, CELF4:p.A309P, CFDP1:p.P129fs, CHN1:p.K264N, CHRNA4:p.S396R, CHRNA9:p.P361Q, CLCNKA:p.P124Q, CLEC12B:p.W217L, CLK4:p.R68L, CNTFR:p.D252Y, CNTN6:p.R807M, CNTNAP2:p.F395L, COL19A1:p.P538Q, COL5A2:p.G612W, COL5A2:p.G516W, COL9A1:p.P211Q, CPE:p.P290Q, CPNE8:p.Q127H, CPSF4:p.P219Q, CRIPAK:p.S180fs, CROT:p.Q580H, CRTC3:p.S363L, CSMD2:p.P1855Q, CSMD3:p.T2810N, CSMD3:p.P2727T, CSMD3:p.Q174H, CUBN:p.G596C, CUL4B:p.R91S, CUL7:p.L371F, CXCL9:p.K122N, CXCR4:p.E345Q, CXorf59:p.R198M, CYP11B1:p.R498G, CYP27A1:p.P112Q, CYP2B6:p.A444E, DACH2:p.R539L, DCC:p.R446H, DDX56:p.R329L, DEFA1:p.W90C, DENND2A:p.R688Q, DENND2A:p.R499L, DMBT1:p.R1521L, DNAH5:p.R3822L, DNAH9:p.S2993R, DNAI2:p.V231L, DPP6:p.L757F, DSG4:p.R128L, DST:p.A4410S, DZIP3:p.M322L, EBF3:p.R231S, EFCAB4B:p.E265Q, EHHADH:p.Q704H, ELAVL2:p.L263F, EMR1:p.R493H, ENAH:p.R514L, ENPP1:p.G738E, EPB41L3:p.A896S, EPG5:p.R2289L, EPHA1:p.G111V, EPHB6:p.R337H, EPRS:p.V1151L, ERBB2:p.S310Y, ERBB2:p.774_775insAYVM, ERBB2:p.776_776G>VC, ERN2:p.T295K, FAM120B:p.P467H, FAM127C:p.F52L, FAM135B:p.W240C, FAM210B:p.L112F, FAM47A:p.R690L, FAM47B:p.W163C, FAM47B:p.L567F, FAM5C:p.R457G, FAM70B:p.P277T, FAM71B:p.L583M, FAM75A6:p.R304S, FAM75A6:p.P54L, FAM75D1:p.R1265S, FARP1:p.R299L, FAT1:p.R4359L, FAT3:p.R1266H, FAT3:p.G1899V, FAT3:p.H3574N, FBXO18:p.M144I, FBXO31:p.G443fs, FCGBP:p.A1022S, FCRL2:p.V505L, FERD3L:p.P92H, FGB:p.E339Q, FGFR2:p.E116K, FGFRL1:p.R243L, FGFRL1:p.V274L, FKBPL:p.R320L, FLG2:p.G1545V, FLG2:p.L572F, FLG:p.P3254H, FLG:p.P2466Q, FMN2:p.P992T, FOLH1:p.A643S, FOXRED1:p.R136L, FRAS1:p.C382F, FRG2B:p.D142Y, FRMPD1:p.E1093Q, FSHB:p.T43N, GABRA5:p.Q224K, GADL1:p.L352I, GAL3ST3:p.A271S, GALNT14:p.D234E, GAS8:p.R313S, GATA3:p.M443I, GCDH:p.R82C, GEM:p.R268L, GFRAL:p.Q308K, GIT2:p.R123L, GJB4:p.R22S, GLB1L2:p.I407M, GLOD4:p.Q223fs, GNAO1:p.P283Q, GPNMB:p.I174M, GPR137B:p.G240C, GPR158:p.P762T, GPR98:p.G4307W, GRB7:p.R239L, GRHL1:p.G608W, GRID1:p.R683L, GRIK1:p.R368Q, GRM5:p.P895fs, GTF2E1:p.R192L, H3F3C:p.R131L, HAO2:p.H12N, HCN1:p.P231Q, HECW1:p.A183S, HGF:p.M686T, HIP1:p.R940L, HIST1H1E:p.R25P, HLA-DMA:p.A236fs, HOXA5:p.G11C, HS3ST3A1:p.G399W, HSD17B6:p.F209L, HSPA13:p.V85L, HSPBAP1:p.R282L, HTR5A:p.W298C, IGHMBP2:p.R615S, IL2:p.R103M, IL2RA:p.G61W, IL32:p.P215T, ING1:p.A220S, INMT:p.G56V, ITGA8:p.G616C, ITGAD:p.L528fs, ITGAX:p.R283H, ITIH1:p.G254W, ITIH2:p.L842V, ITK:p.R29L, ITPR2:p.P358Q, JMJD1C:p.R1198S, KCNA1:p.G376C, KCNH8:p.M455I, KCNJ3:p.L430F, KCNK18:p.G23V, KCNK2:p.R166L, KEAP1:p.G603W, KEAP1:p.R260L, KEAP1:p.S144F, KHDRBS2:p.S203L, KIAA1211:p.P1203Q, KIAA1549:p.L1272F, KIAA1755:p.Q108H, KIF15:p.E252Q, KIF9:p.G480R, KIRREL:p.G604C, KLF5:p.E419Q, KRAS:p.Q61H, KRTAP10-12:p.R64P, KRTAP27-1:p.M124I, KRTAP4-5:p.C91F, KRTAP5-1:p.S193Y, L1CAM:p.R632S, L3MBTL4:p.W162L, LAMA1:p.D1030Y, LAMB1:p.T1610fs, LAMB4:p.G1239W, LAMB4:p.G588W, LEF1:p.I53V, LEKR1:p.Q450K, LIM2:p.S150T, LIPJ:p.P236Q, LPHN3:p.E740D, LPPR4:p.R527S, LRFN5:p.N132K, LRP1B:p.G3563C, LRP2:p.M4039I, LRRC4C:p.Q10L, LRRIQ1:p.W792L, LRRTM4:p.S243Y, MAGEA10:p.R7H, MAGEC2:p.W109C, MAGI1:p.G1156V, MAGI2:p.P1044T, MAK:p.P373Q, MAP2K1:p.K57N, MARCH11:p.R193L, MEPE:p.G142C, MKI67:p.R1081S, MKRN3:p.P448H, MLL3:p.N393K, MLL3:p.Q356K, MMRN1:p.A1013S, MOGAT2:p.Q66fs, MXRA5:p.D324Y, MYH4:p.T790M, MYH8:p.R1117C, MYH8:p.H1006N, MYO5B:p.R708L, MYO7B:p.P2040H, MYO9B:p.R94L, MYT1L:p.P351Q, NAA11:p.T184K, NAB1:p.L72F, NAV1:p.R938L, NBPF15:p.G665E, NCAM2:p.G698C, NCAPD2:p.R220L, NDST3:p.V427I, NEK2:p.R239S, NFIA:p.L294F, NLRP3:p.R157C, NOTCH2:p.R2105L, NR4A2:p.R314L, NRG1:p.V481L, NRXN1:p.R813S, NRXN1:p.A660S, NRXN3:p.P23H, NRXN3:p.R103C, NTM:p.G333C, NUAK1:p.G173C, NYAP2:p.P437L, ODZ3:p.P218Q, OIT3:p.R508S, OOEP:p.R101C, OPN1LW:p.P283H, OR10H4:p.M199I, OR10J1:p.L157Q, OR10X1:p.L298I, OR10Z1:p.L205F, OR14A16:p.G160C, OR2A25:p.M80I, OR2AG2:p.G249W, OR2AK2:p.W37C, OR2H2:p.L205F, OR2J2:p.G234W, OR2L13:p.M106I, OR2L13:p.T242A, OR2L3:p.M1I, OR2L3:p.L67I, OR2L8:p.R121C, OR2L8:p.R171S, OR2M2:p.F177L, OR2M2:p.F323L, OR2M5:p.V205L, OR2T12:p.M258L, OR2T27:p.D11Y, OR2T33:p.P165Q, OR2T34:p.C246F, OR2T6:p.V213L, OR4C12:p.D309Y, OR4C12:p.M279I, OR4C16:p.L162M, OR4M2:p.A119S, OR4M2:p.A161S, OR51V1:p.P298T, OR5AS1:p.M39I, OR5B12:p.S289C, OR5B17:p.M266I, OR5D14:p.H246N, OR5D16:p.P264T, OR5D18:p.R123H, OR5F1:p.G44V, OR5J2:p.A36S, OR5L1:p.T275N, OR6C65:p.I154fs, OR6C75:p.G94W, OR6K2:p.P79Q, OR8D2:p.R306M, OR9A2:p.R289W, OR9G9:p.R169L, P2RX7:p.P142Q, P2RY10:p.T10K, P2RY10:p.V196L, PABPC5:p.R99S, PAPPA2:p.P917T, PAPPA2:p.P1706H, PBLD:p.P55Q, PCDH10:p.R587S, PCDH10:p.V986L, PCDH11X:p.R1010I, PCDHAC2:p.A742V, PCDHB5:p.P649S, PCDHGC5:p.K12N, PCDHGC5:p.P684H, PCLO:p.P3946T, PCMTD1:p.R271M, PDPR:p.G793W, PDYN:p.G191W, PDZD2:p.R565S, PDZD8:p.S980G, PFKM:p.R118S, PIGM:p.R225L, PIK3CA:p.E542K, PIK3CG:p.V165I, PILRA:p.S291fs, PLCE1:p.G564C, PLCL1:p.M564I, PLEKHA6:p.R110L, PNKP:p.G174W, POGZ:p.G75W, POLE:p.R573L, POM121L12:p.P231T, POM121L12:p.P242H, POTEE:p.V288M, POTEM:p.S78R, POU3F3:p.D321Y, PPT2:p.R265L, PRDM16:p.P1036L, PRELP:p.D201Y, PRPF40B:p.R160S, PRPF6:p.R763L, PTEN:p.R234L, PTPN11:p.G503V, PTPN13:p.E2067K, PTPRJ:p.G334W, PTPRT:p.R928L, PTPRU:p.P559S, PXDNL:p.P1456T, QSOX1:p.R401L, QSOX2:p.R683L, RAB13:p.R167L, RAB8A:p.G20W, RAPGEFL1:p.R356L, RBM19:p.G390W, RCL1:p.P112Q, REG1B:p.W57L, REG3A:p.S150L, REG4:p.G110V, RIMS2:p.R55L, RIT2:p.R85L, RLN2:p.S138C, RNF20:p.P529Q, RORB:p.G94W, RPL10L:p.K187T, RPRD2:p.R97S, RTN1:p.S103W, RUNX2:p.R337M, RYR2:p.K2413N, RYR2:p.M4334I, RYR3:p.P1670T, S100PBP:p.R5L, S1PR1:p.L104F, SAGE1:p.H298Q, SALL1:p.E965K, SALL1:p.R898W, SALL4:p.R187L, SBSPON:p.G133W, SCAF8:p.G740C, SCG2:p.P252Q, SCML4:p.L261F, SCN2A:p.T155K, SEC24D:p.A50fs, SEC61A2:p.G126V, SERPINA12:p.D253Y, SERPINA9:p.M414I, SERPINC1:p.R45L, SGIP1:p.R502L, SH3GL3:p.R174L, SH3PXD2A:p.S759L, SI:p.V1217F, SKOR1:p.Y883C, SLC1A2:p.F348fs, SLC24A5:p.R35S, SLC25A48:p.R101S, SLC35E2:p.R201L, SLC39A12:p.C628S, SLC39A6:p.R53L, SLC4A5:p.I533V, SLC5A1:p.G53W, SLC5A7:p.G442V, SLC6A11:p.W299L, SLC6A2:p.S354C, SLC8A1:p.G433C, SLIT1:p.R1460L, SLITRK5:p.R68L, SLITRK5:p.R468M, SLITRK6:p.N741K, SORL1:p.R205L, SOS1:p.N233Y, SOX9:p.E75K, SPAG16:p.V439L, SPIN4:p.Y171C, SPRR2D:p.P30fs, SPTA1:p.G2367C, SPTA1:p.D2243Y, SSX3:p.P127T, ST18:p.H778Q, STAC3:p.G117W, STOML3:p.D86Y, STX2:p.R107L, SUMF2:p.G110E, SUN3:p.P339Q, SV2C:p.P60Q, SYNDIG1:p.D135Y, SYNE1:p.K8632E, TARS2:p.E199K, TAS2R16:p.Q177H, TCOF1:p.K264R, TCTE1:p.S127I, TDO2:p.Q197H, THSD7A:p.G810W, THSD7A:p.R801L, TIFAB:p.D43E, TIGD4:p.S312F, TLL1:p.P53Q, TMPRSS11E:p.G259C, TMTC1:p.A864D, TMTC1:p.G212V, TMX3:p.R151C, TNNI1:p.R67L, TNR:p.L692I, TOP2A:p.R736L, TP53:p.R337L, TP53:p.E285K, TP53:p.R283P, TP53:p.D281N, TP53:p.C277F, TP53:p.V274F, TP53:p.R273H, TP53:p.I255F, TP53:p.R249S, TP53:p.M237I, TP53:p.S215I, TP53:p.C176F, TP53:p.R110L, TP53:p.G105C, TP53:p.P72fs, TPO:p.E558K, TRAF6:p.R502S, TRIM42:p.Q127K, TRIM48:p.A93D, TRIM4:p.R398L, TRIM51:p.W131C, TRIM9:p.R337S, TRIML1:p.H399Q, TRPM3:p.G298W, TSC1:p.G378C, TSG101:p.R276S, TSHZ1:p.K501N, TSHZ3:p.G677V, TTF2:p.R761S, TUBA3C:p.Q176fs, UBAC1:p.K330N, UBE2J2:p.G193W, UBR1:p.G1647W, UGT2B7:p.M214I, VMP1:p.E369Q, VPS13B:p.G2575W, VSTM2A:p.G75V, VWA3B:p.R557L, WBP11:p.P227fs, WDR52:p.G612C, WDR59:p.R837S, WDR75:p.P287Q, WDR88:p.G100W, ZCCHC5:p.G335W, ZFHX4:p.L811F, ZFHX4:p.T1663N, ZFHX4:p.H2511Q, ZFP14:p.Q17L, ZIC1:p.A112E, ZNF154:p.T408N, ZNF223:p.G23W, ZNF295:p.S732C, ZNF322:p.K106N, ZNF385D:p.T226S, ZNF454:p.S190I, ZNF492:p.P392H, ZNF521:p.G640C, ZNF521:p.P270H, ZNF536:p.G186C, ZNF536:p.G663W, ZNF644:p.G21W, ZNF716:p.H263L, ZNF71:p.V411L, ZNF782:p.G484W, ZNF831:p.Q617K, ZNF98:p.C492F и ZSWIM2:p.S214Y.

54. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от LUSC; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из PIK3CA:p.E545K, TP53:p.R158L, KRTAP5-5:p.GCG47del, NFE2L2:p.E79Q, CDKN2A:p.D108Y, DHX9:p.V40G, MAFA:p.207_208HH>H, NFE2L2:p.R34Q, PBX2:p.Y262F, PIK3CA:p.E542K, TP53:p.R273L, TP53:p.C242F, TP53:p.R175G, TP53:p.Y163C, TP53:p.V157F, AICDA:p.R131G, ALPK2:p.D53N, ANKFN1:p.M280I, ARPC1A:p.F212L, ASXL2:p.S1081L, C1orf74:p.D254N, C3orf30:p.D227E, CCDC121:p.W397L, CHN2:p.I43M, CLEC4C:p.R179L, CLN3:p.G206S, CNTN5:p.T178N, COL12A1:p.G2753C, CPS1:p.T855K, CSMD3:p.T1094K, CSMD3:p.Q691K, DDX11:p.R167T, EGFR:p.L861Q, EME1:p.D570H, EP300:p.D1399N, ESYT3:p.S574F, FAM135B:p.L648M, FAM135B:p.Q285H, FAM47A:p.G372W, FBXW7:p.R505G, FGFR3:p.S249C, GALNT13:p.G358C, GNL3L:p.K20N, GPC5:p.R347L, HCN1:p.A714S, HCN1:p.R659L, HCN1:p.G499V, HCN1:p.P326T, HERC2P3:p.A803V, HEXDC:p.T482P, HIST1H3B:p.E74K, HIST2H2BE:p.G54D, IFNA10:p.V79A, IL7R:p.S54L, INADL:p.P1340A, ISX:p.C2F, ITGAX:p.R685H, ITPR1:p.E1883Q, KCNN3:p.80_81insQQ, KEAP1:p.G480W, KEAP1:p.R470C, KEAP1:p.V155F, KIAA1751:p.L63F, KIAA2022:p.C345F, KIR3DL2:p.K229E, KLF5:p.E419Q, LAMA4:p.M1293I, LMLN:p.G199C, LRP2:p.A516V, LRRC66:p.F458L, LSG1:p.R517L, LUM:p.R310L, MB21D2:p.Q311E, MCHR1:p.S306F, MKRN3:p.G270V, MUC16:p.N11594K, NFE2L2:p.G81S, NFE2L2:p.G31A, NFE2L2:p.L30F, NFE2L2:p.D29H, OR2B11:p.G10V, OR2T2:p.F13V, OR4K2:p.C254F, OR51F2:p.R67P, OR51S1:p.R159Q, OR5D18:p.T271K, OR8H2:p.L166F, OR8J3:p.S160L, OR8K3:p.K235N, PCDHB1:p.N568K, PHIP:p.I1681M, PIK3CA:p.E726K, PIK3CA:p.H1047R, PLCE1:p.G439C, PRSS57:p.E39Q, PYHIN1:p.G148A, RANBP6:p.I984L, RBMXL1:p.G305C, REG1B:p.M67I, RGS6:p.W366L, RNF5:p.T136I, RP1:p.S1771L, RRP15:p.L214F, RYR2:p.E711K, SAMD3:p.Q206H, SLITRK3:p.R214L, SON:p.S908L, SP4:p.E11del, STK11:p.G279fs, TARBP1:p.L782V, TBCD:p.R476C, TMPRSS11F:p.R274Q, TP53:p.R337L, TP53:p.E271K, TP53:p.R267P, TP53:p.G245V, TP53:p.Y234C, TP53:p.Y220C, TP53:p.H214R, TP53:p.H193L, TP53:p.H179L, TPTE:p.M541I, TRIM7:p.L332I, TTN:p.T32425M, ZFP36L2:p.D240N, ZNF208:p.H883Q, ZNF48:p.R235H, ZNF626:p.K473R, ZNF676:p.P43T, ZZZ3:p.R162Q.

55. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от OV; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из TP53:p.R273H, TP53:p.Y220C, TP53:p.R248Q, TP53:p.R175H, TP53:p.R273C, TP53:p.I195T, TP53:p.R248W, TP53:p.R282W, TP53:p.C176Y, TP53:p.V157F, TP53:p.S241F, TP53:p.H179R, TP53:p.G245S, TP53:p.H193R, ADCY2:p.V888I, B2M:p.M1V, BAP1:p.R227C, CYP4A11:p.V185F, DNAH5:p.R3197Q, GART:p.K807fs, GRIN2B:p.R519Q, HRNR:p.M1fs, KLHL29:p.L716fs, KRAS:p.G12V, MGA:p.R2435Q, MYO3A:p.N525S, NPAS2:p.Q201R, NRAS:p.Q61R, PDAP1:p.K55fs, PGAP1:p.F565C, TP53:p.S315fs, TP53:p.C275Y, TP53:p.R273L, TP53:p.V272M, TP53:p.G266V, TP53:p.G266R, TP53:p.D259Y, TP53:p.P250L, TP53:p.G245D, TP53:p.G245V, TP53:p.G244C, TP53:p.C238fs, TP53:p.Y236C, TP53:p.Y234C, TP53:p.V216M, TP53:p.S215R, TP53:p.Y205C, TP53:p.L194R, TP53:p.P191del, TP53:p.Y163C, TP53:p.A159V, TP53:p.K132N, TRPC7:p.D210V, UXS1:p.V100L, WNT11:p.C344Y и ZNF295:p.E885A.

56. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от READ; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из KRAS:p.G12V, TP53:p.R273H, KRAS:p.A146T, KRAS:p.G12D, TP53:p.R175H, AKAP9:p.L3482I, APBA1:p.E624K, BAG5:p.D439N, C17orf97:p.E230D, CDH23:p.F177L, CERS3:p.E95D, DNAH5:p.R982H, ERBB2:p.V842I, GABRB3:p.D500N, KRAS:p.G13D, KRAS:p.G12C, KRAS:p.G12S, LRP6:p.R675Q, MACF1:p.F722L, MBOAT2:p.R43Q, MYO1D:p.E246K, NLRC4:p.E409K, NRAP:p.E327K, NRAS:p.Q61K, PCDH15:p.R1552I, PIK3CA:p.N345K, PIK3CA:p.E545K, POLE:p.S459F, PPP2R2B:p.P326L, SMAD4:p.R361H, TP53:p.R248W, ZFP2:p.R150I и ZNF563:p.K26N.

57. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от SKCM; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из BRAF:p.V600E, NRAS:p.Q61R, NRAS:p.Q61K, HSD17B7P2:p.N175S, BRAF:p.V600K, DISP1:p.G732L, IDH1:p.R132C, NRAS:p.Q61L, MUC16:p.P5119S, RAC1:p.P29S, WASH3P:p.G175S, AGAP9:p.M248V, C15orf23:p.S24F, DNAH5:p.D3236N, SPTLC3:p.R97K, TMC5:p.R276C, CFB:p.R314M, FRG1B:p.A50P, INMT:p.S212F, LOC649330:p.G93E, MAP2K1:p.P124S, RGS7:p.R44C, STK19:p.D89N, ADAM30:p.G97L, ARL16:p.G6R, ARMC4:p.E22K, BRAF:p.K601E, CAPN13:p.P405S, CD1C:p.R89C, CLCC1:p.P406Q, CNTN5:p.S379F, DNAH5:p.R742Q, EEF1B2:p.S43G, FRG1B:p.I59V, GABRG1:p.E205K, IARS2:p.R832C, IL32:p.D218fs, ISX:p.R86C, KLHDC7A:p.E635K, NAP1L4:p.P285Q, NBPF10:p.Q908E, OR2A5:p.S71L, OR4E2:p.R226Q, OR4M1:p.G41E, OR4M2:p.S268F, OR4N2:p.G41E, OR51B2:p.S163L, PCDHGC5:p.R293C, PCLO:p.R4133C, PHGDH:p.G173L, POTEG:p.D51N, PPP6C:p.R301C, PRAMEF11:p.C84S, PSG9:p.E404K, PTPRB:p.D1560N, RNF152:p.P95S, SPAG16:p.P488S, SPATA8:p.E18K, TAF1A:p.R172M, TCEB3C:p.E308K, THSD7B:p.E126K, TTN:p.E12129K, XIRP2:p.D2439N и ZNF831:p.R1393Q.

58. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от UCEC; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из RPL22:p.K15fs, PTEN:p.R130G, PTEN:p.R130Q, KRAS:p.G12D, KRAS:p.G12V, PIK3CA:p.H1047R, PIK3CA:p.R88Q, PIK3CA:p.E545K, PTEN:p.V317fs, FGFR2:p.S252W, PIK3CA:p.E542K, CTNNB1:p.S37F, POLE:p.P286R, PPP2R1A:p.P179R, CTNNB1:p.S37C, KRAS:p.G13D, CTNNB1:p.D32N, CTNNB1:p.S33F, CTNNB1:p.G34R, KIAA2026:p.R574C, LIMCH1:p.R806fs, PIK3CA:p.H1047L, ALPK2:p.K523fs, CTNNB1:p.S33C, FBXW7:p.R505C, HPD:p.R284fs, KRAS:p.G12A, PIK3CA:p.R93Q, POLE:p.V411L, TP53:p.R248W, ABCA11P:p.R385I, ABI1:p.K445N, ACSM2B:p.K195N, APOB:p.F3102L, ASCC3:p.R136Q, C12orf4:p.R335Q, CCDC132:p.R838C, CHD4:p.R975H, CSDE1:p.R220C, CTNNB1:p.D32Y, CTNNB1:p.S33Y, CTNNB1:p.T41I, EXOC1:p.R588C, FBXW7:p.R465H, FGFR2:p.N549K, FUBP1:p.R430C, GEN1:p.S509L, IK:p.E90fs, KIF20B:p.E54K, MAX:p.H28R, MBOAT2:p.R43Q, METTL14:p.R298P, MFGE8:p.D170N, MS4A8B:p.S3L, NSMCE1:p.D244N, OXR1:p.E122K, PCDH19:p.E530K, PIK3CA:p.R108H, PIK3CA:p.N345K, PIK3CA:p.C420R, PIK3CA:p.Q546P, PIK3CA:p.Q546R, PTEN:p.R130L, RBL2:p.E127K, RXFP1:p.S223Y, SF3B1:p.R957Q, SLC20A1:p.P328fs, SOX17:p.S403I, TNS1:p.Q659del, TP53:p.R273H, TP53:p.R273C, TP53:p.R248Q, TTN:p.D16823N, TXNL1:p.R234C, ZFHX3:p.R1893fs, ZNF180:p.R625I, ZNF257:p.R392I, ZNF354B:p.D609N, ZNF43:p.R280C, ZNF709:p.R468I, ZNF765:p.S254L, ABCA5:p.R1476Q, ACVR1:p.R206H, ADAD1:p.S11L, ADAM9:p.R256Q, ADD3:p.E570K, ADGB:p.S1124L, AGXT2:p.R502C, AMBN:p.S225Y, ANKDD1A:p.R24H, ARHGEF33:p.R46I, ATP10B:p.L1304I, ATP2C1:p.E724K, ATP9A:p.R290Q, ATR:p.R1814fs, AVL9:p.F34L, BMPER:p.R241Q, BTN3A2:p.E153K, C14orf118:p.R279I, C14orf166B:p.F230L, C3orf23:p.R217C, C3orf62:p.R185Q, CACNA1C:p.S710L, CAGE1:p.E539K, CARD10:p.KE272del, CCDC144A:p.S1264L, CCDC168:p.D5020Y, CCDC36:p.R209I, CD55:p.E156K, CEP44:p.S253L, CIITA:p.E728K, CREBBP:p.P2094L, CTNNB1:p.S37A, CTTNBP2:p.S420L, DCT:p.R532Q, DIAPH2:p.E121K, DLG2:p.S624L, DNAH10:p.R1888Q, DNAH14:p.R1367C, DNAH7:p.R2961Q, DNAH8:p.R1347H, DNAJC13:p.E1248K, DNMT1:p.E51K, DST:p.S1767Y, DYNC2H1:p.E883D, EMR1:p.R631Q, EPHX4:p.R282Q, ERCC6L2:p.L445I, F10:p.E117K, FAM155B:p.E158K, FAM83B:p.R206Q, FARP1:p.S383L, FAT3:p.A4159T, FBXW7:p.R689W, FBXW7:p.R465C, FBXW7:p.G423V, FN1:p.R290C, FZD6:p.R416Q, GABRA3:p.R73H, GABRA4:p.R460Q, GALNTL2:p.E395K, GFAP:p.A233T, GGA2:p.A63V, GIGYF2:p.R227H, GNPTAB:p.R1189Q, GPR112:p.S1283Y, GPR98:p.R4142W, GRIA3:p.S646Y, GRM6:p.E363D, HMCN1:p.S133Y, HSPA4L:p.R483C, HTR2A:p.S219L, INTS7:p.R940C, INTS7:p.R106I, ITM2C:p.E167K, JAKMIP2:p.R283I, KCND3:p.S438L, KCNS2:p.D211N, KDM1B:p.F361L, KIAA0556:p.L330I, KIAA1147:p.A149V, KIF23:p.R150Q, KIF27:p.K925N, KIF9:p.R594Q, KLHL13:p.E213K, KLHL28:p.E33K, LIN9:p.R183W, LRBA:p.E2103K, LRP2:p.R2432I, MAGI2:p.L450M, MC5R:p.A109T, MEGF10:p.S1053L, MKI67:p.T1664fs, MKLN1:p.F485L, MMRN1:p.F917L, MSH4:p.E730K, MTOR:p.S2215Y, MUC7:p.S336L, MYBPC2:p.R646H, N4BP2L2:p.R506C, NAPSA:p.R121Q, NCOA7:p.E369D, NCR1:p.R258W, NEK11:p.R374Q, NHEJ1:p.R109Q, NNMT:p.E233K, NOTCH4:p.15_16LL>L, NPY1R:p.A371T, NRAS:p.Q61R, OGDHL:p.R57C, OMA1:p.R445Q, OPRM1:p.R462C, OR4C12:p.F248L, OR5AK2:p.K89N, OSBPL6:p.R577Q, PCDHAC2:p.K138N, PCDHB12:p.R289C, PCDHGC5:p.A70T, PIK3CA:p.R38H, PIK3CA:p.E39K, PIK3CA:p.E110del, PIK3CA:p.K111E, PIK3CA:p.Q546K, PIK3CA:p.M1043V, PIK3CA:p.M1043I, PLA2G3:p.R201Q, PLXNA1:p.E1295K, PON1:p.R306Q, POTEE:p.R303I, POTEF:p.K674N, PPP2R1A:p.S256F, PPP2R3B:p.F310L, PRAM1:p.A268T, PREX1:p.E1246K, PRKCQ:p.A324V, PTEN:p.R130P, PVRL4:p.A358T, RAI2:p.S385Y, RBM39:p.T353I, RELN:p.F2722L, RFPL1:p.R148Q, ROBO2:p.D1018N, ROS1:p.R245I, RPS6KA6:p.S394Y, RSBN1:p.E572K, RYR1:p.A2576T, SACS:p.R2906Q, SCAPER:p.R366Q, SELP:p.R429W, SENP7:p.S673Y, SEPHS1:p.E13K, SFRP4:p.R232Q, SGK1:p.K367del, SIX1:p.E191K, SLC10A7:p.S261L, SLC12A2:p.R828Q, SLC16A14:p.R495Q, SLC7A2:p.R322W, SMCR8:p.E175K, SOS1:p.N233Y, SPOP:p.E50K, STRN3:p.K218N, STXBP6:p.D92N, SULT1E1:p.R77Q, SUN3:p.L124I, SUSD1:p.R343C, SYNM:p.R516Q, TAF1:p.R843W, TDRD3:p.R322Q, THADA:p.S1941L, TLN2:p.S208L, TMEM161B:p.R315Q, TMPRSS3:p.R16Q, TP53:p.Y220C, TPTE:p.S423L, TRANK1:p.E846K, TRPC5:p.S490L, TRPM3:p.R429W, TSSK1B:p.E301K, TTLL7:p.R751H, TTN:p.S20317L, TTN:p.E6404K, TTN:p.R4434Q, TTN:p.R2506Q, UGT8:p.E102K, USF1:p.R52Q, USP16:p.R455Q, USP25:p.R873H, USP33:p.R36Q, VPRBP:p.R802Q, VPS13B:p.R692Q, WDR65:p.F110C, YTHDC2:p.E185K, ZFYVE1:p.R266Q, ZKSCAN1:p.R541fs, ZNF117:p.R157I, ZNF180:p.R569I, ZNF195:p.R59Q, ZNF254:p.K179N, ZNF263:p.R510I, ZNF333:p.R554Q, ZNF354B:p.R402I, ZNF442:p.R309Q, ZNF454:p.R376I, ZNF485:p.R374I, ZNF488:p.R206Q, ZNF559:p.E284K, ZNF594:p.R287I, ZNF611:p.R390I, ZNF645:p.R154C, ZNF649:p.R338Q, ZNF649:p.R198I, ZNF674:p.R405I, ZNF675:p.R220I, ZNF678:p.R564I, ZNF732:p.R354I, ZNF780A:p.R466Q, ZNF823:p.R547I, ZNF836:p.R854I, ZNF836:p.R630I, ZNF841:p.R757I и ZNF98:p.R370I.

59. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от ACC; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из ZFPM1:p.EPL444del, GARS:p.P42A, ZNF517:p.V349A, LRIG1:p.L24V, CCDC102A:p.R96W, OPRD1:p.C27F, SOWAHA:p.R124P, LACTB:p.M5L, TOR3A:p.F13L, ZFPM1:p.E444fs, ZNF787:p.D367del, LRIG1:p.L26V, IRX3:p.L422P, TRIOBP:p.H1300R, TUBA1C:p.L146F, ZFPM1:p.P445fs, ZFPM1:p.446_447LA>P, TPO:p.S398T, USP42:p.R779P, ERCC2:p.D312N, GLTPD2:p.D209E, OTOP1:p.LLW104del, RINL:p.P402L, AMDHD1:p.S3G, ASPDH:p.Q266R, KCNK17:p.S21G, TMEM247:p.Q128E, MUC5B:p.D682G, OBSCN:p.R4516W, FAM184B:p.R784W, SEMA5B:p.V840D, ZNF598:p.E25G, ADAD2:p.G44E, C1orf106:p.R538C, ZAR1:p.Q42H, PANK2:p.G126A, PODXL:p.28_30PSP>P, SALL3:p.L593V, THEM4:p.L17R, C2orf81:p.T315P, CLDN23:p.V210M, FAM109A:p.GGG156del, FPGS:p.I22V, HHIPL1:p.V692A, MUC5B:p.M2869T, PLEC:p.R1386Q, SYT8:p.R373W, TAF5:p.S130A, TMEM189-UBE2V1:p.N6D, UQCRFS1:p.S6A, B3GNT6:p.L316fs, CCDC105:p.P499T, CLIC6:p.Q298E, IDUA:p.T374P, NOTCH2:p.C19W, RGS9BP:p.A96S, RREB1:p.G783V, SP8:p.G165del, WDR34:p.W60G, C19orf10:p.G12R, CELSR2:p.16_17insP, FAM75C1:p.71_71H>HLVSQRH, GPRIN2:p.R446H, KBTBD13:p.A81V, OGFR:p.S557T, PODXL:p.30_30P>PSP, BHLHE22:p.L62Q, C4orf32:p.G32E, C5orf65:p.Q245R, KNDC1:p.V806D, KRTAP10-6:p.49_49P>PSCCAP, LRP11:p.P92R, MAP1S:p.S411C, NOL9:p.S58A, RASIP1:p.R601C, RGMB:p.S63R, SARM1:p.R23P, TSC22D2:p.A419T, ZNF628:p.T230A, ZNF814:p.A337V, AATK:p.A541T, BTBD11:p.G265A, CRIPAK:p.C143R, KCTD3:p.F9V, KRT8:p.S59A, MUC5B:p.S681G, NCOR2:p.1846_1847insSSG, OGFR:p.E556K, APOE:p.C130R, C10orf95:p.A85S, C13orf33:p.R59G, CRIPAK:p.C174R, FAM18B2:p.C51Y, GLI3:p.P998L, GLTSCR2:p.Q389R, HECTD2:p.P19A, IRF2BPL:p.123_125QQQ>Q, MEX3C:p.179_182AAAA>A, NEFH:p.EE658del, RNF149:p.S9G, RNF222:p.A133T, SEZ6L2:p.R74P, TNIP2:p.R73G, ARRDC4:p.T79A, B3GNT6:p.P330fs, BAG1:p.G45R, C22orf26:p.P28L, CHDH:p.E40A, COQ2:p.V66L, CTGF:p.H83D, DLEU7:p.A83V, EPPK1:p.D2378H, FAM86C1:p.R30P, FZD1:p.93_94insP, GPRIN2:p.V241M, GPX1:p.11_13AAA>A, HES3:p.P96T, JMJD4:p.A11V, KANK3:p.R359H, LPPR2:p.A186S, NEFH:p.665_666insEE, NOM1:p.R24G, RNF39:p.G263C, SCRT1:p.S133A, SNED1:p.L1228P, TTLL11:p.122_123insKA, ZCCHC3:p.A159del, ZNF219:p.QP233del, ASB16:p.T249A, ASB2:p.H515P, ATP9B:p.S39G, AVL9:p.G7fs, C17orf96:p.L63V, C19orf29:p.A499V, CRB2:p.T1110M, CRIPAK:p.P173R, CRIPAK:p.I190L, CSGALNACT2:p.L362F, CTBS:p.LAL31del, CTNNB1:p.S45P, DMRT1:p.S45T, DOK7:p.G461D, FBRSL1:p.A836V, FEZ2:p.P50L, FRG1:p.S169N, HSD17B1:p.G313S, IBA57:p.S130R, KIF1A:p.E917D, KRTAP9-1:p.160_160Q>QPSCGSSCCQ, LURAP1L:p.55_56insGGG, NMU:p.A19E, NMU:p.A18E, NOXA1:p.D6E, NPTX1:p.G100D, PLIN5:p.R306W, TBP:p.95_96insQ, TMEM200C:p.S498G, TNXB:p.V706fs, VARS:p.P51S, ZC3H12D:p.P405S и ZZEF1:p.V30A.

60. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от CESC; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из PIK3CA:p.E545K, PIK3CA:p.E542K, MAPK1:p.E322K, EP300:p.D1399N, ERBB2:p.S310F, ERBB3:p.V104M, KRAS:p.G12D, ANKRD12:p.E721Q, ANKRD36:p.M1144T, MICA:p.G318fs, PIK3CA:p.E726K, PTEN:p.R130Q, ABCD1:p.S606P, ACTL7B:p.E211K, ADAM21:p.F129C, ADAMTS12:p.P1053A, AKT1:p.E17K, ANKLE1:p.V643L, ANO3:p.M956I, AOAH:p.R326T, APOD:p.S115L, ASCC1:p.H207Y, ATM:p.S800F, AURKA:p.S387L, BAG5:p.M286I, C12orf43:p.E28Q, C16orf3:p.G65S, C3orf70:p.S6L, C4orf21:p.E800Q, CALB2:p.K60N, CALCB:p.R81T, CCDC152:p.E153Q, CCDC53:p.R58C, CDC27:p.P242S, CFHR5:p.R441H, CLOCK:p.L123fs, CMYA5:p.E2733K, CNTRL:p.P185S, CSHL1:p.R117Q, CSMD3:p.H952Y, CTNNB1:p.D32G, CTSH:p.E254Q, DHPS:p.F49L, DMPK:p.R44H, DNAH14:p.F622fs, DNAH3:p.E3367Q, DNAH8:p.E587D, DNASE1L1:p.D212N, ECE2:p.D254N, FAM71B:p.H445D, FAM73A:p.G23V, FAS:p.E261K, FBXW7:p.R505G, FBXW7:p.R465C, FEZF2:p.E82K, FKBPL:p.E161Q, FMNL1:p.E927Q, GPATCH3:p.E275Q, GPR142:p.R304T, GPRIN2:p.T100P, GRAMD2:p.I123M, HERC2:p.S329F, HGF:p.G229A, HIF3A:p.A72T, HIST1H1B:p.K188N, HIST1H2AL:p.R30P, HIST2H2AC:p.R30P, HLA-C:p.N104K, HLA-DPB1:p.G114fs, HRNR:p.G2539S, INVS:p.R799K, JPH3:p.Q433H, JUP:p.S627L, KIAA1211:p.R308fs, KIAA1211:p.E309fs, KLK2:p.E161K, KRAS:p.G13D, KRAS:p.G12V, LIN9:p.E231K, LOC151174:p.P90S, LRRC37A3:p.A406D, LRTM2:p.L176V, MEPE:p.S30T, MUC12:p.R2634C, MUC4:p.S2936L, MYOM2:p.D988N, NFE2L2:p.D29H, NOTCH2:p.R2298W, NPIPL1:p.P250L, NR5A2:p.E80K, NYAP2:p.R197Q, OBSL1:p.E1642K, OR13C2:p.L9V, OSBP:p.Q721H, PAOX:p.H107Y, PDILT:p.E500K, PIAS3:p.D460N, PLEKHO2:p.E351Q, PNRC1:p.R73C, PPP4R1:p.L597F, PREP:p.F469L, PRKDC:p.Q3568E, PSME3:p.R231W, RANBP6:p.R915W, RCAN2:p.D440N, RNPC3:p.E116fs, SDHAP1:p.H66Y, SDHAP2:p.S37fs, SERPINA3:p.K158N, SERPINA4:p.R98C, SF1:p.R255W, SGSM1:p.E818K, SIM1:p.V213M, SLC10A4:p.F281L, SLC25A5:p.I79F, SLC35G2:p.K62fs, SLC4A9:p.R617C, SLCO2A1:p.M479I, SND1:p.Q38E, SPATA17:p.R72K, SRSF12:p.S150C, TADA2B:p.E67K, TCTEX1D2:p.S74L, TEDDM1:p.M166I, TEX15:p.E1652Q, TMC2:p.E92D, TMEM131:p.E1319Q, TNKS2:p.T619fs, TNS1:p.Q659del, TP53:p.E285K, TRAF3:p.S9F, TRIM61:p.K98N, TRPM1:p.M996I, TUFT1:p.L101F, U2AF1:p.S34F, UNC93B1:p.V498M, USP4:p.L259V, VCAN:p.S1308C, WDR17:p.P278S, ZBED4:p.S385L, ZEB2:p.E1094K, ZFYVE9:p.M1147I, ZNF16:p.R452W, ZNF677:p.R131T и ZSWIM4:p.E407K.

61. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от CRC; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из KRAS:p.G12D, KRAS:p.G12V, BRAF:p.V600E, KRAS:p.G13D, TP53:p.R175H, PIK3CA:p.E545K, FBXW7:p.R465H, KRAS:p.A146T, PIK3CA:p.H1047R, TP53:p.R248W, CDC27:p.D555E, SMAD4:p.R361H, TP53:p.R273H, KRAS:p.G12C, NRAS:p.Q61K, ERBB2:p.V842I, ERBB3:p.V104M, FBXW7:p.R465C, PIK3CA:p.R88Q, PIK3CA:p.E542K, TP53:p.R273C, TP53:p.G245S, AXIN2:p.G665fs, C16orf45:p.T106N, C20orf26:p.R1088Q, DNMT1:p.E432K, FBXW7:p.R505C, HLCS:p.E362K, HPSE2:p.K58N, KIF14:p.R598Q, KIF18A:p.R17C, KIF20B:p.E991K, KLHL5:p.R326C, KLK2:p.P57T, KRAS:p.G12A, KRAS:p.G12S, LPHN3:p.R1183Q, LRP6:p.R675Q, MYH8:p.R1048Q, NRAP:p.E327K, NRAS:p.G12C, PIK3CA:p.N345K, POSTN:p.R508C, PPP2R1A:p.R183W, PTEN:p.R130Q, RAF1:p.S257L, SDK1:p.T1181M, SGSM1:p.F1117L, TCF7L2:p.R482fs, TP53:p.R282W, TRIM23:p.R289Q, UGT8:p.E102K, ZNF491:p.R343Q, A2M:p.R732Q, AADACL4:p.A266T, ABCA8:p.E1158K, ABCA8:p.R842Q, ABCA8:p.A696T, ABCB8:p.R345H, ACACA:p.R1731C, ACADM:p.F48C, ACOT9:p.R50Q, ACPP:p.R105Q, ACTL7B:p.R354H, ACTL9:p.R331H, ACVR1:p.S290L, ADAM30:p.S314Y, ADAM32:p.R559Q, ADAMTS16:p.D817N, ADAMTS4:p.R156W, ADCY5:p.R661H, AGMAT:p.V313M, AGPAT4:p.A212T, AKAP12:p.E1282K, AKAP9:p.L3482I, ALB:p.S294L, ALDH1L1:p.A870T, ALG2:p.S302Y, AMOTL1:p.R676Q, AMPD1:p.K502N, AMPH:p.R292W, ANKRD6:p.R479C, APBA1:p.K730N, APBA1:p.E624K, APC:p.E847fs, APC:p.F1354fs, APC:p.M1413fs, APOB:p.R3136C, APOB:p.A43V, APPL1:p.R668W, AQPEP:p.A309T, ARF4:p.R149H, ARFGEF1:p.D1632N, ARHGAP32:p.E1253K, ARHGAP36:p.R128C, ARHGAP36:p.A147V, ARHGAP5:p.D890fs, ARNTL:p.T395M, ARPP21:p.R338H, ARSG:p.V131I, ASCC3:p.R1197Q, ATP10D:p.R311H, ATP6V0A4:p.R191Q, ATP9B:p.R265Q, AXDND1:p.E930D, AXIN2:p.W663fs, B2M:p.L13fs, B3GALNT1:p.R145Q, BACH1:p.R538Q, BAG5:p.D439N, BBOX1:p.F176V, BCL2L11:p.R91Q, BCL7A:p.T52M, BCLAF1:p.R37fs, BEND5:p.R198C, BICD2:p.R162H, BLVRA:p.S44L, BMP3:p.R344W, BNC2:p.R512W, BRPF1:p.R66C, BRWD3:p.R787C, BTBD7:p.S436L, BUB1B:p.F996L, BZRAP1:p.V1627I, C11orf30:p.R1111C, C14orf101:p.E295K, C14orf102:p.D115N, C14orf105:p.R100I, C15orf2:p.V488I, C15orf33:p.D340N, C16orf87:p.R151I, C1RL:p.L351fs, C22orf40:p.P32fs, C3orf39:p.R333W, C5orf30:p.D4N, C5orf4:p.R114Q, C6orf170:p.K724T, C7orf63:p.A10T, CACHD1:p.S720Y, CACNA1A:p.T665M, CACNA2D3:p.A332T, CACNB2:p.R608H, CACNG3:p.V134I, CACNG3:p.A138V, CACNG5:p.G121R, CADM1:p.S190L, CADPS:p.A1073T, CAPRIN2:p.E13K, CARD11:p.R423Q, CASC1:p.R54Q, CASP14:p.R5W, CBFB:p.E152K, CC2D2A:p.R1284C, CCDC18:p.K615N, CCDC60:p.R230H, CCDC81:p.R259I, CCDC88C:p.P1851fs, CCKBR:p.V236M, CD101:p.D283Y, CD101:p.R594Q, CD180:p.N228T, CDC14B:p.R375C, CDCA7L:p.P405fs, CDH10:p.E349K, CDH12:p.D674N, CDH20:p.A134V, CDH23:p.F177L, CDH2:p.D547Y, CDH9:p.F523L, CDK16:p.R108C, CEACAM5:p.L640I, CEP152:p.E21K, CERS3:p.E95D, CHD4:p.R975H, CHD5:p.A801T, CIZ1:p.V668A, CLEC18A:p.R423H, CLTCL1:p.R481W, CMAS:p.R110Q, CNRIP1:p.R102W, COBLL1:p.K732N, COL14A1:p.R1082I, COL17A1:p.P1004L, COL4A6:p.L550I, COL6A3:p.D2792N, COPB1:p.R425C, CORO2A:p.*526R, COX15:p.L86I, CSMD1:p.S781Y, CTCFL:p.E423K, CTDNEP1:p.E126K, CTTNBP2:p.R164C, CYP4B1:p.E434D, DACH2:p.R539C, DBC1:p.V216I, DBF4B:p.S254Y, DCHS2:p.F2149L, DCLK2:p.S549Y, DDI1:p.R275Q, DENND4A:p.P357H, DENND4C:p.R1081Q, DHTKD1:p.R410Q, DISP1:p.R763C, DKK2:p.R230H, DKK4:p.R203Q, DLC1:p.A350V, DLC1:p.E222D, DMD:p.R3195H, DNAH5:p.R982H, DNAH5:p.R224Q, DNAH9:p.D1547N, DNAJC24:p.E61K, DNM1:p.A251T, DNMT1:p.E1531Q, DNMT3B:p.R92W, DOCK10:p.A1830V, DOCK1:p.E864K, DOCK2:p.G170R, DOCK3:p.R1183C, DOCK5:p.E177K, DOK5:p.R274W, DPP8:p.G165R, DPY19L1:p.F378L, DUOX2:p.F880L, DVL2:p.A601fs, EBAG9:p.E187K, EBF3:p.G255fs, EDNRB:p.L450R, EGR2:p.R390H, EHD3:p.E44K, EIF2C1:p.R139Q, ELF3:p.F305fs, ELMOD2:p.T141M, EMR2:p.S75L, ENAM:p.R373H, ENOX2:p.R356W, ENTPD7:p.E327K, EPG5:p.D369N, EPHB2:p.R392H, ERCC6:p.V780I, ERCC6L:p.R505Q, ERRFI1:p.A421T, ESCO1:p.R300Q, ETV6:p.R369W, F8:p.S2269Y, FAM123B:p.F173fs, FAM135B:p.R884H, FAM169B:p.K165N, FAM170A:p.E56K, FAM171B:p.D459N, FAM181A:p.R109H, FAM5B:p.R402C, FBXO11:p.A432V, FBXW7:p.R689W, FBXW7:p.S582L, FBXW7:p.R14Q, FGF14:p.A236V, FHDC1:p.R254W, FHOD3:p.A225T, FHOD3:p.E813K, FMO3:p.F510L, FNDC1:p.R652H, FOXK1:p.R354W, FOXN3:p.P96fs, FPGT-TNNI3K:p.R455H, FZD3:p.D367N, GABRA4:p.R460Q, GABRA5:p.S126N, GABRB3:p.D500N, GALNTL5:p.R262I, GJA1:p.R362Q, GLRA3:p.L454I, GLRA3:p.F132L, GOLGA4:p.Q1536H, GP2:p.S41L, GPC6:p.A214T, GPLD1:p.R717Q, GPR125:p.R113Q, GPR156:p.F754L, GPR158:p.D566N, GPR21:p.R216H, GPR61:p.A62T, GPR98:p.R4142W, GPRC5A:p.V30I, GRAP2:p.E69D, GRIA1:p.R218C, GRIA2:p.R845Q, GRM7:p.R679Q, GTF3A:p.K306N, HAO1:p.R172C, HARS2:p.R168H, HBB:p.F42L, HCN4:p.R525H, HDAC5:p.A1044T, HGF:p.S467Y, HIPK4:p.R280H, HLA-DMA:p.E84K, HMG20A:p.E248D, HPS3:p.S468L, HRSP12:p.R120Q, HS3ST1:p.E287K, HTR3B:p.R236C, HTR5A:p.R152C, HTT:p.D1548N, HYDIN:p.R1187C, HYDIN:p.R939Q, HYDIN:p.R451Q, HYOU1:p.R158C, IFT172:p.A944V, IGJ:p.R77Q, IL17RA:p.Q803fs, IL1RAPL2:p.T647M, IL3:p.A90T, IL5RA:p.L47I, INPP5D:p.R523Q, INPP5K:p.R263C, IRAK3:p.R267Q, IREB2:p.R419Q, ITGA4:p.T673M, ITGA4:p.F900L, ITIH5:p.A912T, ITK:p.E196K, JAG1:p.A462T, JAK1:p.V310I, KAL1:p.V303I, KBTBD8:p.V549I, KCNA3:p.A415V, KCND3:p.S438L, KCNMB4:p.F209L, KCTD20:p.L314fs, KDELC1:p.L447I, KIAA0528:p.R181Q, KIAA0556:p.R1082W, KIAA1109:p.S4937Y, KIAA1804:p.V474M, KIAA1804:p.R477W, KIF16B:p.R145Q, KIF26B:p.A1114V, KPNA4:p.R29Q, KRAS:p.K117N, KRAS:p.Q61L, KRAS:p.Q61K, KRT6B:p.L197P, L1CAM:p.T186M, LALBA:p.A41T, LAMA4:p.A558V, LBX1:p.R176W, LPAR4:p.R145Q, LRP1B:p.K2623N, LRP2:p.R3043C, LRP2:p.S737L, LRRC18:p.R218W, LRRC31:p.K23T, LRRC7:p.R1389H, LZTS2:p.P100fs, MACF1:p.S292L, MACF1:p.F722L, MAEL:p.R345C, MAGEE1:p.V380M, MAGI1:p.R1198C, MAP1B:p.E2046D, MAP2:p.K530N, MAP2K4:p.R287H, MAP3K4:p.R275Q, MAP7D2:p.R487C, MAPK8IP1:p.L217fs, MBOAT2:p.R43Q, MCF2L2:p.R926Q, MECOM:p.R969C, METTL16:p.R200Q, METTL21A:p.R174Q, METTL6:p.F56L, MFF:p.R162C, MFSD5:p.R280Q, MIA3:p.Q356H, MMAA:p.R326C, MORC1:p.D113Y, MORC2:p.R740H, MPDZ:p.L804I, MR1:p.S46L, MRPL47:p.L234I, MS4A8B:p.S3L, MSH4:p.K464N, MSH6:p.T1085fs, MSH6:p.R1095H, MUC16:p.R8606H, MYH13:p.D311N, MYH7:p.R1689C, MYO1D:p.E246K, MYO3A:p.N525H, MYO6:p.D1180N, MYO9A:p.R2179Q, MYO9A:p.R167Q, MYOZ2:p.E251K, MYT1:p.E226K, NAA25:p.S807Y, NCAM1:p.R474W, NCOA4:p.R562Q, NEB:p.D5434N, NEB:p.L1591I, NEB:p.E1214K, NEDD9:p.A798T, NEDD9:p.A316T, NEK1:p.R608C, NFASC:p.V256I, NINL:p.R1366C, NLRC4:p.D593N, NLRC4:p.E409K, NLRP4:p.V229I, NLRP5:p.R392H, NME9:p.E75K, NOLC1:p.T428M, NPC1:p.E451K, NPSR1:p.R235Q, NRAS:p.Q61L, NRAS:p.G13R, NRAS:p.G12D, NRG2:p.T246M, NTN4:p.E59K, NUB1:p.R373Q, NUDT15:p.S83Y, NUF2:p.S340L, NUP88:p.A302V, ODZ1:p.R2556W, OGDHL:p.A427T, OGFRL1:p.E427K, OLFM4:p.K132N, OPRM1:p.R353H, OR10A3:p.S93Y, OR2M3:p.R235H, OR52W1:p.R133C, OR5AU1:p.R312H, OR5B17:p.R163H, OR8S1:p.A99V, OSTN:p.R115Q, OTOL1:p.V431I, OTUD3:p.R277I, PAN3:p.S580N, PANK3:p.R260I, PAX3:p.T424M, PCBP1:p.L102Q, PCDH10:p.V477M, PCDH15:p.R1552I, PCDHAC2:p.A519T, PCDHAC2:p.E190K, PCDHAC2:p.A266T, PCDHAC2:p.A156V, PCDHAC2:p.E271K, PCDHAC2:p.A736V, PCDHB5:p.D51Y, PCDHB8:p.D235N, PCDHGC5:p.S289L, PCDHGC5:p.V662M, PCNXL2:p.R135Q, PCOLCE2:p.A348V, PCOLCE2:p.R87H, PDE4B:p.S417L, PGAM1:p.R240H, PHF3:p.R1410I, PIAS2:p.S519L, PIGR:p.A580T, PIK3CA:p.D350G, PIK3CA:p.E545A, PIK3CA:p.E545G, PIK3CA:p.Q546K, PIP4K2C:p.R204H, PKHD1L1:p.F1856L, PLA2G4A:p.E443K, PLCG2:p.E544K, PLCG2:p.D973N, PLEKHA6:p.V328fs, PLEKHG4B:p.E384K, PLK1:p.D233G, PLOD3:p.R297fs, PLSCR3:p.E77K, PLXNC1:p.S462L, PLXNC1:p.R819C, POLA1:p.E603D, POLE:p.S459F, POLE:p.V411L, POLQ:p.R860Q, PPP2R2B:p.P326L, PPP2R5C:p.S259Y, PRAMEF4:p.R248H, PREX1:p.V731I, PRKAA2:p.R407Q, PRKAR2B:p.S309L, PRKCI:p.R480C, PRKRA:p.K122N, PSG8:p.R397C, PSG8:p.R320C, PSMD12:p.R201Q, PTPDC1:p.R430W, PTPN12:p.R765Q, PTPN13:p.S887L, PTPRD:p.L1053I, PTPRU:p.D1434N, PXDN:p.P856fs, PXDNL:p.T1312M, QRSL1:p.S226L, RAB7L1:p.R79W, RALGAPA1:p.R398C, RANBP2:p.R1231C, RBBP7:p.E313K, RBBP7:p.E274K, RBFOX2:p.A340T, RBMXL1:p.R331Q, RHOBTB1:p.T464M, RIMS2:p.R599Q, RIN3:p.S708L, RLBP1:p.D281N, RLBP1:p.A72V, RNASET2:p.A127V, RNF113B:p.A172V, RNF150:p.R236Q, RNF150:p.S208L, RNF43:p.S216L, ROR2:p.D672N, RPL6:p.F193C, RPS6KA5:p.E166K, RSPO2:p.R28C, RUVBL1:p.E431K, RUVBL1:p.R117C, RWDD2B:p.R254H, RXFP3:p.R113C, RYR3:p.R2705Q, SAGE1:p.R229C, SCFD2:p.R545W, SCML4:p.R194Q, SCN10A:p.T1570M, SCN11A:p.A1688T, SCN11A:p.V1289I, SCN11A:p.V566I, SCUBE2:p.V342M, SEMA3A:p.D81N, SEMA4D:p.R252Q, SEPHS1:p.R371Q, SEZ6L:p.S207L, SFPQ:p.R611Q, SFSWAP:p.S617Y, SGCG:p.A220V, SGCZ:p.I41M, SH3TC2:p.R89C, SIGLEC11:p.S363F, SIPA1L1:p.R1063Q, SIPA1L1:p.S1227Y, SLC12A1:p.S292L, SLC22A15:p.S201L, SLC24A2:p.A134V, SLC25A40:p.R96Q, SLC2A7:p.A65T, SLC30A9:p.R194H, SLC33A1:p.S542L, SLC35F3:p.A280T, SLC39A7:p.R382C, SLC43A1:p.P133L, SLC43A3:p.R216H, SLC44A5:p.R185H, SLC6A2:p.A562T, SLC8A1:p.R431H, SLFN12L:p.F232fs, SLITRK1:p.R52H, SLITRK3:p.S298L, SMAD2:p.R321Q, SMARCA4:p.R381Q, SOCS5:p.S464L, SORBS1:p.V1156M, SORBS1:p.F570L, SORCS2:p.R320W, SOX6:p.R719W, SPATA22:p.S150L, SPEG:p.A944V, SPTB:p.R86C, SPTBN4:p.A1993V, STIM2:p.R572Q, STT3B:p.D583Y, SULT1C4:p.R85Q, SUN3:p.E128K, SUPT6H:p.A957T, SYNE1:p.I1249L, SYNE1:p.R170W, SYNE2:p.K3103N, SYNGR4:p.R169Q, SYT7:p.T349M, TANK:p.S380L, TAS1R2:p.R270C, TAS2R1:p.F183L, TCF7L2:p.R488C, TDRD10:p.S322L, TECTB:p.L29I, TEKT5:p.R401H, TGFBR1:p.S241L, THAP5:p.S287Y, THSD7B:p.R90H, TLL1:p.T153M, TLL2:p.S872L, TM9SF2:p.R91H, TMCC3:p.R110H, TMEM132A:p.R481C, TMEM132D:p.R578W, TMEM55A:p.R189Q, TMEM74:p.R125Q, TMPRSS11A:p.S288L, TNIP2:p.A139T, TOP2B:p.R656H, TOX:p.S354L, TP53:p.G244D, TP53:p.R175C, TPO:p.A826T, TPR:p.S2155L, TPTE2:p.R258Q, TPTE:p.S423L, TRAK1:p.D627N, TRAPPC11:p.R568Q, TRIM23:p.R396Q, TRIM44:p.D331N, TRIO:p.R661W, TRPA1:p.K54N, TRPC5:p.S490L, TRPM6:p.R995H, TRPM7:p.R1862C, TRPM7:p.R843Q, TRPS1:p.R1125W, TRPV5:p.R492H, TRRAP:p.R3515W, TSHZ1:p.R881M, TTC21A:p.S270Y, TTN:p.R22795C, TTN:p.R3193Q, TTN:p.R328H, TUBA3D:p.R243Q, TUFT1:p.A340T, TXNDC15:p.R343Q, UBE2NL:p.R86I, UBIAD1:p.A97T, UGT2A1:p.N97fs, USH2A:p.F2369L, USP11:p.A286T, USP25:p.R1119Q, USP26:p.R861Q, USP29:p.F81L, USP31:p.D391N, USP40:p.S851L, UTP14A:p.V148I, VAV3:p.E685K, VCAN:p.R1125H, VPS13C:p.D1359Y, WBSCR17:p.R228C, WDR3:p.E841K, WDR52:p.A157T, XKR6:p.R268Q, XPOT:p.R541W, YTHDC1:p.R267Q, YTHDC2:p.E634K, ZBBX:p.R596I, ZBTB24:p.L607I, ZC3H13:p.R103Q, ZCWPW2:p.D144N, ZEB2:p.R156H, ZFHX4:p.E237D, ZFP14:p.R386C, ZFP28:p.R525I, ZFP2:p.R150I, ZFP3:p.R273I, ZFP90:p.R330Q, ZHX2:p.V790I, ZIC4:p.S305L, ZIM3:p.D352N, ZKSCAN4:p.R319Q, ZMYM4:p.R1446Q, ZNF117:p.R185I, ZNF167:p.R683I, ZNF180:p.R401I, ZNF19:p.R349I, ZNF205:p.R384C, ZNF236:p.S1480L, ZNF248:p.R568I, ZNF259:p.R174I, ZNF266:p.R512Q, ZNF266:p.R344Q, ZNF280B:p.E363K, ZNF283:p.R392Q, ZNF32:p.S62L, ZNF345:p.R82Q, ZNF345:p.R334I, ZNF350:p.R310Q, ZNF434:p.R306C, ZNF439:p.E239D, ZNF439:p.R262I, ZNF443:p.R301I, ZNF445:p.L682M, ZNF470:p.R641I, ZNF471:p.R282I, ZNF484:p.R138C, ZNF528:p.R279Q, ZNF563:p.K26N, ZNF573:p.R350I, ZNF583:p.R344I, ZNF585A:p.E638K, ZNF585A:p.E491D, ZNF625:p.R235Q, ZNF652:p.K327N, ZNF677:p.R451I, ZNF678:p.R368I, ZNF699:p.R41I, ZNF70:p.R244I, ZNF770:p.S441P, ZNF774:p.R423Q, ZNF782:p.K247T, ZNF7:p.R337I и ZNF831:p.E949D.

62. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от DLBCL; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из EZH2:p.Y641F, MYD88:p.L273P, BCL2:p.G33R, CARD11:p.E626K, ADCY2:p.A87V, BCL2:p.N172S, BCL2:p.H20Q, BRAF:p.K601E, BTG1:p.L31F, CACNA1E:p.R1458C, CARD11:p.E93D, CD79B:p.Y197D, CD79B:p.Y197H, CREBBP:p.R1446H, GRID1:p.E622K, HIST1H1C:p.A65V, HIST1H1E:p.G133A, HIST1H3B:p.A48S, KRAS:p.G13D, MYD88:p.S251N, PABPC1:p.R94C, PIM1:p.L164F, PIM1:p.L184F, POU2F2:p.T239A, POU2F2:p.T239S, RELN:p.R2971Q, SLC25A48:p.A67T, STAT6:p.D468H, TNF:p.L47F и TRAF7:p.R11H.

63. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от KICH; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из ACR:p.W279C, AGRN:p.1284_VT>A, C7orf25:p.R384fs, CAMSAP1:p.T466fs, CBWD6:p.E102fs, DOCK8:p.L1111fs, EBPL:p.Q196P, EBPL:p.L189V, GFM1:p.A17fs, GOLGA6L6:p.D570E, ITGA5:p.A48D, LUZP2:p.S154fs, MTMR9:p.K193fs, MUC16:p.P10452fs, MUC4:p.S2832P, ODF2L:p.K407fs, RHBDD3:p.G34fs, RILPL1:p.S358R, TAS2R30:p.L236fs, TRRAP:p.A973S, UBR5:p.K2120fs, URGCP:p.G639fs, ZNF98:p.A222T и ZSWIM6:p.Q610fs.

64. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от KIRP; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из FAM18B2:p.C51Y, ZNF598:p.E25G, NEFH:p.E645K, EEF1B2:p.S43G, NEFH:p.AKSPEKEE652del, OBP2B:p.K61N, SKI:p.A62G, C14orf126:p.R6W, KRT8:p.S59A, ACSBG2:p.I250M, ASIC2:p.R46L, CSGALNACT2:p.L362F, FRG1B:p.A50P, IDUA:p.H33Q, KRTAP4-5:p.S74C, SCAF11:p.E926fs, SYN2:p.A34del, ZNF814:p.R322K, BMS1:p.E878D, JMY:p.P822T, KIF1A:p.E917D, KRTAP4-7:p.S57P, LAMA5:p.L2223R, LRP1:p.P1058T, MED16:p.H449Q, MUC2:p.T1488P, MUC5B:p.D682G, NACA2:p.R75K, NEFH:p.665_666insEE, OR2L8:p.S201fs, RGPD5:p.P1760A, RRN3:p.P11S, RRN3:p.R9C, STAG3L2:p.L81fs, ZNF814:p.G320E, ACP6:p.V29G, AHNAK2:p.S2166F, AHNAK2:p.P1215S, AP1G1:p.I782fs, AQP2:p.N68T, BAIAP2L2:p.V396M, BMP6:p.Q118L, BST1:p.G36A, CDR1:p.V31A, CLDN7:p.S172A, CLIP1:p.S1018fs, COL18A1:p.G884fs, CROCC:p.A355P, CTAGE15P:p.A364V, CUBN:p.I2816M, DMRT2:p.T106S, DPY19L1:p.V249L, DSPP:p.D1047N, EBPL:p.L189V, EIF4G1:p.E465del, EXOSC2:p.R11P, FAM216A:p.P36S, FCGR2A:p.V222G, FMOD:p.S331R, FOLR2:p.Q112R, FRG1B:p.L20P, GAGE2B:p.9_10insY, GDPD5:p.G593fs, GIMAP8:p.A544S, GLUD2:p.R300G, GLUD2:p.S496R, GPR135:p.Q5P, HOXD8:p.Q67H, IER5:p.R194G, IL25:p.C168fs, JSRP1:p.V92A, KRAS:p.G12D, KRTAP1-1:p.Y86C, KRTAP4-11:p.L161V, LTBP1:p.L163P, MAML2:p.Q591K, MAPK7:p.A501D, MEF2A:p.P99S, MET:p.H1094Y, MET:p.M1250T, MST1:p.N435fs, MUC2:p.T1582R, MUC2:p.T1722I, MUC4:p.A4222T, MUC4:p.T2335M, MUC4:p.P1138L, MUC5B:p.S1098A, MUC5B:p.S3431N, MYH7:p.A1487T, NBPF10:p.R39fs, NBPF10:p.Y638S, NEFH:p.654_654S>SPEKAKS, PARG:p.A584T, PBX2:p.Y262F, PIP4K2A:p.R219K, RLIM:p.S471P, RUNX2:p.Q71E, SGK223:p.R63S, SMARCB1:p.L365fs, SRCAP:p.Q1875fs, TBC1D2B:p.R920Q, TCF7L2:p.R482fs, TMEM131:p.K640fs, TMEM60:p.K77fs, TPPP:p.R30K, TRPV3:p.A218E, TTBK2:p.C83W, UBXN11:p.S510G, UGT1A1:p.T4A, UTS2R:p.A289E, YBX1:p.P250L, ZNF514:p.V81G, ZNF516:p.A256D, ZNF681:p.K405Q, ZNF814:p.D404E, ZNF814:p.P323H, ZXDB:p.G206R.

65. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от LIHC; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из TP53:p.R249S, CTNNB1:p.D32V, CTNNB1:p.D32G, CTNNB1:p.S33P, CTNNB1:p.K335I, CTNNB1:p.H36P, EEF1A1:p.T432L, GNAS:p.R844C, OR2T4:p.V137L, TP53:p.H193R, ATXN1:p.Q217H, CSMD3:p.F2383fs, CTNNB1:p.D32N, CTNNB1:p.S33C, CTNNB1:p.G34V, CTNNB1:p.S45P, CTNNB1:p.N387K, DHRS4:p.I218T, DNM2:p.E378D, F5:p.Q426L, GALNTL5:p.A45T, GPX1:p.P77R, GRM8:p.R852C, IDH1:p.R132C, KIF26B:p.A2033T, KRT8:p.S59A, LOC100132247:p.T532P, NEB:p.D3854H, PIK3CA:p.H1047R, SOLH:p.R714H, TP53:p.R158H, TP53:p.V157F и ZNF638:p.D400N.

66. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от MM; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из NRAS:p.Q61R, KRAS:p.Q61H, KRAS:p.G13D, NRAS:p.Q61K, BRAF:p.V600E, NRAS:p.Q61H, NRAS:p.G13R, ZNF717:p.W315C, ATP13A4:p.V431G, DNAJC12:p.R135K, IRF4:p.K123R, KRAS:p.A146T, KRAS:p.Q61R, KRAS:p.G12A, KRAS:p.G12D, ZNF717:p.N594I, ACTG1:p.A22P, ARL6IP1:p.M75L, BEND2:p.E630K, BRAF:p.G469A, CDHR1:p.R218G, DIS3:p.R780K, DMXL2:p.D2412E, DNAJC10:p.I80K, EGR1:p.Q9H, FGFR3:p.*807S, IDH1:p.R132C, IL6ST:p.P216H, INTS12:p.M1V, KRAS:p.K117N, KRAS:p.A59G, KRAS:p.G12R, MAX:p.R36W, MLL5:p.G492E, NBPF1:p.E810K, NRAS:p.Q61L, NRAS:p.G12D, ODF2L:p.E294K, PADI2:p.T114P, PNLIP:p.T37M, PRDM1:p.S588C, PTPN11:p.E76K, PTPN14:p.E286K, RBM6:p.V675G, SCN10A:p.R1142H, SRGAP1:p.T61M, SUSD1:p.T168P, TAS2R16:p.V231I, TINAG:p.E403K, TRIP12:p.L1775P и ZNF717:p.C844S.

67. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от PRAD; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из HSD17B7P2:p.N175S, RGPD5:p.P1760A, FRG1B:p.L52S, EEF1B2:p.S43G, FRG1B:p.I10T, FRG1B:p.A53T, LRRC37A2:p.T102S, NBPF10:p.E3455K, PTH2:p.L22V, CYP2D7P1:p.S32A, FAM47C:p.N648D, MAP3K9:p.E38del, MUC4:p.H4205Q, CHEK2:p.K373E, FRG1B:p.A11T, FRG1B:p.A50P, HLA-J:p.R124W, KRTAP1-5:p.I88T, KRTAP4-9:p.D18V, NPIP:p.A271V, PDGFRA:p.R483fs, ZNF780A:p.Q600H, ZNF845:p.R925H, ZNF91:p.R333H, ARFGAP3:p.N299fs, BTN2A3P:p.P3S, FNBP4:p.TT58del, HLA-A:p.Q78R, LOC554223:p.RAPWMEQ147del, PODXL:p.28_30PSP>P, POLI:p.D17del, SPOP:p.F133L, SYN2:p.A34del, TMEM52:p.23_26LLPL>L, UBC:p.L149R, ZNF208:p.I647S, ZNF799:p.E589G, ZNF814:p.D404E, ASTN2:p.L221del, B4GALNT1:p.G88fs, C16orf74:p.S21del, CCDC15:p.H458P, CD209:p.R129W, CNTNAP1:p.S1029I, DBR1:p.541_542DD>D, FAM22F:p.S691del, FRG1B:p.D32V, FRG1B:p.I34T, FRG1B:p.N55D, FRG1B:p.I59V, FRG1B:p.S71N, KIF25:p.W3R, KRTAP4-11:p.L161V, KRTAP4-11:p.M93V, KRTAP4-11:p.R51K, KRTAP4-6:p.S153Y, LILRB5:p.S598P, LMOD2:p.E124del, LOC645752:p.L40P, LRP1:p.P1058T, LRRIQ3:p.K244fs, LURAP1L:p.55_56insGGG, MLLT10:p.V463E, MYOCD:p.Q310del, NBPF10:p.N1369D, OTUD4:p.T909I, PARG:p.A584T, PEX1:p.I370fs, POTEC:p.K507E, POTEC:p.R477Q, POU4F2:p.68_69insG, PRG4:p.T417P, SDHAP2:p.R31C, SPOP:p.F133C, SPOP:p.W131G, TIMD4:p.T152del, TMEM121:p.P299del, TP53:p.G245S, UBC:p.R73L, UBC:p.I191T, WASH3P:p.G175S, ZMIZ1:p.D1048fs, ZNF709:p.T413I, ACADS:p.R330H, ADAMTS7:p.K1357fs, AFF2:p.R597H, AGAP6:p.S127I, AK302238:p.A44T, AK302879:p.Q191R, ALDH1A2:p.R85C, ANAPC1:p.T537A, ANKRD36C:p.H438R, AP4B1:p.R276W, ARFGAP2:p.S38N, BBS9:p.F268fs, BC139719:p.L133R, BRAF:p.G469A, C22orf43:p.D171del, CANT1:p.K131R, CHD3:p.E35del, CLEC4A:p.R209H, CNOT3:p.E20K, CNPY3:p.17_18LL>L, CNTNAP3B:p.S317T, CNTNAP3B:p.M1247I, CTNNB1:p.T41A, DDX10:p.D788del, DLC1:p.S741T, DPY19L2:p.M210V, EDC4:p.S617del, EFCAB6:p.R379K, ERC2:p.927_928HH>H, FAM111B:p.S269fs, FEM1A:p.L620M, FHOD3:p.A632fs, FLJ43860:p.L850fs, FMN2:p.G59del, FNBP4:p.914_915PP>P, FRG1:p.E86del, FRG1B:p.K13N, FRG1B:p.P42Q, GABRB1:p.R416C, GABRR2:p.A368V, GAGE2B:p.9_10insY, GOLGA8DP:p.N84H, GOT2:p.R355W, GPATCH4:p.K210fs, HDGFL1:p.188_189insA, HLA-DQB2:p.G250S, HLA-DQB2:p.R247H, IDH1:p.R132H, IL27:p.E176del, IRF2BPL:p.123_125QQQ>Q, KANK3:p.DGDS489del, KIAA1462:p.858_859SS>S, KRTAP4-11:p.S48R, KRTAP4-7:p.S57P, KRTAP4-8:p.C95S, LPHN3:p.R826H, LRP10:p.L11del, LRP5:p.S1609P, LRRC16B:p.R787W, MAS1L:p.R324G, MECOM:p.R915Q, MED12:p.L1224F, MED12L:p.Q2115del, MESP2:p.GQGQGQGQ195del, MGAT4C:p.T345M, MLEC:p.E238del, MSLNL:p.T68P, MUC7:p.S173P, MYC:p.Q37del, NBPF10:p.N440D, NLRP6:p.E611del, NOX3:p.C404fs, OR1M1:p.V69I, OR7E24:p.L7fs, OTUD4:p.A153del, PANK2:p.T417fs, PCLO:p.S496P, PCNT:p.S162G, PCSK9:p.23_24insL, PHOSPHO1:p.S32del, POU4F1:p.H108del, PRAMEF8:p.R319H, PRDM7:p.M387L, PRG4:p.T597P, PTPRD:p.R1323C, PTPRF:p.R1174Q, ROBO3:p.RS1367del, ROCK1:p.T518S, RPTN:p.G296S, RTL1:p.152_152E>EE, SIRPA:p.V233I, SLC2A6:p.A230D, SLC8A2:p.E710del, SMG7:p.E846fs, SNAPC4:p.S542del, SP8:p.G165del, SPOP:p.F133I, SPOP:p.F133V, SPOP:p.F102C, SPOP:p.F102V, SRSF11:p.G17fs, SRSF4:p.K396del, SSPO:p.S4198fs, STAG3L2:p.L81fs, STK19:p.R18fs, TBC1D2B:p.R920Q, TBC1D9:p.P1233T, TCHH:p.P1158R, TCOF1:p.K1366del, TNRC18:p.2664_2665SS>S, TP53:p.R248Q, TP53:p.R175H, TP53:p.C141G, TSPAN4:p.L92V, UBXN11:p.GPGPGPSP504del, UTP3:p.E81del, WASH3P:p.L187V, ZAN:p.P717L, ZAN:p.L878P, ZFP90:p.R591fs, ZNF761:p.H373R и ZNF91:p.H305R.

68. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от STAD; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из RNF43:p.G659fs, BZRAP1:p.P1416fs, XYLT2:p.Y526fs, LARP4B:p.T163fs, PGM5:p.I98V, ZBTB20:p.P692fs, ARID1A:p.G1848fs, FHOD3:p.P334fs, KIAA0182:p.T120fs, ATP6V1B1:p.Y383fs, PIK3CA:p.H1047R, FRMD4A:p.P1005fs, PIK3CA:p.E545K, CDC14A:p.N123fs, KRAS:p.G13D, MLL2:p.T172fs, BCORL1:p.S1679fs, PLEKHA6:p.V328fs, C9orf131:p.P342fs, CD4:p.Q164fs, FBXW7:p.R465C, GNG12:p.T68fs, IRS4:p.G591fs, JARID2:p.V422fs, KIAA0195:p.I902fs, MBD6:p.P732fs, MVK:p.P138fs, PAMR1:p.G101fs, WNT16:p.W165fs, ZNF43:p.N251fs, ABCA6:p.L306fs, ADAM28:p.K73fs, AOC3:p.L79fs, ATP2A1:p.R819fs, B2M:p.L13fs, C6orf89:p.P58fs, CNTLN:p.K1305fs, CR2:p.V206fs, DYRK4:p.K468fs, ERBB3:p.V104M, GLI1:p.W272fs, KRAS:p.G12D, MLL2:p.T172fs, MSH6:p.T1085fs, NLK:p.C190fs, OR5M3:p.T89fs, PAX6:p.P375fs, PTEN:p.L265fs, RABGAP1:p.K928fs, RAD51AP2:p.T316fs, SVIL:p.G1862fs, TP53:p.R273H, WNK4:p.G606fs, ARID1A:p.P2139fs, AXIN2:p.G665fs, C13orf33:p.R67fs, C1QTNF5:p.P308fs, CELSR1:p.G614fs, CRYGD:p.G159fs, DCHS1:p.R235fs, DDC:p.I433fs, EDNRB:p.Y383fs, EPHA2:p.P460fs, FOXN3:p.P96fs, HDAC4:p.P901fs, INF2:p.S527fs, KIRREL2:p.V649fs, KLF3:p.I104fs, KLHL14:p.P231fs, MAP7D3:p.Q308fs, OTX2:p.R44fs, PAFAH1B1:p.K302fs, PLAGL2:p.P10fs, POLM:p.P97fs, PRPF40B:p.I31fs, RALGAPB:p.T379fs, SBNO1:p.N1139fs, SERPINI1:p.L81fs, SH3KBP1:p.L574fs, SLC12A7:p.H686fs, SLC27A3:p.P643fs, TBX4:p.S370fs, TP53:p.R273C, TP53:p.R175H, TRAM1L1:p.R345fs, WBP1:p.P138fs, ABCC4:p.L883fs, AKAP13:p.K2785fs, ALDH3A1:p.P562fs, ALPK2:p.L356fs, ARFGEF1:p.P1552fs, ARID1A:p.G1848fs, AVPR1A:p.F351fs, BAX:p.M38fs, C14orf43:p.P313fs, C1QTNF5:p.G194fs, C7orf50:p.L179fs, CDC25C:p.K322fs, CETN3:p.K63fs, CHD3:p.P597fs, CTCF:p.K202fs, CTSC:p.F105fs, DDX17:p.G163fs, DLGAP3:p.G377fs, EBF3:p.G255fs, FHDC1:p.F100fs, FILIP1L:p.K749fs, FLNB:p.W529fs, GBP7:p.G431fs, GCC2:p.E700fs, GPR161:p.G517fs, IWS1:p.S802fs, KIAA0240:p.K895fs, KIAA1967:p.P415fs, LRRC43:p.D558fs, MACF1:p.R707fs, MBD6:p.G780fs, MLL3:p.F4496fs, MPRIP:p.A351fs, MUC6:p.2129_2130SS>S, NOX5:p.P467fs, OPTN:p.P24fs, OR4K5:p.F177fs, PIK3CA:p.N345K, PIK3CA:p.E542K, PLXNA1:p.P1016fs, PNPLA7:p.P1199fs, PODN:p.I301fs, PPP2R3B:p.T389fs, PRSS36:p.L680fs, RGL2:p.G203fs, RHOQ:p.V190fs, RNF111:p.R771fs, RTN2:p.P313fs, SALL4:p.V995fs, SBF1:p.P1076fs, SETDB2:p.R715fs, SNAPC2:p.T292fs, SPG20:p.F232fs, SRCAP:p.P1876fs, STAT2:p.P489fs, TCHP:p.E172fs, TP53:p.R282W, TP53:p.R248Q, USP21:p.K474fs, WDR7:p.G262fs, ZBTB7C:p.E157fs, ZFC3H1:p.K385fs, ZNF124:p.T339fs, ZNF626:p.K115fs, ADNP2:p.S322fs, AGAP1:p.G127fs, ALDH2:p.L286fs, ARHGAP5:p.D890fs, ARHGEF17:p.A615fs, ARID1A:p.Y1324fs, ART1:p.I243fs, ASCL4:p.D35fs, ATXN2L:p.G998fs, B3GNT5:p.F30fs, BCKDHA:p.H37fs, BCL9L:p.P1127fs, BEND3:p.D265fs, BNC2:p.S575R, BRD3:p.P24fs, C12orf51:p.P4235fs, C1R:p.P216fs, C7orf49:p.G130fs, CA2:p.I145fs, CABP5:p.R145fs, CASD1:p.F781fs, CASP8:p.R471fs, CCDC153:p.P200fs, CD93:p.D280fs, CROT:p.L32fs, CSF3R:p.P468fs, CTCF:p.K202fs, ERBB2:p.S310F, FAM46D:p.S69R, FBN3:p.G601fs, FBXO21:p.F144fs, GAS6:p.G150fs, GLYR1:p.G380fs, GXYLT1:p.L223fs, HAUS6:p.S530fs, IGF2R:p.T1314fs, ITGB1:p.L378I, KDM3B:p.P1316fs, KIF13A:p.K1115fs, KLF3:p.S224fs, LARP1:p.A223fs, LRP1:p.G1488fs, LRP1:p.G1488fs, MAGEE2:p.Q45fs, MAMSTR:p.P162fs, MAPK15:p.Q511fs, MLL2:p.P647fs, MOCS2:p.P22fs, MTG1:p.L105fs, MTG1:p.H327fs, MTIF2:p.N109fs, NID2:p.R1035fs, PAX2:p.P395fs, PCCA:p.R230H, PDZD2:p.R101fs, PFKP:p.M593fs, PIK3CA:p.R88Q, PLA2G1B:p.L53fs, PLAU:p.R201fs, PMEPA1:p.P208fs, POP1:p.K750fs, PTCH1:p.P1307fs, PTPRT:p.P1075fs, RDBP:p.P6fs, RNMT:p.K392fs, ROBO2:p.P1080fs, RUNDC3B:p.L6fs, SDAD1:p.K275fs, SLC10A6:p.G109fs, SNAPC1:p.D211fs, SPATA5L1:p.C685fs, SPTA1:p.K1732T, STAT5B:p.P367fs, SYT4:p.M1fs, TAF1L:p.K851fs, TAP2:p.L75fs, TBL1XR1:p.N126fs, THEMIS:p.K406fs, TMEM79:p.P161fs, TP53:p.C176F, TP53BP2:p.K69fs, TP53RK:p.L174fs, UBQLN2:p.A523fs, UHRF1BP1:p.I1330fs, VPRBP:p.K939fs, VPS13B:p.T56fs, WASF3:p.P305fs, YLPM1:p.E1178fs, ZC3H13:p.K1006fs, ZC3H18:p.P825fs, ZC3H4:p.E779Q, ZNF48:p.P247fs, ZNF608:p.A465fs, ZNF878:p.S238fs, ZSCAN18:p.P225fs, ABCB1:p.R527fs, ABCB6:p.G318fs, ACACB:p.G255fs, ACP1:p.Q123fs, ACTL6A:p.L88fs, ADAMTSL4:p.G778fs, AGBL5:p.I420fs, AHI1:p.K303fs, AKAP9:p.M3743fs, AKD1:p.R1209fs, ANKRD40:p.D99E, ARHGEF5:p.S1512fs, ARID1A:p.K1071fs, ARID3A:p.S557G, ARPP21:p.I130fs, ASPN:p.F67fs, ASXL3:p.E873fs, ATP6V1C2:p.R312fs, BEST3:p.P444fs, BRAF:p.P403fs, BRMS1:p.G107fs, BTBD11:p.T451fs, BTBD11:p.A561V, C11orf9:p.S261fs, C14orf102:p.R90fs, C14orf43:p.Q36fs, C15orf52:p.G98fs, C19orf21:p.R262C, C19orf70:p.P50fs, C20orf160:p.P46fs, C3:p.P890fs, CADPS2:p.N468fs, CASC3:p.S232F, CASC3:p.P603L, CASC3:p.P645L, CASC3:p.S658L, CASKIN2:p.P727fs, CBLL1:p.E138fs, CBLN3:p.P69fs, CCDC108:p.P1164fs, CCDC148:p.K420fs, CCDC153:p.P200fs, CCDC169-SOHLH2:p.K162R, CCDC88A:p.K677fs, CD1E:p.F85V, CD3EAP:p.K218fs, CDH11:p.K357T, CDH1:p.D254Y, CDH23:p.V403I, CFI:p.K37fs, CHPF2:p.D645fs, CIC:p.R507fs, CIC:p.A1114fs, CIC:p.A1114fs, CLSTN1:p.T615M, CNBD1:p.L396P, CNGA4:p.K510T, CNOT6:p.S248fs, CNTROB:p.R920fs, COL9A1:p.P283fs, CPAMD8:p.P784fs, CR1L:p.L79fs, CRB1:p.F630V, CSMD1:p.L3410V, CTNNA3:p.K856fs, CTNND1:p.I447fs, CTSD:p.P89fs, CUX1:p.A439fs, CYP7B1:p.K332T, DAB2IP:p.D994fs, DNAH11:p.T871fs, DNAH8:p.K1688fs, DNAJC1:p.K193fs, DNM2:p.P791fs, DSTN:p.F101fs, DYRK1B:p.Q545fs, EAF2:p.V109fs, EDNRB:p.A104V, EEA1:p.N570fs, EFHA1:p.F290fs, EGR1:p.P332fs, EIF4G3:p.K563fs, ELK3:p.S173fs, ENTPD2:p.G204fs, EOMES:p.G332fs, EPHA10:p.P868fs, EPHB6:p.G54fs, EPHX1:p.P132fs, EPPK1:p.G2015fs, ERBB4:p.M1fs, ESF1:p.T99fs, EXOSC8:p.L160fs, FAM113B:p.R51fs, FAM116A:p.L441fs, FAM135B:p.S645R, FAM151A:p.P117fs, FAM193A:p.D428fs, FAM193A:p.D428fs, FAM214B:p.A42fs, FAM40B:p.R740C, FAM70B:p.S19L, FASTKD1:p.K3fs, FBXW7:p.R479Q, FBXW9:p.G298fs, FER:p.L474fs, FERMT2:p.K152fs, FGGY:p.G138fs, FIGNL1:p.K309fs, FLG:p.K159fs, FLNB:p.W529fs, FOLH1:p.S501fs, FYB:p.G324fs, GABRD:p.Q412fs, GALNTL1:p.W317fs, GANAB:p.L23fs, GCDH:p.L389fs, GIMAP7:p.V276fs, GIPC3:p.G227fs, GLI3:p.P1033fs, GLIPR1L2:p.G92fs, GNPNAT1:p.F54fs, GON4L:p.M134fs, GPATCH4:p.K210fs, GRK4:p.K22fs, GTF3C1:p.S767fs, GTF3C4:p.E562fs, H2AFY2:p.K144fs, HCFC1R1:p.P83fs, HCRTR2:p.S9fs, HCRTR2:p.S9fs, HDLBP:p.G747fs, HECA:p.R333fs, HIVEP3:p.H554fs, HIVEP3:p.P534fs, HLA-C:p.P209fs, HOOK1:p.L361fs, HOXD8:p.P122fs, HTT:p.G697fs, IBTK:p.K1213fs, IDE:p.K37fs, IFT172:p.A837T, INPPL1:p.A974fs, INPPL1:p.P1154fs, INSM2:p.T533fs, INTS12:p.L14fs, INVS:p.R815fs, IPO11:p.S844fs, IRX6:p.A425V, ISG20L2:p.P288fs, ITGB8:p.A7fs, JARID2:p.G394fs, JHDM1D:p.R97fs, KBTBD6:p.G442fs, KCNC1:p.K455fs, KCNH2:p.G149A, KCNJ10:p.P102fs, KCNMB2:p.N151K, KCTD21:p.T6M, KIAA0586:p.A1592fs, KIAA1009:p.F406fs, KIAA1109:p.E1588fs, KIAA2026:p.K690fs, KIF26B:p.S1065fs, KIF6:p.L204fs, KIRREL:p.P335fs, KLC2:p.T568fs, KRAS:p.Q61H, KRAS:p.G12S, MAN1C1:p.G431fs, MAP1A:p.P2063fs, MAP2:p.K1472fs, MAP3K12:p.R449del, MAP7D1:p.A80fs, MGST2:p.K102fs, MKI67:p.T1664fs, MKL1:p.P307fs, MLL2:p.P2354fs, MLL2:p.L656fs, MLL2:p.P647fs, MLL2:p.L1877fs, MMP3:p.I64fs, MPDZ:p.K1582fs, MTUS2:p.R1005W, MUC16:p.A6156T, MYB:p.R481fs, MYEOV:p.L269fs, MYH11:p.K1263del, MYO18A:p.P209fs, MYO7A:p.I539fs, MYOCD:p.G226fs, NAA16:p.H514fs, NBEA:p.V2247fs, NCAPD3:p.Q909fs, NCAPH:p.T466fs, NCOR2:p.P1308fs, NEFM:p.A213V, NEK8:p.V690fs, NF1:p.T676fs, NHLRC1:p.F204fs, NKD1:p.P286fs, NPR3:p.Y138H, NT5M:p.P206fs, NUFIP2:p.R224fs, NUP210:p.L135fs, NYNRIN:p.G113fs, OBSCN:p.G997fs, OGDH:p.Y948fs, OR4C16:p.S135R, OR51A7:p.L124R, OR7C1:p.C179fs, OSBP2:p.H627fs, OTOF:p.E1304K, P2RX1:p.R20fs, PALB2:p.M296fs, PALB2:p.N280fs, PANK1:p.K400fs, PAPD4:p.C225fs, PAPPA2:p.I1683fs, PARP15:p.K461fs, PARP4:p.K847fs, PCDH10:p.N118fs, PCDH10:p.P225fs, PCGF3:p.H63fs, PELI2:p.G197fs, PHACTR1:p.V251fs, PHACTR2:p.S237fs, PHACTR4:p.S354fs, PHKB:p.K642fs, PIAS3:p.H116fs, PIGO:p.P787fs, PIGT:p.A346fs, PIK3R3:p.M341fs, PITPNM1:p.P295fs, PKN2:p.K76fs, PLA2G15:p.W230fs, PLAG1:p.K184fs, PLEKHO1:p.T254fs, PLOD3:p.R297fs, PLOD3:p.P296fs, PLXNA2:p.P464fs, POLQ:p.L1430fs, PPARGC1B:p.P135fs, PPL:p.P454fs, PPM1H:p.P226fs, PPP1R12C:p.P372fs, PREX2:p.R562fs, PRICKLE4:p.Q109fs, PRKAR1B:p.P87fs, PRKCG:p.R345C, PRMT8:p.S28fs, PROX1:p.F592fs, PRRG3:p.R163fs, PSD2:p.G256fs, PTCHD3:p.F588fs, PTPN4:p.N319fs, PTPRC:p.Q895H, PWWP2B:p.S84fs, PYGO2:p.Q150fs, RABGAP1:p.K928fs, RB1CC1:p.N1171fs, RBM6:p.R96fs, RHOA:p.Y42C, RIMS1:p.R71G, RIMS2:p.V401fs, RING1:p.G171fs, RINT1:p.L107fs, RNF43:p.P116fs, ROBO2:p.K1293fs, RPS6KA6:p.K109fs, RRS1:p.N45fs, RSF1:p.K386fs, RUSC2:p.P486fs, RXFP3:p.A60V, SAFB:p.W798fs, SCARF1:p.R614Q, SCLT1:p.K109fs, SERPINB12:p.Q168fs, SGK3:p.L61fs, SGOL2:p.E407fs, SIGLEC1:p.P318fs, SIK1:p.Q678fs, SLC16A6:p.G98fs, SLC25A17:p.F28fs, SLC26A7:p.I629fs, SLC32A1:p.V494I, SLC4A3:p.L1061fs, SLC7A10:p.P157fs, SLC9A2:p.T746fs, SLITRK1:p.K45fs, SND1:p.H721fs, SOAT1:p.F64fs, SORBS2:p.E1158fs, SOX7:p.L309fs, SPAG17:p.Q1264fs, SPTY2D1:p.P485fs, SRCIN1:p.P865fs, SREBF2:p.H763fs, SRRT:p.G102fs, STAB1:p.P1120fs, STRADA:p.R333fs, STX2:p.K252fs, SV2A:p.E138fs, SYCP2:p.M176fs, SYNJ2:p.P1111fs, TAS2R10:p.L196fs, TBC1D22B:p.A175fs, TEAD2:p.P298fs, TFE3:p.G482fs, TGM6:p.T358fs, TIMM44:p.K83fs, TIMP3:p.A199fs, TLR4:p.L498V, TMEM132D:p.P206fs, TMEM41A:p.F156fs, TMEM41B:p.F230fs, TMTC4:p.R611C, TNK2:p.P632fs, TOPBP1:p.I1381fs, TP53:p.E286K, TP53:p.P152fs, TRIP11:p.K541fs, TRPA1:p.T673fs, TRPM8:p.H765fs, TTF1:p.K336fs, TTI1:p.R707H, TTN:p.E15192D, U2AF2:p.L175fs, UBC:p.G684fs, UBR4:p.P2802fs, UPF2:p.E1033D, UPK2:p.P49fs, USP13:p.I116fs, USP15:p.K782fs, VASH1:p.G3fs, VEZF1:p.355_356insN, VPS13A:p.F2883fs, WAPAL:p.R522fs, WDFY3:p.L1842fs, WDR59:p.N160fs, WDR5:p.N214fs, WDR60:p.Q412fs, WDTC1:p.M287fs, WHSC1L1:p.K418fs, WNT1:p.W167fs, XIRP2:p.E1007D, YBX2:p.P226fs, YIF1A:p.R131fs, ZBBX:p.E151del, ZBTB40:p.L262fs, ZBTB7C:p.G342fs, ZBTB7C:p.D154fs, ZC3H18:p.T701fs, ZDHHC5:p.E651del, ZDHHC7:p.P316fs, ZFHX3:p.R1893fs, ZFHX3:p.E763fs, ZFHX4:p.L408fs, ZHX3:p.N249K, ZIM3:p.I384fs, ZKSCAN5:p.D13fs, ZMYM4:p.K345fs, ZNF236:p.T1410M, ZNF23:p.F122fs, ZNF334:p.K426fs, ZNF358:p.T130fs, ZNF701:p.L296fs, ZNF711:p.L737fs и ZNF831:p.A49fs.

69. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от TGCT; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из FAM18B2:p.C51Y, BTN2A3P:p.P3S, MUC2:p.G1715S, NBPF10:p.L44V, SP8:p.G156S, DCP1B:p.Q252H, DEK:p.E41D, ERC1:p.K692R, FAM104B:p.D75H, FRG1B:p.M49V, KRTAP10-10:p.V234M, LRRCC1:p.A6V, NRAS:p.Q61R, PNPLA4:p.L223P, ANKLE1:p.C644fs, ANKLE1:p.C644fs, KIT:p.D816H, KIT:p.D816Y, MUC2:p.T1597I, PSMD11:p.A5V, RHPN2:p.V73M, RUNX2:p.Q71E, SP4:p.E7K, TUBA1C:p.L146F, ZNF814:p.Y324H, ADAMTS17:p.N572T, ATRX:p.K1936R, BCL11B:p.E535D, BMP2K:p.Q460H, BMP2K:p.H487Q, C12orf32:p.D60V, C22orf43:p.K19E, CDC27:p.N571I, CDC27:p.P242S, DDX11:p.K208fs, EBPL:p.L189V, EZH2:p.K510R, FAM86A:p.A141T, GAS2L2:p.D189A, GRID2IP:p.LS754del, HGC6,3:p.E171G, KIT:p.D816V, KIT:p.N822Y, KIT:p.N822K, KRAS:p.Q61R, KRAS:p.G12V, KRTAP1-1:p.I116V, LRRC37BP1:p.Y166D, MEF2A:p.R127Q, MFF:p.S7F, MST1:p.R347W, MUC4:p.S3048L, MUC6:p.H2000Q, MUC6:p.P1977H, NAT10:p.I393T, OPLAH:p.A900D, PIEZO1:p.Q749E, PRAMEF4:p.F300V, RBM10:p.E184D, SERINC2:p.T121P, SPIN2A:p.M150V, SRRM2:p.A2257S, SSBP3:p.K6R, ZNF680:p.R501W, ABCC8:p.Y512C, ABCC9:p.L466P, ABCD1:p.H169Q, ABL2:p.P19T, ACVR2B:p.R48C, AHDC1:p.P33fs, AHNAK2:p.L1640M, ALPPL2:p.W31S, AMMECR1:p.G77C, ANK3:p.D1322E, ANKHD1-EIF4EBP3:p.G60S, ANKRD11:p.Y2015S, ANKRD11:p.K369R, ANKRD50:p.V637M, APBB3:p.L450P, ARHGAP24:p.T35A, ARID4B:p.G1076A, ARMC3:p.A514T, ARRB2:p.T99P, ATAD5:p.I305V, ATXN3:p.305_306insQQQQQQQ, AVPR1B:p.G39R, AXDND1:p.E994Q, BAI2:p.A231G, BEST3:p.P383L, BIRC6:p.V414L, BIRC8:p.A225M, BRWD1:p.K1319R, BTN2A2:p.L15F, C12orf51:p.A2644T, C12orf65:p.K143T, C16orf62:p.L244I, C1QBP:p.T225I, C1orf167:p.S123G, C5orf25:p.Y4F, CACNA1E:p.G2080S, CAPNS1:p.LV303del, CCDC159:p.A332S, CDKAL1:p.P409L, CDYL:p.V48A, CDYL:p.A60G, CELSR2:p.L17P, CHD4:p.E138D, CKAP5:p.G576A, CLCC1:p.K52R, CMTM8:p.S26T, CNKSR2:p.P249L, CNTN5:p.I501T, COG5:p.H617R, COL15A1:p.K708R, COL6A3:p.A2378D, CRYGB:p.R143G, CSGALNACT2:p.L362F, CUL4A:p.I438F, CXXC1:p.Q156H, CYP19A1:p.F406L, DCLRE1B:p.F28I, DDX11:p.A376T, DDX11:p.E680D, DEPDC5:p.R1525Q, DLC1:p.S741T, DNMT1:p.R995Q, DOCK11:p.Q169E, DSPP:p.D1047N, E2F7:p.I91S, EBF1:p.D353G, ECI2:p.K55R, EEF1A2:p.Y418S, EIF3J:p.A8G, EML6:p.K805R, EPAS1:p.S474T, EPRS:p.L1335I, ERICH1:p.E327K, FAM101B:p.L5P, FAM104A:p.M1R, FAM110D:p.R71H, FAM155A:p.Q95R, FAM186A:p.G1492E, FAM194B:p.Y139H, FAM21B:p.P1231S, FAM32A:p.K9R, FAM46B:p.H416R, FAM48B1:p.I499V, FAM48B1:p.A516P, FAM5C:p.S425W, FAM86C2P:p.C120Y, FBXL14:p.V48G, FRMPD3:p.Q832del, FRS2:p.L47S, GDF5:p.E105fs, GPNMB:p.C3fs, GPT2:p.R10P, H2AFV:p.Q125R, HDLBP:p.R503C, HERC2:p.R2129C, HIST1H2BJ:p.K13R, HLX:p.N231K, HMGB3:p.E198D, HSF4:p.R169W, HSF4:p.S491P, HYAL4:p.D222N, INO80E:p.P206fs, INTS4:p.S460A, IQCF6:p.R3H, ITPR1:p.M1569I, ITPR3:p.R1698G, KANSL3:p.G376E, KCNA4:p.E627del, KDM5A:p.P423S, KDM6A:p.Y362fs, KIAA0020:p.K63R, KIDINS220:p.N851S, KIT:p.W557G, KLHDC2:p.W321S, KRAS:p.A146T, KRAS:p.Q61H, KRAS:p.Q61L, KRAS:p.G12A, KRAS:p.G12R, KRBA1:p.R839G, KRTAP4-8:p.T63S, L2HGDH:p.P441del, LAMC3:p.P174Q, LHCGR:p.L16Q, LOC401296:p.L144M, LPHN2:p.F906I, LRP12:p.G310C, LTB4R:p.F73L, LTBP3:p.L35del, LUC7L3:p.S148T, LYPD4:p.T64K, MAMLD1:p.Q572L, MAP4K2:p.R341G, MAPK7:p.A501D, MAT2A:p.E166G, MED12L:p.C1292Y, MESP2:p.Q182E, MEX3C:p.R534S, MIER2:p.L131F, MLL5:p.Y66C, MLLT3:p.177_178SS>S, MMS19:p.D1005N, MRPS25:p.E119del, MSH6:p.D576A, MTIF3:p.G65E, MUC17:p.M1807T, MUC17:p.T2279N, MUC17:p.G2474S, MUC2:p.TTPSPP1475del, MUC2:p.T1568M, MUC2:p.T1580N, MUC2:p.T1704I, MUC2:p.T1706M, MUC4:p.H1117D, MUC5B:p.R1097H, MYEF2:p.K323E, MYEOV:p.L302H, MYH8:p.A785V, MYO1A:p.N584K, NAP1L3:p.P353R, NAV1:p.I1433M, NCAM1:p.E131G, NEB:p.D3107N, NEFH:p.V670E, NELL2:p.G170D, NHS:p.D1561N, NKD2:p.H447del, NSD1:p.T461R, NT5C3:p.A3P, NYAP1:p.P480S, OBSCN:p.A908T, OR10J1:p.R244Q, OR1S2:p.M298I, OR2L3:p.K294R, OR6K6:p.F311L, PABPC3:p.V325fs, PBX2:p.Y262F, PCDHB4:p.P255F, PCMTD1:p.V281A, PCP4L1:p.K64R, PDE3A:p.A98E, PDIA6:p.N56K, PDS5A:p.L1309F, PHLDA2:p.R28S, PIGR:p.V183G, PIK3CA:p.E545K, PIK3CD:p.C381R, PKD1:p.T938M, PLEKHM1:p.A895V, PLEKHN1:p.A600D, PLXND1:p.R367L, PMS2:p.K651R, PNMA3:p.E200G, POTEF:p.S112G, PRAMEF8:p.I448V, PRDM2:p.E278D, PRODH:p.L527V, PRPF31:p.R289W, PSME4:p.N495D, PTGR1:p.E40A, PTPRB:p.Q726H, RABGEF1:p.N207D, RAC1:p.P34R, RANBP17:p.M900I, REV3L:p.A30S, RFC3:p.I82N, RFC3:p.K296N, RIMBP3:p.Q1154R, RPL19:p.R151C, RPL5:p.R58fs, RPTN:p.M538I, RRAD:p.A278E, RYR1:p.D668Y, RYR2:p.L2023F, SAFB:p.G799V, SCRIB:p.G332V, SDK1:p.Y2146C, SEC16A:p.T443K, SEC31B:p.P905S, SELO:p.R565Q, SELP:p.A297T, SI:p.I1681K, SLC2A7:p.H268Q, SLC37A1:p.V528I, SLC38A1:p.G100R, SMARCA2:p.D1158A, SMARCA5:p.T156fs, SMC3:p.E970Q, SMG1:p.P2696H, SNRNP200:p.A2129G, SPIN2B:p.M150V, ST6GALNAC1:p.S354N, STAMBPL1:p.Y143H, STARD8:p.G662A, STON1-GTF2A1L:p.N451S, SYMPK:p.A336G, TAS2R8:p.W98C, TCHH:p.W1016R, TET1:p.T1472S, TIAM1:p.G247M, TNS1:p.P183S, TOR1AIP2:p.G146R, TPRX1:p.S216P, TPRX1:p.S200P, TRMT61A:p.S244I, TSPAN4:p.L92V, TTF1:p.Q530R, UBE2M:p.G131D, UBR5:p.R2517S, UGT2B11:p.R447I, UMODL1:p.M559I, UNC93A:p.V445A, USP46:p.Q137R, VWA2:p.G317D, VWA7:p.V792G, WASH3P:p.L187V, WNT5B:p.K327E, WRN:p.E510D, XDH:p.P410S, ZAN:p.S755P, ZC3H11A:p.I777T, ZC3H7A:p.C575S, ZDHHC11:p.H250Q, ZFHX4:p.D3239N, ZKSCAN3:p.K200A, ZMYM4:p.T367I, ZNF174:p.P353T, ZNF322:p.Y353C, ZNF592:p.K324Q, ZNF592:p.P500T, ZNF782:p.C145F, ZNF799:p.C453R, ZNF804B:p.P644S и ZNRF3:p.R889W.

70. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от THCA; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из BRAF:p.V600E, NRAS:p.Q61R, HRAS:p.Q61R, NRAS:p.Q61K, OTUD4:p.T909I, HRAS:p.Q61K, NLRP6:p.E611G, AKT1:p.E17K, ANKMY1:p.N302I, ATP6V1A:p.L237P, CYP19A1:p.S113I, DCUN1D4:p.L275P, DGCR8:p.E518K, DLC1:p.S741T, DNAH10:p.C1853F, EIF1AX:p.G9D, FAM75D5:p.L222P, FCGRT:p.P40A, KRAS:p.Q61K, LMX1B:p.Q285del, MAS1L:p.R324G, MED15:p.S35I, MEGF6:p.Y393C, ODZ2:p.A1529V, OR5L1:p.R122H, OR6K6:p.F311L, OTX1:p.D315N, POTEE:p.S75G, SCN5A:p.D1978H, TOP2A:p.K1199E и TSG101:p.K265R.

71. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от UCS; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из TP53:p.R248Q, ZNF814:p.D404E, BTN2A3P:p.P3S, FBXW7:p.R465C, FRG1B:p.G65E, MUC4:p.H4205Q, NBPF10:p.V99F, PIK3CA:p.E545K, PIK3CA:p.H1047R, PPP2R1A:p.P179R, DDX11L2:p.*128Q, FBXW7:p.R479Q, FRG1B:p.K13N, FRG1B:p.L52S, HSD17B7P2:p.N175S, KRAS:p.G12V, LOC283788:p.S37G, TP53:p.R273H, TP53:p.S241Y, ADAMTS12:p.E359K, BCL2L11:p.L187fs, CDC27:p.L460fs, CHEK2:p.K373E, ESPNP:p.W122fs, FBXW7:p.R689W, FBXW7:p.R505G, FBXW7:p.R465H, FCGBP:p.V4019M, FRG1B:p.I10T, FRG1B:p.D32V, FRG1B:p.R37K, KRAS:p.G12D, LOC100233156:p.R21C, LOC283788:p.I46M, LRP1B:p.L1392F, MAMLD1:p.Q572L, MST1P9:p.L319P, MUC4:p.A2390T, MUC4:p.G2172S, NBPF10:p.E3455K, PIK3CA:p.G106V, PODXL:p.28_30PSP>P, POTEC:p.R477Q, PPP2R1A:p.R183W, PPP2R1A:p.S219L, PTPN18:p.TG378del, RGPD3:p.N756D, RPL13AP20:p.G107R, SAMD4B:p.R477W, SMAP1:p.E169fs, TP53:p.H193R, TP53:p.H179R, TP53:p.R175H, TUBBP5:p.R119H и U2AF1:p.S34F.

72. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-36, при этом:

(a) популяция субъектов страдает от PAAD; и

(b) по меньшей мере одна опухолеспецифичная мутация включает любую комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из RBM14:p.AAAAAAA286del, KRAS:p.G12D, JMY:p.PPPPPPPPPPPP811del, RIOK1:p.D69del, LCE2A:p.SSGGCCGSSSGGCC47del, KRAS:p.G12V, C1QB:p.GPKGPMGPKGGPGAPGAP90del, ZFHX3:p.V777del, DBR1:p.541_542DD>D, AEBP1:p.K1133del, KRAS:p.G12R, RBM47:p.495_502AAAAAAAA>A, AP3S1:p.K41fs, MLL2:p.AEGPHLSPQPEELHLSPQ792del, RFX1:p.386_401GGGGGGGGGGGGGGSG>G, AXDND1:p.EQ991del, HERC2P3:p.A803V, RGPD3:p.N756D, FNDC1:p.D1180del, ANAPC1:p.T537A, IRS4:p.21_22AA>A, GIGYF2:p.Q1005del, NCOA3:p.Q1253fs, SIK3:p.950_951QQ>Q, GPR6:p.AAAAATAAGGPDTGEWGPPA36del, NBPF12:p.D1323fs, SHROOM4:p.1156_1157EE>E, ZMIZ2:p.VAAAAATATATATAT153del, DGKK:p.PAPP41del, LZTS1:p.RTQDLEGALRTKGLEL432del, CASQ2:p.395_396DD>D, DCP1B:p.251_252insH, ESPNP:p.296_317PPPPSFPPPPPPPGTQLPPPPP>P, KBTBD6:p.T403K, NBPF16:p.D449fs, ANKRD36C:p.H438R, ESPN:p.PPPPPPSFPPPPPPPGTQLPP430del, FCGBP:p.A2493V, KRAS:p.Q61H, NCOA3:p.Q1276del, OR2T2:p.C203fs, TMCC1:p.Q565L, BCKDHA:p.G129fs, ESPNP:p.H64fs, GNAS:p.R844H, NBPF14:p.R25C, OGFOD1:p.G477fs, RBM12:p.P693S, SLC38A10:p.1071_1072II>I, SORBS2:p.P866S, TP53:p.R248W, TP53:p.R175H и UBAC1:p.E269del.

73. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-72, при этом композиция содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или по меньшей мере 30 неоантигенных пептидов.

74. Фармацевтическая композиция по п. 73, при этом композиция содержит от 15 до 20 неоантигенных пептидов.

75. Фармацевтическая композиция по п. 73 или 74, дополнительно содержащая еще по меньшей мере один неоантигенный пептид, который специфичен для опухоли индивидуального пациента.

76. Фармацевтическая композиция по п. 75, при этом специфичный для пациента неоантигенный пептид выбран путем идентификации отличий в последовательности между геномом, экзомом и/или транскриптомом из образца опухоли пациента и геномом, экзомом и/или транскриптомом неопухолевого образца.

77. Фармацевтическая композиция по п. 75, при этом образцы представляют собой свежие или фиксированные формалином заключенные в парафин опухолевые ткани, свежевыделенные клетки или циркулирующие опухолевые клетки.

78. Фармацевтическая композиция по п. 75, при этом отличия в последовательности определяются методом секвенирования следующего поколения.

79. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-78, при этом каждый неоантигенный пептид имеет длину от 5 до 50 аминокислот.

80. Фармацевтическая композиция по п. 79, при этом каждый неоантигенный пептид имеет длину от 15 до 35 аминокислот; около 15 аминокислот или меньше; от 8 до 11 аминокислот; либо 9 или 10 аминокислот.

81. Фармацевтическая композиция по п. 79 или 80, при этом каждый неоантигенный пептид связывается с главным комплексом гистосовместимости (MHC) класса I.

82. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-81, при этом каждый неоантигенный пептид связывается с MHC класса I со сродством связывания менее 500 нМ или же необязательно каждый неоантигенный пептид связывается с HLA-A, -B или -C со значением K_D менее 500 нМ.

83. Фармацевтическая композиция по п. 79, при этом каждый неоантигенный пептид имеет длину около 30 аминокислот или меньше; от 6 до 25 аминокислот; от 15 до 24 аминокислот; или от 9 до 15 аминокислот.

84. Фармацевтическая композиция по п. 79, 82 или 83, при этом каждый неоантигенный пептид связывается с главным комплексом гистосовместимости (MHC) класса II.

85. Фармацевтическая композиция по п. 84, при этом каждый неоантигенный пептид связывается с MHC класса I со сродством связывания менее 500 нМ или же необязательно каждый неоантигенный пептид связывается с HLA-A, -B или -C со значением K_D менее 500 нМ.

86. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-85, при этом по меньшей мере один неоантигенный пептид дополнительно содержит фланкирующие аминокислоты.

87. Фармацевтическая композиция по п. 86, при этом фланкирующие аминокислоты не являются нативными фланкирующими аминокислотами.

88. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-87, при этом по меньшей мере один неоантигенный пептид соединяется по меньшей мере со вторым неоантигенным пептидом.

89. Фармацевтическая композиция по п. 88, при этом пептиды соединяются с помощью полиглицинового или полисеринового линкера.

90. Фармацевтическая композиция по п. 88 или 89, при этом второй неоантигенный пептид связывается с MHC класса I или класса II со сродством связывания менее 1000 нМ.

91. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 88-90, при этом второй неоантигенный пептид связывается с MHC класса I или класса II со сродством связывания менее 500 нМ.

92. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 88-91, при этом оба неоэпитопа связываются с человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA) -A, -B, -C, -DP, -DQ или -DR.

93. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 88-92, при этом выделенный неоантигенный пептид и второй неоантигенный пептид связываются с HLA класса I или же выделенный неоантигенный пептид и второй неоантигенный пептид связываются с HLA класса II.

94. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 88-92, при этом выделенный неоантигенный пептид связывается с HLA класса II, а второй неоантигенный пептид связывается с HLA класса I, или же выделенный неоантигенный пептид связывается с HLA класса I, а второй неоантигенный пептид связывается с HLA класса II.

95. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-94, при этом по меньшей мере один неоантигенный пептид дополнительно включает модификации, которые повышают период полужизни in vivo, клеточный таргетинг, поглощение антигена, процессинг антигена, сродство к MHC, устойчивость к MHC или презентирование антигена.

96. Фармацевтическая композиция по п. 95, при этом модификация представляет собой конъюгирование с белком-носителем, конъюгирование с лигандом, конъюгирование с антителом, ПЭГилирование, полисиалилирование, HESилирование, рекомбинантные PEG-миметики, слияние с Fc, слияние с альбумином, присоединение к наночастицам, инкапсулирование в наночастицах, присоединение холестерина, включение железа, ацилирование, амидирование, гликозилирование, окисление боковой цепи, фосфорилирование, биотинилирование, присоединение поверхностно-активного вещества, добавление аминокислотных миметиков или добавление неприродных аминокислот.

97. Фармацевтическая композиция по п. 95, при этом клетки, которые подвергаются таргетингу, представлены антиген-презентирующими клетками.

98. Фармацевтическая композиция по п. 97, при этом антиген-презентирующие клетки представлены дендритными клетками.

99. Фармацевтическая композиция по п. 98, при этом дендритные клетки подвергаются таргетингу с помощью маркера DEC205, XCR1, CD197, CD80, CD86, CD123, CD209, CD273, CD283, CD289, CD184, CD85h, CD85j, CD85k, CD85d, CD85g, CD85a, CD141, CD11c, CD83, рецептора TSLP или маркера CD1a.

100. Фармацевтическая композиция по п. 99, при этом дендритные клетки подвергаются таргетингу с помощью маркера CD141, DEC205 или XCR1.

101. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 30-100, которая является иммуногенной или вакцинной композицией.

102. Фармацевтическая композиция по п. 101, дополнительно содержащая иммуномодулятор или адъювант.

103. Фармацевтическая композиция по п. 102, при этом иммунодулятор или адъювант выбран из группы, состоящей из поли-(I:C), поли-ICLC, агонистов STING, ISS 1018, солей алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCO Matrix, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Montanide IMS-1312 VG, Montanide ISA-206 VG, Montanide ISA-50 V2, Montanide ISA-51 VG, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, агониста ISA-TLR2, ONTAK, PepTel^®, векторных систем, микрочастиц PLG, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, VEGF Trap, R848, бета-глюкана, Pam3Cys, Pam3CSK4, акриловых или метакриловых полимеров, сополимеров малеинового ангидрида и стимулона QS21.

104. Выделенный полинуклеотид, кодирующий выделенный неоантигенный пептид по любому из пп. 1-24.

105. Выделенный полинуклеотид по п. 104, который представлен РНК.

106. Выделенный полинуклеотид по п. 105, при этом РНК подвергалась модификации для повышения стабильности, усиления клеточного таргетинга, повышения эффективности трансляции, адъювантности, доступности в цитозоле и/или снижения цитотоксичности.

107. Выделенный полинуклеотид по п. 106, при этом модификация представляет собой конъюгирование с белком-носителем, конъюгирование с лигандом, конъюгирование с антителом, оптимизацию кодонов, повышение содержания GC, включение модифицированных нуклеозидов, включение 5′-кэпа или его аналога и/или включение немаскированной последовательности поли-A.

108. Клетка, содержащая полинуклеотид по любому из п.п. 104-107.

109. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из п.п. 104-107.

110. Вектор по п. 110, при этом полинуклеотид функционально связан с промотором.

111. Вектор по п. 109 или 110, который представляет собой плазмиду, фаг, транспозон, космиду, вирус или вирион.

112. Вектор по п. 111, который представляет собой аденоассоциированный вирус, герпесвирус, лентивирус или его псевдотип.

113. Система доставки in vivo, содержащая выделенный полинуклеотид по любому из п.п. 104-107.

114. Система доставки по п. 113, при этом система доставки включает в себя сферические нуклеиновые кислоты, вирусы, вирусоподобные частицы, плазмиды, бактериальные плазмиды или наночастицы.

115. Клетка, содержащая вектор или систему доставки по любому из п.п. 109-114.

116. Клетка по п. 115, которая является антиген-презентирующей клеткой.

117. Клетка по п. 116, которая является дендритной клеткой.

118. Клетка по п. 117, которая является незрелой дендритной клеткой.

119. Композиция, содержащая по меньшей мере один полинуклеотид по любому из п.п. 104-107.

120. Композиция по п. 119, при этом композиция содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или по меньшей мере 30 выделенных полинуклеотидов.

121. Композиция по п. 120, при этом композиция содержит от 2 до 20 полинуклеотидов.

122. Композиция по любому из п.п. 119-121, при этом композиция дополнительно содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или по меньшей мере 30 дополнительных неоантигенных полинуклеотидов, кодирующих дополнительные неоантигенные пептиды.

123. Композиция по п. 122, при этом композиция содержит от 4 до 20 дополнительных неоантигенных полинуклеотидов.

124. Композиция по п. 122, при этом выделенные полинуклеотиды и дополнительные неоантигенные полинуклеотиды соединяются.

125. Композиция по п. 124, при этом полинуклеотиды соединяются с помощью нуклеиновых кислот, кодирующих полиглициновый или полисериновый линкер.

126. Композиция по любому из п.п. 122-125, при этом по меньшей мере один из дополнительных неоантигенных пептидов специфичен для опухоли индивидуального пациента.

127. Композиция по п. 126, при этом специфичный для пациента неоантигенный пептид выбран путем идентификации отличий в последовательности между геномом, экзомом и/или транскриптомом из образца опухоли пациента и геномом, экзомом и/или транскриптомом неопухолевого образца.

128. Композиция по п. 127, при этом образцы представляют собой свежие или фиксированные формалином заключенные в парафин опухолевые ткани, свежевыделенные клетки или циркулирующие опухолевые клетки.

129. Композиция по п. 127 или 128, при этом отличия в последовательности определяются методом секвенирования следующего поколения.

130. T-клеточный рецептор (TCR), способный связываться по меньшей мере с одним неоантигенным пептидом, приведенным в любом из п.п. 1-27, причем необязательно неоантигенный пептид включает FGFR3 S249C, ERBB3 V104M, EGFR L858R, MUC4 H4205Q, PDGFRA R483fs, TMEM52 23_26LLPL>L или PODXL 28_30PSP>P.

131. TCR по п. 130, который способен связываться с выделенным неоантигенным пептидом в контексте MHC класса I или класса II.

132. Химерный антигеновый рецептор, включающий: (i) молекулу T-клеточной активации; (ii) трансмембранный участок; и (iii) антигенраспознающий фрагмент, способный связываться с выделенным неоантигенным пептидом по любому из п.п. 1-27.

133. Химерный антигеновый рецептор по п. 132, при этом молекула T-клеточной активации представлена CD3-дзета.

134. Химерный антигеновый рецептор по п. 132 или 133, дополнительно содержащий по меньшей мере один костимулирующий домен сигнализации.

135. Химерный антигеновый рецептор по любому из п.п. 132-134, при этом домен сигнализации представлен CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, ITAM или γ-цепью FcεRI.

136. Химерный антигеновый рецептор по любому из п.п. 132-135, при этом антигенраспознающий фрагмент способен связываться с выделенным неоантигенным пептидом в контексте MHC класса I или класса II.

137. Химерный антигеновый рецептор по любому из п.п. 132-136, включающий трансмембранную область CD3-zeta, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR или трансмембранный участок PD-1.

138. Химерный антигеновый рецептор по любому из п.п. 132-137, при этом опухолеспецифичный эпитоп располагается во внеклеточном домене ассоциированного с опухолью полипептида, причем необязательно опухолеспецифичный эпитоп включает FGFR3 S249C, ERBB3 V104M, EGFR L858R, MUC4 H4205Q, PDGFRA R483fs, TMEM52 23_26LLPL> L или PODXL 28_30PSP> P.

139. T-клетка, содержащая T-клеточный рецептор или химерный антигеновый рецептор по любому из п.п. 130-138.

140. T-клетка по п. 139, которая представлена хелперной или цитотоксической T-клеткой.

141. Нуклеиновая кислота, содержащая промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим T-клеточный рецептор по п. 130 или 131.

142. Нуклеиновая кислота по п. 141, при этом TCR способен связываться с по меньшей мере одним неоантигенным пептидом в контексте главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II.

143. Нуклеиновая кислота, содержащая промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигеновый рецептор по любому из п.п. 132-138.

144. Нуклеиновая кислота по п. 143, при этом антигенраспознающий фрагмент способен связываться по меньшей мере с одним неоантигенным пептидом в контексте главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II.

145. Нуклеиновая кислота по п. 143 или 144, при этом опухолеспецифичный эпитоп располагается во внеклеточном домене ассоциированного с опухолью полипептида.

146. Нуклеиновая кислота по любому из п.п. 143-145, включающая участок CD3-zeta, CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, KIR, LAG3, CD137, OX40, CD27, CD40L, Tim-3, A2aR или трансмембранный участок PD-1.

147. Антитело, способное связываться с по меньшей мере одним неоантигенным пептидом, приведенным в табл. 1-9.

148. Модифицированная клетка, трансфецированная или трансдуцированная нуклеиновой кислотой по любому из п.п. 141-146.

149. Модифицированная клетка по п. 148, при этом модифицированная клетка представляет собой T-клетку, инфильтрирующий опухоль лимфоцит, T-клетку NK, TCR-экспрессирующую клетку, T-клетку CD4+, T-клетку CD8+ или NK-клетку.

150. Композиция, содержащая T-клеточный рецептор или химерный антигеновый рецептор по любому из п.п. 130-138.

151. Композиция, включающая аутологичные T-клетки пациента, содержащие T-клеточный рецептор или химерный антигеновый рецептор по любому из п.п. 130-138.

152. Композиция по п. 150 или 151, дополнительно включающая ингибитор контрольной точки иммунного ответа (immune checkpoint inhibitor).

153. Композиция по п. 150 или 151, дополнительно включающая по меньшей мере два ингибитора контрольных точек иммунного ответа.

154. Композиция по п. 152 или 153, при этом ингибитор контрольной точки иммунного ответа ингибирует белок контрольной точки, выбранный из группы, состоящей из CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR и лигандов семейства B-7 либо их комбинаций.

155. Композиция по п. 154, при этом ингибитор контрольной точки иммунного ответа взаимодействует с лигандом белка контрольной точки, выбранного из группы, состоящей из CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR и лигандов семейства B-7 либо их комбинаций.

156. Композиция по любому из п.п. 119-129 или 150-156, дополнительно включающая иммуномодулятор или адъювант.

157. Композиция по п. 156, при этом иммуномодулятором является костимулирующий лиганд, лиганд TNF, лиганд надсемейства Ig, CD28, CD80, CD86, ICOS, CD40L, OX40, CD27, GITR, CD30, DR3, CD69 или 4-1BB.

158. Композиция по п. 156, при этом иммуномодулятором является по меньшей мере одна раковая клетка или экстракт раковых клеток.

159. Композиция по п. 158, при этом раковая клетка аутологична для субъекта, нуждающегося в композиции.

160. Композиция по п. 159, при этом раковая клетка подвергалась лизису или воздействию УФ-излучения.

161. Композиция по п. 156, при этом композиция дополнительно включает адъювант.

162. Композиция по п. 161, при этом адъювант выбран из группы, состоящей из поли-(I:C), поли-ICLC, агонистов STING, ISS 1018, солей алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCO Matrix, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Montanide IMS-1312 VG, Montanide ISA-206 VG, Montanide ISA-50 V2, Montanide ISA-51 VG, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, агониста ISA-TLR2, ONTAK, PepTel^®, векторных систем, микрочастиц PLG, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, VEGF Trap, R848, бета-глюкана, Pam3Cys, Pam3CSK4, акриловых или метакриловых полимеров, сополимеров малеинового ангидрида и стимулона QS21.

163. Композиция по п. 161 или 162, при этом адъювант индуцирует гуморальный иммунный ответ при введении субъекту.

164. Композиция по п. 162, при этом адъювант индуцирует T-хелперный клеточный ответ типа 1 при введении субъекту.

165. Система доставки in vivo, включающая фармацевтическую композицию по любому из п.п. 30-103.

166. Система доставки in vivo по п. 165, при этом система доставки включает в себя проникающие в клетки пептиды, инкапсулирование наночастиц, вирусные частицы или липосомы.

167. Система доставки in vivo по п. 166, при этом проникающий в клетку пептид представляет собой пептид TAT, VP22 вируса Herpes simplex, транспортан или Antp.

168. Клетка, содержащая выделенный неоантигенный пептид по любому из п.п. 1-29.

169. Клетка по п. 168, которая является антиген-презентирующей клеткой.

170. Клетка по п. 169, которая является дендритной клеткой.

171. Способ лечения рака или запуска, усиления или продления противоопухолевых ответов у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту пептида, полинуклеотида, вектора, композиции, антитела или клеток по любому из пп. 1-164.

172. Способ профилактического лечения рака, включающий:

(a) выбор противоракового препарата для нуждающегося в этом пациента, причем препарат выбирается из группы, состоящей из ибрутиниба, эрлотиниба, иматиниба, гефитиниба, кризотиниба, трастузумаба, вемурафениба, ингибиторов RAF/MEK либо антиэстрогеновой терапии; и

(b) профилактическое введение субъекту фармацевтической композиции по любому из п.п. 30-103, причем по меньшей мере один неоантигенный пептид получен при мутациях типа лекарственной устойчивости, связанных с выбранным противораковым препаратом.

173. Способ лечения или профилактики опухолей в популяции нуждающихся в этом субъектов, включающий введение субъекту средства, содержащего внеклеточный лиганд-связывающий домен, распознающий опухолеспецифичный неоэпитоп, содержащий опухолеспецифичную мутацию, которая встречается по меньшей мере у 1% субъектов в популяции.

174. Способ по любому из п.п. 171-173, при этом опухолеспецифичная мутация включает мутации, приведенные для любых популяций в табл. 9.

175. Способ по любому из п.п. 171-173, при этом опухолеспецифичная мутация находится в пределах гена, содержащего внеклеточный домен.

176. Способ по п. 175, при этом опухолеспецифичная мутация включает FGFR3 S249C, ERBB3 V104M, EGFR L858R, MUC4 H4205Q, PDGFRA R483fs, TMEM52 23_26LLPL> L или PODXL 28_30PSP> P.

177. Способ по п. 176, при этом опухолеспецифичная мутация находится в пределах внеклеточного домена.

178. Способ по п. 177, при этом опухолеспецифичная мутация включает FGFR3 S249C или ERBB3 V104M.

179. Способ по любому из п.п. 171-178, при этом субъектом является человек.

180. Способ по п. 179, при этом субъект болен раком.

181. Способ по п. 180, при этом рак выбран из группы, состоящей из урогенитального, гинекологического, рака легких, желудочно-кишечного тракта, рака головы и шеи, злокачественной глиобластомы, злокачественной мезотелиомы, неметастатического или метастатического рака молочной железы, злокачественной меланомы, карциномы клеток Меркеля, саркомы костных и мягких тканей, гематологических неоплазий, множественной миеломы, острой миелогенной лейкемии, хронической миелогенной лейкемии, миелодиспластического синдрома и острой лимфобластной лейкемии, немелкоклеточного рака легких (NSCLC), рака молочной железы, метастатического колоректального рака, гормон-чувствительного или гормон-рефрактерного рака простаты, колоректального рака, рака яичников, гепатоцеллюлярного рака, почечно-клеточного рака, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака пищевода, гепатоцеллюлярного рака, холангиоцеллюлярного рака, плоскоклеточного рака головы и шеи, саркомы мягких тканей и мелкоклеточного рака легких.

182. Способ по любому из п.п. 171-181, при этом субъект подвергался хирургическому удалению опухоли.

183. Способ по любому из п.п. 171-182, при этом пептид, полинуклеотид, вектор, композиция или клетки вводятся внутривенно, внутрибрюшинно, внутрь опухоли, внутрикожно или подкожно.

184. Способ по п. 183, при этом пептид, полинуклеотид, вектор, композиция или клетки вводятся в анатомический участок, который дренируется в лимфатический коллектор.

185. Способ по п. 184, при этом введение осуществляется в несколько лимфатических коллекторов.

186. Способ по любому из п.п. 183-185, при этом введение проводится подкожно или внутрикожно.

187. Способ по п. 183, при этом вводится пептид.

188. Способ по п. 187, при этом введение проводится внутрь опухоли.

189. Способ по п. 183, при этом вводится полинуклеотид, необязательно РНК.

190. Способ по п. 189, при этом полинуклеотид вводится внутривенно.

191. Способ по п. 183, при этом клетки представляют собой T-клетки или дендритные клетки.

192. Способ по п. 191, при этом пептид или полинуклеотид включает компонент, нацеленный на антиген-презентирующие клетки.

193. Способ по любому из п.п. 171-192, дополнительно включающий введение субъекту по меньшей мере одного ингибитора контрольной точки иммунного ответа.

194. Способ по п. 193, при этом ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой биологическое терапевтическое средство или небольшую молекулу.

195. Способ по п. 193 или 194, при этом ингибитор контрольной точки выбран из группы, состоящей из моноклонального антитела, гуманизованного антитела, полностью человеческого антитела и слитого белка либо их комбинаций.

196. Способ по любому из п.п. 193-195, при этом ингибитор контрольной точки ингибирует белок контрольной точки, выбранный из группы, состоящей из CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR и лигандов семейства B-7 либо их комбинаций.

197. Способ по любому из п.п. 193-196, при этом ингибитор контрольной точки взаимодействует с лигандом белка контрольной точки, выбранного из группы, состоящей из CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR и лигандов семейства B-7 либо их комбинаций.

198. Способ по любому из п.п. 193-197, при этом вводятся два или несколько ингибиторов контрольных точек.

199. Способ по п. 198, при этом ингибиторами контрольных точек являются: (i) ипилимумаб или тремелимумаб и (ii) ниволумаб.

200. Способ по любому из п.п. 193-199, при этом ингибитор контрольной точки и композиция вводятся одновременно или последовательно в любом порядке.

201. Способ по п. 200, при этом пептид, полинуклеотид, вектор, композиция или клетки вводятся до ингибитора контрольной точки.

202. Способ по п. 200, при этом пептид, полинуклеотид, вектор, композиция или клетки вводятся после ингибитора контрольной точки.

203. Способ по п. 200, при этом введение ингибитора контрольной точки продолжается на всем протяжении терапии с помощью неоантигенного пептида, полинуклеотида, вектора, композиции или клеток.

204. Способ по любому из п.п. 193-203, при этом терапия с помощью неоантигенного пептида, полинуклеотида, вектора, композиции или клеток назначается субъектам, которые лишь частично реагируют или не реагируют на терапию ингибитором контрольной точки.

205. Способ по любому из п.п. 193-204, при этом ингибитор контрольной точки вводится внутривенно или подкожно.

206. Способ по п. 205, при этом ингибитор контрольной точки вводится подкожно в пределах примерно 2 см от места введения композиции.

207. Способ по п. 206, при этом композиция вводится в тот же дренирующий лимфатический узел, что и ингибитор контрольной точки.

208. Способ по любому из п.п. 171-207, дополнительно включающий введение дополнительного терапевтического средства субъекту до, одновременно с либо после введения пептида, полинуклеотида, вектора, композиции или клеток.

209. Способ по п. 208, при этом дополнительное средство представляет собой химиотерапевтическое средство, иммуномодулирующий препарат, препарат, модифицирующий иммунный метаболизм, таргетную терапию, облучение, средство против ангиогенеза или средство, уменьшающее иммуносупрессию.

210. Способ по п. 209, при этом химиотерапевтическим средством является алкилирующий реагент, ингибитор топоизомеразы, антиметаболит или антимитотический реагент.

211. Способ по п. 208, при этом дополнительное средство представляет собой антитело или фрагмент антитела против индуцируемого глюкокортикоидами рецептора из семейства фактора некроза опухолей (GITR), ибрутиниб, доцетаксель, цисплатин или циклофосфамид.

212. Способ по любому из п.п. 171-211, который вызывает иммунный ответ T-клеток CD4+.

213. Способ по любому из п.п. 171-212, который вызывает иммунный ответ T-клеток CD4+ и иммунный ответ T-клеток CD8+.

214. Способ стимулирования иммунного ответа у субъекта, включающий введение эффективного количества модифицированных клеток или композиции по любому из п.п. 30-103, 108, 115-129, 139, 140, 148-164 и 168-170.

215. Способ по п. 214, при этом иммунный ответ представляет собой цитотоксический и/или гуморальный иммунный ответ.

216. Способ по п. 214, при этом способ стимулирует T-клеточный иммунный ответ у субъекта.

217. Способ по п. 216, при этом T-клеточный иммунный ответ направлен против клетокмишеней.

218. Способ по п. 217, при этом клетки-мишени являются опухолевыми клетками.

219. Способ по любому из п.п. 214-218, при этом модифицированные клетки трансфецированы или трансдуцированы in vivo.

220. Способ по любому из п.п. 214-219, при этом модифицированные клетки трансфецированы или трансдуцированы ex vivo.

221. Способ по любому из п.п. 214-220, при этом модифицированные клетки являются аутологичными T-клетками пациента.

222. Способ по п. 221, при этом аутологичные T-клетки пациента получены от пациента, получавшего неоантигенный пептид или вакцину из нуклеиновой кислоты.

223. Способ по п. 222, при этом неоантигенный пептид или вакцина из нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере один персонализированный неоантиген.

224. Способ по п. 223, при этом неоантигенный пептид или вакцина из нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере один дополнительный неоантигенный пептид, приведенный в табл. 1-9.

225. Способ по п. 224, при этом пациент получал химиотерапевтическое средство, иммуномодулирующий препарат, препарат, модифицирующий иммунный метаболизм, таргентую терапию или облучение до и/или во время получения неоантигенного пептида или вакцины из нуклеиновой кислоты.

226. Способ по любому из п.п. 222-225, при этом пациент получает лечение по меньшей мере одним ингибитором контрольной точки.

227. Способ по любому из п.п. 222-226, при этом аутологичные T-клетки получены от пациента, который уже получал по меньшей мере один цикл терапии T-клетками, содержащими неоантиген.

228. Способ по любому из п.п. 222-227, при этом способ дополнительно включает адоптивную T-клеточную терапию.

229. Способ по п. 228, при этом адоптивная T-клеточная терапия включает аутологичные T-клетки.

230. Способ по п. 229, при этом аутологичные T-клетки нацелены на опухолевые антигены.

231. Способ по п. 228 или 229, при этом адоптивная T-клеточная терапия дополнительно включает аллогенные T-клетки.

232. Способ по п. 231, при этом аллогенные T-клетки нацелены на опухолевые антигены.

233. Способ по любому из п.п. 227-231, при этом адоптивная T-клеточная терапия проводится до ингибитора контрольной точки.

234. Способ оценки эффективности любого из п.п. 171-213, включающий: (i) измерение количества или концентрации клеток-мишеней в первом образце, полученном от субъекта до введения модифицированных клеток, (ii) измерение количества или концентрации клеток-мишеней во втором образце, полученном от субъекта после введения модифицированных клеток; и (iii) определение увеличения или уменьшения количества или концентрации клеток-мишеней во втором образце по сравнению с количеством или концентрацией клеток-мишеней в первом образце.

235. Способ по п. 234, при этом эффективность лечения определяется путем мониторинга клинического исхода; увеличения, усиления или продления T-клетками противоопухолевой активности; увеличения числа противоопухолевых T-клеток или активированных T-клеток по сравнению с их количеством до лечения; активности B-клеток; активности T-клеток CD4; или их комбинации.

236. Способ по п. 235, при этом эффективность лечения определяется путем мониторинга биомаркера.

237. Способ по п. 236, при этом биомаркер выбирают из группы, состоящей из CEA, Her-2/neu, опухолевого антигена мочевого пузыря, тиреоглобулина, альфа-фетопротеина, PSA, CA-125, CA-19.9, CA-15.3, лептина, пролактина, остеопонтина, IGF-II, CD98, фасцина, sPIgR, 14-3-3 eta, тропонина I и натрийуретического пептида b-типа.

238. Способ по п. 235, при этом клинический исход выбирают из группы, состоящей из регрессии опухоли; уменьшения опухоли; некроза опухоли; противоопухолевого ответа иммунной системы; увеличения, рецидива или распространения опухоли; либо их комбинации.

239. Способ по п. 235, при этом клинический исход прогнозируется по наличию T-клеток или по наличию сигнатуры гена, свидетельствующей о T-клеточном воспалении, либо их комбинации.

240. Набор, включающий терапевтический неоантиген по любому из п.п. 1-164.

Соответственно, целью изобретения не является охват изобретением каких-либо ранее известных продуктов, способов получения продуктов или способов применения продуктов, так что заявители оставляют за собой право и настоящим заявляют об отказе от любых ранее известных продуктов, процессов или способов. Также следует отметить, что изобретение не стремится охватывать своими рамками какие-либо продукты, способы получения продуктов или способы применения продуктов, которые не соответствует письменному описанию и требованиям к применению по USPTO (35 USC §112, первый абзац) или EPO (статья 83 EPC), так что заявители оставляют за собой право и настоящим заявляют об отказе от любых ранее описанных продуктов, способов получения продуктов или способов применения продуктов. При практическом применении изобретения рекомендуется придерживаться требований Ст. 53(c) EPC и Правила 28(b) и (c) EPC. Прямо оговариваются все права на явный отказ от любых воплощений, которые являются предметом любого выданного патента (патентов) заявителя по линии настоящей заявки или по любой другой линии или в любом ранее поданном заявлении от любой третьей стороны. Ничто в настоящем документе не должно истолковываться как обязательство.

Следует отметить, что в данном изложении, в частности, в формуле изобретения и/или её пунктах такие термины, как “включает”, “содержится”, “включающий” и т.п. могут иметь значения, придаваемые им в патентном праве США; например, они могут означать “включает в себя”, “включенный”, “включая” и т.п.; а такие термины, как “состоящий в основном из” и “состоит в основном из” имеют значения, придаваемые им в патентном праве США, например, они допускают элементы, не приведенные явным образом, но исключают элементы, которые встречаются на предшествующем уровне техники или затрагивают основные или новые характеристики изобретения. Ничто в настоящем документе не подразумевается как обязательство.

Эти и другие воплощения изложены или очевидны из последующего подробного описания и охватываются им.

Раскрытие сущности изобретения

Чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, здесь приводятся определения ряда терминов и выражений.

Если специально не указано или не очевидно из контекста, в настоящем изобретении термин “примерно” означает в пределах диапазона нормального допуска в данной области, например, в пределах 2 стандартных отклонений от среднего значения. Примерно может означать в пределах 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанного значения. Если из контекста не следует иначе, все приведенные здесь числовые значения определяются термином “примерно”.

Если специально не указано или не очевидно из контекста, в настоящем изобретении термин “или” понимается как инклюзивный. Если специально не указано или не очевидно из контекста, в настоящем изобретении термины указанные в единственном числе, включают в себя как единственное, так и множественное число.

Все обозначения названий генов относятся к тем генам, которые общеизвестны в данной области. Гены могут обозначаться символами, приведенными Комитетом по номенклатуре генов HUGO (HGNC). Обозначения генов относятся ко всему гену или к вариантам гена. Комитет по номенклатуре генов HUGO отвечает за предоставление рекомендаций по наименованию генов человека и утверждение новых уникальных названий и обозначений генов человека. Все названия и обозначения генов человека можно искать на www.genenames.org, веб-сайте HGNC, и там же приводятся рекомендации по их составлению (www.genenames.org/guidelines).

Под “действующими веществами” (агентами) подразумеваются любые низкомолекулярные химические соединения, антитела, молекулы нуклеиновой кислоты или полипептиды либо их фрагменты.

Под “улучшением” подразумевается снижение, подавление, ослабление, уменьшение, прекращение или стабилизация развития или прогрессирования заболевания (например, неоплазии, опухоли и т.д.).

Под “изменением” подразумевается изменение (повышение или снижение) уровня экспрессии или активности гена или полипептида при определении известными в данной области стандартными методами типа описанных здесь. В настоящем изобретении изменение означает изменение уровня экспрессии на 10%, предпочтительно на 25%, более предпочтительно на 40% и наиболее предпочтительно на 50% или больше.

Под “аналогом” имеется в виду молекула, которая не идентична, но имеет аналогичные функциональные или структурные признаки. Например, аналог опухолеспецифичного неоантигенного полипептида сохраняет биологическую активность соответствующего естественного опухолеспецифичного неоантигенного полипептида, но имеет определенные биохимические модификации, которые усиливают функции аналога по сравнению с естественным полипептидом. Такие биохимические модификации могут приводить к повышению устойчивости аналога к протеазам, мембранной проницаемости или периода полураспада, не изменяя, к примеру, связывание лиганда. Аналог может включать не встречающиеся в природе аминокислоты.

“Комбинированная терапия” охватывает введение терапевтических средств (например, описанных здесь неоантигенных пептидов) последовательным образом, то есть когда каждое терапевтическое средство вводится в разное время, а также введение этих терапевтических средств или по меньшей мере двух терапевтических средств практически одновременно. Практически одновременное введение может осуществляться, к примеру, путем введения субъекту одной капсулы с фиксированным соотношением между терапевтическими средствами или в виде нескольких отдельных капсул для каждого из терапевтических средств. Например, одна комбинация по настоящему изобретению может содержать объединенный образец неоантигенных пептидов, вводимых в одно и то же или в разное время, или же они могут быть составлены в виде единой составной фармацевтической композиции, содержащей эти пептиды. В качестве другого примера комбинация по настоящему изобретению (например, объединенный образец опухолеспецифичных неоантигенов) может быть составлена в виде отдельных фармацевтических композиций, которые можно вводить в одно и то же или разное время. В настоящем изобретении термин “одновременно” означает введение одного или нескольких средств в одно и то же время. Например, в некоторых воплощениях неоантигенные пептиды вводятся одновременно. Одновременно включает введение в одно время, то есть в течение одного и того же периода времени. В некоторых воплощения одно или несколько средств вводятся одновременно в один и тот же час или одновременно в один и тот же день. Последовательное или практически одновременное введение каждого терапевтического средства может осуществляться любым подходящим способом, включая, без ограничения, пероральное, внутривенное, подкожное, внутримышечное введение, прямое всасывание через слизистые оболочки тканей (например, через нос, рот, вагинально или ректально) и в глаза (например, интравитреально, интраокулярно и т.д.). Терапевтические средства можно вводить одним и тем же способом или разными способами. Например, один компонент определенной комбинации можно вводить путем внутривенной инъекции, а другие компоненты можно вводить перорально. Компоненты можно вводить в любой терапевтически эффективной последовательности. Выражение “комбинация” охватывает группы соединений или нелекарственных препаратов, которые применяются в составе комбинированной терапии.

Термин “неоантиген” или “неоантигенный” означает такой класс опухолевых антигенов, который возникает при опухолеспецифичных мутациях, изменяющих аминокислотную последовательность кодируемых геномом белков.

Под “неоплазией” подразумеваются любые заболевания, которые вызваны или приводят к неадекватно высокому уровню деления клеток, неадекватно низкому уровню апоптоза или тому и другому. Например, примером неоплазии является рак. Примерами раковых заболеваний являются, без ограничения, лейкемия (например, острая лейкемия, острая лимфоцитарная лейкемия, острая миелоцитарная лейкемия, острая миелобластная лейкемия, острая промиелоцитарная лейкемия, острая миеломоноцитарная лейкемия, острая моноцитарная лейкемия, острая эритролейкемия, хроническая лейкемия, хроническая миелоцитарная лейкемия, хроническая лимфоцитарная лейкемия), полицитемия, лимфома (например, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома), макроглобулинемия Вальденстрёма, болезнь тяжелых цепей и такие твердые опухоли, как саркомы и карциномы (например, фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак простаты, плоскоклеточный рак, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечно-клеточная карцинома, гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильма, рак шейки матки, рак матки, рак яичек, карцинома легких, мелкоклеточная карцинома легких, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, акустическая неврома, олигоденроглиома, шваннома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома). Лимфопролиферативные расстройства также считаются пролиферативными заболеваниями.

Термин “вакцина” в данном контексте служит для обозначения объединенного образца опухолеспецифичных неоантигенных пептидов, к примеру, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти и более неоантигенных пептидов. Под “вакциной” подразумевается композиция для выработки иммунитета для профилактики и/или лечения заболеваний (напр, неоплазии/опухоли). Соответственно, вакцины представляют собой лекарственные средства, которые содержат антигены и предназначены для применения на людях или животных для вырабатывания специфических защитных и предохраняющих от болезни веществ при вакцинации. “Вакцинная композиция” может включать в себя фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель.

Термин “фармацевтически приемлемый” означает утвержденный или одобренный регулирующим органом федерального правительства или штата либо приведенный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения на животных, включая людей.

“Фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель” означает такой эксципиент, носитель или разбавитель, который может вводиться субъекту вместе с действующим веществом и не разрушает его фармакологическую активность и нетоксичен при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества действующего вещества.

“Фармацевтически приемлемая соль” приведенных здесь объединенных опухолеспецифичных неоантигенов может представлять собой соль кислоты или основания, которая в данной области обычно считается подходящей для применения при контакте с тканями людей или животных без излишней токсичности, раздражения, аллергических реакций или других проблем или осложнений. К таким солям относятся соли минеральных и органических кислот таких оснований, как амины, а также щелочные или органические соли таких кислот, как карбоновые кислоты. Конкретные фармацевтические соли включают, без ограничения, соли таких кислот, как соляная, фосфорная, бромистоводородная, яблочная, гликолевая, фумаровая, серная, сульфаминовая, сульфанильная, муравьиная, толуолсульфоновая, метансульфоновая, бензолсульфоновая, этандисульфоновая, 2-гидроксиэтилсульфоновая, азотная, бензойная, 2-ацетоксибензойная, лимонная, винная, молочная, стеариновая, салициловая, глутаминовая, аскорбиновая, памоиновая, янтарная, фумаровая, малеиновая, пропионовая, гидроксималеиновая, йодистоводородная, фенилуксусная, алкановые кислоты типа уксусной, HOOC-(CH₂)_n-COOH, где n равно 0-4 и т.п. Аналогично, фармацевтически приемлемые катионы включают, без ограничения, натрий, калий, кальций, алюминий, литий и аммоний. Рядовым специалистам в данной области должно быть понятно из этого описания и познаний в данной области, что возможны и другие фармацевтически приемлемые соли для приведенных здесь объединенных опухолеспецифичных неоантигенов, включая соли, приведенные в Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985). В общем, фармацевтически приемлемые соли кислот или оснований могут быть синтезированы из исходных соединений, содержащих основную или кислотную часть, любым стандартным химическим методом. Вкратце, такие соли могут быть получены при реакции свободных кислотных или основных форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в подходящем растворителе.

Под “полипептидом” или “пептидом” подразумевается полипептид, который был отделен от тех компонентов, которые его сопровождают в природе. Как правило, полипептид считается выделенным, когда он по меньшей мере на 60% по массе свободен от белков и тех органических молекул, с которыми он связан в природе. Предпочтительно препарат содержит по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% по массе полипептида. Выделенный полипептид может быть получен, к примеру, путем экстракции из природного источника, путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей такой полипептид; или путем химического синтеза белка. Чистоту можно измерить любым подходящим способом, например, методом колоночной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле или HPLC.

В настоящем изобретении термины “предотвращать”, “предотвращающий”, “профилактика”, “профилактическое лечение” и т.п. означают снижение вероятности возникновения заболевания у субъекта, у которого его нет, но который подвергается риску или подвержен возникновению заболевания.

Термины “прайм/буст” или “по схеме с ревакцинацией” служат для обозначения последовательного введения вакцины либо иммуногенных или иммунологических композиций. Первичное введение (прайминг) означает первое введение типа вакцины либо иммуногенной или иммунологической композиции и может включать одно, два или несколько введений. Ревакцинация (бустинг) означает второе введение типа вакцины либо иммуногенной или иммунологической композиции и может включать одно, два или несколько введений и, к примеру, может включать или в основном состоять из ежегодных введений. В некоторых воплощениях введение вакцины или иммуногенной композиции против неоплазии проводится по схеме с ревакцинацией.

Приведенные здесь диапазоны понимаются как сокращенные обозначения для всех значений в пределах диапазона. Например, диапазон от 1 до 50 понимается как включающий любые числа, комбинации чисел или субдиапазоны из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50, а также все промежуточные десятичные значения между указанными целыми числами, как-то, к примеру, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 и 1,9. В отношении субдиапазонов специально предусмотрены “вложенные субдиапазоны”, которые простираются от любой конечной точки диапазона. Например, вложенный субдиапазон типичного диапазона от 1 до 50 может содержать от 1 до 10, от 1 до 20, от 1 до 30 и от 1 до 40 в одном направлении или от 50 до 40, от 50 до 30, от 50 до 20 и от 50 до 10 в другом направлении.

“Рецептор” следует понимать как термин, означающий биологическую молекулу или группу молекул, способных связывать лиганд. Рецептор может служить для передачи информации в клетках, клеточных образованиях или организме. Рецептор содержит по меньшей мере один рецепторный блок, а зачастую содержит два или несколько рецепторных блоков, причем каждый рецепторный блок может состоять из белковой молекулы, в частности, молекулы гликопротеина. Рецептор имеет структуру, которая дополняет структуру лиганда и может комплексировать лиганд в виде партнера по связыванию. Сигнальная информация может передаваться посредством конформационных изменений рецептора после связывания с лигандом на поверхности клетки. В соответствии с изобретением, рецептор может относиться к определенным белкам MHC класса I и II, способным образовывать комплекс рецептор/лиганд с лигандом, в частности, с пептидом или фрагментом пептида подходящей длины.

Термин “субъект” относится к животным, которые являются объектами лечения, наблюдения или эксперимента. В качестве примера субъектами являются, без ограничения, млекопитающие, включая, без ограничения, человека и других млекопитающих, как-то приматы, быки, лошади, собаки, овцы или кошки.

Термины “лечить”, “лечили”, “лечение”, “обработка” и т.д. служат для обозначения уменьшения или ослабления заболевания и/или связанных с ним симптомов (например, неоплазии или опухоли). “Лечение” может означать проведение терапии у субъекта после возникновения или подозрения на возникновение рака. “Лечение” включает понятие “облегчения”, которое означает уменьшение частоты возникновения или рецидива или тяжести любых симптомов или других вредных эффектов, связанных с раком, и/или побочных эффектов, связанных с терапией рака. Термин “лечение” также охватывает понятие “контролирования”, которое означает уменьшение тяжести определенного заболевания или расстройства у пациента или отсрочку его рецидива, например, удлинение периода ремиссии у пациента, который страдал этим заболеванием. Предполагается, хотя и не исключается, что лечение заболевания не требует полного устранения расстройства, заболевания или связанных с этим симптомов.

Термин “терапевтический эффект” означает некоторую степень ослабления одного или нескольких симптомов заболевания (например, неоплазии или опухоли) или связанной с ним патологии. “Терапевтически эффективное количество” в настоящем изобретении означает такое количество средства, которое при однократном или неоднократном введении его в клетки или субъекту эффективно продлевает выживаемость пациентов с таким заболеванием, уменьшает один или несколько признаков или симптомов заболевания, предотвращает или замедляет его и т.д. за пределами того, что ожидается в отсутствие такого лечения. “Терапевтически эффективное количество” определяется как количество, необходимое для достижения терапевтического эффекта. Рядовой врач или ветеринар сможет легко определить и назначить “терапевтически эффективное количество” (например, ED₅₀) требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать со введения дозы соединений по изобретению, используемых в фармацевтической композиции, на меньшем уровне, чем это нужно для достижения требуемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку вплоть до достижения требуемого эффекта.

Термины “спейсер” или “линкер” в применении к слитым белкам обозначают пептиды, которые соединяют белки, составляющие слитый белок. Как правило, спейсер не обладает какой-то специфической биологической активностью, помимо соединения или сохранения какого-то минимального расстояния или иной пространственной связи между белками или последовательностями РНК. Однако в некоторых воплощениях входящие в состав спейсера аминокислоты могут быть выбраны так, чтобы они влияли на какое-то свойство молекулы типа укладки, общего заряда или гидрофобности молекулы.

Подходящие линкеры для применения в воплощениях настоящего изобретения хорошо известны специалистам в данной области и включают, без ограничения, углеродные линкеры с прямой или разветвленной цепью, гетероциклические углеродные линкеры или пептидные линкеры. Линкер используется для отделения двух неоантигенных пептидов на расстояние, достаточное для того, чтобы, в предпочтительном воплощении, каждый неоантигенный пептид правильно укладывался. Предпочтительные последовательности пептидных линкеров принимают гибкую растянутую конформацию и не проявляют склонности к образованию упорядоченной вторичной структуры. Типичные аминокислоты в гибких участках белков включают Gly, Asn и Ser. Ожидается, что практически любая перестановка аминокислотных последовательностей, содержащих Gly, Asn и Ser, будет соответствовать вышеуказанным критериям для последовательностей линкеров. В последовательностях линкеров могут использоваться и другие почти нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala. Другие аминокислотные последовательности, которые могут использоваться в качестве линкеров, описаны в Maratea et al. (1985), Gene 40: 39-46; Murphy et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-62; патент США No. 4,935,233; и патент США No. 4,751,180.

Приведение здесь перечня химических групп в любом определении переменных включает определения этой переменной в виде какой-то отдельной группы или комбинации перечисленных групп. Приведение здесь воплощения для переменной или аспекта включает это воплощение в виде какого-то одного воплощения или в сочетании с любыми другими воплощениями или их частями.

Любые композиции или способы, представленные здесь, можно комбинировать с одной или несколькими из представленных здесь других композиций и способов.

Изложенная здесь терапия составляет новый способ лечения различных типов рака. Описанная здесь терапия также обеспечивает метод терапии для достижения клинической пользы без неприемлемого уровня побочных эффектов.

В одном аспекте настоящее изобретение касается способов лечения неоплазий, в частности опухолей, путем введения субъекту вакцины или иммуногенной композиции, содержащей множество опухолеспецифичных неоантигенных пептидов. Как описано более подробно ниже, в некоторых воплощения композиция обеспечивает определенное, оптимизированное подмножество опухолеспецифичных неоантигенов, пригодных для лечения опухолей у большой части пациентов, страдающих раком. В некоторых воплощениях опухолеспецифичные неоантигены вместе могут связываться с большой частью HLA-аллотипов, присутствующих в данной популяции.

Иммунная система подразделяется на две функциональные подсистемы: систему врожденного и приобретенного иммунитета. Система врожденного иммунитета является первой линией защиты от инфекций, и большинство потенциальных патогенов быстро нейтрализуются этой системой еще до того, как они могут вызвать, к примеру, заметную инфекцию. Система приобретенного иммунитета реагирует на молекулярные структуры, именуемые антигенами, у вторгающегося организма. Существует два типа реакций приобретенного иммунитета, который включает гуморальный иммунитет и клеточный иммунитет. При гуморальном иммунитете антитела, секретируемые B-клетками в жидкие фазы организма, связываются с антигенами патогена, что ведет к элиминации возбудителя по различным механизмам, например, опосредованного комплементом лизиса. При клеточном иммунитете активируются T-клетки, способные уничтожать другие клетки. Например, если в клетке присутствуют белки, связанные с заболеванием, то они подвергаются протеолитической фрагментации на пептиды внутри клетки. Затем к образовавшимся при этом антигенам или пептидам присоединяются определенные клеточные белки, которые переносят их на поверхность клетки, где они презентируются молекулярным защитным механизмам, в частности, T-клеткам организма. Цитотоксические T-клетки распознают эти антигены и уничтожают те клетки, которые содержат антигены.

Молекулы, которые транспортируют и презентируют пептиды на поверхности клеток, именуются белками главного комплекса гистосовместимости (MHC). Белки MHC подразделяются на два типа, которые именуются MHC класса I и MHC класса II. Структуры белков у этих двух классов MHC очень похожи, однако они имеют очень разные функции. Белки MHC класса I присутствуют на поверхности почти всех клеток организма, включая большинство опухолевых клеток. Белки MHC класса I нагружаются антигенами, которые обычно происходят из эндогенных белков или из патогенов, находящихся внутри клеток, а затем презентируют их наивным или цитотоксическим T-лимфоцитам (CTLs). Белки MHC класса II присутствуют в дендритных клетках, B-лимфоцитах, макрофагах и других антиген-презентирующих клетках. Они в основном презентируют пептиды, которые поступают из внешних источников антигенов, то есть вне клеток, Т-хелперным (Th) клеткам. Большинство пептидов, связывающихся с белками MHC класса I, происходят из цитоплазматических белков, вырабатываемых в здоровых клетках своего организма, и в норме не вызывают иммунных реакций. Соответственно, цитотоксические Т-лимфоциты, которые распознают такие молекулы MHC класса I, презентирующие свои пептиды, удаляются в тимусе (центральная толерантность) или, после их высвобождения из тимуса, удаляются либо инактивируются, то есть подвергаются толеризации (периферическая толерантность). Молекулы MHC способны вызывать иммунные реакции тогда, когда они презентируют пептиды нетолеризованным T-лимфоцитам. Цитотоксические T-лимфоциты содержат на своей поверхности и T-клеточные рецепторы (TCR), и молекулы CD8. T-клеточные рецепторы способны распознавать и связывать пептиды, комплексованные с молекулами MHC класса I. Каждый цитотоксический Т-лимфоцит экспрессирует уникальный T-клеточный рецептор, который способен связывать специфические комплексы MHC/пептид.

Пептидные антигены прикрепляются к молекулам MHC класса I посредством конкурентного афинного связывания в эндоплазматическом ретикулуме, после чего они презентируются на поверхности клетки. При этом сродство индивидуальных пептидных антигенов непосредственно зависит от их аминокислотной последовательности и наличия специфических связывающихся мотивов в определенных положениях в аминокислотной последовательности. Если последовательность такого пептида известна, то можно настроить иммунную систему против пораженных клеток, используя, к примеру, пептидные вакцины.

Одним из критических барьеров при разработке лечебной и опухолеспецифичной иммунотерапии является идентификация и отбор высокоспецифичных и ограниченных опухолевых антигенов, чтобы избежать аутоиммунитета. Опухолевые неоантигены, которые возникают в результате генетических изменений (например, инверсии, транслокации, делеции, миссенс-мутации, мутации сайта сплайсинга и т.д.) в злокачественных клетках, представляют наиболее опухолеспецифичный класс антигенов. Неоантигены редко использовались в противораковых вакцинах или иммуногенных композициях из-за технических трудностей с их идентификацией, отбором оптимизированных неоантигенов и получением самих неоантигенов для применения в вакцинах или иммуногенных композициях. Эти проблемы можно решить путем:

• выявления таких мутаций в неоплазиях/опухолях, которые присутствуют на уровне ДНК в опухоли, но не в соответствующих гаметных образцах у большой части субъектов, страдающих раком;

• анализа выявленных мутаций с помощью одного или нескольких алгоритмов, прогнозирующих связывание пептидов с MHC, получая множество T-клеточных эпитопов неоантигенов, экспрессирующихся в неоплазии/опухоли и связывающихся с большей частью аллелей HLA пациента; и

• синтеза нескольких неоантигенных пептидов, выбранных из множества всех неоантигенных пептидов и предсказанных связывающихся пептидов для применения в противораковой вакцине или иммуногенной композиции, подходящей для лечения большой части субъектов, страдающих раком.

Например, преобразование информации по секвенированию в терапевтическую вакцину может включать:

(1) Прогнозирование мутантных пептидов, способных связываться с молекулами HLA у большой части индивидов. Эффективный выбор тех конкретных мутаций, которые следует использовать в качестве иммуногенов, требует способности предсказать, какие мутантные пептиды будут эффективно связываться с большей частью аллелей HLA у пациента. В последнее время обучающие подходы на основе нейронных сетей с проверенными связывающимися и несвязывающимися пептидами повысили точность алгоритмов прогнозирования для основных аллелей HLA-A и -B.

(2) Составление препарата в виде многоэпитопной вакцины из длинных пептидов. Использование максимально возможного на практике количества мутантных эпитопов позволяет воспользоваться огромной ёмкостью иммунной системы, предотвращает возможность иммунологического избежания путем снижения уровня определенного генного продукта-мишени иммунной системы и компенсирует известную неточность подходов к прогнозированию эпитопов. Синтетические пептиды обеспечивают особенно полезное средство для эффективного получения множественных иммуногенов и быстрейшего претворения идентификации мутантных эпитопов в эффективную вакцину. Пептиды нетрудно синтезировать химически и очистить с помощью реагентов, свободных от загрязняющих бактерий или веществ животного происхождения. Небольшие размеры позволяют четко сосредоточиться на мутантном участке белка, а также уменьшают нерелевантную антигенную конкуренцию со стороны других компонентов (антигенов немутантного белка или вирусного вектора).

(3) Комбинирование с сильным вакцинным адъювантом. Эффективные вакцины требуют сильного адъюванта для запуска иммунного ответа. Как описано ниже, поли-ICLC, агонист TLR3 и доменов MDA5 и RIG3 РНК-геликазы, проявляет несколько желательных для вакцинного адъюванта свойств. Эти свойства включают индукцию локальной и системной активации иммунных клеток in vivo, выработку стимулирующих хемокинов и цитокинов и стимуляцию презентации антигенов клетками DC. Кроме того, поли-ICLC может индуцировать продолжительные реакции CD4+ и CD8+ у человека. Важно отметить то, что наблюдалось поразительное сходство в повышающей регуляции транскрипции и путей передачи сигналов у субъектов, вакцинированных поли-ICLC, и у добровольцев, получавших высокоэффективную, репликационно-компетентную вакцину против желтой лихорадки. Кроме того, у >90% пациентов с карциномой яичников, иммунизированных поли-ICLC в сочетании с пептидной вакциной NYES0-1 (в дополнение к Montanide), проявлялась индукция T-клеток CD4+ и CD8+, а также антительные ответы на пептид при недавнем исследовании в фазе 1. В то же время поли-ICLC проходил широкое тестирование в более чем 25 клинических испытаниях на сегодняшний день и проявлял относительно доброкачественный профиль токсичности.

Вышеописанные преимущества изобретения будут дополнительно описаны ниже.

Как описано здесь, имеется большое количество данных как на животных, так и на людях о том, что мутантные эпитопы эффективно индуцируют иммунный ответ, а случаи спонтанной регрессии опухолей или долговременной выживаемости коррелируют с реакцией T-клеток CD8+ на мутантные эпитопы (Buckwalter and Srivastava PK. “It is the antigen(s), stupid” and other lessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer. Seminars in Immunology 20:296-300 (2008); Karanikas et al. High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against a tumor-specific mutated antigen detectable with HLA tetramers in the blood of a lung carcinoma patient with long survival. Cancer Res. 61:3718-3724 (2001); Lennerz et al. The response of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutated neoantigens. Proc Natl Acad Sci USA, 102:16013 (2005)), причем “иммуноредактирование” можно отследить по изменениям экспрессии доминантных мутантных антигенов у мышей и человека (Matsushita et al. Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting. Nature 482:400 (2012); DuPage et al. Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting. Nature 482:405 (2012); и Sampson et al. Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermal growth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newly diagnosed glioblastoma. J Clin Oncol. 28:4722-4729 (2010)).

Технология секвенирования показала, что каждая опухоль содержит множественные мутации, специфичные для пациента, которые изменяют состав кодирующего белок гена. Такие мутации создают измененные белки, и варьируют от изменения отдельных аминокислот (вызванных мутациями миссенс) до добавления длинных участков с новой аминокислотной последовательностью вследствие сдвига рамки считывания, перепрыгивания терминальных кодонов или трансляции интронных участков (мутации типа новых открытых рамок считывания, neoORFs). Такие мутантные белки являются ценными мишенями для иммунного ответа хозяина на опухоль, так как, в отличие от нативных белков, они не подвержены ослабляющим иммунитет эффектам аутотолерантности. Поэтому мутантные белки с большей вероятностью будут иммуногенными, а также более специфичными к опухолевым клеткам по сравнению с нормальными клетками пациента.

В одном воплощении неоантигенные пептиды в композиции все вместе обладают сродством ко множеству молекул MHC, например, вместе они охватывают большую часть целевой популяции. Эффективный выбор конкретных мутаций для использования в качестве иммуногенов требует способности прогнозировать, какие мутантные пептиды эффективно связываются с аллелями HLA, присутствующими в популяции пациентов.
В последнее время обучающие подходы на основе нейронных сетей с проверенными связывающимися и несвязывающимися пептидами повысили точность алгоритмов прогнозирования для основных аллелей HLA-A и -B. Используя новейшие усовершенствованные алгоритмы для прогнозирования того, какие миссенс-мутации дают пептиды, сильно связывающиеся с когнатными молекулами MHC, можно идентифицировать и расположить в приоритетном порядке набор пептидов, представляющих оптимальные мутантные эпитопы (и neoORF, и миссенс) для популяции пациентов (Zhang et al. Machine learning competition in immunology – Prediction of HLA class I binding peptides. J Immunol Methods 374:1 (2011); Lundegaard et al. Prediction of epitopes using neural network based methods. J Immunol Methods 374:26 (2011)).

Использование стольких мутантных эпитопов, как это практически возможно, позволяет воспользоваться огромной ёмкостью иммунной системы, предотвращает возможность иммунологического избежания путем снижения уровня определенного генного продукта-мишени иммунной системы и компенсирует известную неточность подходов к прогнозированию эпитопов. Синтетические пептиды обеспечивают особенно полезное средство для эффективного получения множественных иммуногенов и быстрейшего претворения идентификации мутантных эпитопов в эффективную вакцину или иммуногенную композицию. Пептиды нетрудно синтезировать химически и очистить с помощью реагентов, свободных от загрязняющих бактерий или веществ животного происхождения. Небольшие размеры позволяют четко сосредоточиться на мутантном участке белка, а также уменьшают нерелевантную антигенную конкуренцию со стороны других компонентов (антигенов немутантного белка или вирусного вектора).

В одном воплощении лекарственный препарат представляет собой мультиэпитопную вакцину или иммуногенную композицию из длинных пептидов. Такие “длинные” пептиды эффективно подвергаются интернализации, процессингу и перекрестной презентации в таких специализированных антиген-презентирующих клетках, как дендритные клетки и, как это было показано, индуцируют CTL у людей (Melief and van der Burg. Immunotherapy of established (pre) malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nature Rev Cancer 8:351 (2008)). В одном воплощении для иммунизации получают не менее 2 пептидов. В некоторых воплощения для иммунизации получают 20 или больше пептидов. В одном воплощении неоантигенный пептид имеет длину от 5 до 50 аминокислот. В другом воплощении синтезируются пептиды длиной от 15 до 35 аминокислот. В предпочтительном воплощении неоантигенный пептид имеет длину от 20 до 35 аминокислот.

Получение опухолеспецифичных неоантигенов

Настоящее изобретение основывается, по крайней мере частично, на способности предъявить иммунной системе пациента целый пул опухолеспецифичных неоантигенов. Специалистам в данной области из этого описания и познаний в данной области должно быть ясно, что существуют различные способы получения таких опухолеспецифичных неоантигенов. В общем, такие опухолеспецифичные неоантигены могут быть получены либо in vitro, либо in vivo. Опухолеспецифичные неоантигены могут быть получены in vitro в виде пептидов или полипептидов, которые затем могут быть составлены в виде вакцины или иммуногенной композиции от неоплазии и введены субъекту. Как описано более подробно ниже, такое получение in vitro может происходить различными способами, известными специалистам в данной области, такими, к примеру, как пептидный синтез или экспрессия пептида/полипептида из молекулы ДНК или РНК в любой из различных бактериальных, эукариотических или вирусных рекомбинантных систем экспрессии, с последующей очисткой экспрессированного пептида/полипептида. С другой стороны, опухолеспецифичные неоантигены могут быть получены in vivo путем введения молекул (например, ДНК, РНК, вирусных систем экспрессии и т.п.), кодирующих опухолеспецифичные неоантигены субъекту, после чего будут экспрессироваться кодируемые опухолеспецифичные неоантигены. Способы получения неоантигенов in vitro и in vivo также будут дополнительно описаны здесь в отношении фармацевтических композиций и способов проведения терапии.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение включает модифицированные неоантигенные пептиды. При этом в отношении неоантигенных пептидов термины “модифицированные”, “модификация” и т.п. означают одно или несколько изменений, улучшающих требуемое свойство неоантигенного пептида, причем это изменение не меняет первичную аминокислотную последовательность неоантигенного пептида. “Модификации” включают такие ковалентные химические модификации, которые не изменяют первичную аминокислотную последовательность самого неоантигенного пептида. А требуемые свойства включают, к примеру, продление периода полужизни in vivo, повышение стабильности, уменьшение клиренса, изменение иммуногенности или аллергенности, позволяющее получать определенные антитела, клеточный таргетинг, поглощение антигена, процессинг антигена, сродство к MHC, устойчивость к MHC или презентирование антигена. Изменения неоантигенного пептида, которые можно осуществлять, включают, без ограничения, конъюгирование с белком-носителем, конъюгирование с лигандом, конъюгирование с антителом, ПЭГилирование, полисиалилирование, HESилирование, рекомбинантные PEG-миметики, слияние с Fc, слияние с альбумином, присоединение к наночастицам, инкапсулирование в наночастицах, присоединение холестерина, включение железа, ацилирование, амидирование, гликозилирование, окисление боковой цепи, фосфорилирование, биотинилирование, присоединение поверхностно-активного вещества, добавление аминокислотных миметиков или добавление неприродных аминокислот.

