Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ МУТАГЕННОСТИ СУЛЬФОНИЛМОЧЕВИН И ТРИАЗОЛПИРИМИДИНОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ТЕСТА ЭЙМСА НА ИНДИКАТОРНЫХ ШТАММАХ SALMONELLA TYPHIMURIUM

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и генетической токсикологии и касается способа оценки потенциальной мутагенности сульфонилмочевин и триазолпиримидинов на индикаторных штаммах бактерий Salmonella typhimurium, который может быть использован для выявления потенциальной мутагенности химических веществ методом оценки обратных мутаций на бактериях (тест Эймса).

Уровень техники

Тест Эймса тест на индукцию обратных генных мутаций - является одним из наиболее широко используемых методов генетической токсикологии для оценки потенциальной мутагенности факторов окружающей среды различной природы ввиду простоты исполнения и способности выявлять до 80% мутагенов [Е. Zeiger. Bacterial Mutation Assays. Genotoxicity Assessment. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 2013. 1044: 3-26]. В тесте Эймса в качестве объекта тестирования применяют штаммы Salmonella typhimurium - ауксотрофы по гистидину или Escherichia coli WP2 - ауксотрофы по триптофану. Метод тестирования основан на способности мутагенов вызывать реверсии к прототрофности у ауксотрофных штаммов. Этот тест используют для оценки мутагенного потенциала химических соединений, применяемых в производстве товаров массового потребления, лекарственных препаратов, а также химических соединений, применяемых в сельском хозяйстве (как в открытом, так и в закрытом грунте). Известно применение штаммов бактерий S. typhimurium (ТА1535; ТА1537 или ТА97, или ТА97а; ТА98; ТА100; ТА102) для оценки мутагенности пестицидов [МУ 1.2.3364-16 «Оценка мутагенной активности пестицидов»].

Во многих странах производство средств защиты растений основано на использовании пестицидов-дженериков, представляющих собой «копии» оригинальных действующих веществ [R. Nishimoto. Global trends in the crop protection industry. Journal of pesticide science. 2019. 44(3): 141-147. DOI: 10.1584/jpestics.D19-101]. Однако в этом случае для обращения на рынке пестициды-дженерики должны пройти регистрацию - правовую процедуру, которую предваряет оценка эквивалентности технического продукта действующего вещества (ДВ) регистрируемого пестицида техническому продукту ДВ фирмы-оригинатора.

Алгоритм оценки эквивалентности пестицидов в РФ основан на рекомендациях, изложенных в международных документах [Н.А. Илюшина. Оценка эквивалентности технических продуктов пестицидов-аналогов оригинальным действующим веществам по критерию «мутагенность». Экологическая генетика. 2019. №2, стр. 101-112. DOI: 10.17816/ecogen172101-112] и представляет собой поэтапную процедуру, целью которой является определение соответствия химического состава продукта и его токсикологических характеристик оригинальному продукту, регистрационные испытания которого выполнены в полном объеме. В некоторых странах тест Эймса предлагают в качестве единственного и достаточного метода для первого этапа оценки эквивалентности технических продуктов ДВ пестицидов. Существенным ограничением применимости метода является невозможность его использования для определения эквивалентности химических веществ некоторых классов, например, антибиотиков, а также ряда ингибиторов топоизомераз или аналогов нуклеозидов [OECD. Test No. 471. Bacterial reverse mutation test. In: OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4: Health Effects. Paris: OECD Publishing; 1997. DOI: 10.1787/9789264071247-en; U. Friederich, F. Molko, V. Hofmann, D. Scossa, D. Harm, F.E. Wurgler, H.J. Senn. Limitations of the Salmonella/mammalian microsome assay (Ames test) to determine occupational exposure to cytostatic drugs. Eur J Cancer Clin Oncol. 1986. 22(5): 567-575. DOI: 10.1016/0277-5379(86)90045-3. PMID: 3533554]. ДВ пестицидов на основе сульфонилмочевин (СФМ) и триазолпиримидинов (ТАЛ) обладают цитотоксичностью в отношении индикаторных штаммов S. typhimurium, что не позволяет оценить их потенциальную мутагенность за счет примесей, присутствующих в небольших количествах. Это является серьезным препятствием в случае их тестирования для оценки эквивалентности оригинальным ДВ.