Клиническая эффективность белковых лекарственных средств зачастую ограничивается коротким периодом полужизни в плазме и восприимчивостью к деградации протеазами. Исследования различных терапевтических белков (например, филграстима) показали, что такие трудности можно преодолеть при различных модификациях, включая конъюгирование или присоединение полипептидной последовательности к любому из целого ряда небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолю (ПЭГ), полипропиленгликолю или к полиоксиалкиленам (к примеру, обычно через соединительную часть, ковалентно связанную как с белком, так и с небелковым полимером, например, ПЭГ). Такие конъюгированные с ПЭГ биомолекулы, как оказалось, обладают клинически полезными свойствами, включая лучшую физическую и термическую стабильность, защиту от подверженности ферментативной деградации, повышение растворимости, удлинение периода полужизни в кровотоке in vivo и снижение клиренса, снижение иммуногенности и антигенности и уменьшение токсичности.

Подходящие для конъюгирования с полипептидной последовательностью ПЭГи обычно растворимы в воде при комнатной температуре и имеют общую формулу R(0-CH₂-CH₂)_nO-R, где R означает водород или защитную группу типа алкила или алканола, а n – целое число от 1 до 1000. Когда R представлен защитной группой, то она обычно содержит от 1 до 8 атомов углерода. ПЭГ, конъюгируемый с полипептидной последовательностью, может быть линейным или разветвленным. В настоящем изобретении предусмотрены разветвленные производные ПЭГ, “звездчатые ПЭГи” и “многорукие” ПЭГи. Молекулярная масса ПЭГ, используемых в настоящем изобретении, не ограничивается каким-либо конкретным диапазоном, но в некоторых воплощениях молекулярная масса составляет от 500 до 20000, а в других воплощениях – от 4000 до 10000.

Настоящим изобретением также предусмотрены такие композиции конъюгатов, в которых ПЭГи имеют разные значения n, при этом различные ПЭГи присутствуют в определенных соотношениях. Например, некоторые композиции содержат смесь конъюгатов, у которых n = 1, 2, 3 и 4. В некоторых композициях содержание конъюгатов, где n = 1, составляет 18-25%, содержание конъюгатов, где n = 2, составляет 50-66%, содержание конъюгатов, где n = 3, составляет 12-16%, и содержание конъюгатов, где n = 4, составляет до 5%. Такие композиции могут быть получены при условиях реакции и методах очистки, известных в данной области. Например, для разделения конъюгатов можно использовать катионообменную хроматографию, а затем идентифицировать фракцию, содержащую конъюгат, к примеру, с требуемым количеством присоединенных молекул ПЭГ, который очищен от немодифицированных белковых последовательностей и от конъюгатов с другим количеством присоединенных молекул ПЭГ.

ПЭГ может соединяться с полипептидом настоящего изобретения через концевую реакционноспособную группу (“спейсер”). Спейсер представляет собой, к примеру, концевую реакционноспособную группу, которая опосредует связь между свободными амино- или карбоксильными группами одной или нескольких полипептидных последовательностей и полиэтиленгликолем. ПЭГ со спейсером, который может связываться со свободной аминогруппой, включает N-гидроксисукцинилимидный полиэтиленгликоль, который может быть получен путем активирования эфира янтарной кислоты полиэтиленгликоля с помощью N-гидроксисукцинилимида. Другой активированный полиэтиленгликоль, который может связываться со свободной аминогруппой, – это 2,4-бис(0-метоксиполиэтиленгликоль)-6-хлор-s-триазин, который может быть получен при реакции монометилового эфира полиэтиленгликоля с цианурхлоридом. Активированный полиэтиленгликоль, который связывается со свободной карбоксильной группой, включает полиоксиэтилендиамин.

Конъюгирование одной или нескольких полипептидных последовательностей по настоящему изобретению с ПЭГ, содержащим спейсер, может проводиться различными стандартными способами. Например, реакция конъюгирования может проводиться в растворе при рН от 5 до 10, при температуре от 4°C до комнатной температуры, в течение от 30 мин до 20 часов, при молярном соотношении реагента к белку от 4:1 до 30:1. Условия реакции можно выбрать так, чтобы направить реакцию на получение преимущественно желательной степени замещения. В общем, низкая температура, низкие значения pH (например, pH = 5) и короткое время реакции обычно ведут к уменьшению количества присоединенного ПЭГ, тогда как высокая температура, значения рН от нейтрального до высоких (например, pH >7) и более длительное время реакции обычно ведут к увеличению количества присоединенного PEG. Для прекращения реакции можно использовать различные способы, известные в данной области. В некоторых воплощениях реакцию останавливают путем подкисления реакционной смеси и замораживания, например, при -20°C.

Настоящим изобретением также предусмотрено использование ПЭГ-миметиков. Были разработаны рекомбинантные ПЭГ-миметики, которые сохраняют свойства ПЭГ (например, повышение периода полужизни в сыворотке) и вместе с тем придают некоторые дополнительные выгодные свойства. В качестве примера: можно рекомбинантно получить простые полипептидные цепи (содержащие, к примеру, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser и Thr), способные образовывать растянутую конформацию, подобную ПЭГ, заранее слитые с представляющим интерес пептидным или белковым препаратом (например, по технологии XTEN фирмы Amunix, Mountain View, CA). Это устраняет необходимость в дополнительной стадии конъюгирования в процессе изготовления. Кроме того, общепринятые методы молекулярной биологии позволяют контролировать состав боковых цепей у полипептидных цепей, что позволяет оптимизировать иммуногенность и производственные свойства.

В настоящем изобретении “гликозилирование” в широком смысле означает такой ферментативный процесс, который присоединяет гликаны к белкам, липидам или другим органическим молекулам. В применении к настоящему изобретению термин “гликозилирование” означает добавление или удаление одного или нескольких углеводных фрагментов (путем удаления лежащего в основе сайта гликозилирования либо путем устранения гликозилирования химическими и/или ферментативными средствами) и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которых может и не быть в нативной последовательности. Кроме того, это выражение охватывает качественные изменения в гликозилировании нативных белков, включающие изменение природы и соотношения различных присутствующих углеводных фрагментов. Гликозилирование может резко повлиять на физические свойства белков, а также может иметь важное значение для стабильности, секреции и субклеточной локализации белков. Правильное гликозилирование может быть существенным для биологической активности. Так, некоторые гены из эукариотических организмов при экспрессировании в бактериях (например, E. coli), у которых отсутствуют клеточные процессы для гликозилирования белков, образуют белки, которые при выделении почти или совсем не обладают активностью вследствие отсутствия у них гликозилирования.

Добавление сайтов гликозилирования может осуществляться путем изменения аминокислотной последовательности. Изменение полипептида может осуществляться, к примеру, путем добавления или замены на один или несколько остатков серина или треонина (для сайтов, связанных с О-гликозилированием) или остатков аспарагина (для сайтов, связанных с N-гликозилированием). У каждого типа структуры N-связанных и O-связанных олигосахаридов и остатки сахаридов могут быть разными. Один тип сахара, который обычно встречается у обоих – это N-ацетилнейраминовая кислота (в дальнейшем именуется сиаловой кислотой). Сиаловая кислота обычно является концевым остатком у N-связанных и O-связанных олигосахаридов и в силу своего отрицательного заряда может придавать кислотные свойства гликопротеинам. Предпочтительное воплощение настоящего изобретения включает получение и применение N-гликозилированных вариантов.

Полипептидные последовательности настоящего изобретения необязательно изменяются посредством изменений на уровне ДНК, в особенности путем мутации ДНК, кодирующей полипептид, по заранее выбранным основаниям с тем, чтобы образовались кодоны, которые будут транслироваться в требуемые аминокислоты. Другим способом увеличения количества углеводных фрагментов у полипептидов является химическое или ферментативное связывание гликозидов с полипептидом.

Удаление углеводов может осуществляться химическим или ферментативным способом либо путем замены кодонов, кодирующих аминокислотные остатки, подвергающиеся гликозилированию. Известны химические методы дегликозилирования, а ферментативное отщепление углеводных фрагментов у полипептидов может осуществляться при помощи различных эндо- и экзогликозидаз.

Для получения рекомбинантных гликопротеинов в качестве клеток хозяина широко применяются дефектные по дигидрофолатредуктазе (DHFR) клетки яичников китайского хомячка (CHO). Эти клетки не экспрессируют фермент β-галактозид–альфа-2,6-сиалилтрансферазу, поэтому у гликопротеинов, получаемых в этих клетках, сиаловая кислота не присоединяется по связи альфа-2,6 к N-связанным олигосахаридам.

Настоящим изобретением также предусмотрено полисиалилирование, то есть конъюгирование пептидов и белков с природной биодеградируемой α-(2→8)-связанной полисиаловой кислотой (“PSA”), для улучшения их стабильности и фармакокинетики in vivo. PSA – это биодеградируемый, нетоксичный природный полимер, который сильно гидрофилен, что придает ему высокую молекулярную массу в крови, повышая период полужизни в сыворотке. Кроме того, полисиалилирование ряда пептидных и белковых терапевтических средств приводит к значительному снижению протеолиза, сохранению активности in vivo и снижению иммуногенности и антигенности (например, см. G. Gregoriadis et al., Int. J. Pharmaceutics 300(1-2): 125-30). Как и при модификации с помощью других конъюгатов (например, PEG), доступны различные методы сайт-специфичного полисиалилирования (например, см. T. Lindhout et al., PNAS 108(18):7397-7402 (2011)).

Другие подходящие компоненты и молекулы для конъюгирования включают, к примеру, тиреоглобулин; альбумины типа сывороточного альбумина человека (HSA); столбнячный токсоид; дифтерийный токсоид; полиаминокислоты типа поли-(D-лизин:D-глутаминовой кислоты); полипептиды VP6 ротавирусов; геммаглютинин вируса гриппа, нуклеопротеин вируса гриппа; гемоцианин моллюска блюдечко (KLH); основной белок и поверхностный антиген вируса гепатита B; и любые комбинации вышеприведенных.

Слияние с альбумином одного или нескольких полипептидов настоящего изобретения может осуществляться, к примеру, путем генетической манипуляции с тем, чтобы ДНК, кодирующая HSA или его фрагмент, соединялась с ДНК, кодирующей одну или несколько полипептидных последовательностей. После этого подходящие клетки можно трансформировать или трансфецировать слитыми последовательностями нуклеотидов в виде, к примеру, подходящей плазмиды с тем, чтобы экспрессировать слитый полипептид. Экспрессирование может осуществляться in vitro, к примеру, из прокариотических или эукариотических клеток, либо in vivo, к примеру, из трансгенного организма. В некоторых воплощениях настоящего изобретения экспрессия слитого белка происходит в клеточных линиях млекопитающих, к примеру, в линиях клеток СНО. При этом трансформация в широком смысле означает генетическое изменение клеток, вызванное прямым захватом, включением и экспрессией экзогенного генетического материала (экзогенной ДНК) из его окружения после переноса через клеточную мембрану (мембраны). У некоторых видов бактерий трансформация происходит естественным образом, но она также может осуществляться искусственным образом и в других клетках.

Кроме того, можно модифицировать сам альбумин, чтобы продлить его период полужизни в кровотоке. Слияние модифицированного альбумина с одним или несколькими полипептидами может осуществляться методами генетической манипуляции, описанными выше, или путем химического конъюгирования; при этом образуется слитая молекула, у которой период полужизни превышает таковой при слиянии с немодифицированным альбумином (см. WO 2011/051489).

В качестве альтернативы прямому слиянию было разработано несколько методов связывания с альбумином, включающих связывание альбумина через цепочку конъюгированной жирной кислоты (ацилирование). Поскольку сывороточный альбумин является транспортным белком для жирных кислот, то эти природные лиганды с активностью связывания альбумина использовались для продления времени полужизни небольших терапевтических белков. Например, препарат инсулина детермир (Levemir), одобренный для диабета, содержит цепь миристила, конъюгированную с генетически модифицированным инсулином, образуя аналог инсулина длительного действия.

Другой тип модификации заключается в конъюгировании (например, присоединении) одного или нескольких дополнительных компонентов или молекул по N- и/или С-концу полипептидной последовательности типа другого белка (например, белка с аминокислотной последовательностью, гетерологичной данному белку) или молекулы носителя. Таким образом, типичная полипептидная последовательность может быть представлена в виде конъюгата с другим компонентом или молекулой.

При модификации типа конъюгата может образоваться полипептидная последовательность, сохраняющая активность с дополнительной или комплементарной функцией или активностью второй молекулы. Например, полипептидная последовательность может быть конъюгирована с молекулой, например, для улучшения растворимости, времени полужизни in vivo или срока годности или устойчивости при хранении, снижения иммуногенности, замедленного или контролируемого высвобождения in vivo и т.д. Другие функции или действия включают конъюгаты, уменьшающие токсичность по сравнению с неконъюгированной полипептидной последовательностью, конъюгаты, нацеленные на какой-то тип клеток или орган более эффективно, чем неконъюгированная полипептидная последовательность, или препараты для дальнейшего противодействия причинам или эффектам, связанным с расстройством или заболеванием, как изложено здесь (например, при диабете).

Полипептид также может быть конъюгирован с крупными, медленно метаболизирующимися макромолекулами типа белков; полисахаридами типа сефарозы, агарозы, целлюлозы, целлюлозных гранул; полимерными аминокислотами типа полиглутаминовой кислоты, полилизина; аминокислотными сополимерами; инактивированными вирусными частицами; инактивированнымие бактериальными токсинами типа дифтерийного, столбнячного, холерного токсоида, молекул лейкотоксина; инактивированными бактериями; и дендритными клетками.

Другие компоненты-кандидаты и молекулы для конъюгирования включают такие, которые пригодны для выделения или очистки. Конкретные неограничительные примеры включают связывающие молекулы типа биотина (специфическая связывающая пара типа биотин-авидин), антитела, рецепторы, лиганды, лектины или молекулы, составляющие твердую подложку, включая, к примеру, пластиковые или полистирольные гранулы, пластины или шарики, магнитные шарики, тест-полоски и мембраны.

Для разделения конъюгатов по разности зарядов можно использовать такие методы очистки, как катионообменная хроматография, которая эффективно разделяет конъюгаты по различиям в молекулярной массе. Например, можно нанести на катионообменную колонку и промыть 20 мМ ацетатом натрия, pH 4, а затем элюировать линейным (от 0 М до 0,5 М) градиентом NaCl с буфером при pH от 3 до 5,5, например, при pH 4,5. Содержимое фракций, полученных при катионообменной хроматографии, можно идентифицировать по молекулярной массе с помощью стандартных методов, к примеру, масс-спектроскопии, SDS-PAGE или других известных методов разделения молекулярных образований по молекулярной массе.

В некоторых воплощениях амино- или карбоксильный конец полипептидной последовательности настоящего изобретения может быть слит с Fc-областью иммуноглобулина (например, Fc человека) с образованием слитого конъюгата (или слитой молекулы). Было показано, что у слитых с Fc конъюгатов повышается системный период полужизни биофармацевтических препаратов, поэтому может потребоваться менее частое введение биофармацевтических препаратов.

Fc связывается с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) в эндотелиальных клетках, выстилающих кровеносные сосуды, причем после связывания слитая с Fc молекула защищена от деградации и снова высвобождается в кровоток, дольше оставаясь в кровотоке. Считается, что такое связывание с Fc является тем механизмом, по которому эндогенный IgG сохраняет свой длительный период полужизни в плазме. По новейшей технологии Fc-слияния с Fc-областью антитела соединяется единственная копия биофармацевтического препарата для оптимизации фармакокинетических и фармакодинамических свойств данного препарата по сравнению с традиционными слитыми с Fc конъюгатами.

Настоящим изобретением предусмотрены и другие модификации полипептидов, уже известные или разрабатываемые в будущем, для улучшения одного или нескольких свойств. Один из таких методов продления периода полужизни в кровотоке, повышения стабильности, уменьшения клиренса или изменения иммуногенности или аллергенности полипептидов настоящего изобретения включает модификацию полипептидных последовательностей посредством HESилирования, при котором для модификации характеристик молекул используются производные гидроксиэтилкрахмала, соединенные с другими молекулами. Различные аспекты HESилирования описаны, к примеру, в Патент США Appln. Nos. 2007/0134197 и 2006/0258607.

Синтез пептидов/полипептидов in vitro

Белки или пептиды можно получить любым методом, известным специалистам в данной области, включая экспрессирование белков, полипептидов или пептидов стандартными методами молекулярной биологии, выделение белков или пептидов из природных источников, транслирование in vitro или химический синтез белков или пептидов. Ранее были описаны нуклеотидные и белковые, полипептидные и пептидные последовательности, соответствующие различным генам, которые находятся в компьютеризованных базах данных, известных рядовым специалистам в данной области. Такими базами данных являются базы данных GenBank и GenPept Национального центра информации по биотехнологии, расположенные на веб-сайте Национального института здоровья. Кодирующие области для известных генов можно амплифицировать и/или экспрессировать с помощью методов, описанных здесь или же известных специалистам в данной области. С другой стороны, специалистам известны различные коммерческие препараты белков, полипептидов и пептидов.

Пептиды можно легко синтезировать химически с использованием реагентов, не содержащих загрязняющих бактериальных веществ или веществ животного происхождения (Merrifield RB. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963). В некоторых воплощениях неоантигенные пептиды получают путем (1) параллельного твердофазного синтеза на многоканальных приборах при одинаковых условиях синтеза и отщепления; (2) очистки на колонке RP-HPLC с десорбированием колонки; и повторной промывки, но без обмена между пептидами; с последующим (3) анализом с помощью ограниченного набора самых информативных методов. Можно установить зону охвата Надлежащей производственной практики (GMP) по набору пептидов для индивидуальных пациентов, так что перенастройка процедур потребуется только между синтезом пептидов для разных пациентов.

С другой стороны, для получения неоантигенного пептида in vitro можно использовать нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую неоантигенный пептид по изобретению. Полинуклеотид может представлять собой, к примеру, ДНК, кДНК, ПНК, CNA, РНК, одно- и/или двухцепочечные, или же нативные или стабилизированные формы полинуклеотидов, такие, например, как полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом, либо их комбинации, и он может и не содержать интронов, если он кодирует пептид. В одном воплощении для получения пептида используется трансляция in vitro. Существует много типичных систем, которые могут использовать специалисты (например, Retic Lysate IVT Kit, Life Technologies, Waltham, MA).

Также можно получить экспрессирующий вектор, способный экспрессировать полипептид. Экспрессирующие векторы для разных типов клеток хорошо известны в данной области и могут быть выбраны без излишнего экспериментирования. Как правило, в экспрессирующий вектор типа плазмиды вставляют ДНК в правильной ориентации и в правильной рамке считывания для экспрессии. При необходимости ДНК может быть связана с соответствующими регулирующими транскрипцию и трансляцию контрольными последовательностями нуклеотидов, которые распознаются требуемым хозяином (например, бактериями), хотя такие средства контроля обычно имеются в экспрессирующем векторе. Затем вектор вводится в бактерии хозяина для клонирования с помощью стандартных методов (например, см. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Также предусмотрены экспрессирующие векторы, содержащие выделенные полинуклеотиды, а также клетки-хозяева, содержащие экспрессирующие векторы. Неоантигенные пептиды могут быть представлены в виде молекул РНК или кДНК, кодирующих требуемые неоантигенные пептиды. Один экспрессирующий вектор может кодировать один или несколько неоантигенных пептидов по изобретению.

Термин “полинуклеотид, кодирующий полипептид” охватывает полинуклеотиды, которые включают только кодирующие последовательности для полипептидов, а также полинуклеотиды, которые включают дополнительные кодирующие и/или некодирующие последовательности. Полинуклеотиды могут быть в виде РНК или в виде ДНК. ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК; и может быть двухцепочечной или одноцепочечной, а если одноцепочечная, то это может быть кодирующая нить или некодирующая (антисмысловая) нить.

В воплощениях полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для опухолеспецифичного неоантигенного пептида, которая слита в той же рамке считывания с полинуклеотидом, способствующим, к примеру, экспрессии и/или секреции полипептида из клеток хозяина (например, лидерную последовательность, которая функционирует в качестве секреторной последовательности для управления транспортом полипептида из клетки). Полипептид, содержащий лидерную последовательность, является препротеином, причем лидерная последовательность может отщепляться клетками-хозяевами с образованием зрелой формы полипептида.

В воплощениях полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для опухолеспецифичного неоантигенного пептида, которая слита в той же рамке считывания с последовательностью маркера, который способствует, к примеру, очистке кодируемого полипептида, который затем может быть включен в персонализованную вакцину или иммуногенную композицию против неоплазии. Например, маркерная последовательность может представлять собой гексагистидиновый тег, снабжаемый вектором pQE-9, который обеспечивает очистку зрелого полипептида, слитого с маркером, в случае бактериального хозяина, или же маркерная последовательность может представлять собой гемагглютининовый (HA) тег, полученный из белка гемагглютинина вируса гриппа, когда в качестве хозяина используются млекопитающие (например, клетки COS-7). Дополнительные теги включают, без ограничения, кальмодулиновые теги, FLAG-теги, Myc-теги, S-теги, теги SBP, Softag 1, Softag 3, тег V5, тег Xpress, Isopeptag, SpyTag, теги на основе Biotin Carboxyl Carrier Protein (BCCP), GST-теги, теги из флуоресцентных белков (например, теги из зеленого флуоресцентного белка), теги на основе связывающего мальтозу белка, Nus-теги, Strep-теги, тиоредоксиновые теги, TC-тег, Ty-тег и др.

В воплощениях полинуклеотиды могут содержать кодирующую последовательность для нескольких опухолеспецифичных неоантигенных пептидов, слитых в одной и той же рамке считывания, получая единую конструкцию для конкатамеризованных неоантигенных пептидов, способную вырабатывать несколько неоантигенных пептидов.

В некоторых воплощениях предусмотрены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% идентична полинуклеотиду, кодирующему опухолеспецифичный неоантигенный пептид настоящего изобретения.

Под полинуклеотидом, имеющем нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере, к примеру, на 95% “идентична” эталонной нуклеотидной последовательности, имеется в виду то, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична эталонной последовательности за исключением того, что последовательность полинуклеотида может включать вплоть до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной нуклеотидной последовательности. Иными словами, чтобы получить полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична эталонной нуклеотидной последовательности, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности можно удалить или заменить другими нуклеотидами либо вплоть до 5% от общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности можно вставить в эталонную последовательность. Эти мутации эталонной последовательности могут происходить в N- или C-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или где-нибудь между этими концевыми положениями, перемежаясь либо по отдельности среди нуклеотидов в эталонной последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в эталонной последовательности.

В практическом отношении то, что какая-то конкретная молекула нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, а в некоторых воплощениях по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична эталонной последовательности, можно определить традиционно с помощью известных компьютерных программ типа программы Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit использует алгоритм локальной гомологии по Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), чтобы найти наилучшие сегменты гомологии между двумя последовательностями. При использовании программы Bestfit или любой другой программы сопоставления последовательностей для определения того, что данная конкретная последовательность, к примеру, на 95% идентична эталонной последовательности по настоящему изобретению, параметры устанавливаются таким образом, чтобы степень идентичности вычислялась по всей длине эталонной нуклеотидной последовательности, а пробелы в гомологии составляли до 5% от общего числа нуклеотидов в эталонной последовательности.

Выделенные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды, описанные здесь, могут быть получены in vitro (например, в лаборатории) любым подходящим методом, известным в данной области. Такие методы варьируются от методов прямого синтеза белков до конструирования последовательности ДНК, кодирующей последовательности выделенных полипептидов, и экспрессирование этих последовательностей в подходящем трансформированном хозяине. В некоторых воплощениях последовательность ДНК конструируют по рекомбинантной технологии путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес белок дикого типа. Необязательно последовательность может быть подвергнута мутагенезу методом сайт-специфичного мутагенеза с получением её функциональных аналогов. Например, см. Zoeller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-5066 (1984) и патент США No. 4,588,585.

В воплощениях последовательность ДНК, кодирующая представляющий интерес полипептид, конструируется путем химического синтеза с использованием синтезатора олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды разрабатываются на основе аминокислотной последовательности требуемого полипептида, выбирая те кодоны, которые предпочтительны в клетках хозяина, в которых вырабатывается данный рекомбинантный полипептид. Для синтеза последовательности выделенного полинуклеотида, кодирующего данный выделенный полипептид, могут применяться стандартные методы. Например, можно использовать полную аминокислотную последовательность для конструирования гена по принципу обратной трансляции. Также можно синтезировать ДНК-олигомеры, содержащие последовательность нуклеотидов, кодирующую данный выделенный полипептид. Например, можно синтезировать, а затем лигировать несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части требуемого полипептида. Как правило, индивидуальные олигонуклеотиды содержат 5′- или 3′-выступы для комплементарной сборки.

После сборки (например, путем синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другим способом) последовательность полинуклеотидов, кодирующую данный конкретный выделенный полипептид, вставляют в экспрессирующий вектор и необязательно функционально связывают с контролирующей экспрессию последовательностью, подходящей для экспрессии белка в требуемом хозяине. Правильность сборки можно проверить путем секвенирования нуклеотидов, рестрикционного картирования и экспрессии биологически активного полипептида в подходящем хозяине. Как хорошо известно в данной области, для получения высокого уровня экспрессии трансфецированного гена у хозяина этот ген может быть функционально связан с контролирующими экспрессию последовательностями контроля транскрипции и трансляции, которые будут функциональными в выбранном для экспрессии организме.

Для амплификации и экспрессии ДНК, кодирующей опухолеспецифичные неоантигенные пептиды, можно использовать рекомбинантные экспрессирующие векторы. Рекомбинантные экспрессирующие векторы представляют собой реплицирующиеся конструкции из ДНК, которые содержат синтетические или полученные из кДНК фрагменты ДНК, кодирующие опухолеспецифичный неоантигенный пептид или биоэквивалентный аналог, функционально связанные с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами, происходящими из генов млекопитающих, микроорганизмов, вирусов или насекомых. Транскрипционный блок обычно содержит комплект из (1) генетического элемента или элементов, выполняющих регуляторную роль при экспрессии генов, к примеру, транскрипционных промоторов или энхансеров, (2) структурной или кодирующей последовательности, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок, и (3) соответствующих последовательностей инициации и терминации транскрипции и трансляции, как описано подробно здесь. Такие регуляторные элементы могут включать в себя последовательность оператора для контроля транскрипции. Также может быть включена способность к репликации в хозяине, которая обычно обеспечивается началом репликации, и ген по которому ведется отбор, облегчающий распознавание трансформантов. Участки ДНК являются функционально связанными, когда они функционально связаны друг с другом. Например, ДНК для сигнального пептида (лидера секреции) функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде предшественника, который участвует в секреции полипептида; промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию последовательности; а сайт связывания с рибосомой функционально связан с кодирующей последовательностью, если он располагается так, чтобы способствовать трансляции. Обычно функционально связанный означает прилегающий, а в случае лидера секреции означает непрерывный и в одной рамке считывания. Структурные элементы, предназначенные для дрожжевых систем экспрессии, включают лидерную последовательность, обеспечивающую внеклеточную секрецию транслируемого белка клетками хозяина. С другой стороны, если рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать N-концевой остаток метионина. Этот остаток необязательно может впоследствии отщепляться от экспрессируемого рекомбинантного белка с получением конечного продукта.

Подходящие экспрессирующие векторы для эукариотических хозяев, особенно млекопитающих или человека, включают, к примеру, векторы, содержащие контролирующие экспрессию последовательности из SV40, бычьего вируса папилломы, аденовирусов и цитомегаловирусов. Подходящие экспрессирующие векторы для бактериальных хозяев включают известные бактериальные плазмиды, как-то плазмиды из Escherichia coli, включая pCR1, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды для более широкого спектра хозяев типа M13 и одноцепочечные ДНК нитчатых фагов.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии полипептидов включают прокариот, дрожжевые, клетки насекомых или высших эукариот под контролем соответствующих промоторов. Прокариоты включают грамотрицательные или грамположительные организмы, к примеру, E. coli или бациллы. Клетки высших эукариот включают стабильные клеточные линии из млекопитающих. Также можно использовать бесклеточные системы трансляции. Соответствующие клонирующие и экспрессирующие векторы для бактериальных, грибковых, дрожжевых клеток хозяев и клеток млекопитающих хорошо известны в данной области (см. Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).

Для экспрессии рекомбинантных белков также предпочтительно применяются различные системы культивирования клеток млекопитающих или насекомых. Экспрессия рекомбинантных белков в клетках млекопитающих проводится потому, что такие белки обычно правильно укладываются, надлежащим образом модифицируются и полностью функциональны. Примеры подходящих линий клеток-хозяев из млекопитающих включают почечные клетки обезьян линии COS-7, описанные Gluzman (Cell 23: 175, 1981), и другие линии клеток, способные экспрессировать соответствующий вектор, включая, к примеру, L-клетки, клетки C127, 3T3, клетки яичников китайского хомячка (CHO), клетки линии 293, HeLa и BHK. Экспрессирующие векторы для млекопитающих могут включать нетранскрибируемые элементы типа точки начала репликации, подходящие промоторы и энхансеры, связанные с экспрессируемым геном, и другие 5′- или 3′-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, а также 5′- или 3′-нетранслируемые последовательности, как-то необходимые сайты связывания с рибосомами, сайты полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга и последовательности терминации транскрипции. Бакуловирусные системы для получения гетерологических белков в клетках насекомых рассмотрены в обзоре Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

Белки, вырабатываемые трансформированным хозяином, могут быть очищены в соответствии с любым подходящим методом. Такие стандартные методы включают хроматографию (например, ионообменную, афинную и эксклюзионную хроматографию и т.п.), центрифугирование, дифференциальную растворимость и любые другие стандартные методы очистки белков. К белку могут присоединяться афинные теги типа гексагистидина, связывающего мальтозу домена, белка оболочки вируса гриппа, глутатион-S-трансферазы и др., которые обеспечивают легкость очистки путем пропускания через соответствующую аффинную колонку. Выделенные белки также могут быть физически охарактеризованы такими методами, как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография.

Например, супернатанты из систем, секретирующих рекомбинантные белки в культуральную среду, можно сначала сконцентрировать с помощью коммерчески доступного фильтра для концентрирования белка, к примеру, ультрафильтрационной установки Amicon или Millipore Pellicon. После стадии концентрирования концентрат можно нанести на подходящий матрикс для очистки. С другой стороны, можно использовать анионообменную смолу, к примеру, матрикс или субстрат, содержащий боковые диэтиламиноэтильные (DEAE) группы. Матриксом может быть акриламид, агароза, декстран, целлюлоза или другие, которые обычно используются при очистке белков. С другой стороны, можно использовать катионообменную стадию. Подходящие катионообменники включают различные нерастворимые матриксы, содержащие сульфопропильные или карбоксиметильные группы. Наконец, можно использовать одну или несколько стадий обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) с использованием гидрофобной среды для RP-HPLC, например, силикагеля, содержащего боковые метильные или другие алифатические группы, для дальнейшей очистки композиции белка раковых стволовых клеток с Fc. Некоторые или все вышеуказанные стадии очистки в различных сочетаниях также можно использовать для получения гомогенного рекомбинантного белка.

Рекомбинантный белок, полученный в бактериальной культуре, можно выделить, к примеру, путем первоначальной экстракции из клеточного осадка, с последующим проведением одной или нескольких стадий концентрирования, высаливания, водного ионообмена или эксклюзионной хроматографии. Для конечных стадий очистки можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC). Клетки микроорганизмов, используемые для экспрессии рекомбинантного белка, можно разрушить любым удобным способом, включая замораживание-оттаивание, обработку ультразвуком, механическое разрушение или использование средств, лизирующих клетки.

Синтез пептидов/полипептидов in vivo

Настоящим изобретением также предусмотрено использование молекул нуклеиновых кислот в качестве носителей для доставки неоантигенных пептидов/полипептидов нуждающимся в этом субъектам in vivo, например, в виде ДНК/РНК-вакцин (например, см. WO 2012/159643 и WO 2012/159754, включенные сюда путем ссылки во всей полноте).

В одном воплощении неоантигены могут вводиться нуждающимся в этом пациентам при помощи плазмиды. Такие плазмиды обычно содержат сильный вирусный промотор, способствующий транскрипции и трансляции in vivo представляющего интерес гена (или комплементарной ДНК) (Mor et al., 1995, Journal of Immunology 155 (4): 2039-2046). Иногда может быть включен интрон A для улучшения стабильности мРНК и тем самым усиления экспрессии белка (Leitner et al., 1997, Journal of Immunology 159 (12): 6112-6119). Плазмиды также содержат сильный сигнал терминации полиаденилирования/транскрипции типа последовательности полиаденилирования бычьего гормона роста или бета-глобулина кролика (Alarcon et al., 1999, Advances in Parasitology 42: 343-410; Robinson et al., 2000, Advances in Virus Research 55: 1-74; Böhmet et al., 1996, Journal of Immunological Methods 193 (1): 29-40). Иногда конструируются полицистронные векторы для экспрессии более чем одного иммуногена или же для экспрессии иммуногена и иммуностимулирующего белка (Lewis et al., 1999, Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).

Поскольку плазмида является “носителем”, из которого экспрессируется иммуноген, то необходимо оптимизировать конструкцию вектора для максимальной экспрессии белка (Lewis et al., 1999, Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88). Одним из способов усиления экспрессии белка является оптимизация употребления кодонов у мРНК патогенов для эукариотических клеток. Другое соображение – выбор промотора. Таким промотором может быть промотор SV40 или вируса саркомы Рауса (RSV).

Плазмиды могут вводиться в ткани животных несколькими различными способами. Два наиболее популярных подхода – введение ДНК в физрастворе с помощью стандартного шприца с иглой и введение с помощью генной пушки. Схематическое изложение конструкции вакцинной ДНК-плазмиды и её последующей доставки этими двумя методами в организм хозяина приведено в Scientific American (Weiner et al., 1999, Scientific American 281 (1): 34-41). Инъекция в физрастворе обычно проводится внутримышечно (IM) в скелетные мышцы или внутрикожно (ID), при этом ДНК попадает во внеклеточное пространство. Это может сопровождаться электропорацией путем кратковременного повреждения мышечных волокон такими миотоксинами, как бупивакаин; или при помощи гипертонических растворов соли или сахарозы (Alarcon et al., 1999, Adv. Parasitol. 42: 343-410). На иммунные ответы при этот способе введения могут повлиять многие факторы, включая тип иглы, выравнивание иглы, скорость инъекции, объем инъекции, тип мышц и возраст, пол и физиологическое состояние получающего инъекцию животного (Alarcon et al., 1999, Advances in Parasitology 42: 343-410).

В другом широко используемом методе доставки – введении с помощью генной пушки – плазмидная ДНК (pDNA), которая адсорбирована на микрочастицах золота или вольфрама, баллистически разгоняется в клетки мишени с помощью сжатого гелия в качестве ускорителя (Alarcon et al., 1999, Advances in Parasitology 42: 343-410; Lewis et al., 1999, Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).

Альтернативные способы доставки могут включать аэрозольную инстилляцию (капельное введение) голой ДНК на слизистые поверхности типа слизистой оболочки носа и легких (Lewis et al., 1999, Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88) и местное введение pDNA в глаза и слизистые оболочки влагалища (Lewis et al., 1999, Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88). Доставка на слизистые поверхности также осуществляется с помощью препаратов ДНК в катионных липосомах, биоразлагаемых микросфер, векторов из аттенуированных Shigella или Listeria для перорального введения в слизистые кишечника и рекомбинантных аденовирусных векторов. ДНК или РНК также можно вводить в клетки после легкого механического разрушения клеточной мембраны, вызывающего временную пермеабилизацию клеток. Такое легкое механическое повреждение мембраны может осуществляться путем мягкого пропускания клеток через небольшое отверстие (Ex Vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, Sharei et al., PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0118803 April 13, 2015).

Способ доставки определяет дозу ДНК, необходимую для получения эффективного иммунного ответа. Для получения эффективного иммунного ответа при инъекции в физрастворе требуются различные количества ДНК от 10 мкг до 1 мг, тогда как при введении с помощью генной пушки требуется в 100-1000 раз меньше ДНК, чем при внутримышечной инъекции в физрастворе. Обычно требуется от 0,2 мкг до 20 мкг, хотя приводились и столь малые количества, как 16 нг. Эти величины варьируются от вида к виду, причем мышам, к примеру, требуется примерно в 10 раз меньше ДНК, чем приматам. Для инъекции в физрастворе требуется больше ДНК, так как ДНК попадает во внеклеточные пространства ткани-мишени (обычно мышцы), где она должна преодолевать физические барьеры (типа базальной пластинки и большого количества соединительной ткани, если упомянуть лишь некоторые) перед тем, как попадет в клетки, тогда как при введении с помощью генной пушки ДНК выстреливается прямо в клетки, что приводит к меньшим “потерям” (например, см.Sedegah et al., 1994, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91 (21): 9866-9870; Daheshiaet al., 1997, Journal of Immunology 159 (4): 1945-1952; Chen et al., 1998, Journal of Immunology 160 (5): 2425-2432; Sizemore, 1995, Science 270 (5234): 299-302; Fynan et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (24): 11478-82).

В одном воплощении вакцина или иммуногенная композиция против неоплазии может содержать отдельные ДНК-плазмиды, кодирующие, к примеру, один или несколько приведенных здесь неоантигенных пептидов/полипептидов по изобретению. Как уже обсуждалось, точный выбор экспрессирующих векторов может зависеть от того, какие пептиды/полипептиды должны экспрессироваться, что находится в компетенции рядовых специалистов. Предполагается, что ожидаемая персистенция ДНК-конструкций (например, в виде нереплицирующихся, неинтегрирующихся эписом в мышечных клетках) должна обеспечить повышенную продолжительность защиты.

Один или несколько неоантигенных пептидов по изобретению могут кодироваться и экспрессироваться in vivo с использованием системы на основе вируса (например, аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), поксвируса или лентивируса). В одном воплощении вакцина или иммуногенная композиция против неоплазии для нуждающихся в этом пациентов может включать в себя вектор на основе вируса, к примеру, типа аденовируса (например, см. Baden et al. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV-1 Env vaccine (IPCAVD 001). J Infect Dis. 2013 Jan 15, 207(2):240-7, включенную сюда путем ссылки во всей полноте). Плазмиды, которые можно использовать для доставки с помощью аденоассоциированных вирусов, аденовирусов и лентивирусов, были описаны ранее (например, см. Патент США Nos. 6,955,808 и 6,943,019, Патент США application No. 2008/0254008, включенные сюда путем ссылки).

Пептиды и полипептиды по изобретению также можно экспрессировать из вектора, например, молекулы нуклеиновой кислоты, как описано здесь, например, из РНК- или ДНК-плазмиды, вирусного вектора типа поксвируса, например, ортопоксвируса, авипоксвируса, либо аденовируса, AAV или лентивируса. Этот подход включает использование вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих пептиды изобретения. При введении в организм остро или хронически инфицированного хозяина либо неинфицированного хозяина вектор экспрессирует иммуногенный пептид и тем самым вызывает реакцию CTL у хозяина.

Среди векторов, которые можно использовать при осуществлении изобретения, встраивание в геном клеток хозяина возможно с помощью ретровирусных методов переноса генов, что часто приводит к долговременной экспрессии введенного трансгена. В предпочтительном воплощении ретровирус представляет собой лентивирус. Кроме того, наблюдалась высокая эффективность трансдукции во многих различных типах клеток и тканях-мишенях. Тропизм ретровируса можно изменить путем включения чужеродных белков оболочки, что расширяет потенциальную целевую популяцию клеток-мишеней. Ретровирус также можно спроектировать так, чтобы он обеспечивал обусловленную экспрессию введенного трансгена с тем, чтобы лишь определенные типы клеток инфицировались лентивирусом. Для наведения экспрессии на конкретные типы клеток можно использовать промоторы, специфичные к типу клеток. Лентивирусные векторы являются ретровирусными (поэтому при осуществлении изобретения можно использовать как лентивирусные, так и ретровирусные векторы). Более того, лентивирусные векторы предпочтительны, так как они способны трансдуцировать или инфицировать неделящиеся клетки и обычно дают высокие титры вируса. Поэтому выбор ретровирусной системы переноса генов может зависеть от ткани-мишени. Ретровирусные векторы содержат действующие в цис-положении длинные концевые повторы с упаковочной емкостью до 6-10 т.о. чужеродной последовательности. Для репликации и упаковки векторов достаточно минимального количества цис-действующих LTR, которые затем используются для встраивания требуемой нуклеиновой кислоты в клетки мишени и обеспечения постоянной экспрессии. Широко используемые ретровирусные векторы, которые можно использовать при осуществлении изобретения, включают векторы на основе вируса лейкемии мышей (MuLV), вируса лейкемии гиббонов (GaLV), вируса иммунодефицита обезьян (SIV), вируса иммунодефицита человека (HIV) и их комбинаций (например, см. Buchscher et al., 1992, J. Virol. 66: 2731-2739; Johann et al., 1992, J. Virol. 66: 1635-1640; Sommnerfelt et al., 1990, Virol. 176: 58-59; Wilson et al., 1998, J. Virol. 63: 2374-2378; Miller et al., 1991, J. Virol. 65: 2220-2224; PCT/US94/05700).

Также при осуществлении изобретения применимы минимальные лентивирусные векторы не приматов типа лентивирусных векторов на основе вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV) (например, см. Balagaan, 2006, J Gene Med., 8: 275-285, опубликовано online 21 ноября 2005 г. в Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Векторы могут содержать промотор цитомегаловируса (CMV), вызывающий экспрессию целевого гена. Соответственно, изобретением предусмотрены такие векторы, применимые при осуществлении изобретения: вирусные векторы, в том числе ретровирусные векторы и лентивирусные векторы.

Лентивирусные векторы были описаны при лечении болезни Паркинсона, например, см. патентная публикация США No. 2012/0295960 и патент США Nos. 7303910 и 7351585. Также были раскрыты лентивирусные векторы для доставки в головной мозг, например, см. патентные публикации США Nos. US20110293571, US20040013648, US20070025970, US20090111106 и патент США No. US7259015. В другом воплощении лентивирусные векторы применяются для доставки векторов в мозг пациентов, проходящих лечение от болезни.

В отношении лентивирусных векторных систем, применимых при осуществлении изобретения, отметим патенты США Nos. 6428953, 6165782, 6013516, 5994136, 6312682, 7,198,784 и приведенные в них документы.

В одном воплощении доставка осуществляется через лентивирус. Zou et al. вводили около 10 мкл рекомбинантного лентивируса с титром 1×10⁹ трансдуцирующих единиц (TU)/мл при помощи интратекального катетера. Такие дозировки можно адаптировать или экстраполировать для применения ретровирусных или лентивирусных векторов в настоящем изобретении. Для трансдукции в таких тканях, как мозг, необходимо использовать очень маленькие объемы, поэтому вирусный препарат концентрируют ультрацентрифугированием. Полученный препарат должен содержать по меньшей мере 10⁸ TU/мл, предпочтительно от 10⁸ до 10⁹ TU/мл, более предпочтительно по меньшей мере 10⁹ TU/мл. Можно использовать и другие методы концентрирования типа ультрафильтрации или связывания и элюирования из матрикса.

В других воплощениях количество вводимого лентивируса может составлять 1×10⁵ или около 1×10⁵ бляшкообразующих единиц (PFU), 5×10⁵ или около 5×10⁵ PFU, 1×10⁶ или около 1×10⁶ PFU, 5×10⁶ или около 5×10⁶ PFU, 1×10⁷ или около 1×10⁷ PFU, 5×10⁷ или около 5×10⁷ PFU, 1×10⁸ или около 1×10⁸ PFU, 5×10⁸ или около 5×10⁸ PFU, 1×10⁹ или около 1×10⁹ PFU, 5×10⁹ или около 5×10⁹ PFU, 1×10¹⁰ или около 1×10¹⁰ PFU либо 5×10¹⁰ или около 5×10¹⁰ PFU в виде общей разовой дозы для среднего человека весом 75 кг или с поправкой на вес, размер и биологический вид субъекта. Специалисты в данной области смогут определить подходящую дозировку. Подходящие дозы для вируса можно определить эмпирически.

Также при осуществлении изобретения применимы аденовирусные векторы. Одним из преимуществ является способность рекомбинантных аденовирусов эффективно переносить и экспрессировать рекомбинантные гены в различных клетках и тканях млекопитающих in vitro и in vivo, что приводит к высокой экспрессии переносимых нуклеиновых кислот. Кроме того, способность продуктивно инфицировать покоящиеся клетки расширяет полезность рекомбинантных аденовирусных векторов. А также высокие уровни экспрессии гарантируют, что продукты нуклеиновых кислот будут экспрессироваться на достаточном уровне для выработки иммунного ответа (например, см. патент США No. 7,029,848, включенный сюда путем ссылки).

В отношении аденовирусных векторов, применимых при осуществлении изобретения, отметим патент США No. 6,955,808. Используемый аденовирусный вектор можно выбрать из группы, состоящей из векторов Ad5, Ad35, Ad11, C6 и C7. Опубликована последовательность генома аденовируса 5 (“Ad5”) (Chroboczek, J., Bieber, F. and Jacrot, B. (1992) The sequence of the genome of adenovirus type 5 and its comparison with the genome of adenovirus type 2. Virology 186, 280-285; содержание которой включено сюда путем ссылки). Векторы Ad35 описаны в патентах США Nos. 6,974,695, 6,913,922 и 6,869,794. Векторы Ad11 описаны в патенте США No. 6,913,922. Аденовирусные векторы C6 описаны в патентах США Nos. 6,780,407; 6537594; 6309647; 6265189; 6156567; 6090393; 5,942,235 и 5,833,975. Векторы С7 описаны в патенте США No. 6,277,558. Также можно использовать аденовирусные векторы с дефектным или удаленным E1, дефектным или удаленным E3 и/или дефектным или удаленным E4. Некоторые аденовирусы с мутациями в районе E1 обладают большим пределом безопасности, поскольку мутанты аденовируса с дефектным E1 дефектны по репликации в непермиссивных клетках или, по крайней мере, сильно аттенуированы. Аденовирусы с мутациями в районе Е3 могут обладать повышенной иммуногенностью из-за нарушения механизма, по которому аденовирус подавляет экспрессию молекул MHC класса I. Аденовирусы с мутациями в районе E4 могут обладать пониженной иммуногенностью у аденовирусных векторов вследствие подавления экспрессии поздних генов. Такие векторы могут быть особенно полезными тогда, когда требуется повторная вакцинация с использованием того же самого вектора. В настоящем изобретении можно использовать аденовирусные векторы с удаленными или мутантными областями E1, E3 и E4, E1 и E3 или E1 и E4. Кроме того, в настоящем изобретении также можно использовать и “выпотрошенные” аденовирусные векторы, у которых удалены все вирусные гены. Таким векторам для репликации требуется вспомогательный вирус и нужна специальная линия клеток 293 человека, экспрессирующих как E1a, так и Cre, чего не бывает в естественной обстановке. Такие “выпотрошенные” векторы неиммуногенны, поэтому эти векторы можно вводить многократно для повторной вакцинации. “Выпотрошенные” аденовирусные векторы можно использовать для введения гетерологичных вставок/генов типа трансгенов настоящего изобретения и даже для совместного введения большого числа гетерологичных вставок/генов.

В одном воплощении доставка осуществляется через аденовирус, который может составлять одну бустерную дозу, содержащую по меньшей мере 1×10⁵ частиц (что также именуется корпускулярной единицей, pu) аденовирусного вектора. В одном воплощении доза предпочтительно составляет по меньшей мере 1×10⁶ частиц (к примеру, от 1×10⁶ до 1×10¹² частиц), более предпочтительно по меньшей мере 1×10⁷ частиц, более предпочтительно по меньшей мере 1×10⁸ частиц (например, от 1×10⁸ до 1×10¹¹ или от 1×10⁸ до 1×10¹² частиц) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 1×10⁹ частиц (например, от 1×10⁹ до 1×10¹⁰ или от 1×10⁹ до 1×10¹² частиц) или даже по меньшей мере 1×10¹⁰ частиц (например, от 1×10¹⁰ до 1×10¹² частиц) аденовирусного вектора. С другой стороны, доза составляет не более 1×10¹⁴ частиц, предпочтительно не более 1×10¹³ частиц, еще более предпочтительно не более 1×10¹² частиц, еще более предпочтительно не более 1×10¹¹ частиц и наиболее предпочтительно не более 1×10¹⁰ частиц (например, не более 1×10⁹ частиц). Так, доза может содержать однократную дозу аденовирусного вектора, к примеру, около 1×10⁶ корпускулярных единиц (pu), около 2×10⁶ pu, около 4×10⁶ pu, около 1×10⁷ pu, около 2×10⁷ pu, около 4×10⁷ pu, около 1×10⁸ pu, около 2×10⁸ pu, около 4×10⁸ pu, около 1×10⁹ pu, около 2×10⁹ pu, около 4×10⁹ pu, около 1×10¹⁰ pu, около 2×10¹⁰ pu, около 4×10¹⁰ pu, около 1×10¹¹ pu, около 2×10¹¹ pu, около 4×10¹¹ pu, около 1×10¹² pu, около 2×10¹² pu или около 4×10¹² pu аденовирусного вектора. Например, см. аденовирусные векторы в Патент США No. 8,454,972 B2 на Nabel et al., выданном 4 июня 2013 г., который включен сюда путем ссылки, с дозировками в столбце 29, строки 36-58. В одном воплощении аденовирус вводится в виде нескольких доз.

В отношении доставки in vivo AAV предпочтительны перед другими вирусными векторами из-за низкой токсичности и низкой вероятности возникновения инсерционного мутагенеза, так как они не встраиваются в геном хозяина. AAV имеет предел упаковки в 4,5 или 4,75 т.о. Конструкции размером более 4,5 или 4,75 т.о. приводят к значительному снижению продукции вируса. Существует много промоторов, которые можно использовать для запуска экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Промотором может служить ITR AAV, который выгоден тем, что устраняет потребность в дополнительном промоторном элементе. Для повсеместной экспрессии можно использовать следующие промоторы: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, тяжелых или легких цепей ферритина и др. Для экспрессии в мозге можно использовать следующие промоторы: синапсина I для всех нейронов, CaMKIIalpha для возбуждающих нейронов, GAD67 или GAD65 или VGAT для ГАМКергических нейронов и т.д. Промоторы, используемые для запуска синтеза РНК, могут включать: промоторы Pol III типа U6 или H1. Промоторы Pol II и интронные кассеты можно использовать для экспрессии гидовой РНК (gRNA).

В отношении векторов AAV, применимых при осуществлении изобретения, отметим патенты США. 5658785, 7115391, 7172893, 6953690, 6936466, 6924128, 6893865, 6793926, 6537540, 6475769 и 6258595 и приведенные в них документы.

Что касается AAV, то AAV может быть представлен AAV1, AAV2, AAV5 или любой комбинацией из них. Можно выбрать AAV в отношении намеченных клеток; например, можно выбрать серотипы AAV 1, 2, 5 или гибридные капсиды AAV1, AAV2, AAV5 или любые их комбинации для наведения на клетки мозга или нейронов; и можно выбрать AAV4 для наведения на ткани сердца. AAV8 применим для доставки в печень. Указанные выше промоторы и векторы являются предпочтительными индивидуально.

В одном воплощении доставка осуществляется через AAV. Терапевтически эффективная доза для доставки AAV в организм человека in vivo составляет от 20 до 50 мл солевого раствора, содержащего от 1×10¹⁰ до 1×10⁵⁰ функциональных частиц AAV/мл. Дозировка может корректироваться так, чтобы сбалансировать терапевтическое преимущество против каких-либо побочных эффектов. В одном воплощении доза AAV обычно составляет от 1×10⁵ до 1×10⁵⁰ геномов AAV, от 1×10⁸ до 1×10²⁰ геномов AAV, от 1×10¹⁰ до 1×10¹⁶ геномов или от 1×10¹¹ до 1×10¹⁶ геномов AAV. Дозировка для человека может составлять около 1×10¹³ геномов AAV. Такие дозы могут вводиться в объеме от 0,001 мл до 100 мл, от 0,05 до 50 мл или от 10 до 25 мл раствора носителя. В предпочтительном воплощении AAV применяется с титром около 2×10¹³ вирусных геномов на мл, а полосатое тело каждого полушария мыши получает одну инъекцию в 500 нанолитров. Рядовые специалисты в данной области могут легко установить и другие эффективные дозы с помощью стандартных проб и составления кривых зависимости от дозы. Например, см. патент США No. 8,404,658 B2 на Hajjar et al., выданный 26 марта 2013 г., в столбце 27, строки 45-60.

В другом воплощении эффективная активация клеточного иммунного ответа на вакцины или иммуногенные композиции против неоплазии может осуществляться путем экспрессии соответствующих неоантигенов из вакцины или иммуногенной композиции в непатогенном микроорганизме. Хорошо известные примеры таких микроорганизмов – Mycobacterium bovis BCG, Salmonella и Pseudomonas (см. патент США No. 6,991,797, включенный сюда путем ссылки во всей полноте).

В другом воплощении в вакцинах или иммуногенных композициях против неоплазии используются поксвирусы. К ним относятся ортопоксвирусы, авипоксвирусы, вирус осповакцины, MVA, NYVAC, поксвирус канарейки, ALVAC, поксвирус дикой птицы, TROVAC и др. (например, см. Verardi et al., Hum Vaccin Immunother. 2012 Jul, 8(7): 961-70; и Moss, Vaccine 2013, 31(39): 4220-4222). Экспрессирующие векторы на основе поксвирусов были описаны в 1982 г. и скоро стали широко применяться для разработки вакцин, а также для исследований во многих областях. Преимущества этих векторов включают простоту конструкции, способность вмещать большое количество чужеродной ДНК и высокий уровень экспрессии.

Информация касательно поксвирусов, которые можно использовать при осуществлении изобретения, как-то поксвирусов подсемейства Chordopoxvirinae (поксвирусов позвоночных), к примеру, ортопоксвирусов и авипоксвирусов, например, вируса осповакцины (например, штамма Wyeth, штамма WR типа ATCC^® VR-1354, штамма Copenhagen, NYVAC, NYVAC.1, NYVAC.2, MVA, MVA-BN), поксвируса канарейки (например, штамма Wheatley C93, ALVAC), поксвируса дикой птицы (например, штамма FP9, штамма Webster, TROVAC), поксвируса голубей, диких голубей, перепелов и енота, среди прочего, их синтетических или не встречающихся в природе рекомбинантов, их применения и способов получения и применения таких рекомбинантов приведена в научной и патентной литературе, как-то:

патенты США Nos. 4,603,112, 4,769,330, 5,110,587, 5,174,993, 5,364,773, 5,762,938, 5,494,807, 5,766,597, 7,767,449, 6,780,407, 6,537,594, 6,265,189, 6,214,353, 6,130,066, 6,004,777, 5,990,091, 5,942,235, 5,833,975, 5,766,597, 5,756,101, 7,045,313, 6,780,417, 8,470,598, 8,372,622, 8,268,329, 8,268,325, 8,236,560, 8,163,293, 7,964,398, 7,964,396, 7,964,395, 7,939,086, 7,923,017, 7,897,156, 7,892,533, 7,628,980, 7,459,270, 7,445,924, 7,384,644, 7,335,364, 7,189,536, 7,097,842, 6,913,752, 6,761,893, 6,682,743, 5,770,212, 5,766,882 и 5,989,562, а также

Panicali D. Proc. Natl. Acad. Sci. 1982, 79: 4927-493; Panicali D. Proc. Natl. Acad. Sci. 1983, 80(17): 5364-8; Mackett M. Proc. Natl. Acad. Sci. 1982, 79:7415-7419; Smith GL. Proc. Natl. Acad. Sci. 1983, 80(23): 7155-9; Smith GL. Nature 1983, 302:490-5; Sullivan VJ. Gen. Vir. 1987, 68: 2587-98; Perkus M. Journal of Leukocyte Biology 1995, 58:1-13; Yilma TD. Vaccine 1989, 7: 484-485; Brochier B. Nature 1991, 354: 520-22; Wiktor TJ. Proc. Natl Acad. Sci. 1984, 81:7194-8; Rupprecht CE. Proc. Natl Acad. Sci. 1986, 83:7947-50; Poulet H. Vaccine 2007, 25(Jul): 5606-12; Weyer J. Vaccine 2009, 27(Nov): 7198-201; Buller RM. Nature 1985, 317(6040): 813-5; Buller RM. J. Virol. 1988, 62(3):866-74; Flexner C. Nature 1987, 330(6145): 259-62; Shida H. J. Virol. 1988, 62(12): 4474-80; Kotwal GJ. J. Virol. 1989; 63(2): 600-6; Child SJ. Virology 1990, 174(2): 625-9; Mayr A. Zentralbl Bakteriol. 1978, 167(5,6): 375-9; Antoine G. Virology 1998, 244(2): 365-96; Wyatt LS. Virology 1998, 251(2): 334-42; Sancho MC. J. Virol. 2002, 76(16): 8313-34; Gallego-Gomez JC. J. Virol. 2003, 77(19): 10606-22; Goebel SJ. Virology 1990, 179(a,b): 247-66; Tartaglia, J. Virol. 1992, 188(1): 217-32; Najera JL. J. Virol. 2006, 80(12): 6033-47; Najera JL. J. Virol. 2006, 80: 6033-6047; Gomez CE. J. Gen. Virol. 2007, 88:2473-78; Mooij P. Jour. of Virol. 2008, 82: 2975-2988; Gomez CE. Curr. Gene Ther. 2011, 11: 189-217; CoxW. Virology 1993, 195: 845-50; Perkus M. Jour. of Leukocyte Biology 1995, 58: 1-13; Blanchard TJ. J Gen Virology 1998, 79(5): 1159-67; Amara R. Science 2001, 292:69-74; Hel Z., J. Immunol. 2001, 167: 7180-9; Gherardi MM. J. Virol. 2003, 77: 7048-57; Didierlaurent A. Vaccine 2004, 22: 3395-3403; Bissht H. Proc. Nat. Acad. Sci. 2004, 101: 6641-46; McCurdy LH. Clin. Inf. Dis. 2004, 38:1749-53; Earl PL. Nature 2004, 428:182-85; Chen Z. J. Virol. 2005, 79: 2678-2688; Najera JL. J. Virol. 2006, 80(12): 6033-47; Nam JH. Acta. Virol. 2007, 51:125-30; Antonis AF. Vaccine 2007, 25: 4818-4827B; Weyer J. Vaccine 2007, 25: 4213-22; Ferrier-Rembert A. Vaccine 2008, 26(14): 1794-804; Corbett M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008, 105(6): 2046-51; Kaufman HL. J. Clin. Oncol. 2004, 22:2122-32; Amato, RJ. Clin. Cancer Res. 2008, 14(22): 7504-10; Dreicer R. Invest New Drugs 2009, 27(4): 379-86; Kantoff PW. J. Clin. Oncol. 2010, 28, 1099-1105; Amato RJ. J. Clin. Can. Res. 2010, 16(22): 5539-47; Kim DW. Hum. Vaccine 2010, 6:784-791; Oudard S. Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60:261-71; Wyatt LS. AIDS Res. Hum. Retroviruses 2004, 20:645-53; Gomez CE. Virus Research 2004, 105:11-22; Webster DP. Proc. Natl. Acad. Sci. 2005, 102: 4836-4; Huang X. Vaccine 2007, 25: 8874-84; Gomez CE. Vaccine 2007a, 25: 2863-85; Esteban M. Hum. Vaccine 2009, 5:867-871; Gomez CE. Curr. Gene Therapy 2008, 8(2): 97-120; Whelan KT. Plos one 2009, 4(6): 5934; Scriba TJ. Eur. Jour. Immunol. 2010, 40(1): 279-90; Corbett M. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008, 105: 2046-2051; Midgley CM. J. Gen. Virol. 2008, 89: 2992-97; Von Krempelhuber A. Vaccine 2010, 28: 1209-16; Perreau M. J. of Virol. 2011, Oct: 9854-62; Pantaleo G. Curr Opin HIV-AIDS 2010, 5:391-396;

каждая из которых включена сюда путем ссылки.

В другом воплощении в вакцинах или иммуногенных композициях против неоплазии для экспрессии неоантигена используется вирус осповакцины (Rolph et al., Recombinant viruses as vaccines and immunological tools. Curr Opin Immunol 9:517-524, 1997). Рекомбинантный вирус осповакцины способен реплицироваться в цитоплазме инфицированных клеток хозяина, поэтому представляющий интерес полипептид может индуцировать иммунный ответ. Более того, поксвирусы широко применялись в качестве векторов для вакцин или иммуногенных композиций вследствие их способности направлять кодируемые антигены на процессинг в путь главного комплекса гистосовместимости I типа путем непосредственного инфицирования иммунных клеток, в частности антиген-презентирующих клеток, а также из-за их способности самим служить адъювантами.

В другом воплощении в вакцинах или иммуногенных композициях против неоплазии в качестве вектора используется ALVAC. ALVAC – это поксвирус канарейки, который можно модифицировать для экспрессии чужеродных трансгенов и использовался в качестве метода вакцинации против прокариотических и эукариотических антигенов (Horig H, Lee DS, Conkright W, et al. Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule. Cancer Immunol Immunother 2000, 49:504-14; von Mehren M, Arlen P, Tsang KY, et al. Pilot study of a dual gene recombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen (CEA) and B7.1 transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas. Clin Cancer Res 2000, 6:2219-28; Musey L, Ding Y, Elizaga M, et al. HIV-1 vaccination administered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cell immunity in HIV-1-uninfected individuals. J Immunol 2003, 171:1094-101; Paoletti E. Applications of pox virus vectors to vaccination: an update. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93:11349-53; патент США No. 7,255,862). На фазе I клинических испытанийвирус ALVAC, экспрессирующий опухолевый антиген CEA, проявлял отличный профиль безопасности и приводил к усилению СЕА-специфичных Т-клеточных ответов у отдельных пациентов; однако не отмечались объективные клинические реакции (Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY, et al. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen. J Clin Oncol 1999, 17:332-7).

В другом воплощении в качестве вирусного вектора для неоантигенной вакцины или иммуногенной композиции может использоваться модифицированный вирус осповакцины Ankara (MVA). MVA является представителем семейства ортопоксвирусов и был получен в результате около 570 последовательных пассажей вируса осповакцины штамма Ankara (CVA) на фибробластах куриных эмбрионов (см. обзор Mayr A. et al., Infection 3, 6-14, 1975). В результате этих пассажей полученный вирус MVA содержит на 31 т.о. меньше геномной информации, чем CVA, и сильно ограничен в спектре возможных клеток-хозяев хозяина (Meyer H. et al., J. Gen. Virol., 72, 1031-1038, 1991). MVA отличается чрезвычайной ослабленностью, то есть снижением вирулентности или инфицирующей способности, но при этом обладает отличной иммуногенностью. При тестировании на различных животных моделях MVA оказался авирулентным, даже у особей с иммуносупрессией. Кроме того, MVA-BN^®-HER2 является кандидатом для иммунотерапии, предназначенной для лечения HER-2-положительного рака молочной железы и сейчас проходит клинические испытания (Mandl et al., Cancer Immunol Immunother. Jan 2012, 61 (1):19-29). Описаны способы получения и применения рекомбинантных MVA (например, см. патенты США Nos. 8,309,098 и 5,185,146, включенные сюда во всей полноте).

В другом воплощении в качестве вектора используется модифицированный штамм Copenhagen вируса осповакцины – NYVAC, а также варианты NYVAC (см. патент США No. 7,255,862; PCT WO 95/30018; патент США Nos. 5,364,773 и 5,494,807; которые включены сюда путем ссылки во всей полноте).

В одном воплощении нуждающимся в этом пациентам вводятся рекомбинантные вирусные частицы вакцины или иммуногенной композиции. Дозировка экспрессируемого неоантигена может составлять от нескольких до нескольких сотен микрограмм, например, от 5 до 500 мкг. Для достижения экспрессии на уровне этих доз вакцину или иммуногенную композицию можно вводить в любом подходящем количестве. Вирусные частицы можно вводить нуждающимся в этом пациентам или трансфецировать в клетки в количестве по меньшей мере 10^3,5 бляшкообразующих единиц (pfu); при этом вирусные частицы предпочтительно вводят нуждающимся в этом пациентам либо инфицируют или трансфецируют в клетки в дозе от 10⁴ pfu до 10⁶ pfu; однако нуждающимся в этом пациентам можно вводить как минимум 10⁸ pfu с тем, что более предпочтительное количество для введения может составлять от 10⁷ pfu до 10⁹ pfu. Дозы применительно к NYVAC применимы и в отношении ALVAC, MVA, MVA-BN и таких авипоксвирусов, как поксвирус канарейки и поксвирус дикой птицы.

Адъюванты вакцин или иммуногенных композиций

Эффективные вакцины или иммуногенные композиции преимущественно содержат сильный адъювант для запуска иммунного ответа. Как описано здесь, поли-ICLC, агонист TLR3 и доменов MDA5 и RIG3 РНК-геликазы, проявляет некоторые желательные для адъюванта вакцины или иммуногенной композиции свойств. Эти свойства включают индукцию локальной и системной активации иммунных клеток in vivo, выработку стимулирующих хемокинов и цитокинов и стимуляцию презентации антигена клетками DC. Кроме того, поли-ICLC может индуцировать долговременные реакции CD4+ и CD8+ у людей. Важно отметить, что наблюдалось поразительное сходство в повышающей регуляции транскрипции и путей передачи сигналов у субъектов, вакцинированных поли-ICLC, и добровольцев, получавших высокоэффективную, репликационно-компетентную вакцину против желтой лихорадки. Кроме того, >90% пациентов с карциномой яичников, иммунизированных поли-ICLC в сочетании с пептидной вакциной NY-ESO-1 (вместе с Montanide), проявляли индукцию T-клеток CD4+ и CD8+, а также антительные ответы на пептид в недавнем исследовании фазы 1. В то же время поли-ICLC проходил широкое тестирование более чем в 25 клинических испытаниях на сегодняшний день и проявлял сравнительно доброкачественный профиль токсичности. Наряду с сильными и специфическими иммуногенами, неоантигенные пептиды можно комбинировать с адъювантами (например, поли-ICLC) или другими противораковыми средствами. Не придерживаясь какой-либо теории, предполагается, что эти неоантигены обходят центральную толерантность в тимусе (что способствует усилению противоопухолевой реакции Т-клеток), одновременно снижая возможность аутоиммунитета (например, избегая таргетинга нормальных аутоантигенов). Эффективный иммунный ответ преимущественно включает сильный адъювант для активации иммунной системы (Speiser and Romero. Molecularly defined vaccines for cancer immunotherapy and protective T cell immunity. Seminars in Immunol. 22:144 (2010)). Например, Toll-подобные рецепторы (TLR) оказались мощными сенсорами “сигналов об опасности” у микробных и вирусных патогенов, эффективно индуцируя врожденный иммунитет и, в свою очередь, приобретенный иммунитет (Bhardwaj and Gnjatic, TLR Agonists: Are They Good Adjuvants? Cancer J. 16: 382-391 (2010)). Среди агонистов TLR одним из наиболее мощных активаторов дендритных клеток миелоидного происхождения является поли-ICLC (синтетическаий миметик двухцепочечной РНК). В исследовании на добровольцах было показано, что поли-ICLC безопасен и индуцирует профиль экспрессии генов в клетках периферической крови, сопоставимый с тем, который индуцируется одной из самых сильных живых аттенуированных вирусных вакцин – вакциной YF-17D против желтой лихорадки (Caskey et al. Synthetic double-stranded RNA induces innate immune responses similar to a live viral vaccine in humans. J Exp Med 208:2357 (2011)). В предпочтительном воплощении в качестве адъюванта используется Hiltonol^®, GMP-препарат поли-ICLC фирмы Oncovir, Inc. В других воплощениях предусмотрены и другие адъюванты, описанные здесь. Например, типа масло-в-воде, вода-в-масле или многофазные вода/масло/вода; например, см. US 7608,279; и Aucouturier et al., Vaccine 19 (2001), 2666-2672; и приведенные в них документы.

Показания к применению

Примеры раковых заболеваний, которые можно лечить способом терапии настоящего изобретения, включают, без ограничения, таких нуждающихся в этом пациентов, которым был поставлен диагноз рака или которые подвержены риску возникновения рака. У них могут быть твердые опухоли типа рака молочной железы, яичников, простаты, легких, почек, желудка, толстой кишки, яичек, головы и шеи, поджелудочной железы, головного мозга, меланомы и другие опухоли тканей и органов, и гематологические опухоли типа лимфомы и лейкемии, в том числе острая миелогенная лейкемия, хроническая миелогенная лейкемия, хроническая лимфоцитарная лейкемия, Т-лимфоцитарная лейкемия и B-клеточная лимфома, опухоли головного мозга и центральной нервной системы (например, опухоли мозговых оболочек, мозга, спинного мозга, черепных нервов и других частей ЦНС типа глиобластомы или медуллярной бластомы); рак головы и/или шеи, опухоли молочной железы, опухоли системы кровообращения (например, сердца, средостения и плевры других органов грудной клетки, опухоли сосудов и связанной с опухолью сосудистой ткани); опухоли крови и лимфатической системы (например, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, связанные со СПИДом лимфомы, злокачественные иммунопролиферативные заболевания, множественная миелома и злокачественные новообразования плазматических клеток, лимфоидная лейкемия, миелоидная лейкемия, острая или хроническая лимфоцитарная лейкемия, моноцитарная лейкемия, другие лейкемии определенных типов клеток, лейкемия неопределенного типа клеток, неопределенные злокачественные новообразования лимфоидной, кроветворной и родственных тканей типа диффузной крупноклеточной лимфомы, Т-клеточной лимфомы или кожной Т-клеточной лимфомы); опухоли выделительной системы (например, почек, почечной лоханки, мочеточников, мочевого пузыря и других органов мочевыделения); опухоли желудочно-кишечного тракта (например, пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстой кишки, колоректальные, ректосигмовидного отдела, прямой кишки, ануса и анального канала); опухоли, затрагивающие печень и внутрипеченочные желчные протоки, желчный пузырь и другие части желчных протоков, поджелудочную железу и другие пищеварительные органы; опухоли ротовой полости (например, губ, языка, десен, дна полости рта, неба, околоушных желез, слюнных желез, миндалин, ротоглотки, носоглотки, пуринозного синуса, подглоточника и других участков полости рта); опухоли репродуктивной системы (например, вульвы, влагалища, шейки матки, матки, яичников и других участков, связанных с женскими половыми органами, плаценты, пениса, простаты, яичек и других участков, связанных с мужскими половыми органами); опухоли дыхательных путей (например, полости носа, среднего уха, придаточных пазух, гортани, трахеи, бронхов и легких типа мелкоклеточного рака легких и немелкоклеточного рака легких); опухоли скелетной системы (например, костей и суставных хрящей конечностей, костно-суставных хрящей и других участков); опухоли кожи (например, злокачественная меланома кожи, безмеланомный рак кожи, базально-клеточная карцинома кожи, плоскоклеточная карцинома кожи, мезотелиома, саркома Капоши); и опухоли, затрагивающие другие ткани, включая периферические нервы и вегетативную нервную систему, соединительные и мягкие ткани, забрюшинное пространство и брюшину, глаза, щитовидную железу, надпочечники, другие эндокринные железы и связанные с ними структуры, вторичные и неопределенные злокачественные новообразования лимфатических узлов, вторичные злокачественные новообразования респираторной и пищеварительной системы и вторичные злокачественные новообразования других участков. Таким образом, описанная здесь популяция субъектов может страдать одним из вышеприведенных типов рака. В других воплощениях популяцию субъектов могут составлять все субъекты, страдающие от солидных опухолей, или все субъекты, страдающие от опухолей жидких тканей.

Особый интерес представляет лечение неходжкинской лимфомы (NHL), светлоклеточной почечно-клеточной карциномы (ccRCC), метастатической меланомы, саркомы, лейкемии или рака мочевого пузыря, толстой кишки, головного мозга, молочной железы, головы и шеи, эндометрия, легких, яичников, поджелудочной железы или простаты. В некоторых воплощениях меланома представлена меланомой повышенного риска.

Раковые заболевания, которые можно лечить с помощью описанной здесь терапии, могут включать, среди прочего, случаи, которые не поддаются лечению другими химиотерапевтическими средствами. Термин “рефрактерный” в настоящем изобретении относится к такому раку (и/или метастазам), который не проявляет или проявляет лишь слабый антипролиферативный ответ (например, отсутствие или лишь слабое томожение роста опухоли) после лечения другим химиотерапевтическим средством. Это такие раковые заболевания, которые невозможно удовлетворительно лечить другими химиотерапевтическими средствами. Рефрактерный рак охватывает не только такие (i) раковые заболевания, при которых одно или несколько химиотерапевтических средств уже не сработали при лечении пациентов, но и такие (ii) раковые заболевания, которые могут быть установлены как рефрактерные другими способами, например, биопсией и культивированием в присутствии химиотерапевтических средств.

Описанная здесь терапия также применима для лечения таких нуждающихся в этом пациентов, которые ранее не подвергались лечению.

Описанная здесь терапия также применима тогда, когда у субъекта не выявляется неоплазия, но он подвержен высокому риску рецидива заболевания.

Также особый интерес представляет лечение таких нуждающихся в этом пациентов, которые подвергались аутологической трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (AHSCT), в частности, таких пациентов, у которых проявляется остаточное заболевание после прохождения AHSCT. Ситуация после AHSCT характеризуется низким объемом остаточного заболевания, инфузией иммунных клеток до состояния гомеостатической экспансии и отсутствием какой-либо стандартной терапии, замедляющей рецидивы. Эти особенности дают уникальную возможность использовать заявленные вакцины или иммуногенные композиции против неоплазии для замедления рецидива заболевания.

Фармацевтические композиции/Способы доставки

Настоящее изобретение также касается фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество одного или нескольких неоантигенных пептидов, как описано здесь (включая их фармацевтически приемлемые соли), необязательно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или добавкой.

При введении в виде комбинации терапевтические средства (то есть неоантигенные пептиды) могут быть составлены в виде отдельных композиций, которые вводятся в одно и то же время или в разное время, или же терапевтические средства могут вводиться в виде единой композиции.

Композиции можно вводить раз в день, два раза в день, раз в два дня, раз в три дня, раз в четыре дня, раз в пять дней, раз в шесть дней, раз в семь дней, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели, раз в два месяца, раз в шесть месяцев или один раз в год. Интервал дозирования можно регулировать в соответствии с потребностями отдельных пациентов. Для более длительных интервалов введения можно использовать препараты с пролонгированным высвобождением или типа депо.

Композиции по изобретению можно использовать для лечения таких заболеваний, которые являются острыми, а также для лечения хронических заболеваний. В частности, композиции по изобретению применяются в способах лечения или профилактики неоплазии. В некоторых воплощениях соединения по изобретению вводятся на протяжении времени, превышающего две недели, три недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, один год, два года, три года, четыре года или пять лет, десять лет или пятнадцать лет; или, к примеру, на протяжении стольких дней, месяцев или лет, в которых нижний предел диапазона составляет любой период времени от 14 дней до 15 лет, а верхний предел диапазона составляет от 15 дней до 20 лет (например, от 4 недель до 15 лет, от 6 месяцев до 20 лет). В некоторых случаях может быть выгодным вводить соединения по изобретению в течение всей оставшейся части жизни пациента. В предпочтительном воплощении пациента обследуют для проверки течения заболевания или состояния и корректируют дозу соответствующим образом. В предпочтительных воплощениях лечение согласно изобретению осуществляется в течение по меньшей мере двух недель, трех недель, одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, одного года, двух лет, трех лет, четырех лет или пяти лет, десяти лет, пятнадцати лет, двадцати лет или всю оставшуюся часть жизни субъекта.

При хирургической резекции применяется оперативной вмешательство для удаления аномальной ткани при раке типа медиастинальных, нейрогенных или половоклеточных опухолей либо при тимоме. В некоторых воплощениях введение композиции начинают после резекции опухоли. В других воплощениях введение вакцинной или иммуногенной композиции против неоплазии начинают через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше недель после резекции опухоли. Предпочтительно введение вакцины или иммуногенной композиции против неоплазии начинают через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель после резекции опухоли.

Схемы вакцинации типа прайм/буст означают последовательное введение вакцинных либо иммуногенных или иммунологических композиций. В некоторых воплощениях введение вакцинной или иммуногенной композиции против неоплазии проводится в режиме прайм/буст вакцинации, например, введение вакцинной или иммуногенной композиции против неоплазии в 1, 2, 3 или 4-ю неделю в качестве прайма и введение вакцинной или иммуногенной композиции против неоплазии во 2, 3 или 4-й месяц в качестве буста. В другом воплощении применяются гетерологические стратегии прайм-буст, чтобы получить больший цитотоксический Т-клеточный ответ (см. Schneider et al. Induction of CD8+ T cells using heterologous prime-boost immunisation strategies. Immunological Reviews Volume 170, Issue 1, pages 29-38, August 1999). В другом воплощении для прайм вакцинации используется ДНК, кодирующая неоантигены, а для буст – белок. В другом воплощении для прайм вакцинации используется белок, а для буст – вирус, кодирующий неоантиген. В другом воплощении для прайм вакцинации используется вирус, кодирующий неоантиген, а для буст – другой вирус. В другом воплощении для прайм вакцинации используется белок, а для буст – ДНК. В предпочтительном воплощении для примирования Т-клеточного ответа используется вакцинная или иммуногенная композиция из ДНК, а для рестимулирования – рекомбинантная вирусная вакцинная или иммуногенная композиция. В другом предпочтительном воплощении вирусная вакцина или иммуногенная композиция вводится вместе с белковой или ДНК-вакциной или иммуногенной композицией, действуя в качестве адъюванта для белковой или ДНК-вакцины или иммуногенной композиции. Затем пациент подвергается стимулированию с помощью вирусной вакцины или иммуногенной композиции либо белковой или ДНК-вакцины или иммуногенной композиции (см. Hutchings et al. Combination of protein and viral vaccines induces potent cellular and humoral immune responses and enhanced protection from murine malaria challenge. Infect Immun. 2007 Dec, 75(12):5819-26. Epub 2007 Oct 1).

Фармацевтические композиции могут подвергаться обработке в соответствии со стандартными методами фармацевтики для получения лекарственных средств для введения нуждающимся в этом пациентам, включая людей и других млекопитающих.

Модификации неоантигенных пептидов могут повлиять на растворимость, биодоступность и скорость метаболизма пептидов, обеспечивая тем самым контроль за доставкой активных веществ. Растворимость можно оценить путем получения неоантигенного пептида и тестирования в соответствии с известными методами, входящими в рамки обычной квалификации работников в данной области.

В некоторых воплощениях фармацевтических композиций фармацевтически приемлемый носитель включает воду. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый носитель дополнительно включает декстрозу. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый носитель дополнительно включает диметилсульфоксид. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит иммуномодулятор или адъювант. В некоторых воплощениях иммуномодулятор или адъювант выбирают из группы, состоящей из поли-ICLC, агонистов STING, ISS 1018, солей алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимода, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCO Matrix, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипида A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel^®, векторных систем, микрочастиц PLGA, резиквимода, SRL172, виросом и других вирусоподобных частиц, YF-17D, VEGF Trap, R848, бета-глюкана, Pam3Cys и стимулона QS21 фирмы Aquila. В некоторых воплощениях иммуномодулятор или адъювант включает поли-ICLC.

В качестве адъювантов согласно воплощениям изобретения также можно использовать производные ксантенона, такие, к примеру, как Vadimezan или AsA404 (также известны как 5,6-диметилксантенон-4-уксусная кислота (DMXAA). С другой стороны, такие производные можно вводить и параллельно с вакцинной или иммуногенной композицией по изобретению, например, путем системного или внутриопухолевого введения, для стимуляции иммунитета в опухолевом участке. Не придерживаясь какой-либо теории, полагаем, что такие производные ксантенона действуют путем стимуляции образования интерферона (IFN) через стимулирующий ген IFN рецептор STING (например, см. Conlon et al. (2013) Mouse, but not human STING, binds and signals in response to the vascular disrupting agent 5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid. Journal of Immunology, 190:5216-25; и Kim et al. (2013) Anticancer flavonoids are mouse-selective STING agonists. 8:1396-1401).

Вакцинная или иммунологическая композиция также может содержать адъювантное соединение, выбранное из акриловых или метакриловых полимеров и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильных производных. В частности, это полимер акриловой или метакриловой кислоты, сшитый с полиалкениловым эфиром сахара или полиспирта (карбомера), в частности, сшитый с аллилсахарозой или с аллилпентаэритритом. Им также может быть сополимер малеинового ангидрида и этилена, сшитый, к примеру, с дивиниловым эфиром (см. патент США No. 6,713,068, включенный сюда путем ссылки во всей полноте).

В некоторых воплощениях модификатор рН может стабилизировать адъювант или иммуномодулятор, как описано здесь.

В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция включает: от одного до пяти пептидов, диметилсульфоксид (ДМСО), декстрозу, воду, сукцинат, поли-I:поли-C, поли-L-лизин, карбоксиметилцеллюлозу и хлорид. В некоторых воплощениях каждый из одного-пяти пептидов присутствует в концентрации 300 мкг/мл. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит ≤ 3% ДМСО по объему. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит 3,6-3,7% декстрозы в воде. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит 3,6-3,7 мМ сукцината (например, в виде сукцината натрия) или его соли. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит 0,5 мг/мл поли-I:поли-C. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит 0,375 мг/мл поли-L-лизина. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит 1,25 мг/мл натриевой карбоксиметилцеллюлозы. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит 0,225% хлорида натрия.

Фармацевтические композиции содержат описанные здесь опухолеспецифичные неоантигенные пептиды в терапевтически эффективном количестве для лечения заболеваний (например, неоплазии/опухоли), которые были описаны здесь, необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемой добавкой, носителем и/или эксципиентом. Рядовым специалистам в данной области из этого описания и познаний в данной области должно быть известно, что терапевтически эффективное количество одного или нескольких соединений по настоящему изобретению может колебаться в зависимости от подлежащего лечению заболевания, его тяжести, используемой схемы лечения, фармакокинетики используемого средства, а также самого пациента (животного или человека).

Для получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению терапевтически эффективное количество одного или нескольких соединений по настоящему изобретению предпочтительно тщательно смешивают с фармацевтически приемлемым носителем в соответствии со стандартными методами составления фармацевтических препаратов для получения дозы. Носитель может принимать самые различные формы в зависимости от формы препарата, требуемой для введения, например, глазного, перорального, местного или парентерального, включая гели, кремы, мази, лосьоны и высвобождающиеся по времени имплантируемые препараты, среди множества других. При приготовлении фармацевтических композиций в пероральной дозовой форме можно использовать любые обычные фармацевтические среды. Так, для жидких пероральных препаратов типа суспензий, эликсиров и растворов можно использовать подходящие носители и добавки, включая воду, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты, красители и т.п. Для твердых пероральных препаратов типа порошков, таблеток, капсул и для таких твердых препаратов, как свечи можно использовать подходящие носители и добавки, включая крахмал, сахарные носители типа декстрозы, маннита, лактозы и родственных им носителей, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие вещества, связывающие вещества, дезинтегрирующие вещества и т.п. При желании таблетки или капсулы могут быть покрыты энтеросолюбильным покрытием или для замедленного высвобождения при помощи стандартных методов.

Активное соединение включается в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества для требуемого показания, не вызывая серьезных токсических эффектов у проходящих лечение пациентов.

Пероральные композиции обычно включают инертный разбавитель или пищевой носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы или спрессованы в виде таблеток. Для перорального терапевтического введения активное соединение или его пролекарственное производное можно включать вместе с эксципиентами и использовать в виде таблеток, пастилок или капсул. В состав композиции могут входить фармацевтически совместимые связывающие вещества и/или адъювантные материалы.

Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любые из следующих ингредиентов или соединения аналогичного характера: связующее типа микрокристаллической целлюлозы, трагакантовой камеди или желатина; эксципиент типа крахмала или лактозы, диспергирующее средство типа альгиновой кислоты или кукурузного крахмала; смазывающее вещество типа стеарата магния; скользящее вещество типа коллоидного диоксида кремния; подсластитель типа сахарозы или сахарина; или ароматизатор типа мяты перечной, метилсалицилата или апельсинового ароматизатора. Когда стандартная дозовая форма представляет собой капсулы, она может содержать, наряду с уже приведенными материалами, жидкий носитель типа жирного масла. Кроме того, стандартные дозовые формы могут содержать различные другие материалы, которые модифицируют физическую форму дозовой единицы, к примеру, покрытия из сахара, шеллака или энтеросолюбильного вещества.

Лекарственные формы настоящего изобретения, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц типа капсул, пакетиков или таблеток, содержащих заданное количество активного ингредиента; порошков или гранул; растворов или суспензий в водной жидкости или неводной жидкости; либо жидких эмульсий типа масло-в-воде или эмульсий типа вода-в-масле, а также в виде болюса и др.

Таблетки могут быть получены путем прессования или формования, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены путем прессования в подходящей машине активного ингредиента в сыпучем виде типа порошка или гранул, необязательно в смеси со связывающим, смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим веществом. Формованные таблетки могут быть получены путем формования в подходящей машине смеси порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно могут иметь покрытие или насечки и могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить замедленное или контролируемое высвобождение из них активного ингредиента.

Способы составления таких композиций с замедленным или контролируемым высвобождением фармацевтически активных ингредиентов известны в данной области и описаны в нескольких выданных патентах США, к которым относятся, без ограничения, патенты США Nos. 3,870,790; 4,226,859; 4,369,172; 4,842,866 и 5,705,190, содержание которых включено сюда путем ссылки во всей полноте. Покрытия могут использоваться для доставки соединений в кишечник (например, см. патенты США Nos. 6,638,534, 5,541,171, 5,217,720 и 6,569,457 и приведенные в них ссылки).

Активное соединение или его фармацевтически активная соль также может вводиться в виде компонента эликсира, суспензии, сиропа, облатки, жевательной резинки и т.п. Сироп может содержать, помимо активных соединений, сахарозу или фруктозу в качестве подсластителя и некоторые консерванты, красители и красящие вещества и ароматизаторы.

Растворы или суспензии, используемые для глазного, парентерального, внутрикожного, подкожного или местного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель типа воды для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства типа бензилового спирта или метилпарабена; антиоксиданты типа аскорбиновой кислоты или бисульфита натрия; хелатирующие агенты типа этилендиаминтетрауксусной кислоты; буферы типа ацетатов, цитратов или фосфатов; и средства для доведения тоничности типа хлорида натрия или декстрозы.

В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемым носителем является водный растворитель, то есть растворитель, содержащий воду, необязательно с дополнительными сорастворителями. Типичными фармацевтически приемлемыми носителями являются вода, буферные растворы в воде (типа физраствора с фосфатным буфером (PBS) и 5% декстроза в воде (D5W). В некоторых воплощениях водный растворитель дополнительно содержит диметилсульфоксид (ДМСО), например, в количество 1-4% или 1-3%. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый носитель является изотоническим (т.е. имеет практически такое же осмотическое давление, как и жидкие фазы организма типа плазмы).

В одном воплощении активные соединения готовятся с носителями, которые защищают соединение от быстрого удаления из организма, типа препаратов с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразрушимые, биосовместимые полимеры типа этиленвинилацетата, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры, полимолочную кислоту и сополимеры молочной и гликолевой кислоты (PLGA). Способы получения таких форм находятся в рамках компетенции специалистов с учетом настоящего описания и познаний в данной области.

Специалистам в данной области из этого описания и познаний в данной области должно быть известно, что наряду с таблетками для обеспечения замедленного или контролируемого высвобождения активного ингредиента могут быть составлены и другие дозовые формы. Такие дозовые формы включают, без ограничения, капсулы, гранулированные препараты и гелевые колпачки.

Липосомные суспензии тоже могут быть фармацевтически активными носителями. Они могут быть получены в соответствии с методами, известными специалистам в данной области. Например, липосомные формы могут быть получены путем растворения соответствующих липидов в неорганическом растворителе, который затем испаряется, оставляя за собой тонкую пленку высушенного липида на поверхности контейнера. Затем в контейнер вводят водный раствор активного соединения. А затем контейнер вращают вручную, чтобы освободить липидный материал со стенок контейнера и диспергировать липидные агрегаты, получая при этом липосомную суспензию. В этом аспекте настоящего изобретения можно использовать и другие способы получения, хорошо известные рядовым специалистам.

Лекарственные формы для удобства могут быть представлены в стандартной дозовой форме и могут быть получены стандартными фармацевтическими методами. Такие методы включают стадию ассоциации активного ингредиента и фармацевтических носителей или эксципиентов. В общем, лекарственные формы получают путем равномерной и тесной ассоциации активного ингредиента с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями или с теми и другими, а затем, если это нужно, формования продукта.

Лекарственные формы и композиции, подходящие для местного введения в рот, включают лепешки, содержащие ингредиенты в ароматизированной основе, обычно в сахарозе и гуммиарабике или трагаканте; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе типа желатина и глицерина или сахарозы и гуммиарабика; и жидкости для полоскания рта, содержащие вводимый ингредиент в подходящем жидком носителе.

Лекарственные формы, подходящие для местного нанесения на кожу, могут быть представлены в виде мазей, кремов, гелей и паст, содержащих вводимый ингредиент в фармацевтически приемлемом носителе. Предпочтительной системой местной доставки является трансдермальный пластырь, содержащий вводимый ингредиент.

Лекарственные формы для ректального введения могут быть представлены в виде свечей на подходящей основе, включающей, к примеру, масло какао или салицилат.

Лекарственные формы, подходящие для интраназального введения, в которых носителем является твердое вещество, включают грубые порошки с размером частиц, к примеру, в диапазоне от 20 до 500 микрон, которые вводятся способом, аналогичным вдыханию нюхательного табака, то есть путем быстрой ингаляции через носовой проход из контейнера с порошком, удерживаемым близко к носу. Подходящие лекарственные формы, в которых носителем является жидкое вещество, к примеру, для введения в виде носового спрея или капель в нос, включают водные или масляные растворы активного ингредиента.

Лекарственные формы, подходящие для интравагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пенистых или аэрозольных составов, содержащих наряду с активным ингредиентом такие носители, которые в данной области считаются подходящими.

Парентеральные препараты могут быть заключены в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы из стекла или пластика. При внутривенном введении предпочтительными носителями являются, к примеру, физиологический раствор или физраствор с фосфатным буфером (PBS).

Носители для парентеральных форм обычно включают стерильную воду или водный раствор хлорида натрия, хотя могут входить и другие ингредиенты, в том числе способствующие диспергированию. Конечно, при использовании стерильной воды и содержании её в стерильном виде, композиции и носители тоже подвергают стерилизации. Также можно готовить суспензии для инъекций, при этом можно использовать подходящие жидкие носители, суспендирующие вещества и т.п.

Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, делающие композицию изотоничной с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие вещества и загустители. Эти формы могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, к примеру, в герметичных ампулах и флаконах, и могут храниться в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, к примеру, воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Растворы и суспензии для инъекций ex temporo могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток типа тех, что описаны ранее.

Введение активного соединения может варьироваться от непрерывного (внутривенная капельница) до нескольких пероральных введений в день (к примеру, 4 раза в день) и может включать пероральное, местное, глазное или интраокулярное, парентеральное, внутримышечное, внутривенное, подкожное, трансдермальное (которое может включать средство, усиливающее проникновение), буккальное введение и свечи, среди других путей введения, в том числе через глаза или интраокулярно.

Вакцинные или иммуногенные композиции против неоплазии и любые дополнительные средства можно вводить путем инъекции, перорально, парентерально, при помощи ингаляционного распылителя, ректально, вагинально или топически в стандартных дозовых формах, содержащих обычные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и жидкие носители. Термин “парентерально” в настоящем изобретении включает введение в лимфатические узлы, подкожное, внутривенное, внутримышечное, интрастернальное, методом инфузии, внутрибрюшинное, в глаза или интраокулярное, интравитреальное, интрабуккальное, трансдермальное, интраназальное, в мозг, включая внутричерепное и интрадуральное введение, в суставы, в том числе лодыжки, колени, бедра, плечи, локти, запястья, непосредственно в опухоли и т.п., а также в виде свечей.

В некоторых воплощениях вакцинные или иммуногенные композиции вводятся внутривенно или подкожно. Для доставки данных композиций в нужное место можно использовать различные способы, как-то инъекции, с помощью катетеров, троакаров, уколов, гелей типа Pluronic, стентов, полимеров для замедленного высвобождения или других устройств, обеспечивающих их поступление внутрь. Когда орган или ткань доступны вследствие удаления из пациента, такой орган или ткань можно окунуть в среду, содержащую данные композиции, либо их можно намазывать или наносить на органы любым удобным способом.

Опухолеспецифичные неопантигенные пептиды можно вводить через устройство, подходящее для контролируемого и пролонгированного высвобождения композиции, эффективной для получения требуемого местного или системного физиологического или фармакологического эффекта. Этот способ включает помещение системы пролонгированного высвобождения препарата в тот участок, где требуется его высвобождение, и подачу препарата через устройство в требуемый участок обработки.

Опухолеспецифичные неоантигенные пептиды можно использовать в комбинации по меньшей мере с еще одним известным терапевтическим средством или с фармацевтически приемлемой солью данного средства. Примеры известных терапевтических средств, которые можно использовать для комбинированной терапии, включают, без ограничения, кортикостероиды (например, кортизон, преднизон, дексаметазон), нестероидные противовоспалительные средства (NSAIDS) (например, ибупрофен, целекоксиб, аспирин, индометацин, напроксен), алкилирующие реагенты, как-то бусульфан, цисплатин, митомицин C и карбоплатин; антимитотические средства, как-то колхицин, винбластин, паклитаксель и доцетаксель; ингибиторы топоизомеразы I типа камптотецина и топотекана; ингибиторы топоизомеразы II типа доксорубицина и этопозида; и/или антиметаболиты РНК/ДНК типа 5-азацитидина, 5-фторурацила и метотрексата; антиметаболиты ДНК типа 5-фтор-2′-дезоксиуридина, ара-С, гидроксимочевины и тиогуанина; такие антитела, как Herceptin и Rituxan.

Следует иметь в виду, что наряду с ингредиентами, конкретно приведенными здесь, лекарственные формы настоящего изобретения могут включать в себя и другие средства, общепринятые в данной области, имеющие отношение к рассматриваемому типу композиций, например, формы, подходящие для перорального введения, могут включать ароматизаторы.

Фармацевтически приемлемые солевые формы могут быть предпочтительной химической формой соединений по настоящему изобретению для включения в фармацевтические композиции по настоящему изобретению.

Соединения настоящего изобретения или их производные, включая пролекарственные формы этих веществ, могут быть представлены в виде фармацевтически приемлемых солей. В настоящем изобретении термин “фармацевтически приемлемые соли или комплексы” относится к соответствующим солям или комплексам активных соединений по настоящему изобретению, которые сохраняют требуемую биологическую активность исходного соединения и проявляют ограниченное токсикологическое действие на нормальные клетки. Неограничительные примеры таких солей включают: а) соли соединений с кислотами, образованные с неорганическими кислотами (к примеру, соляной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и др.), и соли, образованные с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, памоиновая кислота, альгиновая кислота и полиглутаминовая кислота, среди прочих; (b) соли присоединения оснований, образованные с катионами таких металлов, как цинк, кальций, натрий, калий и т.п., среди многих других.

Приведенные здесь соединения являются коммерчески доступными или могут быть синтезированы. Специалистам может быть известно, что есть дополнительные способы синтеза соединений по приведенным формулам, известные рядовым специалистам в данной области. Кроме того, для получения требуемых соединений различные стадии синтеза могут выполняться в альтернативной последовательности или порядке. В данной области известны превращения при химическом синтезе и методологии защитных групп (блокирование и деблокирование), применимые для синтеза описанных здесь соединений, включая, к примеру, те, что описаны в R. Larock. Comprehensive Organic Transformations, 2nd. Ed., Wiley-VCH Publishers (1999); T.W. Greene and P.G.M. Wuts. Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser. Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis. John Wiley and Sons (1999); и L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995); и последующие их издания.

Дополнительные средства, которые могут входить вместе с опухолеспецифичными неоантигенными пептидами настоящего изобретения, могут содержать один или несколько асимметрических центров, поэтому они встречаются в виде рацематов и рацемических смесей, одиночных энантиомеров, индивидуальных диастереомеров и смесей диастереомеров. Все такие изомерные формы данных соединений специально включены в настоящее изобретение. Соединения настоящего изобретения также могут быть представлены в нескольких таутомерных формах, и в таких случаях изобретение специально включает все таутомерные формы описанных здесь соединений (например, алкилирование кольцевой системы может приводить к алкилированию по нескольким сайтам, а изобретение специально включает все продукты таких реакций). Все такие изомерные формы данных соединений специально включены в настоящее изобретение. Все кристаллические формы описанных здесь соединений также специально включены в настоящее изобретение.

Дозировка

Когда описанные здесь действующие вещества вводятся в виде фармацевтических препаратов людям или животным, они могут вводиться сами по себе или в виде фармацевтической композиции, содержащей активный ингредиент в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентом или разбавителем.

Фактические уровни дозировки и схемы введения по времени активных ингредиентов в фармацевтических композициях по изобретению можно варьировать, чтобы получить такое количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения без токсичности для пациента. Как правило, действующие вещества или фармацевтические композиции по изобретению вводятся в количестве, достаточном для уменьшения или устранения симптомов, связанных с неоплазией, например, раком или опухолями.

Предпочтительной дозой действующего вещества является максимальная, которую пациент может переносить без возникновения серьезных или неприемлемых побочных эффектов. Типичные диапазоны доз включают от 0,01 до 250 мг в день, от 0,01 мг до 100 мг в день, от 1 мг до 100 мг в день, от 10 мг до 100 мг в день, от 1 мг до 10 мг в день и от 0,01 мг до 10 мг в день. Предпочтительная доза агента – максимальная, которую пациент может переносить без возникновения серьезных или неприемлемых побочных эффектов. В воплощениях действующее вещество вводится в дозе от 10 мкг до 100 мг на кг массы тела в день, от 0,1 до 10 мг/кг в день или от 1,0 мг до 10 мг/кг массы тела в день.

В воплощениях фармацевтическая композиция содержит действующее вещество в количестве от 1 до 10 мг, как-то 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг.

В воплощениях терапевтически эффективная доза дает концентрацию в сыворотке действующего вещества от 0,1 нг/мл до 50-100 мг/мл. Как правило, фармацевтические композиции должны обеспечивать дозу от 0,001 мг до 2000 мг соединения на кг массы тела в день. Например, дозировки для системного введения больным людям могут составлять 1-10 мг/кг, 20-80 мг/кг, 5-50 мг/кг, 75-150 мг/кг, 100-500 мг/кг, 250-750 мг/кг, 500-1000 мг/кг, 1-10 мг/кг, 5-50 мг/кг, 25-75 мг/кг, 50-100 мг/кг, 100-250 мг/кг, 50-100 мг/кг , 250-500 мг/кг, 500-750 мг/кг, 750-1000 мг/кг, 1000-1500 мг/кг, 1500-2000 мг/кг, 5 мг/кг, 20 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 500 мг/кг, 1000 мг/кг, 1500 мг/кг или 2000 мг/кг. Фармацевтические стандартные дозовые формы обычно содержат от 1 мг до 5000 мг, к примеру, от 100 до 2500 мг соединения или комбинации основных ингредиентов на единицу дозовой формы.

В воплощениях субъекту вводят от 50 нМ до 1 мкМ действующего вещества. В родственных воплощениях субъекту вводят 50-100 нМ, 50-250 нМ, 100-500 нМ, 250-500 нМ, 250-750 нМ, 500-750 нМ, от 500 нМ до 1 мкМ или от 750 нМ до 1 мкМ действующего вещества.

Определение эффективного количества находится в пределах компетенции специалистов, особенно в свете приведенного здесь подробного описания. Как правило, эффективное количество действующего вещества определяют при введении сначала низкой дозы вещества, а затем постепенно увеличивают вводимую дозу или дозы до тех пор, пока у проходящего лечение субъекта не будет наблюдаться требуемый эффект (например, уменьшение или устранение симптомов, связанных с вирусной инфекцией или аутоиммунным заболеванием), при минимальных или приемлемых токсических побочных эффектах. Применимые способы определения надлежащей дозы и схемы дозировки при введении фармацевтических композиций настоящего изобретения описаны, к примеру, в Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11th Edition, McGraw-Hill 2005; и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott, Williams & Wilkins (2003 и 2005); которые включены сюда путем ссылки.

Предпочтительными стандартными дозовыми формами являются формы, которые содержат суточную дозу или единицу, суточную субдозу, как обсуждается здесь, или соответствующую дробную дозу вводимого ингредиента.

Схема дозировки при лечении заболеваний с помощью опухолеспецифичных неоантигенных пептидов настоящего изобретения и/или композиций по настоящему изобретению основывается на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояние здоровья пациента, тяжесть заболевания, способ введения и конкретное используемое соединение. Таким образом, схема дозировки может варьироваться в широких пределах, но обычно определяется стандартными методами.

Количества и схемы дозировки при введении субъектам могут зависеть от ряда факторов, как-то способа введения, характера подлежащего лечению заболевания, веса тела подлежащего лечению субъекта и мнения назначающего лечение врача; все такие факторы находятся в пределах компетенции специалистов из этого описания и познаний в данной области.

Количество соединения, входящего в терапевтически активные лекарственные формы по настоящему изобретению, составляет эффективное количество для лечения заболевания. В общем случае терапевтически эффективное количество предпочтительных соединений настоящего изобретения в дозовой форме обычно составляет от чуть менее 0,025 мг/кг/день до 2,5 г/кг/день, предпочтительно от 0,1 мг/кг/день до 100 мг/кг/день на пациента или значительно больше, в зависимости от подлежащего лечению заболевания или инфекции и способа введения, хотя настоящим изобретением могут предусматриваться исключения из этого диапазона доз. В наиболее предпочтительном виде соединения по настоящему изобретению вводятся в количествах от 1 мг/кг/день до 100 мг/кг/день. Дозировка соединения может зависеть от подлежащего лечению заболевания, конкретного соединения и других клинических факторов типа веса и состояния пациента и способа введения соединения. Следует иметь в виду, что настоящее изобретение применимо как для человека, так и для ветеринарного применения.

Для перорального введения людям обычно достаточна дозировка от примерно 0,1 до 100 мг/кг/день, предпочтительно примерно между 1 и 100 мг/кг/день.

В тех случаях, когда доставка препарата является системной, а не местной, этот диапазон доз обычно дает эффективные концентрации активного соединения в крови в пределах от 0,04 до 400 мкг/мл крови или больше у пациента. Соединение удобно вводить в любой подходящей стандартной дозовой форме, включая, без ограничения, формы, содержащие от 0,001 до 3000 мг, предпочтительно от 0,05 до 500 мг активного ингредиента на единицу дозовой формы. Обычно удобной является пероральная доза в 10-250 мг.

В соответствии с некоторыми типичными воплощениями вакцинная или иммуногенная композиция вводится в дозе от 10 мкг до 1 мг в пересчете на неоантигенный пептид. В соответствии с некоторыми типичными воплощениями вакцинная или иммуногенная композиция вводится на уровне средней недельной дозы от 10 мкг до 2000 мкг в пересчете на неоантигенный пептид.

Концентрация активного соединения в композиции препарата будет зависеть от всасывания, распределения, инактивации и скорости выделения препарата, а также других факторов, известных специалистам в данной области. Следует отметить, что дозировка также будет варьироваться в зависимости от тяжести подлежащего лечению заболевания. Также нужно иметь в виду, что для любого конкретного субъекта конкретные схемы дозировки следует корректировать с течением времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональным суждением лица, осуществляющего или контролирующего введение композиций, а приведенные здесь диапазоны концентраций являются лишь примерными и не должны ограничивать рамки или применение на практике заявленной композиции. Активный ингредиент можно вводить сразу или же его можно разделить на несколько меньших доз, вводимых через различные промежутки времени.

Изобретением предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один опухолеспецифичный неоантиген, описанный здесь. В воплощениях фармацевтические композиции содержат фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или разбавители, к которым относятся такие фармацевтические агенты, которые сами по себе не вызывают иммунных ответов, вредных для субъектов, получающих композицию, и которые можно вводить без чрезмерной токсичности. В настоящем изобретении термин “фармацевтически приемлемый” означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или приведенный в Фармакопее США, Европейской фармакопее или другой общепризнанной фармакопее для применения на млекопитающих, более предпочтительно на людях. Эти композиции могут применяться для лечения и/или профилактики вирусных инфекций и/или аутоиммунных заболеваний.

Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и других эксципиентов представлено в Remington’s Pharmaceutical Sciences (17th ed., Mack Publishing Company) и Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st ed., Lippincott Williams & Wilkins), которые включены сюда путем ссылки. Состав фармацевтической композиции должен соответствовать способу введения. В воплощениях фармацевтические композиции подходят для введения людям и могут быть стерильными, не содержащими частиц и/или апирогенными.

Фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или разбавители включают, без ограничения, солевые растворы, буферные солевые растворы, декстрозу, воду, глицерин, этанол, стерильные изотонические водные буферы и их комбинации.

В композициях также могут присутствовать смачивающие агенты, эмульгаторы и смазывающие вещества типа лаурилсульфата натрия и стеарата магния, а также красители, высвобождающие средства, покрывающие средства, подсластители, ароматизаторы и отдушки, консерванты и антиоксиданты.

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают, без ограничения: (1) водорастворимые антиоксиданты, как-то аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и др.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, как-то аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и др.; и (3) хелаторы металлов, как-то лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и др.

В воплощениях фармацевтическая композиция представлена в твердом виде типа лиофилизованного порошка, подходящего для восстановления в виде жидкого раствора, суспензии, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, формы с замедленным высвобождением или порошка.

В воплощениях фармацевтическая композиция поставляется в жидком виде, к примеру, в герметическом контейнере с указанием количества и концентрации активного ингредиента в фармацевтической композиции. В родственных воплощениях жидкая форма фармацевтической композиции поставляется в герметически закрытом контейнере.

Способы составления фармацевтических композиций настоящего изобретения являются стандартными и хорошо известны в данной области (см. Remington and Remington’s). Специалисты в данной области могут легко составить фармацевтическую композицию с нужными характеристиками (например, способом введения, биобезопасностью и профилем высвобождения).

Способы получения фармацевтических композиций включают стадию приведения активного ингредиента в ассоциацию с фармацевтически приемлемым носителем и, необязательно, одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Фармацевтические композиции могут быть получены путем равномерной и тесной ассоциации активного ингредиента с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями или теми и другими, а затем, при необходимости, формования продукта. Дополнительные методики получения фармацевтических композиций, включая получение многослойных дозовых форм, описаны в Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (9th ed., Lippincott Williams & Wilkins), включенном сюда путем ссылки.

Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут иметь вид капсул, пакетиков, пилюль, таблеток, лепешек (на ароматизированной основе, обычно сахарозы и гуммиарабика или трагаканта), порошков, гранул или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости или в виде жидкой эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле или в виде эликсира или сиропа либо в виде пастилок (на инертной основе типа желатина и глицерина или сахарозы и гуммиарабика) и/или в виде жидкости для полоскания рта и т.п., которые все содержат заданное количество описанных здесь соединений, их производных или фармацевтически приемлемых солей или пролекарств в качестве активных ингредиентов. Активные ингредиенты также можно вводить в виде болюса, лекарственной кашки или пасты.

В твердых дозовых формах для перорального введения (например, капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и т.п.) активный ингредиент смешивают с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или разбавителями типа цитрата натрия или дикальцийфосфата и/или любыми из следующего: (1) наполнители или заполнители, как-то крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и/или кремниевая кислота; (2) связующие вещества, такие, к примеру, как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или гуммиарабик; (3) увлажнители типа глицерина; (4) дезинтегрирующие агенты, как-то агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (5) замедлители растворения типа парафина; (6) ускорители всасывания типа соединений четвертичного аммония; (7) смачивающие вещества, такие, к примеру, как ацетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбенты типа каолина и бентонитовой глины; (9) смазывающие вещества, как-то тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; и (10) красители. В случае капсул, таблеток и пилюль фармацевтические композиции также могут содержать буферные вещества. Твердые композиции аналогичного типа также могут быть получены с помощью заполнителей для заполнения мягких и твердых желатиновых капсул и таких эксципиентов, как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярных полиэтиленгликолей и т.п.

Таблетки могут быть получены путем прессования или формования, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены с использованием связующих веществ (например, желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), смазывающих веществ, инертных разбавителей, консервантов, разрыхлителей (к примеру, натриевого гликолата крахмала или сшитой натриевой карбоксиметилцеллюлозы), поверхностно-активных и/или диспергирующих веществ. Формованные таблетки могут быть получены путем формования в подходящей машине смеси порошкообразного активного ингредиента, смоченного инертным жидким разбавителем.

Таблетки и другие твердые лекарственные формы типа драже, капсул, пилюль и гранул необязательно могут иметь насечки или покрытия и оболочки типа энтеросолюбильной оболочки и других покрытий, хорошо известных в данной области.

В некоторых воплощениях для того, чтобы продлить действие активного ингредиента, желательно замедлить всасывание соединения при подкожной или внутримышечной инъекции. Это может осуществляться путем использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с низкой растворимостью в воде. При этом скорость всасывания активного ингредиента зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. С другой стороны, замедление всасывания при парентеральном введении активного ингредиента осуществляется путем растворения или суспендирования соединения в масляном носителе. Кроме того, пролонгированное всасывание фармацевтических форм для инъекций может осуществляться путем включения агентов, замедляющих всасывание, типа моностеарата алюминия и желатина.

Парентеральные композиции с контролируемым высвобождением могут быть в виде водных суспензий, микросфер, микрокапсул, магнитных микросфер, масляных растворов, масляных суспензий, эмульсий или же активный ингредиент может быть включен в биосовместимые носители, липосомы, наночастицы, имплантаты или инфузионные устройства.

Материалы для применения при получении микросфер и/или микрокапсул включают биоразложимые/биоразрушимые полимеры, как-то полиглактин, поли(изобутилцианоакрилат), поли(2-гидроксиэтил-L-глутамин) и поли(молочная кислота).

Биосовместимые носители, которые можно использовать при составвлении парентеральных форм с контролируемым высвобождением, включают углеводы типа декстранов, белки типа альбумина, липопротеины или антитела.

Материалы для применения в имплантатах могут не быть биоразлагаемыми, например, полидиметилсилоксан, или быть биоразлагаемыми, как-то, например, поли(капролактон), поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота) или поли(ортоэфиры).

В воплощениях активные ингредиенты вводятся при помощи аэрозоля. Это осуществляется путем приготовления водного аэрозоля, липосомального препарата или твердых частиц, содержащих соединение. Можно использовать неводные суспензии (например, фторуглеродные вытеснители). Фармацевтические композиции также можно вводить с помощью ультразвукового распылителя, что сводит к минимуму воздействие сдавливания на вещество, которое может привести к разложению соединения.

Обычно водные аэрозоли получают путем приготовления водного раствора или суспензии активного ингредиента вместе с обычными фармацевтически приемлемыми носителями и стабилизаторами. Носители и стабилизаторы варьируют в зависимости от требований по конкретному соединению, но обычно включают неионные поверхностно-активные вещества (Tweens, Pluronics или полиэтиленгликоль), безвредные белки типа сывороточного альбумина, сложные эфиры сорбитана, олеиновую кислоту, лецитин, аминокислоты типа глицина, буферы, соли, сахара или сахароспирты. Аэрозоли обычно получают из изотонических растворов.

Дозовые формы для местного или трансдермального введения активных ингредиентов включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. Активные ингредиенты можно смешивать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемыми носителями и с любыми консервантами, буферами или вытеснителями, как надлежит.

Трансдермальные пластыри, подходящие для применения в настоящем изобретении, описаны в Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives (Marcel Dekker Inc., 1989) и патенты США Nos. 4,743,249, 4,906,169, 5,198,223, 4,816,540, 5,422,119, 5,023,084, которые включены сюда путем ссылки. Трансдермальный пластырь также может представлять собой любой трансдермальный пластырь, хорошо известный в данной области, включая трансскротальные пластыри. Фармацевтические композиции в таких трансдермальных пластырях могут содержать один или несколько усилителей всасывания или усилителей проницаемости кожи, хорошо известных в данной области (например, см. патенты США Nos. 4,379,454 и 4,973,468, которые включены сюда путем ссылки). Трансдермальные терапевтические системы для применения в настоящем изобретении могут основываться на ионтофорезе, диффузии или комбинации этих двух эффектов.