Ранее было показано, что при тестировании фармакологических субстанций в максимальной дозе (5 мг/чашка), определенной руководящим документом ОЭСР [OECD. Test No. 471. Bacterial reverse mutation test. In: OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4: Health Effects. Paris: OECD Publishing; 1997. DOI: 10.1787/9789264071247-en], концентрация, при которой может быть выявлено большинство мутагенных примесей, составляет 250 мкг/чашка [М.О. Kenyon, J.R. Cheung, K.L. Dobo, W.W. Ku. An evaluation of the sensitivity of the Ames assay to discern low-level mutagenic impurities. Regul Toxicol Pharmacol. 2007. 48(1): 75-86. DOI: 10.1016/j.yrtph.2007.01.006]. Следовательно, в случае технических продуктов ДВ пестицидов, цитотоксичных для индикаторных культур, вероятность обнаружения мутагенных примесей становится крайне низкой.

Наличие цитотоксичности тестируемого вещества может привести как к ложно-негативным, так и ложно-позитивным результатам. Ложно-позитивные результаты получают вследствие гибели большей части популяции внесенных бактерий. При этом оставшиеся микроорганизмы растут в условиях избытка гистидина, что приводит к формированию многочисленных микроколоний ауксотрофных спонтанных ревертантов, что ошибочно может быть принято за картину позитивного ответа [D.D. Levy, A. Hakura, R.K. Elespuru, P.A. Escobar, М. Kato, J.Lott et al. Demonstrating laboratory proficiency in bacterial mutagenicity assays for regulatory submission. Mut Research/Genetic Toxicol Environ Mutagenesis. 2018. 848: 403075. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2019.07.005]. Так, некоторые ДВ пестицидов определенных химических классов цитотоксичны для клеток тест-штаммов S. typhimurium. Например, для производных дитиокарбаматов (тирам, манкоцеб), триазолпиримидинов (флорасулам, пеноксулам и др.), сульфонилмочевин (СФМ) (этаметсульфуронметил, метсульфуронметил и др.) максимальная нецитотоксичная доза не превышает 0,125 мг/чашка [N.A. Ilyushina, O.V. Egorova, and V.N. Rakitskii. Limitations of pesticide genotoxicity testing using the bacterial in vitro method. Toxicology in Vitro. 2019. 57: 110-116. DOI: 10.1016/j.tiv.2019.02.018; O.V. Egorova, N.A. Ilyushina, and V.N. Rakitskii. Mutagenicity evaluation of pesticide analogs using standard and 6-well miniaturized bacterial reverse mutation tests. Toxicology in Vitro. 2020. 69: 105006. DOI: 10.1016/j.tiv.2020.105006].

Известно, что механизм действия пестицидов, относящихся к классам СФМ и ТАП, заключается в ингибировании синтазы ацетогидроксикислот (acetohydroxyacid synthase, AHAS), участвующей в синтезе разветвленных аминокислот, что приводит к подавлению роста растений. Аналогичное действие пестициды из этих классов оказывают и на клетки микроорганизмов.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа оценки потенциальной мутагенности триазолпиримидинов и сульфонилмочевин с применением теста Эймса, позволяющего проводить тестирование химических веществ из классов СФМ и ТАП на индикаторных штаммах S. typhimurium при высоких концентрациях вплоть до максимальной (5 мг/чашка), рекомендованной руководством ОЭСР №471, а также для подтверждения эквивалентности технических продуктов ДВ пестицидов указанных химических классов оригинальным действующим веществам по критерию «мутагенность».

Раскрытие изобретения

Поставленная задача решалась путем применения оригинального состава агаризованной среды для проведения тестирования технических продуктов ДВ классов СФМ и ТАП по критерию «мутагенность» с использованием индикаторных штаммов S. typhimurium.

Известно, что для проведения теста Эймса используют среды следующего состава [Фонштейн Л.М., Калинина Л.М., Полухина Т.Н., Абилев С.К., Шапиро А.А. Тест-система оценки загрязнителей среды на S. typhimurium. - М.: ВИНИТИ, 1997. - 52 с.]:

- Нижний минимальный селективный агар: 2% водный агар (300 мл), солевой концентрат (100 мл), 20% р-р глюкозы (10 мл), 1% р-р MgSO₄ (2 мл). Солевой концентрат: натрий лимоннокислый трехзамещенный (Na₃C₆H₅O₇⋅2Н₂О) - 2 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный (K₂HPO₄⋅3Н₂О) - 42 г/л; калий фосфорнокислый однозамещенный (KH₂PO₄) - 18 г/л; аммоний сернокислый ((NH₄)₂SO₄) - 4 г/л; дистиллированная вода до 1000 мл.

- Верхний полужидкий полуобогащенный агар: 0,7% минимальный агар (80 мл), 0,5 мМ гистидин (10 мл), 0,5 мМ биотин (10 мл).

Для снятия цитотоксического эффекта СФМ и ТАП в отношении индикаторных штаммов S. typhimurium по предлагаемому способу в верхний полужидкий агар дополнительно вводили изолейцин в концентрациях 1 мМ, 2 мМ и 5 мМ. При этом добавление изолейцина может быть выполнено как в верхний агар, так и в нижний агар. Однако, принимая во внимание наличие 2 вариантов приготовления нижнего минимального селективного агара, оптимальным и технологически целесообразным является модификация состава верхнего полужидкого агара.

Техническим результатом является способ оценки потенциальной мутагенности сульфонилмочевин и триазолпиримидинов, основанный на обогащении среды изолейцином. Настоящее изобретение позволяет проводить тестирование данной группы химических соединений на индикаторных штаммах S. typhimurium вплоть до максимальной концентрации 5 мг/чашка, рекомендованной руководством ОЭСР №471.

Предлагаемый способ по настоящему изобретению может быть использован в тесте Эймса для выявления потенциальной мутагенности химических веществ. При этом он имеет очевидные преимущества в сравнении с известными способами применения штаммов S. typhimurium.

Так, штамм S. typhimurium ВКПМ В-5300 (ТА100) чувствителен к действию цитотоксичных технических продуктов пестицидов класса СФМ (например, римсульфурон, тифенсульфурон-метил, метсульфурон-метил, триасульфурон, хлорсульфурон) и класса ТАП (например, пеноксулам, флорасулам), максимальные нецитотоксичные концентрации которых не превышают 0,05-0,125 мг/чашка, что не позволяет оценить потенциальную мутагенность пестицида за счет примесей, присутствующих в небольших количествах [N.A. Ilyushina, O.V. Egorova, and V.N. Rakitskii. Limitations of pesticide genotoxicity testing using the bacterial in vitro method. Toxicology in Vitro. 2019. 57: 110-116. DOI: 10.1016/j.tiv.2019.02.018]. Напротив, добавление изолейцина в среду при оценке химических соединений классов СФМ и ТАП позволяет проводить тестирование в диапазоне доз вплоть до максимальной - 5 мг/чашка, рекомендованной руководством ОЭСР №471 [https://www.oecd.org/chemicalsafety/risk-assessment/1948418.pdf]. Следует отметить, что применение способа по настоящему изобретению может иметь большое значение в фармацевтической промышленности для выявления мутагенности примесей в субстанциях лекарственных препаратов, в частности, производных СФМ.

Использование способа по настоящему изобретению проиллюстрировано следующими примерами.

Культуры штаммов S. typhimurium получены из НБЦ ВКПМ в лиофилизированном виде. Использована рекомендуемая комбинация штаммов [Testing of chemicals of human hazard. Bacterial reverse mutation test. ГОСТ 32376-2013 https://docs.cntd.ru/document/1200110800; Методические указания МУ-1.2.3365-16 от 04.07.2016 «Оценка мутагенной активности пестицидов». М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2016. 49 с.; Guidelines on Assessment of the toxicity and hazards of chemicals and their mixtures for human health (P 1.2.3156-13). Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor; 2014 (in Russian)]:

- S. typhimurium B-5291 (TA97);

- S. typhimurium B-5294 (TA98);

- S. typhimurium B-5300 (TA100);

- S. typhimurium B-5303 (TA1535);

- S. typhimurium B-5393 (TA102).

Указанные штаммы чувствительны к действию пестицидов классов СФМ и ТАП. Максимальные нецитотоксичные концентрации не превышают 0.05-0.125 мг/чашка, что не позволяет оценить потенциальную мутагенность технического продукта ДВ за счет примесей, присутствующих в небольших количествах.

В работе использованы следующие-среды.