Трансдермальные пластыри имеют дополнительное преимущество обеспечения контролируемой доставки активного ингредиента в организм. Такие дозовые формы могут быть получены путем растворения или диспергирования активного ингредиента в соответствующей среде. Также можно использовать усилители всасывания для увеличения потока активного ингредиента через кожу. Скорость такого потока можно контролировать при помощи мембраны, контролирующей скорость, либо диспергирования активного ингредиента в полимерном матриксе или геле.

Такие фармацевтические композиции могут быть в виде кремов, мазей, лосьонов, линиментов, гелей, гидрогелей, растворов, суспензий, палочек, спреев, паст, пластырей и других типов трансдермальных систем доставки лекарств. Композиции могут также включать фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты, как-то эмульгаторы, антиоксиданты, буферные вещества, консерванты, увлажнители, усилители проницаемости, хелаторы агенты, гелеобразующие вещества, основы для мазей, отдушки и защищающие кожу средства.

Примеры эмульгаторов включают, без ограничения, природные камеди, например, гуммиарабик или трагакантовую камедь, натуральные фосфатиды, например, соевый лецитин, и производные сорбитанмоноолеата.

Примеры антиоксидантов включают, без ограничения, бутилированный гидроксианизол (BHA), аскорбиновую кислоту и ее производные, токоферол и его производные и цистеин.

Примеры консервантов включают, без ограничения, парабены типа метил- или пропил-п-гидроксибензоата и бензалконийхлорид.

Примеры увлажнителей включают, без ограничения, глицерин, пропиленгликоль, сорбит и мочевину.

Примеры усилителей проникновения включают, без ограничения, пропиленгликоль, DMSO, триэтаноламин, N,N-диметилацетамид, N,N-диметилформамид, 2-пирролидон и их производные, тетрагидрофурфуриловый спирт, пропиленгликоль, моноэтиловый или монометиловый эфир диэтиленгликоля с монолауратом или метиллауратом пропиленгликоля, эвкалиптол, лецитин, Transcutol и Azone.

Примеры хелатирующих веществ включают, без ограничения, ЭДТА натрия, лимонную кислоту и фосфорную кислоту.

Примеры гелеобразующих агентов включают, без ограничения, карбопол, производные целлюлозы, бентонит, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон.

Наряду с активными ингредиентами, мази, пасты, кремы и гели по настоящему изобретению могут содержать такие эксципиенты, как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремниевую кислоту, тальк и оксид цинка либо их смеси.

Порошки и распылители могут содержать такие эксципиенты, как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и порошки полиамидов либо смеси этих веществ. Распылители также могут содержать обычные вытеснители типа хлорфторуглеводородов и летучих незамещенных углеводородов типа бутана и пропана.

Депо-формы для инъекций получают путем формирования микрокапсульных матриксов соединений по изобретению в биоразлагаемых полимерах типа полилактида-полигликолида. В зависимости от соотношения соединения к полимеру и природы конкретного используемого полимера может контролироваться скорость высвобождения соединения. Примеры других биодеградируемых полимеров включают поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Депо-формы для инъекций также получают путем заключения препарата в липосомы или микроэмульсии, совместимые с тканями организма.

Подкожные имплантаты хорошо известны в данной области и пригодны для применения в настоящем изобретении. Методы подкожной имплантации предпочтительно не вызывают раздражения и являются механически эластичными. Имплантаты могут быть типа матрикса, типа резервуара либо их гибридов. В устройствах типа матрикса материал носителя может быть пористым или непористым, твердым или полутвердым и проницаемым или непроницаемым для активного соединения или соединений. Материал носителя может быть биоразлагаемым или может медленно разрушаться после введения. В некоторых случаях матрикс не разлагается, а вместо этого основывается на диффузии активного соединения через матрикс для разрушения материала носителя. В альтернативных методах подкожной имплантации применяются устройства типа резервуара, в которых активное соединение или соединения окружены контролирующей скорость мембраной, например, мембраной, не зависящей от концентрации компонента (обладающей кинетикой нулевого порядка). Также подходят для применения устройства, состоящие из матрикса, окруженного контролирующей скорость мембраной.

Устройства типа резервуара и типа матрикса могут содержать такие материалы, как полидиметилсилоксаны типа Silastic или другие силиконовые каучуки. Материалом матрикса может быть нерастворимый полипропилен, полиэтилен, поливинилхлорид, этилвинилацетат, полистирол или полиметакрилат, а также глицериновые эфиры типа пальмитостеарата глицерина, стеарата глицерина и бегената глицерина. Материалы могут представлять собой гидрофобные или гидрофильные полимеры и необязательно содержать солюбилизирующие вещества.

Устройства типа подкожных имплантатов могут представлять собой капсулы с замедленным высвобождением, изготовленные из любого подходящего полимера, например, как описано в патентах США Nos. 5,035,891 и 4,210,644, которые включены сюда путем ссылки.

В общем, для обеспечения контроля за скоростью высвобождения и трансдермального проникновения лекарственных соединений применяются по меньшей мере четыре разных подхода. Эти подходы следующие: мембранная система замедления, контролируемые диффузией адгезионные системы, системы типа дисперсионного матрикса и системы типа микрорезервуара. Имеется в виду, что чрезкожные и/или топические композиции с контролируемым высвобождением могут быть получены с использованием подходящей комбинации этих подходов.

В мембранной системе замедления активный ингредиент находится в резервуаре, который полностью инкапсулирован в неглубоком отсеке, отлитом из непроницаемого для лекарств слоистого материала типа металлопластика и контролирующей скорость полимерной мембраны типа микропористой или непористой полимерной мембраны, например, сополимера этилена и винилацетата. Активный ингредиент высвобождается через контролирующую скорость полимерную мембрану. В резервуаре с лекарственным средством активный ингредиент может быть либо диспергирован в твердом полимерном матриксе, либо суспендирован в непроницаемой вязкой жидкой среде типа жидкого силикона. На внешнюю поверхность полимерной мембраны наносится тонкий слой адгезивного полимера для обеспечения тесного контакта трансдермальной системы с поверхностью кожи. Адгезивный полимер предпочтительно представляет собой такой полимер, который является гипоаллергенным и совместимым с активным лекарственным веществом.

В контролируемой диффузией адгезионной системе резервуар активного ингредиента образуется путем прямого диспергирования активного ингредиента в адгезивном полимере, а затем, например, путем отливки из растворителя, нанесения адгезива, содержащего активный ингредиент, на плоский лист практически непроницаемой для лекарств подложки из металлопластика с образованием тонкого слоя резервуара для препарата.

Система типа дисперсионного матрикса характеризуется тем, что резервуар активного ингредиента образуется путем практически гомогенного диспергирования активного ингредиента в матриксе из гидрофильного или липофильного полимера. Затем из содержащего препарат полимера формуется диск с практически четко определенной площадью поверхности и контролируемой толщиной. Адгезивный полимер наносится по окружности, образуя полоску адгезива вокруг диска.

Система типа микрорезервуара может рассматриваться как комбинация систем типа резервуара и дисперсионного матрикса. В этом случае резервуар активного вещества образуется сначала путем суспендирования твердого вещества препарата в водном растворе водорастворимого полимера, а затем диспергирования суспензии препарата в липофильном полимере с образованием множества непроницаемых микроскопических сфер-резервуаров препарата.

Любые из описанных здесь композиций с контролируемым высвобождением, пролонгированным высвобождением и замедленным высвобождением могут быть составлены так, чтобы активный ингредиент высвобождался на протяжении от 30 минут до 1 недели, от 30 минут до 72 часов, от 30 минут до 24 часов, от 30 минут до 12 часов, от 30 минут до 6 часов, от 30 минут до 4 часов и от 3 часов до 10 часов. В воплощениях эффективная концентрация активного ингредиента у субъектов поддерживается в течение 4 часов, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 16 часов, 24 часов, 48 часов, 72 часов или больше после введения субъектам фармацевтических композиций.

Вакцинные или иммуногенные композиции

Настоящее изобретение в некоторых аспектах направлено на фармацевтические композиции, подходящие для профилактики или лечения рака. В одном воплощении композиция включает по меньшей мере одну иммуногенную композицию, например, вакцинную или иммуногенную композицию против неоплазии, способную вызывать специфический Т-клеточный ответ. Вакцинная или иммуногенная композиция против неоплазии включает неоантигенные пептиды и/или неоантигенные полипептиды, соответствующие опухолеспецифичным неоантигенам, как описано здесь.

Подходящая вакцинная или иммуногенная композиция против неоплазии предпочтительно содержит несколько опухолеспецифичных неоантигенных пептидов. В одном воплощении вакцинная или иммуногенная композиция может содержать от 1 до 100 таких пептидов, более предпочтительно от 1 до 50 таких пептидов, еще более предпочтительно от 10 до 30 таких пептидов, еще более предпочтительно от 15 до 25 пептидов. В соответствии с другим предпочтительным воплощением вакцинная или иммуногенная композиция может содержать по меньшей мере один пептид, более предпочтительно 2, 3, 4 или 5 пептидов. В некоторых воплощениях вакцинная или иммуногенная композиция может содержать 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 различных пептидов.

Оптимальное количество каждого пептида, входящего в вакцинную или иммуногенную композицию, и оптимальная схема дозировки может быть установлена специалистами в данной области без излишнего экспериментирования. Например, пептид или его вариант может быть приготовлен для внутривенной (i.v.) инъекции, подкожной (s.c.) инъекции, внутрикожной (i.d.) инъекции, внутрибрюшинной (i.p.) инъекции, внутримышечной (i.m.) инъекции. Предпочтительные способы инъекции пептидов включают s.c, i.d., i.p., i.m. и i.v. Предпочтительные способы инъекции ДНК включают i.s, s.c, i.p. и i.v. Например, могут вводиться дозы от 1 до 500 мг, от 50 мкг до 1,5 мг, предпочтительно от 10 мкг до 500 мкг пептида или ДНК, причем они могут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в этом диапазоне успешно использовались в предыдущих испытаниях (Brunsvig PF et al., Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12): 1553-1564; M. Staehler et al., ASCO meeting 2007, Abstract No 3017). Специалистам в данной области известны и другие способы введения вакцинной или иммуногенной композиции.

В одном воплощении настоящего изобретения различные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды и/или полипептиды выбирают для применения в вакцинной или иммуногенной композиции против неоплазии так, чтобы максимизировать вероятность получения иммунного ответа против неоплазии/опухолей у большой части субъектов в популяции. Не придерживаясь какой-либо теории, полагаем, что включение разнообразных опухолеспецифичных неоантигенных пептидов может вызывать широкомасштабный иммунный ответ против неоплазии/опухоли. В одном воплощении выбранные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды/полипептиды кодируются миссенс мутациями. В другом воплощении выбранные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды/полипептиды кодируются комбинацией миссенс мутаций и мутаций neoORF. В третьем воплощении выбранные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды/полипептиды кодируются мутациями neoORF.

В одном воплощении, в котором выбранные опухолеспецифичные неоантигенные пептиды/полипептиды кодируются миссенс мутациями, пептиды и/или полипептиды выбирают исходя из их способности связываться с молекулами MHC у большой части субъектов в популяции. Пептиды/полипептиды, полученные из мутаций neoORF, также можно выбирать на основе их способности связываться с молекулами MHC в популяции пациентов.

Вакцинные или иммуногенные композиции способны вызывать специфический ответ цитотоксических Т-клеток и/или специфический ответ хелперных Т-клеток.

Вакцинная или иммуногенная композиция может дополнительно содержать адъювант и/или носитель. Примеры полезных адъювантов и носителей приведены здесь. Пептиды и/или полипептиды в композиции могут быть связаны с таким носителем, например, как белок или антиген-презентирующие клетки типа дендритных клеток (DC), способных презентировать пептид Т-клеткам.

Адъювантами являются любые вещества, присутствие которых в вакцинной или иммуногеннной композиции увеличивает или иным образом модифицирует иммунный ответ на мутантный пептид. Носители представляют собой несущие структуры, к примеру, полипептиды или полисахариды, с которыми могут связываться неоантигенные пептиды. Необязательно, адъюванты ковалентно или нековалентно конъюгируют с пептидами или полипептидами по изобретению.

Способность адъюванта к усилению иммунного ответа на антиген обычно проявляется значительным усилением иммунных реакций или уменьшением симптомов заболевания. Например, усиление гуморального иммунитета обычно проявляется значительным повышением титра антител, вырабатываемых в ответ на антиген, а повышение активности Т-клеток обычно проявляется усилением пролиферации клеток или клеточной цитотоксичности или секреции цитокинов. Адъювант также может изменять иммунный ответ, к примеру, путем изменения преимущественно гуморального или Th2-ответа в преимущественно клеточный или Th1-ответ.

Подходящие адъюванты включают, без ограничения, ISS 1018, соли алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, имиквимод, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCO Matrix, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипид A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel^®, векторные системы, микрочастицы PLGA, резиквимод, SRL172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, VEGF Trap, R848, бета-глюкан, Pam3Cys и стимулон QS21 фирмы Aquila (Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA), который происходит из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические миметики бактериальных клеточных стенок, а также другие фирменные адъюванты типа Detox, Quil или Superfos фирмы Ribi. Ранее были описаны некоторые иммунологические адъюванты (например, MF59), специфичные для дендритных клеток, и их получение (Dupuis M. et al., Cell Immunol., 1998, 186(1): 18-27; Allison AC, Dev Biol Stand., 1998, 92:3-11). Также можно использовать цитокины. Некоторые цитокины прямо связывали с их влиянием на миграцию дендритных клеток в лимфоидные ткани (например, TNF-альфа), ускорением созревания дендритных клеток в эффективные антиген-презентирующие клетки для Т-лимфоцитов (например, GM-CSF, IL-1 и IL-4) (патент США No. 5,849,589, специально включенный сюда путем ссылки во всей полноте) и действием в качестве иммуноадъювантов (например, IL-12) (Gabrilovich DI et al., J Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6): 414-418).

Также в качестве адъювантов могут использоваться Toll-подобные рецепторы (TLR), которые являются важными представителями семейства рецепторов опознавания паттерна (PRR), распознающих консервативные мотивы, присущие многим микроорганизмам, которые называют “патоген-ассоциированными молекулярными структурами” (PAMPS). Распознавание этих “сигналов опасности” активирует множественные элементы врожденной и адаптивной иммунной системы. TLRs экспрессируются такими клетками врожденной и адаптивной иммунной системы, как дендритные клетки (DCs), макрофаги, T- и B-клетки, тучные клетки и гранулоциты, и локализуются в различных клеточных компартментах, таких как плазматическая мембрана, лизосомы, эндосомы и эндолизосомы. Различные TLR распознают разные PAMPS. Например, TLR4 активируется LPS, содержащимся в клеточных стенках бактерий, TLR9 активируется неметилированной бактериальной или вирусной CpG-ДНК, а TLR3 активируется двухцепочечной РНК. Связывание лиганда TLR ведет к активации одного или нескольких внутриклеточных сигнальных путей, что в конечном итоге приводит к образованию многих ключевых молекул, связанных с воспалением и иммунитетом (в частности, фактора транскрипции NF-κB и интерферонов типа I). Опосредованная TLR активация DC ведет к усилению активации DC, фагоцитоза, повышающей регуляции маркеров активации и костимуляции типа CD80, CD83 и CD86, экспрессии CCR7, что способствует миграции DC в дренирующие лимфатические узлы и облегчает презентацию антигенов Т-клеткам, а также к усилению секреции таких цитокинов, как интерфероны I типа, IL-12 и IL-6. Все эти нисходящие события имеют решающее значение для индукции адаптивного иммунного ответа.

Среди наиболее перспективных адъювантов вакцинных или иммуногенных композиций против рака, которые в настоящее время проходят клиническую разработку, находятся агонист TLR9 CpG и синтетический лиганд TLR3 типа двухцепочечной РНК (dsRNA) поли-ICLC. В доклинических исследованиях поли-ICLC оказался самым эффективным адъювантом TLR по сравнению с LPS и CpG вследствие индукции им провоспалительных цитокинов и отсутствия стимуляции IL-10, а также поддержания высоких уровней костимулирующих молекул в клетках DCs 1. Кроме того, недавно проводилось прямое сравнение поли-ICLC с CpG на нечеловекообразных приматах (макаках резус) в качестве адъюванта для белковой вакцинной или иммуногенной композиции, состоящей из 16 капсомеров папилломавируса человека (HPV) (Stahl-Hennig C, Eisenblatter M, Jasny E, et al. Synthetic double-stranded RNAs are adjuvants for the induction of T helper 1 and humoral immune responses to human papillomavirus in rhesus macaques. PLoS pathogens. Apr 2009, 5(4).

Также сообщалось, что иммуностимулирующие олигонуклеотиды CpG усиливают действие адъювантов на фоне вакцинных или иммуногенных композиций. Не придерживаясь какой-либо теории, олигонуклеотиды CpG действуют путем активации врожденной (неадаптивной) иммунной системы через Toll-подобные рецепторы (TLR), в основном TLR9. Запускаемая CpG активация TLR9 усиливает антиген-специфичные гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, вакцины из аутологичных клеток и полисахаридные конъюгаты, как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Еще более важно то, что они усиливают созревание и дифференцировку дендритных клеток, приводя к усилению активации клеток Th1 и образованию очень цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) даже без содействия T-клеток CD4. Вызванное стимуляцией TLR9 преобладание Th1 сохраняется даже в присутствии таких вакцинных адъювантов, как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (IFA), которые обычно способствуют преобладанию Th2. Олигонуклеотиды CpG проявляют еще большую адъювантную активность при составлении или совместном введении с другими адъювантами или в таких формах, как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или аналогичные препараты, которые особенно необходимы для индуцирования сильной реакции, когда антиген является относительно слабым. Они также ускоряют иммунный ответ и позволяют уменьшить дозы антигена примерно на два порядка при сравнимых ответах антител на полные дозы вакцины без CpG в некоторых экспериментах (Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, June 2006, 471-484). В патенте США No. 6,406,705 В1 описано комбинированное применение олигонуклеотидов CpG, адъювантов не из нуклеиновых кислот и антигенов для индуцирования антигенспецифичного иммунного ответа. Коммерчески доступным CpG-антагонистом TLR9 является dSLIM (иммуномодулятор типа двойного “стебля и петли”) фирмы Mologen (Berlin, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтических композиций настоящего изобретения. Также можно использовать и другие связывающиеся с TLR молекулы типа РНК, связывающейся с TLR7, TLR8 и/или TLR9.

Другие примеры полезных адъювантов включают, без ограничения, химически модифицированные CpG (например, CpR, Idera), поли(I:C) (например, полиI:CI2U), бактериальные ДНК или РНК не типа CpG, а также иммуноактивные малые молекулы и антитела, как-то циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NCX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафиниб, XL-999, CP-547632, пазопаниб, ZD2171, AZD2171, ипилимумаб, тремелимумаб и SC58175, которые могут действовать терапевтически и/или в качестве адъюванта. Количества и концентрации адъювантов и добавок, применимых в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены специалистами без излишнего экспериментирования. Дополнительные адъюванты включают колониестимулирующие факторы типа гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF, сарграмостим).

Поли-ICLC – полученная синтетически двухцепочечная РНК, состоящая из нитей поли-I и поли-C средней длиной около 5000 нуклеотидов, которая становится устойчивой к термической денатурации и гидролизу сывороточными нуклеазами при добавлении полилизина и карбоксиметилцеллюлозы. Соединение активирует TLR3 и домен MDA5 РНК-геликазы, представителей семейства PAMP, что ведет к активации клеток DC и натуральных киллеров (NK) и вырабатыванию “естественной смеси” интерферонов I типа, цитокинов и хемокинов. Кроме того, поли-ICLC оказывает более прямое, широкое антиинфекционное и, возможно, противоопухолевое действие на организм хозяина, которое опосредуетсям двумя IFN-индуцибельными системами ядерных ферментов, 2′,5′-OAS и киназой P1/eIF2a, также известной как PKR (4-6), а также геликазой RIG-I и MDA5.

На грызунах и приматах-обезьянах было показано, что поли-ICLC усиливает Т-клеточные реакции на вирусные антигены, перекрестное примирование и индукцию опухоле-, вирус- и аутоантиген-специфичных T-клеток CD8+. В недавнем исследовании на приматах-обезьянах поли-ICLC оказался нужным для выработки антительных ответов и Т-клеточного иммунитета к нацеленному или не нацеленному на DC белку Gag p24 HIV, что подчеркивает его эффективность в качестве вакцинного адъюванта.

У человека транскрипционный анализ серийных образцов цельной крови выявил сходные профили экспрессии генов среди 8 здоровых добровольцев, получавших однократное s.c. введение поли-ICLC, и отличия в экспрессии до 212 генов между этими 8 субъектами и 4 субъектами, получавшими плацебо. Примечательно, что сравнение данных по экспрессии генов при обработке поли-ICLC с предыдущими данными у добровольцев, иммунизированных высокоэффективной вакциной YF17D против желтой лихорадки, показало, что большое число канонических транскрипционных путей и путей передачи сигналов, в том числе и врожденной иммунной системы, одинаково подвергаются повышающей регуляции в пиковые моменты времени.

Совсем недавно сообщалось об иммунологическом анализе у пациентов с раком яичников, фаллопиевых труб и первичным перитонеальным раком при второй или третьей полной клинической ремиссии, которые в исследовании 1-й фазы подвергались подкожной вакцинации с помощью синтетических перекрывающихся длинных пептидов (OLP) из антигена NY-ESO-1 рака яичек самих по себе или вместе с Montanide-ISA-51 или с 1,4 мг поли-ICLC и Montanide. Выработка NY-ESO-1-специфичных Т-клеток CD4+ и CD8+ и антительные ответы заметно усиливались при добавлении поли-ICLC и Montanide по сравнению с одними OLP или OLP и Montanide.

Вакцинные или иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут содержать более одного другого адъюванта. Кроме того, изобретение охватывает терапевтические композиции, содержащие любые адъювантные вещества, в том числе любые из обсуждаемых здесь. Также предусматривается, что пептид или полипептид и адъювант можно вводить по отдельности в любом подходящем порядке.

Носитель может присутствовать независимо от адъюванта. Носитель может быть ковалентно связан с антигеном. Носитель также может быть добавлен к антигену путем встраивания ДНК, кодирующей носитель, в одну рамку считывания с ДНК, кодирующей антиген. Функцией носителя может быть, к примеру, придание устойчивости, повышение биологической активности или увеличение периода полужизни в сыворотке. Увеличение периода полужизни может способствовать снижению количества введений и уменьшению дозы, поэтому оно полезно и по терапевтическим, и по экономическим причинам. Кроме того, носитель может способствовать презентации пептидов Т-клеткам. Носителем может быть любой подходящий носитель, известный специалистам в данной области, к примеру, белок или антиген-презентирующая клетка. Белковым носителем может быть, без ограничения, гемоцианин моллюска блюдечко, такие сывороточные белки, как трансферрин, бычий сывороточный альбумин, сывороточный альбумин человека, тиреоглобулин или овальбумин, иммуноглобулины или гормоны типа инсулина или пальмитиновая кислота. Для иммунизации людей носителем может быть физиологически приемлемый носитель, приемлемый и безопасный для человека. Однако в одном воплощении изобретения подходящим носителем является столбнячный токсоид и/или дифтерийный токсоид. С другой стороны, носителем может быть декстран, к примеру, сефароза.

Цитотоксические Т-клетки (CTLs) распознают антиген в виде пептида, связанного с молекулой MHC, а не самого интактного чужеродного антигена. Сама молекула MHC располагается на поверхности антиген-презентирующей клетки. Таким образом, активация CTLs возможна только в том случае, если присутствует тримерный комплекс из пептидного антигена, молекулы MHC и АПК. Соответственно, они могут усиливать иммунный ответ, если для активации CTLs используется не только пептид, но также добавляются АПК с соответствующей молекулой MHC. Поэтому в некоторых воплощениях вакцинная или иммуногенная композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере одну антиген-презентирующую клетку.

Антиген-презентирующие клетки (или стимулирующие клетки), как правило, содержат молекулы MHC класса I или II на своей поверхности, а в одном воплощении они практически неспособны сами нагрузить молекулы MHC класса I или II выбранным антигеном. Как описано более подробно здесь, молекулы MHC класса I или II можно легко нагрузить выбранным антигеном in vitro.

Активность клеток CD8+ может быть увеличена при помощи клеток CD4+. Идентификация эпитопов для опухолевых антигенов у T-клеток CD4+ вызвала интерес, так как многие иммунологические методы лечения рака могли бы быть более эффективными, если использовать T-лимфоциты CD8+ и CD4+ для нацеливания на опухоль пациента. Клетки CD4+ способны усиливать реакции Т-клеток CD8. Многие исследования на животных моделях четко показали лучшие результаты тогда, когда в противоопухолевых ответах участвуют Т-клетки как CD4+, так и CD8+ (например, см. Nishimura et al. (1999) Distinct role of antigen-specific T helper type 1 (Th1) and Th2 cells in tumor eradication in vivo. J Exp Med 190:617-27). Были идентифицированы универсальные эпитопы Т-клеток CD4+, которые применимы к разработке методов лечения различных типов рака (например, см. Kobayashi et al. (2008) Current Opinion in Immunology 20: 221-27). Например, в вакцинах против меланомы для неспецифической активации Т-клеток CD4+ использовался приуроченный к HLA-DR вспомогательный пептид из столбнячного токсоида (например, см. Slingluff et al. (2007) Immunologic and clinical outcomes of a randomized phase II trial of two multipeptide vaccines for melanoma in the adjuvant setting. Clinical Cancer Research 13(21): 6386-95). В рамках изобретения предусматривается, что такие клетки CD4+ могут быть применимы на трех уровнях, отличающихся по своей опухолеспецифичности: 1) широкий уровень, на котором для увеличения количества клеток CD8+ могут использоваться универсальные эпитопы CD4+ (например, столбнячный токсоид); 2) промежуточный уровень, на котором для увеличения количества клеток CD8+ могут использоваться нативные, связанные с опухолью эпитопы CD4+; и 3) уровень конкретного пациента, на котором для увеличения количества клеток CD8+ могут использоваться эпитопы неоантигенов CD4+ у конкретного пациента. Хотя существующие алгоритмы прогнозирования CD4-эпитопов ограничены по точности, можно вполне разумно ожидать, что многие длинные пептиды, содержащие предсказанные неоэпитопы CD8, также будут включать и CD4-эпитопы. CD4-эпитопы длиннее CD8-эпитопов и обычно имеют длину в 10-12 аминокислот, хотя некоторые могут быть и еще длиннее (Kreiter et al. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to cancer. Nature (2015). Таким образом, описанные здесь неоантигенные эпитопы, либо в виде длинных пептидов (> 25 аминокислот), либо нуклеиновых кислот, кодирующих такие длинные пептиды, также могут усиливать CD4-ответы специфичным для опухоли и пациента образом (уровень (3) выше).

Клеточный иммунитет CD8+ также может быть получен с помощью вакцины из нагруженных неоантигеном дендритных клеток (DC). DC являются сильными антиген-презентирующими клетками, которые инициируют Т-клеточный иммунитет и могут применяться в качестве противораковых вакцин при нагрузке их одним или несколькими нужными пептидами, к примеру, путем прямой инъекции пептидов. Было показано, что у пациентов с недавним диагнозом метастатической меланомы вырабатывается иммунитет против 3 пептидов, происходящих из приуроченного к HLA-A* 0201 антигена gp100 меланомы, с помощью обработанных аутологичными пептидами активированных CD40L/IFN-γ зрелых клеток DC посредством вакцины из вырабатывающих IL-12p70 клеток DC пациента (например, см. Carreno et al. (2013) IL-12p70-producing patient DC vaccine elicits Tc1-polarized immunity. Journal of Clinical Investigation, 123(8):3383-94; и Ali et al. (2009) In situ regulation of DC subsets and T cells mediates tumor regression in mice. Cancer Immunotherapy, 1(8):1-10). В рамках изобретения предусматривается, что нагруженные неоантигеном DCs могут быть получены с помощью синтетического агониста TLR3 полиинозиновой-полицитидиловой кислоты-поли-L-лизин-карбоксиметилцеллюлозы (поли-ICLC) для стимуляции DCs. Поли-ICLC является мощным индивидуальным стимулятором созревания для клеток DC человека, судя по повышающей регуляции CD83 и CD86, индукции интерлейкина-12 (IL-12), фактора некроза опухолей (TNF), индуцируемого γ-интерфероном белка 10 (IP-10), интерлейкина-1 (IL-1) и интерферонов I типа (IFN) и минимальной продукции интерлейкина 10 (IL-10). Клетки DC можно подвергнуть дифференцировке из замороженных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs), полученных методом лейкафереза, а сами PBMCs можно выделить центрифугированием в градиенте фиколла и заморозить порциями.

В качестве иллюстрации можно использовать следующий 7-дневный протокол активации. День 1 – оттаивают PBMCs и помещают в колбы для культивирования тканей, чтобы отобрать моноциты, которые прилипают к поверхности пластика после 1-2-часовой инкубации при 37°C в инкубаторе для тканевых культур. После инкубации лимфоциты смывают, а прилипшие моноциты культивируют 5 дней в присутствии интерлейкина-4 (IL-4) и колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) для дифференцировки в незрелые DCs. На 6-й день к незрелым DCs добавляют белок гемоцианин моллюска блюдечко (KLH), который служит контролем на качество вакцины и может усиливать иммуногенность вакцины. Клетки DC стимулируют к созреванию, нагружают пептидными антигенами и инкубируют в течение ночи. На 7-й день клетки промывают, замораживают порциями в 1 мл, содержащими 4-20×10⁶ клеток, используя морозильную камеру с контролируемой скоростью. Перед введением DCs пациентам можно провести контрольное тестирование полученных партий DCs с тем, чтобы они удовлетворяли минимальным требованиям (например, см. Sabado et al. (2013) Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy. J. Vis Exp. Aug 1, (78). doi: 10.3791/50085).

DC-вакцины можно заключить в “скелетную” систему для облегчения их введения пациентам. При терапевтическом лечении неоплазии у пациентов с помощью DC-вакцины можно использовать систему биоматериалов, которая высвобождает факторы, рекрутирующие дендритные клетки хозяина в это устройство, дифференцирует резидентные, незрелые DCs путем локальной презентации адъювантов (например, сигналов опасности) при высвобождении антигена и способствует высвобождению активированных нагруженных антигеном DCs в лимфатические узлы (или желательное место действия), где DCs могут взаимодействовать с Т-клетками и вырабатывать сильные реакции цитотоксических Т-лимфоцитов на раковые неоантигены. Для получения сильной реакции цитотоксических Т-лимфоцитов против неоплазии у пациента специфическим образом можно использовать имплантируемые биоматериалы. При этом обитающие в биоматериале дендритные клетки можно активировать воздействием на них сигналов опасности, имитирующих инфекцию, в сочетании с высвобождением антигена из биоматериала. После этого активированные дендритные клетки мигрируют из биоматериала в лимфатические узлы и индуцируют эффекторные реакции цитотоксических Т-клеток. Ранее в доклинических исследованиях с использованием лизатов, полученных из биоптатов опухолей, было показано, что такой подход приводит к регрессии установившейся меланомы (например, см. Ali et al. (2209) In situ regulation of DC subsets and T cells mediates tumor regression in mice. Cancer Immunotherapy 1(8):1-10; Ali et al. (2009) Infection-mimicking materials to program dendritic cells in situ. Nat Mater. 8:151-8), и теперь такая вакцина проходит клинические испытания фазы I, недавно начавшиеся в Институте рака Dana-Farber. Также было показано, что данный подход приводит к регрессии глиобластомы, а также к индукции сильной реакции памяти для предотвращения рецидива на модели глиомы C6 у крыс в настоящей заявке. Способность таких имплантируемых биоматриксных “скелетных” систем доставки вакцин амплифицировать и поддерживать опухолеспецифичную активацию дендритных клеток может приводить к более устойчивой иммуносенсибилизации против опухолей, чем при традиционном подкожном или интранодальном введении вакцин.

Настоящее изобретение может включать в себя любые методы нагрузки неоантигенных пептидов на дендритные клетки. Одним из таких методов, применимых в настоящем изобретении, являются микрофлюидные системы внутриклеточной доставки. Такие системы вызывают временное разрушение мембраны путем быстрой механической деформации иммунных клеток человека и мыши, что способствует внутриклеточной доставке биомолекул (Sharei et al., 2015, Plos One).

Предпочтительно антиген-презентирующие клетки представлены дендритными клетками. Соответственно, дендритные клетки представлены аутологичными дендритными клетками, которые обработаны неоантигенным пептидом. Пептид может быть представлен любым подходящим пептидом, который вызывает соответствующий Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток, нагруженных пептидами из ассоциированного с опухолью антигена, изложена в Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380; и Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278. В некоторых воплощениях дендритные клетки нацеливают с помощью маркеров CD141, DEC205 или XCR1. Клетки DC CD141⁺ XCR1⁺ были идентифицированы как подмножество, которое лучше всего подходит для индукции противоопухолевых ответов (Bachem et al., J. Exp. Med., 207, 1273-1281 (2010); Crozat et al., J. Exp. Med. 207, 1283-1292 (2010); и Gallois & Bhardwaj, Nature Med., 16, 854-856 (2010)).

Итак, в одном воплощении настоящего изобретения вакцинная или иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере одну антиген-презентирующую клетку, обрабатывается или нагружается одним или несколькими пептидами настоящего изобретения. С другой стороны, можно нагрузить пептидами ex vivo мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs), выделенные у пациента, и ввести обратно пациенту. В качестве альтернативы антиген-презентирующие клетки содержат экспрессионную конструкцию, кодирующую пептид настоящего изобретения. Полинуклеотид может быть представлен любым подходящим полинуклеотидом, который предпочтительно способен трансдуцировать дендритные клетки, что ведет к презентации пептида и индукции иммунитета.

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть составлена таким образом, чтобы выбор, количество и/или содержание пептидов, присутствующих в композиции, охватывало большую часть субъектов в популяции. Выбор может зависеть от конкретного типа рака, статуса заболевания, предыдущего режима лечения и, конечно, HLA-гаплотипов, присутствующих в популяции пациентов.

Фармацевтические композиции, содержащие пептиды по изобретению, могут вводиться лицам, уже страдающим раком. При терапевтическом применении композиции вводятся пациентам в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать эффективную реакцию CTL на опухолевый антиген и вылечить или хотя бы частично остановить симптомы и/или осложнения. Подходящее для достижения этого количество определяется как “терапевтически эффективная доза”. Количество, эффективное для такого применения, может зависеть, например, от пептидной композиции, способа введения, стадии и тяжести подлежащего лечению заболевания, веса и общего состояния здоровья пациента и мнения назначающего врача, но обычно оно составляет при первичной иммунизации (то есть при терапевтическом или профилактическом введении) от 1,0 мкг до 50 000 мкг пептида для пациента в 70 кг с последующими буст-введениями в дозах от 1,0 мкг до 10 000 мкг пептида по схеме ревакцинации на протяжении недель или месяцев в зависимости от реакции и состояния пациента и, по возможности, по измерению специфической CTL-активности в крови пациента. Следует иметь в виду, что пептиды и композиции настоящего изобретения обычно применяются при серьезных заболеваниях, то есть в опасных для жизни или потенциально опасных для жизни ситуациях, особенно если рак уже дал метастазы. Для терапевтического применения введение следует начинать как можно раноше после обнаружения или хирургического удаления опухолей. После этого следует буст-введения до тех пор, пока симптомы по крайней мере не уменьшатся существенно, и в последующий период.

Фармацевтические композиции (например, вакцинные композиции) для терапевтического применения предназначаются для парентерального, топического, назального, перорального или местного введения. Предпочтительно фармацевтические композиции вводятся парентерально, например, внутривенно, подкожно, интрадермально или внутримышечно. Композиции можно вводить по месту хирургического удаления, чтобы индуцировать локальный иммунный ответ на опухоль. Изобретением предусмотрены композиции для парентерального введения, которые включают раствор пептидов, и вакцинные или иммуногенные композиции, которые растворяют или суспендируют в приемлемом носителе, предпочтительно водном носителе. Можно использовать различные водные носители, например, воду, воду с буфером, 0,9% солевой раствор, 0,3% глицин, гиалуроновую кислоту и т.п. Эти композиции стерилизуют стандартными, хорошо известными методами стерилизации или же стерилизуют фильтрованием. Полученные водные растворы упаковывают для использования в таком виде или лиофилизируют, а лиофилизованный препарат комбинируют со стерильным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для аппроксимации физиологических условий, как-то вещества для доведения рН и буферные вещества, средства для поддержания изотоничности, смачивающие вещества и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат, триэтаноламин-олеат и др.

Липосомные суспензии, содержащие пептиды, могут вводиться внутривенно, местно, топически и т.д. в дозах, которые варьируются в зависимости, среди прочего, от способа введения, вводимого пептида и стадии подлежащего лечению заболевания. Для нацеливания на иммунные клетки в липосомы может быть включен лиганд, такой, например, как антитела или их фрагменты, специфичные к детерминантам клеточной поверхности требуемых клеток иммунной системы.

Для твердых композиций можно использовать стандартные нетоксичные твердые носители или наночастицы, которые включают, к примеру, фармацевтические марки маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, талька, целлюлозы, глюкозы, сахарозы, карбоната магния и др. Для перорального введения фармацевтически приемлемые нетоксичные композиции получают путем включения любых обычно применяемых эксципиентов типа приведенных ранее носителей и обычно 10-95% активного ингредиента, то есть одного или нескольких пептидов по изобретению, более предпочтительно в концентрации 25-75%.

Для аэрозольного введения иммуногенные пептиды предпочтительно поставляют в мелкоизмельченном виде вместе с поверхностно-активным веществом и вытеснителем. Типичное содержание пептидов составляет от 0,01% до 20% масс., предпочтительно от 1% до 10%. Поверхностно-активное вещество, конечно, должно быть нетоксичным и предпочтительно растворимым в вытеснителе. Представителями таких веществ являются эфиры или неполные эфиры жирных кислот, содержащих от 6 до 22 атомов углерода, типа капроновой, октановой, лауриновой, пальмитиновой, стеариновой, линолевой, линоленовой, олестеровой и олеиновой кислоты, с алифатическим многоатомным спиртом или его циклическим ангидридом. Можно использовать смешанные сложные эфиры типа смешанных или природных глицеридов. Поверхностно-активное вещество может составлять от 0,1% до 20% мас. композиции, предпочтительно 0,25-5%. Баланс композиции обычно составляет вытеснитель. Также по желанию может быть включен и носитель, например, типа лецитина для интраназального введения.

Пептиды и полипептиды по изобретению можно легко синтезировать химически, используя реагенты, не содержащие загрязняющих бактериальных веществ или веществ животного происхождения (Merrifield RB. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963).

Пептиды и полипептиды по изобретению также можно экспрессировать из вектора, например, молекулы нуклеиновой кислоты типа описанных здесь, например, РНК- или ДНК-плазмид, вирусных векторов типа поксвирусов, например, ортопоксвирусов, авипоксвирусов, либо аденовирусов, AAV или лентивирусов. Этот подход включает использование вектора для экспрессии последовательностей нуклеотидов, кодирующих пептид по изобретению. При введении в организм с острой или хронической инфекцией или в неинфицированный организм хозяина вектор экспрессирует иммуногенный пептид и тем самым вызывает реакцию CTL у хозяина.

В целях лечения или иммунизации пациентам также можно вводить нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды по изобретению, и необязательно один или несколько из описанных здесь пептидов. Для доставки нуклеиновых кислот пациентам обычно применяется целый ряд методов. Например, нуклеиновая кислота может вводиться непосредственно в виде “голой ДНК”. Такой подход описан, к примеру, в Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990), а также в патенты США Nos. 5,580,859 и 5,589,466. Нуклеиновые кислоты также можно вводить баллистическим методом, как описано, к примеру, в патент США No. 5,204,253. Можно вводить частицы, состоящие исключительно из ДНК. С другой стороны, ДНК можно прикрепить к частицам типа частиц золота. Как правило, плазмида для вакцинной или иммунологической композиции может содержать ДНК, кодирующую антиген (например, один или несколько неоантигенов), функционально связанную с регуляторными последовательностями, контролирующими экспрессию либо экспрессию и секрецию антигена из клеток хозяина, например, клеток млекопитающих; к примеру, в нисходящем порядке: ДНК для промотора типа промотора вируса млекопитающих (например, промотора CMV типа промотора hCMV или mCMV, например, раннего-промежуточного промотора, или же промотора SV40, см. документы, приведенные здесь или включенные сюда, на предмет применимых промоторов), ДНК для эукариотического лидерного пептида для секреции (например, активатора тканевого плазминогена), ДНК для неоантигена (неоантигенов) и ДНК, кодирующая терминатор (например, терминатор транскрипции из 3′-UTR гена, кодирующего бычий гормон роста, или поли-A bGH). Композиция может содержать более одной плазмиды или вектора, при этом каждый вектор содержит и экспрессирует другой неоантиген. Также отметим Wasmoen, патент США No. 5,849,303, и Dale, патент США No. 5,811,104, которые могут оказаться полезными. Препараты типа ДНК или ДНК-плазмид могут быть составлены вместе с или внутри катионных липидов; а что касается катионных липидов, а также адъювантов, то отметим также Loosmore, заявка на патент США 2003/0104008. Кроме того, можно использовать приведенные в Audonnet, патент США Nos. 6,228,846 и 6,159,477 сведения насчет ДНК-плазмид при конструировании и использовании ДНК-плазмид, содержащих и экспрессирующих нуклеиновые кислоты in vivo.

Нуклеиновые кислоты также могут доставляться в комплексе с катионными соединениями типа катионных липидов. Опосредованные липидами методы доставки генов описаны, к примеру, в WO 996/18372; WO 1993/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6 (7): 682-691 (1988); патент США No. 5,279,833; WO 1991/06309; и Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987).

Для доставки также можно использовать РНК, кодирующие нужные пептиды (например, мРНК) (например, см. Kiken et al., 2011; Su et al., 2011; а также см. US 8278036, Halabi et al., J Clin Oncol. (2003) 21:1232-1237; Petsch et al., Nature Biotechnology 2012, Dec 7, 30 (12):1210-6).

Для доставки неоантигенных пептидов по изобретению также можно использовать вирусные векторы, описанные здесь. Векторы можно вводить так, чтобы получить экспрессию in vivo и ответы, соответствующие дозам, и/или реакции, вызванные введением антигена.

Предпочтительным средством введения нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды по изобретению, являются минигенные конструкции, кодирующие множественные эпитопы. Для создания последовательности ДНК (минигена), кодирующей выбранные эпитопы CTL для экспрессии в клетках человека, аминокислотные последовательности эпитопов подвергают обратной трансляции. Для помощи в выборе кодонов для каждой аминокислоты используется таблица употребительности кодонов у человека. Эти кодирующие эпитопы последовательности ДНК соединяют друг с другом, создавая непрерывную последовательность полипептида. Для оптимизации экспрессии и/или иммуногенности в конструкцию минигена можно включать дополнительные элементы. Примеры аминокислотных последовательностей, которые можно подвергнуть обратной трансляции и включать в последовательности минигенов, включают: эпитопы хелперных Т-лимфоцитов, лидерные (сигнальные) последовательности и сигналы удерживания в эндоплазматическом ретикулуме. Кроме того, можно улучшить MHC-презентацию CTL-эпитопов путем включения синтетических (например, полиаланиновых) или природных фланкирующих последовательностей, примыкающих к CTL-эпитопам.

Последовательность минигена преобразуют в ДНК путем сборки олигонуклеотидов, кодирующих “плюс-цепь” и “минус-цепь” минигена. Синтезируют перекрывающиеся олигонуклеотиды (длиной в 30-100 оснований), фосфорилируют, очищают и гибридизуют их в подходящих условиях с помощью хорошо известных методов. Концы олигонуклеотидов соединяют с помощью ДНК-лигазы T4. Этот синтетический миниген, кодирующий полипептид эпитопа CTL, можно затем клонировать в желательный экспрессирующий вектор.

Для обеспечения экспрессии в клетках-мишенях в вектор включают стандартные регуляторные последовательности, хорошо известные специалистам. Требуется несколько векторных элементов: промотор с нижерасположенным сайтом клонирования для вставки минигена; сигнал полиаденилирования для эффективной терминации транскрипции; точка начала репликации E. coli; и маркер отбора в E. coli (например, резистентность к ампициллину или канамицину). Для этой цели можно использовать многие промоторы, например, промотор цитомегаловируса человека (hCMV). См. патенты США Nos. 5,580,859 и 5,589,466 на предмет других подходящих последовательностей промоторов.

Для оптимизации экспрессии и иммуногенности минигена могут потребоваться дополнительные модификации вектора. В некоторых случаях для эффективной экспрессии гена требуются интроны, поэтому в транскрибируемую область минигена можно включать один или несколько синтетических или естественных интронов. Для усиления экспрессии минигена также может предусматриваться включение последовательностей стабилизации мРНК. Недавно было предложено, чтобы в иммуногенности ДНК-вакцин играли роль иммуностимулирующие последовательности (ISSs или CpGs). Эти последовательности могут быть включены в вектор за пределами кодирующей последовательности минигена, если окажется, что они усиливают иммуногенность.

В некоторых воплощениях можно использовать бицистронный экспрессирующий вектор, позволяющий продуцировать кодируемые минигеном эпитопы и второй белок, включенный для усиления или уменьшения иммуногенности. Примеры белков или полипептидов, которые могут выгодно усиливать иммунный ответ при совместной экспрессии, включают цитокины (например, IL-2, IL-12, GM-CSF), молекулы, индуцирующие цитокины (например, LeIF), или костимулирующие молекулы. Хелперные (HTL) эпитопы можно соединять с сигналами внутриклеточного таргетинга и экспрессировать отдельно от CTL-эпитопов. Это позволит направлять HTL-эпитопы в клеточный компартмент, отличный от CTL-эпитопов. При необходимости это могло бы способствовать более эффективному вхождению HTL-эпитопов в путь MHC класса II, тем самым улучшая индукцию CTL. В отличие от индукции CTL, именно ослабление иммунного ответа путем совместной экспрессии иммуносупрессорных молекул (например, TGF-β) может быть выгодным при некоторых заболеваниях.

После выбора экспрессирующего вектора миниген клонируют в участок полилинкера ниже промотора. Этой плазмидой трансформируют подходящий штамм E. coli и получают ДНК стандартными методами. Ориентацию и последовательность ДНК минигена, а также всех других элементов, включенных в вектор, проверяют методами рестрикционного картирования и анализа последовательности ДНК. Бактериальные клетки, содержащие правильную плазмиду, можно хранить в виде главного банка клеток и рабочего банка клеток.

Очищенную плазмидную ДНК для инъекций можно приготовить в виде различных составов. Простейшим из них является восстановление лиофилизированной ДНК в стерильном фосфатно-буферном солевом растворе с (PBS). Описано много различных методов, и могут появиться новые методы. Как уже отмечалось, нуклеиновые кислоты обычно составляют с катионными липидами. Кроме того, с очищенной плазмидной ДНК также можно комплексировать гликолипиды, фузогенные липосомы, пептиды и соединения, собирательно именуемые защитными, интерактивными, неконденсирующимися (PINC), которые влияют на такие переменные, как устойчивость, внутримышечное рассасывание или транспортировка в определенные органы или типы клеток.

В качестве функционального анализа на экспрессию и презентацию MHC класса I кодируемых минигеном CTL-эпитопов можно использовать сенсибилизацию клеток мишени. Плазмидную ДНК вводят в линию клеток млекопитающих, которая подходит в качестве мишени для стандартных анализов высвобождения хрома из CTL. Используемый метод трансфекции зависит от конечной рецептуры. Для “голой” ДНК можно использовать электропорацию, тогда как катионные липиды допускают прямую трансфекцию in vitro. Можно совместно трансфецировать плазмиду, экспрессирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP), чтобы обеспечить обогащение трансфецированных клеток методом флуоресцентно-активируемой сортировки (FACS). Эти клетки затем метят хромом-51 и используют в качестве клеток-мишеней для эпитоп-специфичных линий CTL. Цитолиз, детектируемый по высвобождению ⁵¹Cr, указывает на продукцию презентируемых MHC кодируемых минигеном эпитопов CTL.

Второй подход к функциональному тестированию составов с ДНК минигенов заключается в иммуногенности in vivo. Трансгенных мышей, экспрессирующих соответствующие молекулы MHC человека, иммунизируют ДНК-продуктом. Дозировка и способ введения зависят от рецептуры (например, в/м для ДНК в PBS, в/б для ДНК в комплексе с липидами). Через 21 день после иммунизации извлекают спленоциты и подвергают их рестимуляции в течение 1 недели в присутствии пептидов, соответствующих каждому из тестируемых эпитопов. Эти эффекторные клетки (CTLs) анализируют на цитолиз нагруженных пептидами меченных ⁵¹Cr клеток мишени стандартными методами. Лизис клеток мишени, сенсибилизированных при нагрузке MHC пептидами, соответствующими кодируемым минигеном эпитопам, свидетельствует о функциональности ДНК-вакцины для индукции CTLs in vivo.

Пептиды также можно использовать для индукции CTL ex vivo. Полученные CTL можно использовать для лечения хронических опухолей у нуждающихся в этом пациентов, не реагирующих на другие традиционные формы терапии или не реагирующих на лечение с помощью пептидной вакцины. Реакции CTL ex vivo на конкретный опухолевый антиген индуцируют путем инкубации в тканевой культуре клеток-предшественников CTL пациента (CTLp) вместе с источником антиген-презентирующих клеток (АПК) и соответствующим пептидом. После соответствующего времени инкубации (обычно 1-4 недели), при которой CTLp активируются и созревают и превращаются в эффекторные CTL, клетки вводятся обратно пациенту, где они разрушают свою специфичные клетки-мишени (то есть опухолевые клетки). Для того, чтобы оптимизировать условия in vitro для получения специфичных цитотоксических Т-клеток, культуру стимулирующих клеток поддерживают в соответствующей бессывороточной среде.

Перед инкубацией стимулирующих клеток с подлежащими активации клетками, например, предшественниками клеток CD8+, в культуру стимулирующих клеток добавляют антигенный пептид в количестве, достаточном для нагрузки им молекул класса I человека, экспрессирующихся на поверхности стимулирующих клеток. В настоящем изобретении достаточное количество пептида означает такое количество, которое позволяет 200, а предпочтительно 200 и больше молекулам MHC класса I человека, нагруженным этим пептидом, экспрессироваться на поверхности каждой стимулирующей клетки. Предпочтительно стимулирующие клетки инкубируют с пептидом при >2 мкг/мл. Например, стимулирующие клетки инкубируют с пептидом при > 3, 4, 5, 10, 15 мкг/мл или больше.

Затем покоящиеся или предшественники клеток CD8+ инкубируют в культуре с соответствующими стимулирующими клетками в течение периода времени, достаточного для активации клеток CD8+. Предпочтительно клетки CD8+ активируются антиген-специфичным образом. Соотношение покоящихся или предшественников (эффекторных) клеток CD8+ к стимулирующим клеткам может варьироваться от индивида к индивиду и может дополнительно зависеть от таких переменных, как восприимчивость лимфоцитов индивида к условиям культивирования, а также характера и тяжести заболевания или других состояний, при которых применяется описанный здесь способ лечения. Однако предпочтительно соотношение лимфоциты:стимулирующие клетки находится в пределах от 30:1 до 300:1. Культуру эффекторных/стимулирующих клеток можно поддерживать столько, сколько нужно для стимуляции терапевтически пригодного или эффективного количества клеток CD8+.

Индукция CTL in vitro требует специфического распознавания пептидов, связанных с аллелеспецифичными молекулами MHC класса I на АПК. Количество специфичных комплексов MHC/пептид на АПК имеет решающее значение для стимуляции CTL, в особенности при первичных иммунных ответах. Хотя небольшое количество комплексов пептид/MHC на клетку и достаточно для того, чтобы сделать клетки восприимчивыми к лизису под действием CTL или стимулировать вторичный ответ CTL, однако успешная активация предшественников CTL (pCTL) при первичных ответах требует значительно большего числа комплексов MHC/пептид. Нагрузка пептидом пустых молекул главного комплекса гистосовместимости на клетках позволяет индуцировать первичные ответы цитотоксических Т-лимфоцитов.

Поскольку не для каждого аллеля MHC человека существует линия мутантных клеток, то целесообразно использовать метод удаления с поверхности АПК эндогенных пептидов, связанных с MHC, а затем нагрузить образовавшиеся пустые молекулы MHC нужными иммуногенными пептидами. При составлении методик индукции CTL, направленных на разработку CTL-терапии ex vivo, желательно в качестве АПК использовать нетрансформированные (неопухолеродные), неинфицированные клетки, предпочтительно аутологичные клетки пациентов. В настоящей заявке изложены способы удаления с поверхности АПК эндогенных пептидов, связанных с MHC, с последующей загрузкой требуемых пептидов.

Стабильные молекулы MHC класса I образуют тримерный комплекс из следующих элементов: 1) пептид, обычно из 8-10 остатков, 2) трансмембранная тяжелая полиморфная белковая цепь, которая несет сайт связывания пептидов в своих α1- и α2-доменах, и 3) нековалентно связанная неполиморфная легкая цепь – β2-микроглобулин. Удаление связанных пептидов и/или диссоциация β2-микроглобулина из комплекса делает молекулы MHC класса I нефункциональными и нестабильными, что ведет к быстрой деградации. Все молекулы MHC класса I, выделенные из РВМС, содержат связанные с ними эндогенные пептиды. Поэтому первым шагом является удаление всех эндогенных пептидов, связанных с молекулами MHC класса I на АПК, не вызывая их деградации до того, как с ними могут связаться экзогенные пептиды.

Два возможных способа освобождения молекул MHC класса I от связанных пептидов включают снижение температуры культивирования от 37°C до 26°C в течение ночи для дестабилизации β2-микроглобулина и отделение эндогенных пептидов из клетки с помощью мягкой обработки кислотой. Эти способы высвобождения ранее связанных пептидов во внеклеточную среду позволяют новым экзогенным пептидам связываться с пустыми молекулами класса I. Метод инкубации при холодной температуре позволяет экзогенным пептидам эффективно связываться с комплексом MHC, но требует инкубации в течение ночи при 26°C, что может замедлить скорость метаболизма клетки. Также вероятно, что клетки, которые не синтезируют активно молекулы MHC (например, покоящиеся РВМС), не будут давать большого количества пустых молекул MHC на поверхности по методике холодной температуры.

Отделение при жесткой обработке кислотой включает экстракцию пептидов трифторуксусной кислотой при рН 2 или денатурацию кислотой подвергнутых иммуноаффинной очистке комплексов класса I с пептидами. Эти методы не подходят для индукции CTL, так как нужно удалить эндогенные пептиды так, чтобы сохранилась жизнеспособность клеток АПК и оптимальное метаболическое состояние, которое имеет решающее значение для презентации антигена. Для идентификации эндогенных пептидов и идентификации связанных с опухолью Т-клеточных эпитопов использовались слабые растворы кислоты при рН 3 типа глициновых или цитрат-фосфатных буферов. Такая обработка особенно эффективна тем, что дестабилизируются только молекулы MHC класса I (и высвобождаются связанные пептиды), тогда как другие поверхностные антигены остаются интактными, включая молекулы MHC класса II. Самое главное то, что обработка клеток слабыми растворами кислоты не влияет на жизнеспособность или метаболическое состояние клеток. Мягкая обработка кислотой является быстрой, так как отделение эндогенных пептидов происходит за две минуты при 4°C, и клетки АПК готовы выполнять свои функции после загрузки соответствующих пептидов. Эта методика применяется здесь для получения пептидоспецифичных АПК для генерации первичных антигенспецифичных клеток CTL. Образующиеся АПК эффективно индуцируют пептид-специфичные CTL CD8+.

Активированные клетки CD8+ можно эффективно отделить от стимулирующих клеток одним из известных методов. Например, можно использовать моноклональные антитела, специфичные к стимулирующим клеткам, к пептидам, нагруженным на стимулирующие клетки, или к клеткам CD8+ (или их сегментам), чтобы они связались с соответствующим комплементарным лигандом. Затем можно экстрагировать помеченные антителом молекулы из смеси стимулирующих и эффекторных клеток соответствующим способом, например, хорошо известным методом иммунопреципитации или иммуноанализа.

Эффективное цитотоксическое количество активированных клеток CD8+ может варьироваться между применением in vitro и in vivo, а также от количества и типа клеток, являющихся конечной мишенью этих клеток-киллеров. Это количество также может варьироваться в зависимости от состояния пациента и должно определяться лечащим врачом с учетом всех соответствующих факторов. Однако предпочтительно для взрослых людей используют от 1×10⁶ до 1×10¹², более предпочтительно от 1×10⁸ до 1×10¹¹ и еще более предпочтительно от 1×10⁹ до 1×10¹⁰ активированных клеток CD8+, в сравнении с тем, что на мышах используют от 5×10⁶ до 5×10⁷ клеток.

Предпочтительно, как уже обсуждалось, активированные клетки CD8+ собирают из клеточной культуры перед введением клеток CD8+ проходящему лечение индивиду. Однако важно отметить то, что в отличие от других существующих и предлагаемых способов лечения в настоящем способе применяется система культивирования клеток, которая не является опухолеродной. Поэтому, если не достигается полное разделение стимулирующих клеток и активированных клеток CD8+, то это не повлечет опасности, связанной со введением небольшого количества стимулирующих клеток, тогда как введение вызывающих опухоли клеток млекопитающих может быть чрезвычайно опасным.

Способы повторного введения клеточных компонентов известны в данной области и включают в себя процедуры типа тех, что приведены в патент США No. 4,844,893 на Honsik et al. и в патент США No. 4,690,915 на Rosenberg. Например, подходит введение активированных клеток CD8+ путем внутривенной инфузии.

При осуществлении настоящего изобретения применяются, если не указано иначе, стандартные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые входят в компетенцию квалифицированных специалистов. Такие методы полностью изложены в литературе, как-то “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology”, “Handbook of Experimental Immunology” (Wei, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction” (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991). Эти методы применимы к получению полинуклеотидов и полипептидов по изобретению и, как таковые, должны учитываться при осуществлении и практическом применении изобретения. Особенно полезные методы для конкретных воплощений рассматриваются в нижеследующих разделах.

Терапевтические методы

Настоящим изобретением предусмотрены способы индуцирования специфичного к неоплазии/опухоли иммунного ответа у субъекта, вакцинации против неоплазии/опухоли, лечения и/или облегчения симптомов рака у субъектов путем введения им нескольких неоантигенных пептидов или композиции по изобретению.

Согласно изобретению, описанные здесь вакцинные или иммуногенные композиции против неоплазии могут применяться для пациентов, которым был поставлен диагноз рака или подверженных риску возникновения рака.

Заявленные комбинации по изобретению вводятся в количестве, достаточном для индуцирования реакции CTL.

Дополнительные способы лечения

Опухолеспецифичные неоантигенные пептиды и фармацевтические композиции, описанные здесь, также можно вводить при комбинированной терапии с другим агентом, к примеру, терапевтическим средством. В некоторых воплощениях дополнительные средства могут представлять собой, без ограничения, химиотерапевтические средства, средства против ангиогенеза и средства, уменьшающие иммуносупрессию.

Вакцинные или иммуногенные композиции против неоплазии можно вводить до, во время или после введения дополнительного средства. В одних воплощениях вакцинная или иммуногенная композиция против неоплазии вводится перед первым введением дополнительного средства. В других воплощениях вакцинная или иммуногенная композиция против неоплазии вводится после первого введения дополнительного терапевтического средства (например, через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 дней и более). В некоторых воплощениях вакцинная или иммуногенная композиция против неоплазии вводится одновременно с первым введением дополнительного терапевтического средства.

Терапевтическими средствами являются, к примеру, химиотерапевтические или биотерапевтические средства, облучение или иммунотерапия. Может применяться любое подходящее терапевтическое лечение для конкретного рака. Примеры химиотерапевтических и биотерапевтических средств включают, без ограничения, ингибиторы ангиогенеза, как-то гидроксиангиостатин K1-3, DL-α-дифторметил-орнитин, эндостатин, фумагиллин, генистеин, миноциклин, стауроспорин и талидомид; ДНК-интеркалирующие/сшивающие средства, как-то блеомицин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, циклофосфамид, цис-диамминдихлороплатина(II) (цисплатин), мелфалан, митоксантрон и оксалиплатин; ингибиторы синтеза ДНК, как-то (±)-аметоптерин (метотрексат), 3-амино-1,2,4-бензотриазин-1,4-диоксид, аминоптерин, цитозин-D-арабинофуранозид, 5-фтор-5′-дезоксиуридин, 5-фторурацил, ганцикловир, гидроксимочевина и митомицин C; регуляторы транскрипции ДНК-РНК, как-то актиномицин D, даунорубицин, доксорубицин, гомохаррингтонин и идарубицин; ингибиторы ферментов, как-то S-(+)-камптотецин, куркумин, (−)-дегуэлин, 5,6-дихлорбензимидазол-1-β-D-рибофуранозид, этопозид, форместан, фостриецин, гиспидин, 2-имино-1-имидазолидинуксусная кислота (циклокреатин), мевинолин, трихостатин A, тирфостин AG 34 и тирфостин AG 879; регуляторы генов, как-то 5-аза-2′-дезоксицитидин, 5-азацитидин, холекальциферол (витамин D₃), 4-гидрокситамоксифен, мелатонин, мифепристон, ралоксифен, полностью транс-ретиналь (альдегид витамина A), полностью транс-ретиновая кислота (кислота витамина A), 9-цис-ретиновая кислота, 13-цис-ретиновая кислота, ретинол (витамин А), тамоксифен и троглитазон; ингибиторы микротрубочек, как-то колхицин, доцетаксель, доластатин 15, нокодазол, паклитаксель, подофиллотоксин, ризоксин, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин (Navelbine); и неклассифицированные терапевтические средства, как-то 17-(аллиламино)-17-деметоксигелданамицин, 4-амино-1,8-нафталимид, апигенин, брефелдин А, циметидин, дихлорметилендифосфоновая кислота, лейпролид (лейпрорелин), гонадотропин-рилизинг-гормон, пифитрин-α, рапамицин, связывающий половые гормоны глобулин, тапсигаргин и мочевой ингибитор трипсина (Bikunin). Терапевтическим средством может быть альтретамин, амифостин, аспарагиназа, капецитабин, кладрибин, цисаприд, цитарабин, дакарбазин (DTIC), дактиномицин, дронабинол, альфа-эпоетин, филграстим, флударабин, гемцитабин, гранисетрон, ифосфамид, иринотекан, лансопразол, левамизол, лейковорин, мегестрол, месна, метоклопрамид, митотан, омепразол, ондансетрон, пилокарпин, прохлорперазин или топотекан гидрохлорид. Терапевтическим средством может быть моноклональное антитело или небольшая молекула, как-то ритуксимаб (Rituxan^®), алемтузумаб (Campath^®), бевацизумаб (Avastin^®), цетуксимаб (Erbitux^®), панитумумаб (Vectibix^®) и трастузумаб (Herceptin^®), вемурафениб (Zelboraf^®), иматиниб мезилат (Gleevec^®), эрлотиниб (Tarceva^®), гефитиниб (Iressa^®), висмодегиб (Erivedge™), ⁹⁰Y-ибритумомаб тиуксетан, ¹³¹I-тоситумомаб, адо-трастузумаб эмтансин, лапатиниб (Tykerb^®), пертузумаб (Perjeta™), адо-трастузумаб эмтансин (Kadcyla™), регорафениб (Stivarga^®), сунитиниб (Sutent^®), деносумаб (Xgeva^®), сорафениб (Nexavar^®), пазопаниб (Votrient^®), акситиниб (Inlyta^®), дасатиниб (Sprycel^®), нилотиниб (Tasigna^®), босутиниб (Bosulif^®), офатумумаб (Arzerra^®), обинутузумаб (Gazyva™), ибрутиниб (Imbruvica™), иделализиб (Zydelig^®), кризотиниб (Xalkori^®), эрлотиниб (Tarceva^®), афатиниб-дималеат (Gilotrif^®), церитиниб (LDK378/Zykadia), тоситумомаб и ¹³¹I-тоситумомаб (Bexxar^®), ибритумомаб тиуксетан (Zevalin^®), брентуксимаб ведотин (Adcetris^®), бортезомиб (Velcade^®), силтуксимаб (Sylvant™), траметиниб (Mekinist^®), дабрафениб (Tafinlar^®), пембролизумаб (Keytruda^®), карфилзомиб (Kyprolis^®), рамуцирумаб (Cyramza™), кабозантиниб (Cometriq™), вандетаниб (Caprelsa^®). Необязательно терапевтическим средством является неоантиген. Терапевтическим средством может быть цитокин типа интерферона (INF), интерлейкина (IL) или гематопоэтического фактора роста. Терапевтическим средством может быть INF-α, IL-2, Альдеслейкин, IL-2, эритропоэтин, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Терапевтическим средством может быть целенаправленное средство, как-то торемифен (Fareston^®), фулвестрант (Faslodex^®), анастрозол (Arimidex^®), экземестан (Aromasin^®), летрозол (Femara^®), зив-афлиберцепт (Zaltrap^®), алитретиноин (Panretin^®), темсиролимус (Torisel^®), третиноин (Vesanoid^®), денилейкин дитфтитокс (Ontak^®), вориностат (Zolinza^®), ромидепсин (Istodax^®), бексаротен (Targretin^®), пралатрексат (Folotyn^®), леналидомид (Revlimid^®), белиностат (Beleodaq™), леналиомид (Revlimid^®), помалидомид (Pomalyst^®), кабизитаксель (Jevtana^®), энзалутамид (Xtandi^®), абиратерон ацетат (Zytiga^®), хлорид радия-223 (Xofigo^®) или эверолимус (Afinitor^®). Кроме того, терапевтическим средством может быть эпигенетическое таргетное средство типа ингибиторов HDAC, ингибиторов киназ, ингибиторов ДНК-метилтрансферазы, ингибиторов гистоновой деметилазы или ингибиторов метилирования гистонов. Эпигенетическим средством может быть азацитидин (Vidaza), децитабин (Dacogen), вориностат (Zolinga), ромидепсин (Istodax) или руксолитиниб (Jakafi). Для лечения рака простаты предпочтительным химиотерапевтическим средством, с которым можно комбинировать анти-CTLA-4, является паклитаксель (Taxol).

В некоторых воплощениях одно или несколько дополнительных средств представлены одним или несколькими антителами против индуцируемого глюкокортикоидами рецептора из семейства фактора некроза опухолей (GITR). GITR является костимулирующей молекулой для Т-лимфоцитов, он модулирует врожденную и адаптивную иммунную систему и, как было установлено, участвует в различных иммунных реакциях и воспалительных процессах. GITR был впервые описан Nocentini et al. после клонирования из обработанной дексаметазоном мышиной T-клеточной гибридомы (Nocentini et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 6216-6221, 1997). В отличие от CD28 и CTLA-4, GITR имеет очень низкий базальный уровень экспрессии у наивных T-клеток CD4+ и CD8+ (Ronchetti et al., Eur J Immunol 34: 613-622, 2004). Тот факт, что стимуляция GITR оказывает иммуностимулирующее действие in vitro и индуцирует аутоиммунитет in vivo, побудило исследовать противоопухолевую активность при запуске этого пути. Обзор “Modulation of CTLA-4 and GITR for Cancer Immunotherapy” приведен в Cancer Immunology and Immunotherapy (Avogadri et al., Current Topics in Microbiology and Immunology 344, 2011). Другие средства, которые могут способствовать снятию иммуносупрессии, включают ингибиторы контрольной точки, направленные на других представителей надсемейства Ig CD28/CTLA4 типа BTLA, LAG3, ICOS, PDL1 или KIR (Page et al., Annual Review of Medicine 65:27 (2014)). В других дополнительных воплощениях ингибитор контрольной точки направлен на представителей надсемейства TNFR типа CD40, OX40, CD137, GITR, CD27 или TIM-3. В некоторых случаях наведение ингибитора контрольной точки осуществляется с помощью ингибирующего антитела или аналогичной молекулы. В других случаях оно осуществляется с помощью агониста для мишени; примеры этого класса включают стимулирующие мишени OX40 и GITR.

В некоторых воплощениях одно или несколько дополнительных средств являются синергическими, так как они усиливают иммуногенность после обработки. В одном воплощении дополнительное средство позволяет уменьшить токсичность и/или уменьшить дискомфорт вследствие снижения дозы дополнительных терапевтических средств или любых компонентов описанной здесь комбинированной терапии. В другом воплощении дополнительное средство приводит к увеличению продолжительности жизни вследствие повышенной эффективности описанной здесь комбинированной терапии. Имеется обзор по химиотерапевтическим средствам, усиливающим иммунологические реакции у пациентов (Zitvogel et al. Immunological aspects of cancer chemotherapy. Nat Rev Immunol. 2008 Jan, 8(1):59-73). Кроме того, химиотерапевтические средства можно безопасно вводить при иммунотерапии без ингибирования специфичных для вакцины Т-клеточных ответов (Perez et al. A new era in anticancer peptide vaccines. Cancer May 2010). В одном воплощении дополнительное средство вводится для повышения эффективности описанной здесь терапии. В одном воплощении дополнительное средство представлено средством химиотерапии. В одном воплощении низкие дозы химиотерапии потенциируют реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH). В одном воплощении средство химиотерапии направлено на регуляторные Т-клетки. В одном воплощении терапевтическим средством является циклофосфамид. В одном воплощении циклофосфамид вводится до вакцинации. В одном воплощении циклофосфамид вводится в виде разовой дозы перед вакцинацией (Walter et al. Multipeptide immune response to cancer vaccine IMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival. Nature Medicine, 18:8 2012). В другом воплощении циклофосфамид вводится по метрономической схеме, при этом вводится суточная доза в течение одного месяца (Ghiringhelli et al. Metronomic cyclophosphamide regimen selectively depletes CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells and restores T and NK effector functions in end stage cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 2007 56:641-648). В другом воплощении для усиления функций Т-клеток и NK-клеток перед вакцинацией вводятся таксаны (Zitvogel et al., 2008). В другом воплощении вводится низкая доза химиотерапевтического средства при описанной здесь терапии. В одном воплощении химиотерапевтическим средством является эстрамустин. В одном воплощении рак представлен устойчивым к гормонам раком простаты. Наблюдалось снижение специфического антигена предстательной железы в сыворотке (PSA) на ≥50% у 8,7% пациентов с запущенным невосприимчивым к гормонам раком простаты под действием одной лишь персонализованной вакцинации, тогда как такое снижение наблюдалось у 54% пациентов при комбинировании персонализованной вакцинации с низкой дозой эстрамустина (Itoh et al. Personalized peptide vaccines: A new therapeutic modality for cancer. Cancer Sci 2006, 97: 970-976). В другом воплощении вводятся глюкокортикоиды вместе или до описанной здесь терапии (Zitvogel et al., 2008). В другом воплощении глюкокортикоиды вводятся после описанной здесь терапии. В другом воплощении для повышения частоты опухолеспецифичных предшественников CTL вводится гемцитабин до, одновременно или после описанной здесь терапии (Zitvogel et al., 2008). В другом воплощении вместе с описанной здесь терапией вводится 5-фторурацил, так как наблюдались синергические эффекты с вакцинами на основе пептидов (Zitvogel et al., 2008). В другом воплощении в качестве дополнительного средства применяется ингибитор BRAF типа Vemurafenib. Было показано, что ингибирование BRAF связано с усилением экспрессии антигена меланомы и инфильтрации Т-клеток и снижением иммуносупрессивных цитокинов в опухолях у получавших лечение пациентов (Frederick et al. BRAF inhibition is associated with enhanced меланома antigen expression and a more favorable tumor microenvironment in patients with metastatic меланома. Clin Cancer Res. 2013, 19:1225-1231). В другом воплощении в качестве дополнительного средства применяется ингибитор тирозинкиназ. В одном воплощении ингибитор тирозинкиназ применяется до вакцинации при описанной здесь терапии. В одном воплощении ингибитор тирозинкиназ применяется одновременно с описанной здесь терапией. В другом воплощении ингибитор тирозинкиназы применяется для создания более пермиссивной иммунной среды. В другом воплощении ингибитором тирозинкиназ является сунитиниб или иматиниб мезилат. Ранее было показано, что положительные результаты достигаются при последовательном введении постоянной суточной дозы сунитиниба и рекомбинантной вакцины (Farsaci et al. Consequence of dose scheduling of sunitinib on host immune response elements and vaccine combination therapy. Int J Cancer. 130: 1948-1959). Также было показано, что сунитиниб уменьшает иммуносупрессию 1 типа при суточной дозе в 50 мг/день (Finke et al. Sunitinib reverses type-1 immune suppression and decreases T-regulatory cells in renal cell carcinoma patients. Clin Cancer Res 2008, 14(20)). В другом воплощении в сочетании с описанной здесь терапией применяются таргетные терапии. Дозировки при таргетной терапии были описаны ранее (Alvarez. Present and future evolution of advanced breast cancer therapy. Breast Cancer Research 2010, 12(Suppl 2):S1). В другом воплощении вместе с описанной здесь терапией вводится темозоломид. В одном воплощении темозоломид вводится по 200 мг/день в течение 5 дней каждую четвертую неделю при комбинированной терапии с описанной здесь терапией. Было показано, что результаты такой стратегии проявляют низкую токсичность (Kyte et al. Telomerase peptide vaccination combined with temozolomide: a clinical trial in stage IV melanoma patients. Clin Cancer Res. 17(13) 2011). В другом воплощении проводится терапия с дополнительным терапевтическим средством, которое вызывает лимфопению. В одном воплощении дополнительным средством является темозоломид. В этих условиях все еще может индуцироваться иммунный ответ (Sampson et al. Greater chemotherapy-induced lymphopenia enhances tumor-specific immune responses that eliminate EGFRvIII-expressing tumor cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology 13(3):324-333, 2011).

Нуждающиеся в этом пациенты могут получать серию примирующих вакцинаций с помощью смеси опухолеспецифичных пептидов. Кроме того, в течение 4-недель после примирующей вакцинации могут последовать две буст-вакцинации во время поддерживающей фазы. Все вакцинации проводятся подкожно. Вакцинная или иммуногенная композиция проходит оценку на предмет безопасности, переносимости, иммунного ответа и клинического эффекта у пациентов, а также на возможность получения вакцинной или иммуногенной композиции и успешного проведения вакцинации в соответствующий срок. Первая когорта может состоять из 5 пациентов, а после того, как будет адекватно продемонстрирована безопасность, можно вовлечь дополнительную когорту из 10 пациентов. Периферическую кровь тщательно проверяют на пептидоспецифичные Т-клеточные реакции, а пациентов наблюдают вплоть до двух лет для оценки рецидивов заболевания.

Проведение комбинированной терапии в соответствии со стандартом лечения

В другом аспекте описанная здесь терапия предусматривает выбор подходящей точки для проведения комбинированной терапии в связи и в рамках стандарта лечения для данного рака у нуждающегося в этом пациента. Описанные здесь исследования показали, что комбинированная терапия может эффективно проводиться даже в рамках стандартного лечения, которое включает оперативное вмешательство, облучение или химиотерапию. Стандарты лечения для наиболее распространенных раковых заболеваний приведены на веб-сайте Национального института рака (www.cancer.gov/cancertopics). Стандартом лечения является текущее лечение, которое принято медицинскими экспертами в качестве надлежащего лечения для определенного типа заболеваний и широко применяется специалистами сферы здравоохранения. Стандарт лечения также называют наилучшей практикой, стандартным медицинским лечением и стандартной терапией. Стандарты лечения рака обычно включают оперативное вмешательство, удаление лимфатических узлов, облучение, химиотерапию, таргетную терапию, антитела, нацеленные на опухоль, и иммунотерапию. Иммунотерапия может включать блокаторы контрольных точек (CBP), химерные рецепторы антигенов (CAR) и адоптивную Т-клеточную терапию. Описанная здесь комбинированная терапия может быть включена в рамки стандартного лечения. Описанная здесь комбинированная терапия может проводиться, даже если стандарт лечения изменился вследствие прогресса в медицине.

Включение описанной здесь комбинированной терапии может зависеть от стадии лечения в стандарте лечения, которая может приводить к активации иммунной системы. Здесь уже были описаны стадии лечения, которые могут активироваться и функционировать синергически с комбинированной терапией. Терапия может преимущественно проводиться одновременно или после лечения, активирующего иммунную систему.

Включение описанной здесь комбинированной терапии может зависеть от стадии лечения в стандарте лечения, которая вызывает подавление иммунной системы. Такие стадии лечения могут включать облучение, высокие дозы алкилирующих агентов и/или метотрексата, стероиды типа глюкостероидов, операцию типа удаления лимфатических узлов, иматиниб мезилат, высокие дозы TNF и таксанов (Zitvogel et al., 2008). Комбинированная терапия может проводиться перед такими стадиями или же после.

В одном воплощении комбинированная терапия может проводиться после трансплантации костного мозга и пересадки стволовых клеток периферической крови. Трансплантация костного мозга и пересадка стволовых клеток периферической крови – это процедуры, восстанавливающие стволовые клетки, которые были разрушены под действием высоких доз химиотерапии и/или лучевой терапии. После лечения с помощью высоких доз противораковых препаратов и/или облучения пациент получает извлеченные стволовые клетки, которые перемещаются в костный мозг и начинают вырабатывать новые клетки крови. При “мини-трансплантации” применяются более низкие, менее токсичные дозы химиотерапии и/или облучения при подготовке пациента к пересадке. “Тандемная трансплантация” включает в себя два последовательных курса химиотерапии высокими дозами и пересадку стволовых клеток. При аутологической трансплантации пациенты получают свои собственные стволовые клетки. При сингенной трансплантации пациенты получают стволовые клетки от своих идентичных близнецов. При аллогенной трансплантации пациенты получают стволовые клетки от своего брата, сестры или родителя. Также можно использовать людей, не родственных пациентам (неродственных доноров). При некоторых типах лейкемии решающее значение для эффективности лечения имеет реакция “трансплантат против опухоли” (GVT), которая возникает после аллогенной трансплантации костного мозга или стволовых клеток периферической крови. GVT возникает, когда лейкоциты донора (трансплантата) идентифицируют раковые клетки, остающиеся в организме пациента после химиотерапии и/или лучевой терапии (опухоли), как чужие, и атакуют их. Этим можно воспользоваться при иммунотерапии с помощью описанной здесь комбинированной терапии путем вакцинации после трансплантации. Кроме того, перед трансплантацией можно презентировать пересаживаемые клетки неоантигенами из описанной здесь комбинированной терапии.

В одном воплощении комбинированная терапия проводится у нуждающихся в этом пациентов при раке, требующем хирургической операции. В одном воплощении описанная здесь комбинированная терапия проводится у нуждающихся в этом пациентов при раке, если стандартом лечения прежде всего является хирургическое вмешательство, а затем обработка для удаления возможных микрометастазов, типа рака молочной железы. Рак молочной железы обычно лечат при помощи различных сочетаний хирургического вмешательства, лучевой терапии, химиотерапии и гормональной терапии, исходя из стадии и степени рака. Вспомогательная терапия при раке молочной железы – это любое лечение, которое проводится после первичной терапии для повышения вероятности долгосрочного выживания. Неоадъювантная терапия – лечение, которое проводится до первичной терапии. Вспомогательная терапия при раке молочной железы – это любое лечение, которое проводится после первичной терапии для повышения вероятности долгосрочного выживания без заболевания. Первичная терапия – основное лечение, которое применяется для уменьшения или устранения рака. Первичная терапия при раке молочной железы обычно включает хирургическое вмешательство, а именно мастэктомию (удаление молочной железы) или лампэктомию (операцию по удалению опухоли и небольшого количества нормальной ткани вокруг нее; это операция с сохранением груди). При любом типе операции также удаляют один или несколько соседних лимфатических узлов, чтобы выяснить, распространились ли раковые клетки на лимфатическую систему. Когда у женщины проводится операция с сохранением груди, первичная терапия почти всегда включает лучевую терапию. Даже на ранней стадии рака молочной железы клетки могут оторваться от первичной опухоли и распространиться на другие части организма (метастазировать). Поэтому врачи проводят вспомогательную терапию для уничтожения любых раковых клеток, которые могли распространиться, даже если они не выявляются при визуализации или лабораторных анализах.

В одном воплощении комбинированная терапия проводится в соответствии со стандартом лечения карциномы протоков in situ (DCIS). Стандарт лечения для этого типа рака молочной железы:

1) операция с сохранением груди и лучевая терапия с тамоксифеном или без него;

2) полная мастэктомия с тамоксифеном или без него;

3) операция с сохранением груди без лучевой терапии.

Комбинированная терапия может проводиться перед операцией с сохранением груди или полной мастэктомией, чтобы уменьшить опухоль перед операцией. В другом воплощении комбинированная терапия может проводиться в качестве вспомогательной терапии для удаления любых оставшихся раковых клеток.

В другом воплощении описанной здесь комбинированной терапии подвергаются пациенты с диагнозом рака молочной железы на стадии I, II, IIIA и операбельной стадии IIIC. Стандарт лечения для этого типа рака молочной железы:

1) местная-регионарная обработка:

• терапия с сохранением груди (лампэктомия, облучение груди и хирургическая обработка подмышечной впадины);

• модифицированная радикальная мастэктомия (удаление всей груди со вскрытием подмышечной впадины I-II уровня) с реконструкцией груди или без нее;

• биопсия индикаторного узла;

2) вспомогательная лучевая терапия после мастэктомии при выявленных в подмышечных узлах опухолях:

• для одного-трех узлов: не ясна роль регионарного облучения (под/надключичные узлы, внутренние маммарные узлы, подмышечные узлы и стенка грудной клетки);

• для более чем четырех узлов или при экстранодальном участии: рекомендуется регионарное облучение;

3) вспомогательная системная терапия.

В одном воплощении комбинированная терапия проводится как неоадъювантная терапия для уменьшения опухоли. В другом воплощении комбинированная терапия проводится как вспомогательная системная терапия.

В другом воплощении описанной здесь комбинированной терапии подвергаются пациенты с диагнозом неоперабельной стадии IIIB или IIIC либо воспалительного рака молочной железы. Стандарт лечения для этого типа рака молочной железы:

1) комплексная терапия, которая проводится с лечебной целью, является стандартом лечения для пациентов с заболеванием на клинической стадии IIIB;

2) первоначальное хирургическое вмешательство обычно ограничивается биопсией, что позволяет определить гистологию, уровни эстрогеновых рецепторов (ER) и прогестероновых рецепторов (PR) и гиперэкспрессию рецептора-2 эпидермального фактора роста человека (HER2/neu). Стандартным является первоначальное лечение с помощью химиотерапии на основе антрациклина и/или терапии на основе таксана. Для пациентов, реагирующих на неоадъювантную химиотерапию, местная терапия может состоять из полной мастэктомии со вскрытием подмышечных лимфатических узлов и последующей послеоперационной лучевой терапии стенки грудной клетки и регионарных лимфатических узлов. У пациентов с хорошей частичной или полной реакцией на неоадъювантную химиотерапию можно рассматривать терапию с сохранением молочной железы. Последующая системная терапия может состоять из дополнительной химиотерапии. Гормональная терапия должна проводиться у пациентов, у которых опухоли ER-положительные или неизвестные. Всех пациентов следует считать кандидатами на клинические испытания для оценки наиболее подходящего способа проведения различных компонентов комплексного лечения.

В одном воплощении комбинированная терапия проводится как часть различных компонентов комплексного лечения. В другом воплощении комбинированная терапия проводится до, одновременно или после комплексного лечения. В другом воплощении комбинированная терапия проводится, исходя из синергизма между модальностями. В другом воплощении комбинированная терапия проводится после применения химиотерапии на основе антрациклина и/или терапии на основе таксана (Zitvogel et al., 2008). Лечение после проведения комбинированной терапии может отрицательно повлиять на делящиеся эффекторные Т-клетки. Комбинированная терапия также может проводиться после облучения.

В другом воплощении описанная здесь комбинированная терапия применяется
при лечении такого рака, при котором стандартом лечения является прежде всего не хирургическое вмешательство, а главным образом системное лечение, типа хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL).

В другом воплощении описанной здесь комбинированной терапии подвергаются пациенты с диагнозом хронической лимфоцитарной лейкемии на стадии I, II, III и IV. Стандарт лечения для этого типа рака:

1) наблюдение у пациентов с бессимптомным или минимальным поражением;

2) ритуксимаб;

3) офатумомаб;

4) пероральные алкилирующие агенты с кортикостероидами или без них;

5) флударабин, 2-хлордезоксиаденозин или пентостатин;

6) бендамустин;

7) леналидомид;

8) комбинированная химиотерапия:

схемы комбинированной химиотерапии включают следующее:

◦ флударабин плюс циклофосфамид плюс ритуксимаб;

◦ флударабин плюс ритуксимаб, как в испытаниях CLB-9712 и CLB-9011;

◦ флударабин плюс циклофосфамид либо флударабин плюс циклофосфамид плюс ритуксимаб;

◦ пентостатин плюс циклофосфамид плюс ритуксимаб, как в испытании MAYO-MC0183;

◦ офатумумаб плюс флударабин плюс циклофосфамид;

◦ CVP: циклофосфамид плюс винкристин плюс преднизон;

◦ CHOP: циклофосфамид плюс доксорубицин плюс винкристин плюс преднизон;

◦ флударабин плюс циклофосфамид либо флударабин, как в испытании E2997 [NCT00003764] и в испытании LRF-CLL4, к примеру;

◦ флударабин плюс хлорамбуцил, как в испытании CLB-9011, к примеру;

9) лучевая терапия пораженного участка;

10) алемтузумаб;

11) трансплантация костного мозга и пересадка периферических стволовых клеток проходят клиническую оценку;

12) ибрутиниб.

В одном воплощении комбинированная терапия проводится до, одновременно или после применения ритуксимаба или офатумомаба. Поскольку эти моноклональные антитела нацелены на B-клетки, то применение комбинированной терапии может быть синергическим. В одном воплощении комбинированная терапия проводится после применения пероральных алкилирующих агентов с кортикостероидами или без них, флударабина, 2-хлордезоксиаденозина или пентостатина, так как эти препараты могут отрицательно повлиять на иммунную систему, если их вводить до того. В одном воплощении вместе с комбинированной терапией вводится бендамустин в низких дозах на основании результатов при раке простаты, описанных здесь. В одном воплощении комбинированная терапия проводится после применения бендамустина.

В другом воплощении для лечения нуждающихся в этом пациентов, страдающих раком, применяются терапии, направленные на определенные повторяющиеся мутации в генах, содержащих внеклеточные домены. Эти гены предпочтительно являются хорошо экспрессирующимися генами. Хорошо экспрессирующиеся могут выражаться в “транскриптах на миллион” (TPM). TPM более 100 считается хорошо экспрессирующимся. Хорошо экспрессирующимися генами могут быть FGFR3, ERBB3, EGFR, MUC4, PDGFRA, MMP12, TMEM52 и PODXL. Терапия может быть представлена лигандом, способным связываться с внеклеточным неоантигенным эпитопом. Такие лиганды хорошо известны в данной области и могут включать терапевтические антитела либо их фрагменты, конъюгаты антитело-препарат, подвергнутые инженерии T-клетки или аптамеры. Подвергнутые инженерии T-клетки могут содержать химерные рецепторы антигенов (CARs). Антитела могут быть полностью человеческими, гуманизированными или химерными. Фрагменты антител могут представлять собой нанотела, Fab, Fab′, (Fab′)_2, Fv, scFv, диатела, триатела, тетратела, bis-scFv, минитела, фрагменты Fab₂ или Fab₃. Антитела могут быть разработаны против опухолеспецифичных неоэпитопов известными в данной области методами.

Адоптивный перенос клеток (ACT)

Аспекты изобретения включают в себя адаптивный перенос клеток иммунной системы типа T-клеток, специфичных к выбранным антигенам типа связанных с опухолями антигенов (см. Maus et al., 2014. Adoptive immunotherapy for cancer or viruses. Annual Review of Immunology, Vol. 32: 189-225; Rosenberg and Restifo, 2015. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science Vol. 348 no. 6230 pp. 62-68; Restifo et al., 2015. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12(4): 269-281; и Jenson and Riddell, 2014. Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells. Immunol Rev. 257(1): 127-144). Например, можно использовать различные стратегии для генетической модификации T-клеток путем изменения специфичности T-клеточных рецепторов (TCR), к примеру, путем введения новых α- и β-цепей TCR с выбранной пептидной специфичностью (см. патент США No. 8,697,854; патентые публикации РСТ: WO 2003/020763, WO 2004/033685, WO 2004/044004, WO 2005/114215, WO 2006/000830, WO 2008/038002, WO 2008/039818, WO 2004/074322, WO 2006/125962, WO 2013/166321, WO 2013/039889, WO 2014/018863, WO 2014/083173; патент США No. 8,088,379).

В качестве альтернативы или в дополнение к модификациям TCR можно использовать химерные рецепторы антигенов (CAR) с тем, чтобы получить иммунореактивные клетки типа T-клеток, специфичные к выбранным мишеням типа злокачественных клеток, причем описан широкий спектр конструкций для химерных рецепторов (см. патенты США Nos. 5,843,728, 5,851,828, 5,912,170, 6,004,811, 6,284,240, 6,392,013, 6,410,014, 6,753,162, 8,211,422 и публикацию PCT WO 9215322). Альтернативные конструкции CAR можно охарактеризовать как принадлежащие к следующим друг за другом поколениям. CARs первого поколения обычно состоят из одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела, специфичного к антигену, к примеру, содержащего V_L, связанный с V_H определенного антитела, соединенные гибким линкером, например, шарнирным доменом CD8α и трансмембранным доменом CD8α, с трансмембранным и внутриклеточным сигнальным доменом CD3ζ или FcRγ (scFv-CD3ζ или scFv-FcRγ, см. патент США No. 7,741,465; патент США No. 5,912,172; патент США No. 5,906,936). CARs второго поколения включают в себя внутриклеточные домены одной или нескольких костимулирующих молекул типа CD28, OX40 (CD134) или 4-1BB (CD137) в эндодомене (к примеру, scFv-CD28/OX40/4-1BB-CD3ζ; см. патенты США Nos. 8,911,993, 8,916,381, 8,975,071, 9,010,584, 9,102,760, 9,102,761). CARs третьего поколения включают в себя комбинацию костимулирующих эндодоменов типа сигнального домена цепи CD3ζ, CD97, GDI-1a-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB или CD28 (к примеру, scFv-CD28-4-1BB-CD3ζ или scFv-CD28-OX40-CD3ζ, см. патент США No. 8,906,682; патент США No. 8,399,645; патент США No. 5,686,281; публикацию PCT WO 2014/134165; публикацию PCT WO 2012/079000). С другой стороны, костимуляция может быть устроена путем экспрессии CARs в антигенспецифичных T-клетках, выбранных так, чтобы они активировались и распространялись после подключения своего нативного αβTCR, например, под действием антигена на профессиональных антиген-презентирующих клетках, с сопутствующей костимуляцией. Кроме того, можно предусмотреть дополнительные генноинженерные рецепторы на иммунореактивных клетках, к примеру, для лучшего нацеливания T-клеточной атаки и/или минимизации побочных эффектов.

Для трансформации целевых иммунореактивных клеток можно использовать и другие методы, такие как слияние протопластов, липофекция, трансфекция или электропорация. Для введения CARs можно использовать широкий спектр векторов, таких как ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, плазмиды или транспозоны типа транспозона Sleeping Beauty (см. патенты США Nos. 6,489,458, 7,148,203, 7,166,682, 7,985,739, 8,227,432), к примеру, с помощью антиген-специфичных CARs 2-го поколения, передающих сигналы через CD3ζ и либо CD28, либо CD137. Вирусные векторы, к примеру, могут включать векторы на основе HIV, SV40, EBV, HSV или BPV.

Клетки, предназначенные для трансформации, могут включать, к примеру, T-клетки, клетки натуральных киллеров (NK), цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), регуляторные T-клетки, эмбриональные стволовые клетки человека, инфильтрирующие опухоли лимфоциты (TIL) или плюрипотентные стволовые клетки, из которых могут дифференцироваться лимфоидные клетки. Например, можно отобрать T-клетки, экспрессирующие требуемый CAR, путем совместного культивирования с подвергнутыми γ-облучению активирующимися и размножающимися клетками (AАПК), которые экспрессируют и раковый антиген, и костимулирующие молекулы. T-клетки с генноинженерным CAR можно экспансировать, к примеру, путем совместного культивирования на AАПК в присутствии таких растворимых факторов, как IL-2 и IL-21. Такое экспансирование может проводиться, к примеру, для получения T-клеток памяти CAR⁺ (которые, к примеру, можно анализировать методом неферментативной цифровой матрицы и/или многопанельной проточной цитометрии). При этом можно получить T-клетки CAR⁺, обладающие специфической цитотоксической активностью против несущих антиген опухолей (необязательно в сочетании с продукцией требуемых хемокинов типа интерферона-γ). T-клетки CAR⁺ такого типа можно использовать, к примеру, на моделях у животных, например, для обработки ксенотрансплантатов опухолей.

Подходы типа вышеизложенных можно адаптировать для получения способов лечения и/или повышения выживаемости у субъектов с такими заболеваниями, как неоплазия, например, путем введения эффективного количества иммунореактивных клеток, содержащих распознающий антиген рецептор, который связывает выбранный антиген, причем связывание активирует иммунореактивные клетки, тем самым обеспечивая лечение или предотвращение заболевания (типа неоплазии, патогенной инфекции, аутоиммунного заболевания или реакции на аллогенный трансплантат).

В одном воплощении лечение может назначаться пациентам, проходящим иммуносупрессивную терапию. Клетки или популяции клеток можно сделать устойчивыми по меньшей мере к одному иммунодепрессивному средству посредством инактивации гена, кодирующего рецептор для такого иммунодепрессивного средства. Не придерживаясь какой-либо теории, иммуносупрессивная терапия должна способствовать отбору и экспансированию иммунореактивных T-клеток по изобретению у пациента.

Введение клеток или популяции клеток по настоящему изобретению может проводиться любым удобным способом, в том числе путем аэрозольной ингаляции, инъекции, приема внутрь, трансфузии, имплантации или трансплантации. Клетки или популяции клеток можно вводить пациентам подкожно, интрадермально, в опухоль, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, путем внутривенной или внутрилимфатической инъекции или внутрибрюшинно. В одном воплощении клеточные композиции настоящего изобретения предпочтительно вводятся путем внутривенной инъекции.

Введение клеток или популяции клеток может состоять из введения 10⁴-10⁹ клеток на кг массы тела, предпочтительно от 10⁵ до 10⁶ клеток/кг массы тела, включая все целые значения количества клеток в этих пределах. Дозировка при терапии T-клетками CAR⁺ может включать, к примеру, введение от 10⁶ до 10⁹ клеток/кг, вместе с курсом лимфоистощения или без него, к примеру, с помощью циклофосфамида. Клетки или популяции клеток можно вводить в виде одной или нескольких доз. В другом воплощении эффективное количество клеток вводится в виде однократной дозы. В другом воплощении эффективное количество клеток вводится в виде более чем одной дозы за определенный период времени. Сроки введения определяются лечащим врачом и зависят от клинического состояния пациента. Клетки или популяции клеток могут быть получены из любого источника, как-то банка крови или донора. Хотя индивидуальные потребности различаются, определение оптимального диапазона эффективного количества клеток данного типа для определенного заболевания находится в пределах компетенции специалистов. Эффективное количество означает такое количество, которое обеспечивает терапевтическую или профилактическую пользу. Вводимые дозы зависят от возраста, здоровья и веса пациента, типа сопутствующего лечения, если оно проводится, частоты применения и характера требуемого эффекта

В другом воплощении эффективное количество клеток или композиции, содержащей эти клетки, вводится парентерально. Введение может проводиться внутривенно. Введение может проводиться путем инъекции прямо в опухоль.

Для защиты от возможных отрицательных реакций генноинженерные иммунореактивные клетки могут быть снабжены трансгенным аварийным выключателем в виде трансгена, делающего клетки уязвимыми при воздействии определенного сигнала. Например, для этого можно использовать ген тимидинкиназы (TK) вируса простого герпеса, к примеру, путем введения его в аллогенные Т-лимфоциты, используемые при вливании донорских лимфоцитов после трансплантации стволовых клеток (Greco et al. Improving the safety of cell therapy with the TK-suicide gene. Front. Pharmacol. 2015, 6:95). У таких клеток введение нуклеозидного пролекарства типа ганцикловира или ацикловира вызывает гибель клеток. Альтернативные конструкции аварийных выключателей включают индуцибельную каспазу 9, которая, к примеру, запускается при введении низкомолекулярного димеризатора, объединяющего две нефункциональные молекулы icasp9 с образованием активного фермента. Описан целый ряд альтернативных подходов к осуществлению контроля за пролиферацией клеток (см. публикацию патента США No. 2013/0071414; патентную публикацию PCT WO 2011/146862; патентную публикацию PCТ WO 2014/011987; патентную публикацию PCТ WO 2013/040371; Zhou et al., Blood, 2014, 123/25:3895-3905; Di Stasi et al., The New England Journal of Medicine 2011, 365:1673-1683; Sadelain M, The New England Journal of Medicine 2011, 365:1735-173; Ramos et al., Stem Cells 28(6):1107-15 (2010)).

При дальнейшем уточнении методов адоптивной терапии можно использовать редактирование генома для адаптации иммунореактивных клеток к альтернативным реализациям, например, для получения отредактированных T-клеток CAR⁺ (см. Poirot et al., 2015. Multiplex genome edited T-cell manufacturing platform for "off-the-shelf" adoptive T-cell immunotherapies. Cancer Res 75 (18): 3853). Клетки можно редактировать с помощью любого белка, нацеленного на ДНК, включая, без ограничения, систему CRISPR, белок, связывающий “цинковый палец”, TALE или TALEN, которые известны в данной области. Белки, нацеленные на ДНК, можно доставлять в иммунные клетки любым способом, известным в данной области. В предпочтительных воплощениях клетки редактируют ex vivo и переносят нуждающемуся в этом субъекту. Можно редактировать иммунореактивные клетки, T-клетки CAR⁺ или любые клетки, используемые для адоптивного переноса клеток. Редактирование может проводиться для устранения потенциальных аллореактивных T-клеточных рецепторов (TCR), разрушения мишени химиотерапевтического средства, блокирования контрольной точки иммунитета, активации T-клеток и/или усиления дифференцировки и/или пролиферации функционально истощенных или дисфункциональных T-клеток CD8⁺ (см. патентые публикации РСТ: WO 2013/176915, WO 2014/059173, WO 2014/172606, WO 2014/184744 и WO 2014/191128). Редактирование может приводить к инактивации генов.

Под инактивацией гена имеется в виду то, что данный ген не экспрессируется в виде функционального белка. В предпочтительном воплощении система CRISPR специфически катализирует расщепление в одном целевом гене, тем самым инактивируя данный целевой ген. Возникающие разрывы цепей нуклеиновой кислоты обычно исправляются через особые механизмы гомологической рекомбинации или негомологического соединения концов (NHEJ). Однако NHEJ является несовершенным процессом репарации, он часто приводит к изменениям последовательности ДНК в месте расщепления. Репарация с помощью негомологического соединения концов (NHEJ) зачастую приводит к небольшим вставкам или делециям (Indel) и может применяться для нокаута определенных генов. Клетки, в которых произошло событие индуцированного расщеплением мутагенеза, можно идентифицировать и/или отобрать хорошо известными методами.

T-клеточные рецепторы (TCR) – это рецепторы на поверхности клетки, которые участвуют в активации T-клеток в ответ на презентацию антигена. TCR обычно состоят из двух цепей, α и β, которые собираются с образованием гетеродимера и связываются с CD3-трансдуцирующими субъединицами с образованием T-клеточого рецепторного комплекса, находящегося на поверхности клетки. Каждая α- и β-цепь TCR состоит из подобной иммуноглобулину N-концевой вариабельной (V) и константной (C) области, гидрофобного трансмембранного домента и короткой цитоплазматической области. У молекул иммуноглобулина вариабельные области α- и β-цепей образуются при рекомбинации типа V(D)J, создающей большое разнообразие специфичностей к антигенам в популяции T-клеток. А в отличие от иммуноглобулинов, распознающих интактные антигены, T-клетки активируются процессированными пептидными фрагментами в сочетании с молекулой MHC, что придает распознаванию антигена T-клетками дополнительный аспект, известный как MHC-рестрикция. При выявлении несоответствий по MHC между донором и реципиентом через T-клеточный рецептор происходит пролиферация T-клеток и потенциальное развитие реакции “трансплантат против хозяина” (GVHD). Инактивация TCRα или TCRβ может привести к элиминации TCR из поверхности T-клеток, предотвращая распознавание аллоантигена и тем самым GVHD. Однако разрушение TCR обычно ведет к устранению сигнального компонента CD3 и изменяет пути дальнейшей экспансии T-клеток.

Аллогенные клетки быстро отторгаются иммунной системой хозяина. Было показано, что аллогенные лейкоциты, присутствующие в необлученных препаратах крови, сохраняются не более 5-6 дней (Boni, Muranski et al., 2008 Blood 1, 112 (12): 4746-54). Таким образом, чтобы предотвратить отторжение аллогенных клеток, обычно нужно в некоторой степени подавить иммунную систему хозяина. Однако в случае адоптивного переноса клеток применение иммунодепрессантов также оказывает пагубное влияние и на вводимые терапевтические T-клетки. Поэтому для эффективного применения методов адоптивной иммунотерапии в этих условиях вводимые клетки должны быть устойчивыми к воздействию иммунодепрессантов. Так, в предпочтительном воплощении настоящее изобретение дополнительно включает стадию модификации T-клеток, которая делает их устойчивыми к иммунодепрессивным средствам, предпочтительно путем инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего мишень для иммунодепрессанта. Иммунодепрессивное средство – это средство, которое подавляет иммунную функцию по одному из нескольких механизмов действия. Иммунодепрессивным средством может быть, без ограничения, ингибитор кальциневрина, мишень рапамицина, блокатор α-цепи рецептора интерлейкина-2, ингибитор инозинмонофосфатдегидрогеназы, ингибитор редуктазы дигидрофолиевой кислоты, кортикостероид или иммуносупрессивный антиметаболит. Настоящее изобретение позволяет придавать T-клеткам для иммунотерапии резистентность к иммунодепрессантам путем инактивации мишени иммунодепрессивного средства в T-клетках. В качестве неограничительного примера мишенями для иммунодепрессивных средств могут быть такие рецепторы для иммунодепрессантов, как: CD52, глюкокортикоидный рецептор (GR), представители семейства генов FKBP и представители семейства генов циклофилина.

Контрольные точки иммунитета – это тормозные пути, которые замедляют или останавливают иммунные реакции и предотвращают чрезмерное повреждение тканей при неконтролируемой активности иммунных клеток. В некоторых воплощениях целевой контрольной точкой иммунитета является ген запрограммированной смерти-1 (PD-1 или CD279) (PDCD1). В других воплощениях целевой контрольной точкой иммунитета является связанный с цитотоксическими Т-лимфоцитами антиген (CTLA-4). В дополнительных воплощениях целевой контрольной точкой иммунитета является другой представитель надсемейства CD28 и CTLA4 Ig типа BTLA, LAG3, ICOS, PDL1 или KIR. В других дополнительных воплощениях целевой контрольной точкой иммунитета является представитель надсемейства TNFR типа CD40, OX40, CD137, GITR, CD27 или TIM-3.

Дополнительные контрольные точки иммунитета включают содержащую домен Src-гомологии-2 протеин-тирозинфосфатазу-1 (SHP-1) (Watson HA et al. SHP-1: the next checkpoint target for cancer immunotherapy? Biochem Soc Trans. 2016 Apr 15, 44(2):356-62). SHP-1 является широко экспрессирующейся ингибиторной протеин-тирозинфосфатазой (PTP). В T-клетках она является отрицательным регулятором антиген-зависимой активации и пролиферации. Это цитозольный белок, поэтому он не годится для опосредованной антителами терапии, но его роль в активации и пролиферации делает его привлекательной мишенью для генетической манипуляции в методах адоптивного переноса типа T-клеток с химерными рецепторами антигенов (CAR). Контрольные точки иммунитета также могут включать T-клеточные иммунорецепторы с доменами Ig и ITIM (TIGIT/Vstm3/WUCAM/) и VISTA (Le Mercier I. et al. (2015) Beyond CTLA-4 and PD-1, the generation Z of negative checkpoint regulators. Front. Immunol. 6:418).

В WO 2014/172606 изложено применение MT1 и/или ингибиторов MT1 для усиления пролиферации и/или активности истощенных T-клеток CD8⁺ и уменьшения истощения T-клеток CD8⁺ (например, уменьшения функционально истощенных или невосприимчивых иммунных клеток CD8⁺). В некоторых воплощениях мишенью при редактировании генов в адоптивно переносимых T-клетках являются металлотионеины.

В некоторых воплощениях мишенью для редактирования генов может быть по меньшей мере один целевой локус, участвующий в экспрессии белка контрольной точки иммунитета. Такие мишени могут включать, без ограничения, CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, ICOS (CD278), PDL1, KIR, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244 (2B4), TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, VISTA, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, MT1, MT2, CD40, OX40, CD137, GITR, CD27, SHP-1 или TIM-3. В предпочтительных воплощения мишенью является локус генов, участвующих в экспрессии PD-1 или CTLA-4. В других предпочтительных воплощениях мишенью являются комбинации генов, как-то, без ограничения, PD-1 и TIGIT.

В других воплощениях редактируются по меньшей мере два гена. Пары генов могут включать, без ограничения, PD1 и TCRα, PD1 и TCRβ, CTLA-4 и TCRα, CTLA-4 и TCRβ, LAG3 и TCRα, LAG3 и TCRβ, Tim3 и TCRα, Tim3 и TCRβ, BTLA и TCRα , BTLA и TCRβ, BY55 и TCRα, BY55 и TCRβ, TIGIT и TCRα, TIGIT и TCRβ, B7H5 и TCRα, B7H5 и TCRβ, LAIR1 и TCRα, LAIR1 и TCRβ, SIGLEC10 и TCRα, SIGLEC10 и TCRβ, 2B4 и TCRα, 2B4 и TCRβ.

Либо до, либо после генетической модификации T-клеток их можно активировать и экспансировать, как правило, с помощью методов, описанных, к примеру, в патентах США 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; и 7,572,631. T-клетки можно экспансировать in vitro или in vivo.

Выбор популяции пациентов, которым скорее всего пойдет на пользу терапия

В другом аспекте изобретения предусмотрен отбор таких пациентов, которым скорее всего пойдет на пользу терапия по настоящему изобретению. Хотя композиции и способы настоящего изобретения обычно применимы к большой части субъектов, страдающих раком, тем не менее способ может включать одну или несколько стадий отбора пациентов из популяции пациентов, которым это может пойти на пользу с большей вероятностью. Например, способ может включать отбор субъектов, у которых опухоли содержат одну или несколько мутаций, представленных у неоантигенных пептидов в композиции. В другом воплощении способ может включать отбор субъектов, имеющих по меньшей мере один аллель HLA, который связывается с одним или несколькими неоэпитопами, представленными у неоантигенных пептидов в композиции.

Наборы вакцинных или иммуногенных композиций и совместная упаковка

В одном аспекте изобретения предусмотрены наборы, содержащие какой-нибудь один или несколько приведенных здесь элементов, позволяющих проводить терапию. Элементы могут быть представлены индивидуально или в комбинациях и могут помещаться в любом подходящем контейнере типа флакона, бутылки или пробирки. В некоторых воплощения в набор входят инструкции на одном или нескольких языках, к примеру, на нескольких языках. В некоторых воплощения набор содержит один или несколько реагентов для применения в процессе с использованием одного или нескольких элементов, описанных здесь. Реагенты могут быть представлены в любом подходящем контейнере. Например, набор может содержать один или несколько буферов для введения или хранения. Реагенты могут быть представлены в виде, который применяется в определенном процессе, или же в виде, который требует добавления одного или нескольких других компонентов перед использованием (например, в виде концентрата или в лиофилизованном виде). Буфером может быть любой буфер, включая, без ограничения, карбонат натрия, бикарбонат натрия, боратный буфер, трис-буфер, буфер MOPS, буфер HEPES и их комбинации. В некоторых воплощения буфер является щелочным. В некоторых воплощениях буфер имеет рН от 7 до 10. В некоторых воплощениях набор содержит один или несколько векторов, белков и/или один или несколько описанных здесь полинуклеотидов. Набор может преимущественно обеспечивать предоставление всех элементов систем по изобретению. Наборы могут включать в себя векторы и/или частицы и/или наночастицы, содержащие или кодирующие РНК для 1-50 или больше мутантных неоантигенов для введения животным, млекопитающим, приматам, грызунам и т.д., причем такой набор включает инструкции по введению таким эукариотам; и такой набор может необязательно включать любые из описанных здесь противораковых средств. Набор может включать любые из вышеприведенных компонентов (например, векторы и/или частицы и/или наночастицы, содержащие или кодирующие РНК для 1-50 или больше мутантных неоантигенов, неоантигенных белков или пептидов), а также инструкции для применения в любом из способов настоящего изобретения.

В одном воплощении набор содержит по меньшей мере один флакон с иммуногенной композицией или вакциной. В одном воплощении набор содержит по меньшей мере один флакон с иммуногенной композицией или вакциной и по меньшей мере один флакон с противораковым средством. В одном воплощении наборы могут включать готовые к применению компоненты, смешанные и готовые для введения. В одном аспекте набор содержит готовую к применению иммуногенную или вакцинную композицию и готовое к применению противораковое средство. Готовая к применению иммуногенная или вакцинная композиция может включать отдельные флаконы, содержащие различные пулы иммуногенных композиций. Иммуногенные композиции могут включать один флакон, содержащий вирусный вектор или ДНК-плазмиду, а другой флакон может содержать иммуногенный белок. Готовое к применению противораковое средство может содержать коктейль из противораковых средств или одно противораковое средство. Отдельные флаконы могут содержать различные противораковые средства. В другом воплощении набор может содержать готовое к применению противораковое средство и иммуногенную композицию или вакцину в готовой к восстановлению форме. Иммуногенная или вакцинная композиция может быть высушена замораживанием или лиофилизирована. Набор может содержать отдельный флакон с буфером для восстановления, который можно добавлять в лиофилизованную композицию с тем, чтобы она была готова к введению. Буфер может преимущественно содержать адъювант или эмульсию по настоящему изобретению. В другом воплощении набор может содержать готовое к восстановлению противораковое средство и готовую к восстановлению иммуногенную композицию или вакцину. В этом аспекте они оба могут быть лиофилизированы. В этом аспекте в набор могут входить отдельные буферы для восстановления для каждого из них. Буфер может преимущественно содержать адъювант или эмульсию по настоящему изобретению. В другом воплощении набор может включать отдельные флаконы, содержащие одну дозу иммуногенной композиции и противоракового средства, которые вводятся вместе. В другом аспекте включены несколько флаконов с тем, чтобы вводился один флакон согласно расписанию лечения. Один флакон может содержать только противораковое средство для одной дозы лечения, другой может содержать как противораковое средство, так и иммуногенную композицию для другой дозы лечения, а один флакон может содержать только иммуногенную композицию для еще одной дозы. В следующем аспекте флаконы маркированы для правильного введения их нуждающимся в этом пациентам. Иммуногены или противораковые средства в любых воплощениях могут быть в лиофилизированном виде, в высушенном виде или в виде водного раствора, как описано здесь. Иммуногеном может быть живой ослабленный вирус, белок или нуклеиновая кислота, как описано здесь.

В одном воплощении противораковое средство таково, что оно усиливает иммунную систему для повышения эффективности иммуногенной композиции или вакцины. В предпочтительном воплощении противораковое средство представлено ингибитором контрольной точки. В другом воплощении набор содержит несколько флаконов с иммуногенными композициями и противораковыми средствами для введения через различные промежутки времени по схеме лечения. В другом воплощении набор может содержать отдельные флаконы для иммуногенной композиции для прайминга иммунного ответа и другой иммуногенной композиции, используемой для ревакцинации. В одном аспекте иммуногенная композиция для прайминга может содержать ДНК или вирусный вектор, а иммуногенная композиция для ревакцинации – белок. Та или другая композиция может быть лиофилизирована или готова к введению. В другом воплощении различные коктейли противораковых средств, содержащие по меньшей мере одно противораковое средство, включены в различные флаконы для введения по схеме лечения.

Хотя настоящее изобретение и его преимущества были подробно описаны, следует иметь в виду, что в нем можно делать различные изменения, замены и переделки, не отходящие от сущности и не выходящие за рамки объема изобретения, который определен в прилагаемой формуле изобретения.

Далее настоящее изобретение будет раскрыто на следующих примерах, которые приводятся только в иллюстративных целях и никоим образом не предназначены для ограничения изобретения.

Примеры

Пример 1. sPDL1 образует иммуногенные эпитопы по различным аллелям HLA

PDL1 (CD274) – трансмембранный белок, который взаимодействует с PD1 (CD279; PDCD1) на T-клетках и может участвовать во многих формах естественной иммуносупрессии (как-то во время беременности). Экспрессия PDL1 также используется опухолевыми клетками в качестве способа уклонения от иммунного ответа хозяина. sPDL1 является альтернативной сплайс-формой гена PDL1. Эта альтернативная сплайс-форма возникает при отсутствии сплайсинга на конце экзона 4, при этом считывание заходит в 4-й интрон. Транскрипция прекращается внутри интрона 4. Продукт трансляции находится в одной рамке с 18 аминокислотами до встречи со стоп-кодоном.