Полная ростовая среда для культивирования бактерий (LB-среда) на 1 л: 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, дистиллированная вода, (15 г/л агара при приготовлении твердой среды). При генетическом анализе в состав агаризованной среды включали ампициллин и тетрациклин (1 мкг/мл). Концентрация ампициллина в среде для штаммов ТА97, ТА98, ТА100 составила 50 мкг/мл, ТА102 - 80 мкг/мл.

Нижний минимальный селективный агар: 2% водный агар (750 мл), солевой концентрат (40 мл), 20% р-р глюкозы (20 мл), 1% р-р MgSO4 (12 мл). Солевой концентрат: натрий лимоннокислый трехзамещенный (NaC6H5O7Na3x2H2O) - 10 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный, 3-х водный (K2HPO4x3H2O) - 210 г/л; калий фосфорнокислый однозамещенный (KH2PO4) - 90 г/л; аммоний сернокислый ((NH4)2SO4) - 20 г/л; дистиллированная вода.

Верхний полужидкий полуобогащенный агар (состав: 0,7% минимальный агар (80 мл), 0,5 мМ гистидин (10 мл), 0,5 мМ биотин (10 мл)), к 90 мл которого добавлено 10 мл раствора изолейцина с концентрацией 10 мМ, или 20 мМ, или 50 мМ.

В таблицах 2 и 3 приведены некоторые примеры оценки мутагенной активности цитотоксичных соединений классов СФМ (тифенсульфурон-метил) и ТАП (флорасулам) лишь для иллюстрации технического результата применимости нового способа оценки мутагенной активности с использованием добавки изолейцина в среду по настоящему изобретению и его преимуществ по сравнению с использованием среды без изолейцина.

Однако настоящее изобретение не ограничивается этими конкретными вариантами его осуществления, и специалист в данной области техники может внести в него различные изменения и модификации, не выходя за рамки объема или сущности изобретения, определенные в прилагаемой формуле изобретения.

Пример 1. Сравнительная оценка мутагенной активности химических соединений класса ТАП штаммами S. typhimurium ТА в присутствии в среде изолейцина и без него.

В качестве тест-объектов в исследовании использовали штаммы S. typhimurium В-5291, В-5294, В-5303, В-5300, В-5393, полученные из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ). Генотипы использованных тест-штаммов приведены в Таблице 1.

Культуры тест-штаммов получены в лиофилизированном виде. После вскрытия ампулы в стерильных условиях культуру высевали на твердую агаризованную среду (LB-среда) с последующими пересевами (2-3 пассажа) для выделения чистой культуры с последующим генетическим анализом.

Проверка генотипа включала следующие этапы проверки: ауксотрофность по гистидину, наличие/отсутствие плазмид R-фактора, присутствие специфических мутаций rfa и uvrB [4-5].

Ауксотрофность по гистидину оценивали при высеве штамма на нижний минимальный селективный агар, содержащий 0,0001% биотин и не содержащий гистидин. О наличии мутации судили по отсутствию роста на среде без гистидина. В качестве контроля оценивали рост штамма на нижнем минимальном селективном агаре, содержащем 0,0001% биотин и 0,0005% гистидин.

Мутацию г/а оценивали по чувствительности к кристаллическому виолету по наличию четкой зоны ингибирования вокруг диска, с нанесенным 0,1% раствором кристалл виолета.

Наличие плазмиды pAQ1 оценивали по способности штамма к росту на LB- среде, содержащей тетрациклин. В качестве контроля использовали штамм ТА98.

Наличие urB-мутации оценивали по чувствительности к УФ. Культуру высевали на LB-среду с последующей экспозицией секторов чашки Петри в УФ свете разной продолжительности.

После завершения анализа штамма на генетическое соответствие, колонии из контрольной чашки высевали на жидкую LB-среду (15-30 мл). После инкубации в течение 15-16 час при 37±2°С до плотности 1-3×10⁹ КОЕ/мл к инокуляту добавляли криоконсервант ДМСО (в конечной концентрации 5%, об./об.) и тщательно перемешивали. Культуру разливали по 500 мкл в стерильные криогенные пробирки с пометкой «РАБОЧАЯ КУЛЬТУРА» с номером штамма и датой подготовки и помещали в морозильный шкаф при температуре -75°С±5. Повторный генетический анализ рабочих культур проводили с периодичностью 1 раз в 1-2 месяца.