У продукта трансляции отсутствует трансмембранный домен, который обычно встречается в PDL1, поэтому он секретируется. Он также содержит цистеин в пределах neoORF, транслируемой из интрона, и может подвергаться димеризации в среде. Секретируемая форма может блокировать связывание между PDL1 и PD1.

Заявители проанализировали прогнозируемые возможности связывания для 9- и 10-мерных пептидов, содержащих участок neoORF, кодируемый интроном. Данные для предсказанных 9-мерных пептидов представлены в табл. 1. Значения, выделенные желтым цветом, означают аллели, которые присутствуют с частотой > 5% в указанной популяции. Примечательно, что общий аллель A0210 HLA у кавказской популяции должен иметь достаточно прочно связывающийся пептид. Аналогичный анализ показывает, что 10-мерные пептиды тоже должны быть потенциально иммуногенными, в том числе для аллеля A0201 (85 нМ). Опухолевые клетки, экспрессирующие альтернативную форму транскрипта PDL1, тем самым будут становиться мишенями иммунной системы.

Эти пептиды можно использовать у многих пациентов (как с рестрикцией по HLA, так и в более широком плане, если у пациента будет определенная вероятность наличия соответствующего аллеля HLA) в качестве “общего неоантигена”. Отметим, что с учетом относительно короткого размера участка neoORF в sPDL1 можно использовать два или три длинных перекрывающихся пептида в виде смеси, что позволяет таргетировать любые аллели HLA, даже редкие аллели, и уменьшает необходимость получения отдельных продуктов для каждого пациента согласно их типу HLA.

Этот neoORF также может содержать CD4-эпитоп, хотя алгоритмы предсказания для CD4-эпитопов не очень точны. Присутствие CD4-эпитопа можно оценить in vitro с помощью наивных T-клеток или в образцах пациентов.

Таблица 1

Пример 2. Андрогенный рецептор образует иммуногенные эпитопы по различным аллелям HLA

У андрогенного рецептора идентифицирована другая альтернативная сплайс-форма транскрипта, образующая neoORF, которая может специфически экспрессироваться в опухолевых клетках. При альтернативном сплайсинге образуются по меньшей мере две изоформы, содержащие скрытые экзоны, которые представляют собой neoORFs.

Из этих альтернативных транскриптов в образцах рака простаты, резистентного к гормонам, последовательно отмечались AR-V1 и AR-V7.

Иммуногенный потенциал этих neoORFs был неизвестен, поэтому заявители провели анализ прогнозируемого связывания по ряду общих аллелей HLA. Представлены данные для аллелей HLA A (табл. 2).

Таблица 2

Опять же, как и для sPDL1, прогнозируется, что многие пептиды будут иммуногенными при связывании, и их можно применять у большой части пациентов. Эти иммуногенные пептиды можно использовать у многих пациентов.

Пример 3. Мутации типа лекарственной устойчивости

Лечение различными химиотерапевтическими средствами, в частности, таргетными средствами типа ингибиторов тирозинкиназ, часто приводит к новым мутациям в молекулах мишени, которые противодействуют активности терапевтического средства. Проходят оценку многие стратегии для преодоления этой устойчивости, в том числе разработка лекарственных средств второго поколения, не подверженных этим мутациям, и применение нескольких средств, включая средства, которые действуют на нисходящем уровне от мутации резистентности.

Заявители провели оценку иммуногенного потенциала мутантных пептидов, образующихся при этих мутациях резистентности, и обнаружили, что для некоторых из них прогнозируются иммуногенные пептиды, которые могут связываться с рядом аллелей HLA. Ниже приведены два конкретных примера, а также данные для ряда вариантов резистентности.

BTK/C481S

Очень распространенная мутация в ответ на ибрутиниб – молекулу, направленную на тирозинкиназу Брутона (BTK), которая применяется при CLL и некоторых лимфомах. Она представляет собой замену цистеина на серин в положении 481. При этой замене образуется целый ряд связывающихся пептидов, которые связываются с рядом молекул HLA.

Представлены результаты по прогнозированию связывания для 9-мерных пептидов. Аналогичные связывающиеся пептиды встречаются и среди 10-мерных пептидов (табл. 3). Включены только пептиды с предсказанным сродством к мутанту менее 150 нМ. Повышение диапазона пептидов до 500 нМ привело бы к существенному увеличению диапазона HLA.

Таблица 3

Такие пептидные иммуногены предпочтительно применяются профилактически (до выявления резистентного заболевания), чтобы индуцировать иммуногенный ответ, способный убивать любые ранее существовавшие или вновь мутировавшие клетки, или же могут применяться при обнаружении рецидива заболевания после или во время терапии. Эти пептиды можно использовать у многих пациентов (как с рестрикцией по HLA, так и в более широком плане, если у пациента будет определенная вероятность наличия соответствующего аллеля HLA).

EGFR/T790M

Эрлотиниб, который нацелен на тирозинкиназный домен рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), обычно применяется при лечении рака легких, причем после терапии неизменно возникают устойчивые опухоли. Распространенная мутация, которая встречается у резистентных клонов, – это мутация треонина на метионин в положении 790. Эта замена приводит к образованию целого ряда связывающихся пептидов, которые связываются с рядом молекул HLA (табл. 4).

Таблица 4

Как уже было сказано, такие пептидные иммуногены по идее применяются профилактически (до выявления резистентного заболевания), чтобы индуцировать иммуногенный ответ, способный убивать любые ранее существовавшие или вновь мутировавшие клетки, или же могут применяться при обнаружении рецидива заболевания после или во время терапии. Эти пептиды можно использовать у многих пациентов (как с рестрикцией по HLA, так и в более широком плане, если у пациента будет определенная вероятность наличия соответствующего аллеля HLA).

Отметим, что в качестве иммуногена может быть достаточно лишь одного длинного пептида, содержащего мутированную аминокислоту и по меньшей мере 10 аминокислот с каждой стороны от мутантной аминокислоты, чтобы охватить все перечисленные эпитопы. Тем самым будут охвачены все приведенные аллели HLA, а также любые другие аллели, которые не были представлены в этом анализе. У белой популяции приведенные аллели HLA A составляют 17% при распределении аллелей по популяциям, а аллели HLA B составляют 16% при распределении аллелей по популяциям. Поскольку у каждого индивида есть два аллеля HLA A и два аллеля HLA B, то примерно у 50% белых пациентов будет по меньшей мере один из приведенных аллелей, поэтому они получат пользу от иммунотерапии с помощью вакцины, нацеленной на эту молекулу. Такое обоснование применимо и к любым другим рассматриваемым здесь мутациям по одной аминокислоте.

Другие резистентные варианты

Наряду с конкретными случаями резистентности, рассмотренными здесь, существует много других отмеченных мутаций устойчивости к таргетной терапии. Каждая из них также использовалась для определения таких иммуногенных эпитопов, которые могут применяться в качестве вакцины для иммунотерапии, нацеленной на те клетки, которые содержат мутации типа резистентности (табл. 5).

Таблица 5

Многие из этих примеров использовались для прогнозирования иммуногенных эпитопов. Эти результаты приведены в табл. 6, в которой для каждой мутации типа резистентности представлено количество потенциальных связывающихся пептидов (с прогнозируемым сродством <500 нМ) при данной мутации для нескольких аллелей HLA человека.

Таблица 6

Во всех приведенных выше примерах представлены только прогнозы для какой-то подгруппы аллелей HLA. Зачастую, но не всегда, это самые распространенные аллели в каждой этнической популяции. Можно провести прогнозирование и по другим аллелям.

Более того, для данной иммунизации против резистентных вариантов при данной мутации резистентности можно использовать несколько пептидов, каждый из которых нацелен на отдельный возможный вариант резистентности, который может возникнуть, чтобы это принесло пользу самому широкому кругу пациентов.

Пример 4. Иммуногенные композиции, специфичные к подтипам рака

В табл. 7 представлена сводка данных по количеству мутаций, встречающихся в образцах из популяций с определенными подтипами рака. Каждая мутация в этом массиве данных по каждому заболеванию дает по крайней мере один прогнозируемый пептид, связывающийся с каким-либо из 33 аллелей HLA, выбранных потому, что они встречаются по меньшей мере у 5% в любой из трех этнических популяций (белые, черные, азиаты). Комбинация неоантигенных пептидов, полученных из полипептидов, возникающих при этих мутациях, может использоваться в иммуногенных композициях. Исходя из количества пептидов при выбранных мутациях, большой процент пациентов может получить пользу от вакцины. В табл. 7 представлено количество мутаций, встречающихся в массиве данных по каждому подтипу рака. Также приведен процент субъектов в каждом массиве данных, у которых будет по меньшей мере одна мутация из числа повторяющихся мутаций. Например, иммуногенная композиция для SKCM, содержащая неоантигенные пептиды, полученные при 64 повторяющихся мутациях, описанных здесь, охватывает 90,91% пациентов в этой популяции, причем у каждого субъекта должна быть по меньшей мере одна из этих неоантигенных мутаций.

Таблица 7

В табл. 8 представлены специфичные для каждого подтипа рака повторяющиеся мутации, а также пептиды, возникающие при каждой мутации, и фланкирующие пептиды, охватывающие эти пептиды (“ACC”, “BLCA”, “BRCA”, “CESC”, “COAD”, “CLL”, “CRC”, “DLBCL”, “GBM”, “HNSC”, “KICH”, “KIRC”, “KIRP”, “LAML”, “LIHC”, “LUAD”, “LUSC”, “MM”, “OV”, “PAAD”, “PRAD”, “READ”, “SKCM”, “STAD”, “TGCT”, “THCA”, “UCEC” и “UCS”). Мутации со сдвигом рамки отмечены как “fs”. “Del” и “Ins” означают делеции и вставки. Представлено количество пептидов, которые образуются при каждой мутации и связываются с определенным аллелем HLA. Повторяющиеся мутации включают мутации со сдвигом рамки и дают пептиды, связывающиеся с HLA по многим аллелям.

Пример 5. Повторяющиеся мутации для специфичных к подтипам рака иммуногенных композиций

В Атласе раковых геномов (The Cancer Genome Atlas, TCGA) содержатся всеобъемлющие данные по широкомасштабному секвенированию геномов из образцов опухолей, где зафиксированы генетические мутации, ответственные за рак. Опухолеспецифичные неоантигенные пептиды для иммуногенных композиций можно выбирать на основе ряда критериев. Первый критерий основывается на экспрессии генов. Определяли долю пациентов (по типу опухоли), у которых ген экспрессируется на уровне >10 транскриптов на миллион. При оценке принимали случайное распределение типа HLA в зависимости от мутационного статуса каждого гена и экспрессии гена (по типу опухоли). Для рассчета популяции, которую можно лечить каждым пептидом, использовали общенациональный годичный уровень заболеваемости. Пептиды ранжировали по ожидаемой популяции. Результаты анализа представлены в табл. 9.

Пример 6. Терапевтический таргетинг повторяющихся мутаций, экспрессирующихся в генах, содержащих внеклеточные домены

Опухолеспецифичные мутации, присутствующие у более 1% популяции больных раком, можно таргетировать с помощью лекарственных препаратов, распознающих опухолеспецифичный эпитоп, возникающий при мутации. Мутации предпочтительно приходятся на внеклеточные домены. Лекарственные препараты представлены антителами, фрагментами антител, конъюгатами антитело-препарат, аптамерами, CAR-рецепторами или T-клеточными рецепторами. Антитела или их фрагменты могут быть гуманизированными, полностью человеческими или химерными. Фрагменты антител могут представлять собой нанотела, Fab, Fab′, (Fab′)₂, Fv, scFv, диатела, триатела, тетратела, bis-scFv, минитела, Fab₂- или Fab₃-фрагменты.

Повторяющаяся мутация, которую можно таргетировать – ERBB3:p.S249C. Рецептор-3 фактора роста фибробластов – это белок, который у человека кодируется геном FGFR3. FGFR3 также обозначается как CD333 (кластер дифференцировки 333). Полноразмерный белок содержит внеклеточную область, состоящую из трех иммуноглобулиноподобных доменов, единственный пронизывающий мембрану гидрофобный сегмент и цитоплазматический тирозинкиназный домен. Мутация возникает во внеклеточном домене белка. Мутация присутствует у 6,92% больных раком мочевого пузыря (BLCA), проходивших анализ, и 1,12% пациентов с плоскоклеточной карциномой легких (LUSC), проходивших анализ.

Другая повторяющаяся мутация, которую можно таргетировать – ERBB3:p.V104M. Рецепторная тирозин-протеинкиназа erbB3, также известная как HER3 (рецептор эпидермального фактора роста человека) – это мембраносвязанный белок, который у человека кодируется геном ERBB3. ErbB3 является представителем рецепторных тирозинкиназ из семейства рецептора эпидермального фактора роста (EGFR/ERBB). Мутация присутствует у 1,72% больных колоректальным раком (CRC), 2,86% пациентов с аденокарциномой толстой кишки (COAD), 2,42% пациентов с аденокарциномой желудка (STAD) и 2,06% пациентов с плоскоклеточной карциномой шейки матки и эндоцервикальной аденокарциномой (CESC), проходивших анализ.

Еще одна повторяющаяся мутация, которую можно таргетировать – EGFR:p.L858R. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR; ErbB-1; HER1 у человека) – это поверхностный клеточный рецептор для внеклеточных белковых лигандов из семейства эпидермального фактора роста (семейства EGF). Мутация присутствует у 3,24% пациентов с аденокарциномой легких (LUAD), проходивших анализ.

Другая повторяющаяся мутация, которую можно таргетировать – MUC4:p.H4205Q. Муцин 4 (MUC 4) – это белок муцина, который у человека кодируется геном MUC4. Этот ген кодирует интегральный мембранный гликопротеин, который находится на поверхности клеток, хотя могут существовать и секретируемые изоформы. Мутация присутствует у 2,3% пациентов с аденокарциномой простаты (PRAD), 2,31% пациентов с карциномой уротелия мочевого пузыря (BLCA) и 7,14% пациентов с карциносаркомой матки (UCS), проходивших анализ.

Еще одна повторяющаяся мутация, которую можно таргетировать – PDGFRA:p.R483fs. α-Полипептид рецептора тромбоцитарного фактора роста – это белок, который у человека кодируется геном PDGFRA. Этот ген кодирует тирозинкиназный поверхностный клеточный рецептор для представителей семейства тромбоцитарного фактора роста. Мутация присутствует у 1,92% пациентов с аденокарциномой простаты (PRAD), проходивших анализ.

Следующая повторяющаяся мутация, которую можно таргетировать – TMEM52 23_26LLPL>L. Трансмембранный белок 52 кодируется геном TMEM52. Мутация присутствует у 1,53% пациентов с аденокарциномой простаты (PRAD), проходивших анализ.

Следующая повторяющаяся мутация, которую можно таргетировать – PODXL 28_30PSP>P. Белок-1 типа подокаликсина – это белок, который у человека кодируется геном PODXL. Мутация присутствует у 1,53% пациентов с аденокарциномой простаты (PRAD), 15,56% пациентов с адренокортикальной карциномой (ACC) и 3,57% пациентов с карциносаркомой матки (UCS), проходивших анализ.

* * *

После подробного описания предпочтительных воплощений настоящего изобретения следует иметь в виду, что изобретение, определенное вышеприведенными параграфами, не должно ограничиваться конкретными подробностями, изложенными в вышеприведенном описании, так как возможны многие очевидные их варианты, не отходящие от сущности и не выходящие за рамки настоящего изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> THE BROAD INSTITUTE INC.

DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC.

THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION

<120> SHARED NEOANTIGENS

<130> 47608.99.2007

<140> PCT/US2016/033452

<141> 2016-05-20

<150> 62/389,377

<151> 2016-02-23

<150> 62/179,877

<151> 2015-05-20

<160> 33733

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 1

Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly Asn Ile Leu Asn Val

1 5 10 15

Ser Ile Lys Ile Cys Leu Thr Leu Ser Pro Ser Thr

20 25

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 2

Val Ile Pro Gly Asn Ile Leu Asn Val

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 3

Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly Asn Ile

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 4

Asn Ile Leu Asn Val Ser Ile Lys Ile

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 5

Val Ser Ile Lys Ile Cys Leu Thr Leu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 6

Val Ser Ile Lys Ile Cys Leu Thr Leu

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 7

Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly Asn Ile

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 8

Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly Asn Ile

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 9

Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly Asn Ile

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 10

Val Ile Pro Gly Asn Ile Leu Asn Val

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 11

Val Ser Ile Lys Ile Cys Leu Thr Leu

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 12

His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 13

Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly Asn Ile

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 14

Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly Asn Ile

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 15

Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly Asn Ile

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 16

Val Ser Ile Lys Ile Cys Leu Thr Leu

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 17

Val Ile Pro Gly Asn Ile Leu Asn Val

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 18

Val Ile Pro Gly Asn Ile Leu Asn Val

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 19

His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Gly

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 20

Asn Ile Leu Asn Val Ser Ile Lys Ile

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 21

Lys Ile Cys Leu Thr Leu Ser Pro

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 22

Val Ser Ile Lys Ile Cys Leu Thr Leu

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 23

Val Ile Pro Gly Asn Ile Leu Asn Val

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 24

Arg Val Phe Gly Val Ser Glu Trp Leu

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 25

Gly Met Thr Leu Gly Ala Val Val Val

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 26

Met Thr Leu Gly Glu Lys Phe Arg Val

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 27

Arg Val Gly Asn Cys Lys His Leu Lys

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 28

Arg Val Gly Asn Cys Lys His Leu Lys

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 29

Val Val Val Ser Glu Arg Ile Leu Arg

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 30

Arg Val Gly Asn Cys Lys His Leu Lys

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 31

Lys Phe Arg Val Gly Asn Cys Lys His

1 5

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 32

Lys Phe Arg Val Gly Asn Cys Lys His Leu

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 33

Arg Val Gly Asn Cys Lys His

1 5

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 34

Thr Leu Gly Ala Val Val Val

1 5

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 35

Val Val Val Ser Glu Arg Ile Leu

1 5

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 36

Gly Met Thr Leu Gly Glu Lys

1 5

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 37

Ala Val Val Val Ser Glu Arg

1 5

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 38

Ala Gly Met Thr Leu Gly Glu

1 5

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 39

Gly Asn Cys Lys His Leu Lys

1 5

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 40

Leu Gly Ala Val Val Val Ser

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 41

Arg Val Phe Gly Val Ser Glu

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 42

Ile Leu Arg Val Phe Gly Val Ser

1 5

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 43

Asn Cys Lys His Leu Lys Met

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 44

Thr Leu Gly Ala Val Val Val

1 5

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 45

Val Val Val Ser Glu Arg Ile Leu

1 5

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 46

Thr Leu Gly Ala Val Val Val

1 5

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 47

Glu Ala Gly Met Thr Leu Gly

1 5

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 48

Leu Gly Ala Val Val Val Ser

1 5

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 49

Ala Val Val Val Ser Glu Arg

1 5

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 50

Ser Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met

1 5

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 51

Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 52

Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu

1 5

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 53

Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu Asn Tyr

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 54

Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu Asn Tyr

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 55

Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 56

Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met Arg

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 57

Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 58

Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu Asn Tyr

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 59

Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 60

Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 61

Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu Asn Tyr

1 5

<210> 62

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 62

Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met Arg

1 5

<210> 63

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 63

Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu Asn Tyr

1 5

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 64

Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu

1 5

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 65

Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu

1 5

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 66

Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu Asn Tyr

1 5

<210> 67

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 67

Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu Asn Tyr

1 5

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 68

Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu

1 5

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 69

Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met Arg

1 5

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 70

Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu

1 5

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 71

Met Ala Asn Gly Ser Leu Leu Asn Tyr

1 5

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 72

Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu

1 5

<210> 73

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 73

Val Gln Leu Ile Met Gln Leu Met Pro Phe

1 5 10

<210> 74

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 74

Ser Thr Val Gln Leu Ile Met Gln Leu Met

1 5 10

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 75

Gln Leu Ile Met Gln Leu Met Pro Phe

1 5

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 76

Gln Leu Ile Met Gln Leu Met Pro Phe

1 5

<210> 77

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 77

Val Gln Leu Ile Met Gln Leu Met Pro Phe

1 5 10

<210> 78

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 78

Met Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu

1 5 10

<210> 79

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 79

Met Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<400> 80

Gln Leu Ile Met Gln Leu Met Pro Phe

1 5

<210> 81

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R732Q"

<400> 81

Phe Tyr Glu Ser Asp Val Met Gly Arg Gly His Ala Arg Leu Val His

1 5 10 15

Val Glu Glu Pro His Thr Glu Thr Val Gln Gln Lys Tyr Phe Pro Glu

20 25 30

Thr Trp Ile Trp Asp Leu Val Val Val Asn Ser Ala Gly Val Ala Glu

35 40 45

Val Gly Val Thr

50

<210> 82

<211> 37

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.S654fs"

<400> 82

Tyr Asp Gln Cys Pro Val Ser Gly Pro Trp Asp Phe Pro Gln Pro Leu

1 5 10 15

Ile Asp Pro Met Pro Gln Gly His Ser Glu Pro Ala Phe His Tyr Leu

20 25 30

Glu Ala Leu Val Leu

35

<210> 83

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.A266T"

<400> 83

Val Pro Leu Leu Ser Arg Lys Phe Met Val Thr Ser Leu Cys Asn Tyr

1 5 10 15

Leu Ala Ile Asp Leu Ser Trp Arg Asp Thr Thr Ile Leu Asn Gly Thr

20 25 30

Cys Val Pro Pro Asp Val Trp Arg Lys Tyr Glu Lys Trp Leu Ser Pro

35 40 45

Asp Asn Ile Pro

50

<210> 84

<211> 33

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.T878fs"

<400> 84

Lys Thr Ile Asp Leu Val Ala Tyr Gly Asp Ile Asn Gly Phe Ser Ala

1 5 10 15

Met Ala Lys Thr Val Gly Leu Pro Thr Arg His Gly Ser Gln Asn Val

20 25 30

Ala

<210> 85

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R385I"

<400> 85

Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Gly Glu Cys Gly Lys Thr Phe Arg

1 5 10 15

Gln Ser Ala Asn Leu Tyr Val His Arg Ile Ile Ile His Thr Gly Glu

20 25 30

Lys Pro Tyr Lys Cys Glu Asp Cys Gly Lys Ala Phe Gly Arg Tyr Thr

35 40 45

Ala Leu Asn Gln

50

<210> 86

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.E95D"

<400> 86

Thr Phe Pro Pro Pro Gly Asp Thr Trp Glu Leu Ala Tyr Ile Pro Ser

1 5 10 15

His Ser Asp Ala Ala Lys Thr Val Thr Asp Asp Thr Val Arg Arg Ala

20 25 30

Leu Val Ile Asn Met Arg Val Arg Gly Phe Pro Ser Glu Lys Asp Phe

35 40 45

Glu Asp Tyr Ile

50

<210> 87

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R1476Q"

<400> 87

Pro Gln Ile Thr Leu Leu Asp Glu Pro Ser Thr Gly Met Asp Pro Lys

1 5 10 15

Ala Lys Gln His Met Trp Arg Ala Ile Gln Gln Thr Ala Phe Lys Asn

20 25 30

Arg Lys Arg Ala Ala Ile Leu Thr Thr His Tyr Met Glu Glu Ala Glu

35 40 45

Ala Val Cys Asp

50

<210> 88

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.L306fs"

<400> 88

Phe Val Thr Ile Ile Ile Thr Phe Thr Gln Ile Ile Val Met Thr Gly

1 5 10 15

Phe Met Val Ile Phe Ile Leu Phe Phe Tyr Met Ala Tyr Leu Trp

20 25 30

<210> 89

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.A696T"

<400> 89

Ser Thr Gln Phe Met Asp Glu Ala Asp Ile Leu Ala Asp Arg Lys Val

1 5 10 15

Phe Leu Ser Gln Gly Lys Leu Lys Cys Thr Thr Gly Ser Ser Leu Phe

20 25 30

Leu Lys Lys Lys Trp Gly Ile Gly Tyr His Leu Ser Leu Gln Leu Asn

35 40 45

Glu Ile Cys Val

50

<210> 90

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R842Q"

<400> 90

Arg Leu Val Glu Met Glu Gln Val Leu Ser Ser Leu Asn Lys Met Arg

1 5 10 15

Lys Thr Ile Gly Gly Val Ala Leu Trp Gln Gln Gln Gln Ile Cys Ala

20 25 30

Ile Ala Arg Val Arg Leu Leu Lys Leu Lys His Glu Arg Lys Ala Leu

35 40 45

Leu Ala Leu Leu

50

<210> 91

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.E1158K"

<400> 91

Asn Ser Gly Ile Trp Ser Phe Cys Phe Tyr Val Val Thr Val Phe Ser

1 5 10 15

Val Ala Gly Phe Ala Phe Ser Ile Phe Lys Lys Ser Asp Ile Pro Phe

20 25 30

Ile Phe Thr Phe Leu Ile Pro Pro Ala Thr Met Ile Gly Cys Leu Phe

35 40 45

Leu Ser Ser His

50

<210> 92

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R467L"

<400> 92

Arg Leu Tyr Asp Pro Thr Glu Gly Met Val Ser Val Asp Gly Gln Asp

1 5 10 15

Ile Arg Thr Ile Asn Val Arg Phe Leu Leu Leu Glu Ile Ile Gly Val

20 25 30

Val Ser Gln Glu Pro Val Leu Phe Ala Thr Thr Ile Ala Glu Asn Ile

35 40 45

Arg Tyr Gly Arg

50

<210> 93

<211> 51

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R527fs"

<400> 93

Val Lys Glu Ala Asn Ala Tyr Asp Phe Ile Met Lys Leu Pro His Lys

1 5 10 15

Phe Asp Thr Leu Val Gly Glu Arg Gly Pro Val Glu Trp Trp Ala Glu

20 25 30

Ala Glu Asp Arg His Cys Thr Cys Pro Gly Ser Gln Pro Gln Asp Pro

35 40 45

Pro Ala Gly

50

<210> 94

<211> 33

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.G318fs"

<400> 94

Leu Thr Glu Lys Ala Pro Trp Asn Ser Leu Ala Trp Thr Val Thr Ser

1 5 10 15

Tyr Val Phe Leu Lys Phe Leu Gln Gly Val Ala Leu Ala Val Gln Ala

20 25 30

Ser

<210> 95

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R345H"

<400> 95

Ser Arg Gln Cys Gln Glu Gln Ile Ala Arg Ala Met Gly Val Ala Asp

1 5 10 15

Glu Ala Leu Gly Asn Val Arg Thr Val His His Ala Phe Ala Met Glu

20 25 30

Gln Arg Glu Glu Glu Arg Tyr Gly Ala Glu Leu Glu Ala Cys Arg Cys

35 40 45

Arg Ala Glu Glu

50

<210> 96

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R570W"

<400> 96

Arg Met Leu Ile Leu Pro Leu Asn Asn Phe Pro Trp Val Ile Asn Gly

1 5 10 15

Leu Leu Glu Ala Lys Val Ser Leu Asp Trp Trp Ile Gln Leu Phe Leu

20 25 30

Asp Leu Pro Asn His Asn Pro Gln Ala Tyr Tyr Ser Pro Asp Pro Pro

35 40 45

Ala Glu Pro Ser

50

<210> 97

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.L883fs"

<400> 97

Val Ala Val Ile Pro Trp Ile Ala Ile Pro Leu Val Pro Leu Gly Ile

1 5 10 15

Ile Phe Ile Phe Leu Arg Arg Tyr Phe Trp Lys Arg Gln Glu Met

20 25 30

<210> 98

<211> 50

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.L1090fs"

<400> 98

His Ala Tyr Asn Lys Gly Gln Glu Phe Leu His Arg Tyr Gln Glu Leu

1 5 10 15

Leu Asp Asp Asn Gln Ala Pro Phe Phe Cys Leu Arg Val Arg Cys Gly

20 25 30

Gly Trp Leu Cys Gly Trp Thr Ser Ser Ala Ser Pro Ser Ser Pro Pro

35 40 45

Arg Gly

50

<210> 99

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.Y512C"

<400> 99

Ser Thr Leu Glu Tyr Ser Asn Glu Arg Leu Lys Gln Thr Asn Glu Met

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ile Lys Leu Leu Lys Leu Cys Cys Ala Trp Glu Asn Ile

20 25 30

Phe Arg Thr Arg Val Glu Thr Thr Arg Arg Lys Glu Met Thr Ser Leu

35 40 45

Arg Ala Phe Ala

50

<210> 100

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.L466P"

<400> 100

Ile Ile Met Gly Val Ile Leu Leu Tyr Asn Leu Leu Gly Ser Ser Ala

1 5 10 15

Leu Val Gly Ala Ala Val Ile Val Leu Pro Pro Ala Pro Ile Gln Tyr

20 25 30

Phe Ile Ala Thr Lys Leu Ala Glu Ala Gln Lys Ser Thr Leu Asp Tyr

35 40 45

Ser Thr Glu Arg

50

<210> 101

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.S606P"

<400> 101

Asp Val Val His Leu His His Ile Leu Gln Arg Glu Gly Gly Trp Glu

1 5 10 15

Ala Met Cys Asp Trp Lys Asp Val Leu Pro Pro Gly Gly Glu Lys Gln

20 25 30

Arg Ile Gly Met Ala Arg Met Phe Tyr His Arg Pro Lys Tyr Ala Leu

35 40 45

Leu Asp Glu Cys

50

<210> 102

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.H169Q"

<400> 102

Ala Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Tyr Leu Glu Gly Gln Leu Ala

1 5 10 15

Leu Ser Phe Arg Ser Arg Leu Val Ala Gln Gln Ala Tyr Arg Leu Tyr

20 25 30

Phe Ser Gln Gln Thr Tyr Tyr Arg Val Ser Asn Met Asp Gly Arg Leu

35 40 45

Arg Asn Pro Asp

50

<210> 103

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.K445N"

<400> 103

Asp Tyr Glu Asp Glu Glu Ala Ala Val Val Gln Tyr Asn Asp Pro Tyr

1 5 10 15

Ala Asp Gly Asp Pro Ala Trp Ala Pro Asn Asn Asn Tyr Ile Glu Lys

20 25 30

Val Val Ala Ile Tyr Asp Tyr Thr Lys Asp Lys Asp Asp Glu Leu Ser

35 40 45

Phe Met Glu Gly

50

<210> 104

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.P19T"

<400> 104

Met Gly Gln Gln Val Gly Arg Val Gly Glu Ala Pro Gly Leu Gln Gln

1 5 10 15

Pro Gln Thr Thr Arg Gly Ile Arg Gly Ser Ser Ala Ala Arg Pro Ser

20 25 30

Gly Arg Arg Arg Asp Pro Ala Gly Arg Thr Thr Glu Thr

35 40 45

<210> 105

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.L249fs"

<400> 105

Thr Ile Glu Pro Pro Pro Ala Asp Pro Arg Leu Arg Glu Asp Met Ala

1 5 10 15

Leu Leu Ala Asp Cys Ala Leu Pro Pro Arg Ala Pro Arg

20 25

<210> 106

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R1731C"

<400> 106

Ala Arg Ala Glu Gly Ile Pro Arg Ile Tyr Val Ser Ala Asn Ser Gly

1 5 10 15

Ala Arg Ile Gly Leu Ala Glu Glu Ile Cys Cys His Met Phe His Val

20 25 30

Ala Trp Val Asp Pro Glu Asp Pro Tyr Lys Gly Tyr Arg Tyr Leu Tyr

35 40 45

Leu Thr Pro Gln

50

<210> 107

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.E2318Q"

<400> 107

Val Ala Val Gln Phe Ala Asp Phe His Asp Thr Pro Gly Arg Met Leu

1 5 10 15

Glu Lys Gly Val Ile Ser Asp Ile Leu Gln Gln Trp Lys Thr Ala Arg

20 25 30

Thr Phe Leu Tyr Trp Arg Leu Arg Arg Leu Leu Leu Glu Asp Gln Val

35 40 45

Lys Gln Glu Ile

50

<210> 108

<211> 41

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.G255fs"

<400> 108

Glu His Lys Lys Leu Asp Leu His Arg Asp Phe Thr Val Ala Ser Pro

1 5 10 15

Ala Glu Phe Val Thr Arg Phe Gly Gly Ile Gly Ser Ser Arg Arg Cys

20 25 30

Leu Leu Pro Thr Thr Gly Leu Pro Pro

35 40

<210> 109

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.F48C"

<400> 109

Gln His Thr Lys Ala Asn Arg Gln Arg Glu Pro Gly Leu Gly Phe Ser

1 5 10 15

Phe Glu Phe Thr Glu Gln Gln Lys Glu Cys Cys Gln Ala Thr Ala Arg

20 25 30

Lys Phe Ala Arg Glu Glu Ile Ile Pro Val Ala Ala Glu Tyr Asp Lys

35 40 45

Thr Gly Glu Tyr

50

<210> 110

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R330H"

<400> 110

Thr Lys Leu Gln Val Ile Gln Phe Lys Leu Ala Asp Met Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Glu Ser Ala Arg Leu Leu Thr Trp His His Ala Ala Met Leu Lys

20 25 30

Asp Asn Lys Lys Pro Phe Ile Lys Glu Ala Ala Met Ala Lys Leu Ala

35 40 45

Ala Ser Glu Ala

50

<210> 111

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R224L"

<400> 111

Arg Glu Glu Glu Glu Arg Glu Arg Leu Gln Lys Glu Glu Glu Lys Arg

1 5 10 15

Arg Arg Glu Glu Glu Glu Arg Leu Arg Leu Leu Glu Glu Glu Glu Arg

20 25 30

Arg Arg Ile Glu Glu Glu Arg Leu Arg Leu Glu Gln Gln Lys Gln Gln

35 40 45

Ile Met Ala Ala

50

<210> 112

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R50Q"

<400> 112

Gly Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Gly Ile Phe His Ile His Glu Ala

1 5 10 15

Cys Ser Ser Ile His Val Asn His Val Gln Gln Asp Lys Leu Arg Glu

20 25 30

Ile Val Gly Ala Ser Thr Asn Trp Arg Asp His Val Lys Ala Met Glu

35 40 45

Glu Arg Lys Leu

50

<210> 113

<211> 85

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.Q123fs"

<400> 113

Asp Leu Asn Arg Lys Ser Asn Gln Val Lys Thr Cys Lys Ala Lys Ile

1 5 10 15

Glu Leu Leu Gly Ser Tyr Asp Pro Gln Asn Asn Leu Leu Leu Lys Ile

20 25 30

Pro Ile Met Gly Met Thr Leu Thr Leu Arg Arg Cys Thr Ser Ser Val

35 40 45

Ser Gly Ala Ala Glu Arg Ser Trp Arg Arg Pro Thr Glu Ala Gly Ser

50 55 60

Cys Pro Ala Ala Ala Ser Leu Thr Arg Pro His Pro Glu Val Leu His

65 70 75 80

Phe Ser Val Gly Val

85

<210> 114

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.V29G"

<400> 114

Gly Val Phe Ser Met Arg Leu Trp Thr Pro Val Gly Val Leu Thr Ser

1 5 10 15

Leu Ala Tyr Cys Leu His Gln Arg Arg Gly Gly Ala Leu Ala Glu Leu

20 25 30

Gln Glu Ala Asp Gly Gln Cys Pro Val Asp Arg Ser Leu Leu Lys Leu

35 40 45

Lys Met Val Gln

50

<210> 115

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R43W"

<400> 115

Phe Leu Phe Leu Leu Phe Phe Trp Leu Asp Arg Ser Val Leu Ala Lys

1 5 10 15

Glu Leu Lys Phe Val Thr Leu Val Phe Trp Trp His Gly Asp Arg Ser

20 25 30

Pro Ile Asp Thr Phe Pro Thr Asp Pro Ile Lys Glu Ser Ser Trp Pro

35 40 45

Gln Gly Phe Gly

50

<210> 116

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R105Q"

<400> 116

Glu Leu Gly Glu Tyr Ile Arg Lys Arg Tyr Arg Lys Phe Leu Asn Glu

1 5 10 15

Ser Tyr Lys His Glu Gln Val Tyr Ile Gln Gln Ser Thr Asp Val Asp

20 25 30

Arg Thr Leu Met Ser Ala Met Thr Asn Leu Ala Ala Leu Phe Pro Pro

35 40 45

Glu Gly Val Ser

50

<210> 117

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.E321K"

<400> 117

Leu Gln Met Ala Leu Asp Val Tyr Asn Gly Leu Leu Pro Pro Tyr Ala

1 5 10 15

Ser Cys His Leu Thr Glu Leu Tyr Phe Lys Lys Lys Gly Glu Tyr Phe

20 25 30

Val Glu Met Tyr Tyr Arg Asn Glu Thr Gln His Glu Pro Tyr Pro Leu

35 40 45

Met Leu Pro Gly

50

<210> 118

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.W279C"

<400> 118

Tyr Val Val Val Gly Ile Thr Ser Trp Gly Val Gly Cys Ala Arg Ala

1 5 10 15

Lys Arg Pro Gly Ile Tyr Thr Ala Thr Cys Cys Pro Tyr Leu Asn Trp

20 25 30

Ile Ala Ser Lys Ile Gly Ser Asn Ala Leu Arg Met Ile Gln Ser Ala

35 40 45

Thr Pro Pro Pro

50

<210> 119

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.I250M"

<400> 119

Ala Val Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Ile Pro Lys Gly Val

1 5 10 15

Met Leu Ser His Asp Asn Ile Thr Trp Met Met Ala Gly Ala Val Thr

20 25 30

Lys Asp Phe Lys Leu Thr Asp Lys His Glu Thr Val Val Ser Tyr Leu

35 40 45

Pro Leu Ser His

50

<210> 120

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.T188S"

<400> 120

Ala Ile Phe Cys Glu Thr Arg Ala Glu Trp Met Ile Ala Ala Gln Ala

1 5 10 15

Cys Phe Met Tyr Asn Phe Gln Leu Val Ser Ser Leu Tyr Ala Thr Leu

20 25 30

Gly Gly Pro Ala Ile Val His Ala Leu Asn Glu Thr Glu Val Thr Asn

35 40 45

Ile Ile Thr Ser

50

<210> 121

<211> 72

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.L402fs"

<400> 121

Pro Gly Tyr Met Gly Thr Ala Ala Ser Cys Tyr Asp Val Gln Ile Ile

1 5 10 15

Asp Asp Lys Gly Asn Val Leu Pro Pro Arg His Arg Arg Arg His Trp

20 25 30

His Gln Gly Gln Thr His Gln Ala Tyr Arg His Leu Leu Trp Leu Cys

35 40 45

Gly Gln Ser Arg Gln Asp Ser Ser Gln His Ser Arg Arg Leu Leu Ala

50 55 60

Pro Trp Arg Pro Gly Asn Gln Arg

65 70

<210> 122

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.K195N"

<400> 122

Val Ala Ser Glu Cys Pro Ser Leu Arg Ile Lys Leu Leu Val Ser Glu

1 5 10 15

Lys Ser Cys Asp Gly Trp Leu Asn Phe Asn Asn Lys Leu Leu Asn Glu

20 25 30

Ala Ser Thr Thr His His Cys Val Glu Thr Gly Ser Gln Glu Ala Ser

35 40 45

Ala Ile Tyr Phe

50

<210> 123

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.G275C"

<400> 123

Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg Cys Pro Glu Thr Leu Phe Gln

1 5 10 15

Pro Ser Phe Ile Gly Met Glu Ser Ala Cys Cys Ile His Glu Thr Thr

20 25 30

Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Ile Asp Ile Arg Lys Asp Leu Tyr

35 40 45

Ala Asn Asn Val

50

<210> 124

<211> 48

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.A22P"

<400> 124

Met Glu Glu Glu Ile Ala Ala Leu Val Ile Asp Asn Gly Ser Gly Met

1 5 10 15

Cys Lys Ala Gly Phe Pro Pro Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe

20 25 30

Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met

35 40 45

<210> 125

<211> 71

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.L88fs"

<400> 125

Gly Pro Thr Tyr Tyr Ile Asp Thr Asn Ala Leu Arg Val Pro Arg Glu

1 5 10 15

Asn Met Glu Ala Ile Ser Pro Leu Lys Met Gly Trp Leu Lys Thr Gly

20 25 30

Ile Val Ser Lys Leu Phe Trp Ile Ile Pro Thr Lys Cys Met Ser Asn

35 40 45

Gln Lys Pro Val Ser Ile Leu Phe Ser Cys Gln Arg His Arg Gly Ile

50 55 60

Leu Glu Gln Arg Glu Arg Asn

65 70

<210> 126

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R354H"

<400> 126

Thr Gly Phe Lys Glu Glu Met Ala Ala Asn Val Leu Leu Cys Gly Gly

1 5 10 15

Cys Thr Met Leu Asp Gly Phe Pro Glu His His Phe Gln Arg Glu Leu

20 25 30

Ser Leu Leu Cys Pro Gly Asp Ser Pro Ala Val Ala Ala Ala Pro Glu

35 40 45

Arg Lys Thr Ser

50

<210> 127

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.E211K"

<400> 127

Ile Tyr Ser Tyr Gly Lys Thr Ser Gly Leu Val Val Glu Ser Gly His

1 5 10 15

Gly Val Ser His Val Val Pro Ile Ser Lys Lys Gly Asp Val Leu Pro

20 25 30

Gly Leu Thr Ser Arg Ala Asp Tyr Ala Gly Gly Asp Leu Thr Asn Tyr

35 40 45

Leu Met Gln Leu

50

<210> 128

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R331H"

<400> 128

Glu Val Pro Gly Leu Ser Pro Val Gly Leu Ser Thr Met Ala Lys Gln

1 5 10 15

Ser Leu Arg Lys Leu Ser Leu Glu Met His His Ala Asp Leu Ala Gln

20 25 30

Asn Val Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ser Leu Phe Thr Gly Phe Glu Gly

35 40 45

Arg Phe Arg Ala

50

<210> 129

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

peptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.D893Y"

<400> 129

Ala Tyr Ser Gly Pro Gly Ser Val Pro Gly Ala Leu Asp Tyr Ala Ala

1 5 10 15

Phe Ser Ser Ala Leu Tyr Gly Glu Ser Tyr Tyr Leu

20 25

<210> 130

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R206H"

<400> 130

Ala Asp Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu

1 5 10 15

Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala His His Gln Ile Thr Leu Leu

20 25 30

Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg Gly Ser Trp

35 40 45

Gln Gly Glu Asn

50

<210> 131

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.S290L"

<400> 131

Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp

1 5 10 15

Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met Gly Leu Leu Leu Tyr Asp Tyr Leu

20 25 30

Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser

35 40 45

Ile Ala Ser Gly

50

<210> 132

<211> 37

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.S11L"

<400> 132

Met Ala Ser Asn Asn His Trp Phe Gln Ser Leu Leu Gln Val Pro Ser

1 5 10 15

Phe Ala Gln Met Leu Lys Lys Asn Leu Pro Val Gln Pro Ala Thr Lys

20 25 30

Thr Ile Thr Thr Pro

35

<210> 133

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.G44E"

<400> 133

Leu Ala Ala Ser Leu Gln Ile Ser Pro Gln Pro Arg Pro Trp Arg Pro

1 5 10 15

Leu Pro Ala Gln Ala Gln Ser Ala Trp Glu Glu Pro Ala Pro Ala Pro

20 25 30

Ala Thr Tyr Arg Ala Glu Gly Gly Trp Pro Gln Val Ser Val Leu Arg

35 40 45

Asp Ser Gly Pro

50

<210> 134

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.K380M"

<400> 134

Glu Lys Asp Gln Ile Asp Ile Thr Thr Asn Pro Val Gln Met Leu His

1 5 10 15

Glu Phe Ser Lys Tyr Arg Gln Arg Ile Met Met Gln His Ala Asp Ala

20 25 30

Val His Leu Ile Ser Arg Val Thr Phe His Tyr Lys Arg Ser Ser Leu

35 40 45

Ser Tyr Phe Gly

50

<210> 135

<211> 39

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.K73fs"

<400> 135

Gln Glu Gln Phe Glu Thr Glu Leu Lys Tyr Lys Met Thr Ile Asn Gly

1 5 10 15

Lys Ile Ala Val Leu Tyr Leu Lys Lys Lys Gln Glu Pro Pro Cys Thr

20 25 30

Arg Leu His Gly Asn Ile Leu

35

<210> 136

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.V205I"

<400> 136

Ile Asp Asn Ser Thr Gln Lys Gln Ser Ser Tyr Val Gly Trp Trp Ile

1 5 10 15

His Phe Arg Ile Val Glu Ile Val Val Ile Ile Ile Asp Asn Tyr Leu

20 25 30

Tyr Ile Arg Tyr Glu Arg Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Asp Leu Tyr

35 40 45

Val Ile Val Asn

50

<210> 137

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.Q741H"

<400> 137

Leu Lys Pro Lys Gln Glu Lys Met Pro Leu Ser Lys Ala Lys Thr Glu

1 5 10 15

Gln Glu Glu Ser Lys Thr Lys Thr Val His His Glu Glu Ser Lys Thr

20 25 30

Lys Thr Gly Gln Glu Glu Ser Glu Ala Lys Thr Gly Gln Glu Glu Ser

35 40 45

Lys Ala Lys Thr

50

<210> 138

<211> 53

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.G97L"

<400> 138

Lys His Val Leu His Leu Trp Pro Lys Arg Leu Leu Leu Pro Arg His

1 5 10 15

Leu Arg Val Phe Ser Phe Thr Glu His Leu Leu Glu Leu Leu Glu Asp

20 25 30

His Pro Tyr Ile Pro Lys Asp Cys Asn Tyr Met Gly Ser Val Lys Glu

35 40 45

Ser Leu Asp Ser Lys

50

<210> 139

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.S314Y"

<400> 139

Ser Ser Asp Trp Ala His Leu Tyr Leu Gln Arg Lys Tyr Asn Asp Ala

1 5 10 15

Leu Ala Trp Ser Phe Gly Lys Val Cys Tyr Tyr Leu Glu Tyr Ala Gly

20 25 30

Ser Val Ser Thr Leu Leu Asp Thr Asn Ile Leu Ala Pro Ala Thr Trp

35 40 45

Ser Ala His Glu

50

<210> 140

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R559Q"

<400> 140

Asp Arg Asn Asn Lys Tyr Val Phe Cys Gly Trp Arg Asn Leu Ile Cys

1 5 10 15

Gly Arg Leu Val Cys Thr Tyr Pro Thr Gln Gln Lys Pro Phe His Gln

20 25 30

Glu Asn Gly Asp Val Ile Tyr Ala Phe Val Arg Asp Ser Val Cys Ile

35 40 45

Thr Val Asp Tyr

50

<210> 141

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R256Q"

<400> 141

Asn Gln Thr Ala Val Arg Glu Glu Met Ile Leu Leu Ala Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Asp Ser Met Tyr Ile Met Leu Asn Ile Gln Gln Ile Val Leu Val Gly

20 25 30

Leu Glu Ile Trp Thr Asn Gly Asn Leu Ile Asn Ile Val Gly Gly Ala

35 40 45

Gly Asp Val Leu

50

<210> 142

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.E359K"

<400> 142

Leu Asn Pro Val His His Asp Val Ala Val Leu Leu Thr Arg Lys Asp

1 5 10 15

Ile Cys Ala Gly Phe Asn Arg Pro Cys Lys Lys Thr Leu Gly Leu Ser

20 25 30

His Leu Ser Gly Met Cys Gln Pro His Arg Ser Cys Asn Ile Asn Glu

35 40 45

Asp Ser Gly Leu

50

<210> 143

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.P1053A"

<400> 143

Arg Pro Arg Met Leu Thr Thr Pro Thr Gly Pro Glu Ser Met Ser Thr

1 5 10 15

Ser Thr Pro Ala Ile Ser Ser Pro Ser Ala Ala Thr Thr Ala Ser Lys

20 25 30

Glu Gly Asp Leu Gly Gly Lys Gln Trp Gln Asp Ser Ser Thr Gln Pro

35 40 45

Glu Leu Ser Ser

50

<210> 144

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.G238C"

<400> 144

Gln Gln Glu Trp Ala Glu Pro Asp Gly Asp Leu His Asn Glu Ala Phe

1 5 10 15

Gly Leu Gly Asp Leu Pro Asn Leu Leu Cys Cys Leu Val Gly Asp Gln

20 25 30

Leu Gly Asp Thr Glu Arg Lys Arg Arg His Ala Lys Pro Gly Ser Tyr

35 40 45

Ser Ile Glu Val

50

<210> 145

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.D817N"

<400> 145

Leu Arg Arg Tyr Tyr Leu Asn Gly His Trp Thr Val Asp Trp Pro Gly

1 5 10 15

Arg Tyr Lys Phe Ser Gly Thr Thr Phe Asn Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr

20 25 30

Asn Glu Pro Glu Asn Leu Ile Ala Thr Gly Pro Thr Asn Glu Thr Leu

35 40 45

Ile Val Glu Leu

50

<210> 146

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.N572T"

<400> 146

Ser Pro Trp Gly Ala Trp Ser Met Cys Ser Arg Thr Cys Gly Thr Gly

1 5 10 15

Ala Arg Phe Arg Gln Arg Lys Cys Asp Thr Thr Pro Pro Pro Gly Pro

20 25 30

Gly Gly Thr His Cys Pro Gly Ala Ser Val Glu His Ala Val Cys Glu

35 40 45

Asn Leu Pro Cys

50

<210> 147

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.D948N"

<400> 147

Trp Glu Pro Cys Ser Gln Thr Cys Gly Arg Thr Gly Met Gln Val Arg

1 5 10 15

Ser Val Arg Cys Ile Gln Pro Leu His Asn Asn Asn Thr Thr Arg Ser

20 25 30

Val His Ala Lys His Cys Asn Asp Ala Arg Pro Glu Ser Arg Arg Ala

35 40 45

Cys Ser Arg Glu

50

<210> 148

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R541L"

<400> 148

Lys Leu His Lys Gly Cys Phe Thr Gln His Val Pro Pro Ala Asp Gly

1 5 10 15

Thr Asp Cys Gly Pro Gly Met His Cys Leu Leu His Gly Leu Cys Val

20 25 30

Asn Lys Glu Thr Glu Thr Arg Pro Val Asn Gly Glu Trp Gly Pro Trp

35 40 45

Glu Pro Tyr Ser

50

<210> 149

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R1251S"

<400> 149

Gly Lys Thr Thr Arg Gln Val Leu Cys Met Asn Tyr His Gln Pro Ile

1 5 10 15

Asp Glu Asn Tyr Cys Asp Pro Glu Val Ser Ser Pro Leu Met Glu Gln

20 25 30

Glu Cys Ser Leu Ala Ala Cys Pro Pro Ala His Ser His Phe Pro Ser

35 40 45

Ser Pro Val Gln

50

<210> 150

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R156W"

<400> 150

Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp Asp Gly

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Trp Trp Gly Ala Glu Leu His

20 25 30

Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro Gly

35 40 45

Ala His Ile Leu

50

<210> 151

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.L549M"

<400> 151

Gln Gly Gln Met Val Cys Leu Thr Lys Lys Leu Pro Ala Val Glu Gly

1 5 10 15

Thr Pro Cys Gly Lys Gly Arg Ile Cys Met Met Gln Gly Lys Cys Val

20 25 30

Asp Lys Thr Lys Lys Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser Ser His Gly Asn Trp

35 40 45

Gly Ser Trp Gly

50

<210> 152

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.V524M"

<400> 152

Thr Pro Cys Gly Pro Gly His Leu Cys Ser Glu Gly Ser Cys Leu Pro

1 5 10 15

Glu Glu Glu Val Glu Arg Pro Lys Pro Met Met Ala Asp Gly Gly Trp

20 25 30

Ala Pro Trp Gly Pro Trp Gly Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly

35 40 45

Val Gln Phe Ser

50

<210> 153

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.G659W"

<400> 153

Phe Lys Ser Cys Asn Thr Glu Pro Cys Leu Lys Gln Lys Arg Asp Phe

1 5 10 15

Arg Asp Glu Gln Cys Ala His Phe Asp Trp Trp Lys His Phe Asn Ile

20 25 30

Asn Gly Leu Leu Pro Asn Val Arg Trp Val Pro Lys Tyr Ser Gly Ile

35 40 45

Leu Met Lys Asp

50

<210> 154

<211> 83

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.G778fs"

<400> 154

Thr Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly Pro Gly Thr Gln His Arg Gln Leu

1 5 10 15

Gln Cys Arg Gln Glu Phe Gly Gly Gly Trp Leu Leu Gly Ala Pro Gly

20 25 30

Ala Leu Trp Thr Ser Pro Pro Ala Gln His His Pro Val Leu Pro Ala

35 40 45

Ala Pro Leu Trp Pro Leu Gly Ser Trp Leu Ser Leu Glu Pro Val Leu

50 55 60

Arg Ala Val Arg Pro Gly Pro Glu Lys Pro Ala Gly Ser Leu Cys Trp

65 70 75 80

Glu Gln Trp

<210> 155

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.A87V"

<400> 155

Leu Ala Val Phe Phe Ala Leu Gly Leu Glu Val Glu Asp His Val Ala

1 5 10 15

Phe Leu Ile Thr Val Pro Thr Ala Leu Val Val Ile Phe Phe Ala Ile

20 25 30

Phe Ile Leu Val Cys Ile Glu Ser Val Phe Lys Lys Leu Leu Arg Leu

35 40 45

Phe Ser Leu Val

50

<210> 156

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.V888I"

<400> 156

His Val Ala Glu His Phe Leu Ala Arg Ser Leu Lys Asn Glu Glu Leu

1 5 10 15

Tyr His Gln Ser Tyr Asp Cys Val Cys Ile Ile Met Phe Ala Ser Ile

20 25 30

Pro Asp Phe Lys Glu Phe Tyr Thr Glu Ser Asp Val Asn Lys Glu Gly

35 40 45

Leu Glu Cys Leu

50

<210> 157

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.P1016T"

<400> 157

Ser Phe Asn Asp Phe Lys Leu Arg Val Gly Ile Asn His Gly Pro Val

1 5 10 15

Ile Ala Gly Val Ile Gly Ala Gln Lys Thr Thr Gln Tyr Asp Ile Trp

20 25 30

Gly Asn Thr Val Asn Val Ala Ser Arg Met Asp Ser Thr Gly Val Leu

35 40 45

Asp Lys Ile Gln

50

<210> 158

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R661H"

<400> 158

Ser Ile Glu Thr Phe Leu Ile Leu Arg Cys Thr Gln Lys Arg Lys Glu

1 5 10 15

Glu Lys Ala Met Ile Ala Lys Met Asn His His Gln Arg Thr Asn Ser

20 25 30

Ile Gly His Asn Pro Pro His Trp Gly Ala Glu Arg Pro Phe Tyr Asn

35 40 45

His Leu Gly Gly

50

<210> 159

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.E570K"

<400> 159

His Gly Pro Pro Ala Pro Pro Asn Pro Phe Ser His Leu Thr Glu Gly

1 5 10 15

Glu Leu Glu Glu Tyr Lys Arg Thr Ile Lys Lys Arg Lys Gln Gln Gly

20 25 30

Leu Glu Asp Ala Glu Gln Glu Leu Leu Ser Asp Asp Ala Ser Ser Val

35 40 45

Ser Gln Ile Gln

50

<210> 160

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.S1124L"

<400> 160

Pro Cys Asn Ser Phe Ala Ile Lys Glu Ile Arg Asp Tyr Tyr Ile Pro

1 5 10 15

Asn Asp Lys Lys Ile Leu Phe Arg Tyr Leu Leu Val Lys Val Leu Thr

20 25 30

Pro Gln Pro Ala Thr Ile Gln Val Arg Thr Ser Lys Pro Asp Ala Phe

35 40 45

Ile Lys Leu Gln

50

<210> 161

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.D154V"

<400> 161

Ser Arg Phe Thr Cys Arg Arg Lys Pro Ile His His Phe Leu Gly Ile

1 5 10 15

Ser Thr Phe Ser Gln Tyr Thr Val Val Val Val Glu Asn Ala Val Ala

20 25 30

Lys Ile Asp Ala Ala Ser Pro Leu Glu Lys Val Cys Leu Ile Gly Cys

35 40 45

Gly Phe Ser Thr

50

<210> 162

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.S322fs"

<400> 162

Asn Ser Pro Ser Pro Ala Ala Gly Gln Pro Val Thr Val Ala Gln Gly

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Leu Thr His Ser Pro Leu Leu Leu Ala Asn Pro Thr

20 25 30

<210> 163

<211> 52

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

polypeptide"

<220>

<221> source

<223> /note="p.R597H"

<400> 163