Перед началом эксперимента рабочую культуру после оттаивания при комнатной температуре вносили в 15-25 мл жидкой LB-среды и инкубировали в течение 14-16 час при 37±2°С до плотности приблизительно 10⁹/мл. Определение мутности суспензии проводили с помощью денситометра DEN-IB (BioSan, Латвия) и стандартов мутности 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 единиц Мак-Фарланда (Pro-Lab diagnostics, США).

Бактерии подвергали воздействию испытуемого вещества в вариантах с присутствием и отсутствием системы метаболической активации с использованием стандартного чашечного теста Эймса. Система метаболической активации включала кофакторы и постмитохондриальную фракцию печени крыс, полученную в условиях индукции Ароклор-1254 (S9). Постмитохондриальную фракцию использовали в диапазоне концентраций от 20% до 30% объема смеси S9 (15-22 мг/мл белка).

Получение активированной фракции печени S9 проводили как описано в [Egorova О.V., Ilyushina N.A., Rakitskii V.N. Mutagenicity evaluation of pesticide analogs using standard and 6-well miniaturized bacterial reverse mutation tests. Toxicology in Vitro. 2020. 69: 105006. DOI: 10.1016/j.tiv.2020.105006].

Тестировали технические продукты ДВ пестицидов тифенсульфурон-метил (97,4%, класс СФМ) и флорасулам (98,1%, класс ТАП).

Испытуемые вещества растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО).

В качестве отрицательного контроля использовали варианты с растворителем (ДМСО). Положительными контролями (ПК) служили: в условиях метаболической активации - 2-аминоантрацен, без метаболической активации - азид натрия (ТА100, ТА1535); 9-аминоакридин (ТА97); 2-нитрофлуорен (ТА98); метилметансульфонат (ТА102).

Процедура тестирования

В стерильные одноразовые пробирки вносили 0,5 мл буферной смеси для S9 или 0,5 мл системы метаболической активации, 100 мкл тестируемого образца (или положительного, или отрицательного контроля (ДМСО)), 100 мкл суспензии бактерий и 2 мл расплавленного верхнего полужидкого полуобогащенного агара (45-46°С)). Содержимое пробирок быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашках Петри. На каждой чашке отмечали дату, наименование вещества или контроля, его концентрацию, бактериальный штамм и наличие системы метаболической активации. Учет числа ревертантных колоний в контрольных и опытных чашках проводили после 64-68 час инкубации при 37±2°С.

Соединение рассматривали, как цитотоксичное, если имело место 40% снижение фона спонтанного мутирования [A. Hamel, M. Roy, R. Proudlock. The bacterial reverse mutation test. Chapter 4. In Genetic Toxicology Testing. A Laboratory Manual. 2016]. Вещество считали мутагенным согласно критериям, описанным в [O.V. Egorova, N.A. Ilyushina, and V.N. Rakitskii. Mutagenicity evaluation of pesticide analogs using standard and 6-well miniaturized bacterial reverse mutation tests. Toxicology in Vitro. 2020. 69: 105006. DOI: 10.1016/j.tiv.2020.105006].

Статистическую обработку проводили с помощью программы SPSS Statistics v.22.0 (Корпорация IBM, Нью-Йорк, США). Для оценки результатов, полученных в тесте Эймса, использовали t-тест для независимых выборок (для сравнения двух групп), тест Даннетта (для трех и более групп). Различия между группами считали статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты сравнительной оценки мутагенной активности цитотоксичных ДВ пестицидов классов СФМ (тифенсульфурон-метил) и ТАП (флорасулам) штаммами S. typhimurium ТА способом по настоящему изобретению представлены в таблицах 2-5.

Таким образом, если максимальные нецитотоксичные концентрации (НЦК) в случае применения исходной среды для тифенсульфурон-метила не превышали 0,1025-0,5 мг/чашка (табл. 2), то обогащение среды изолейцином позволяло провести оценку мутагенной активности соединения вплоть до максимальной дозы 5,0 мг/чашка (табл. 3-5), рекомендованной руководством ОЭСР №471. Аналогичные результаты были получены при тестировании флорасулама. НЦК для исходной среды составили 0,005-0,05 мг/чашка, в то время как после введения в состав верхнего агара изолейцина диапазон нецитотоксичных концентраций увеличился до 1,6-5,0 мг/чашка.