Результат интеллектуальной деятельности: Универсальная питательная среда плотная для выращивания биомассы бруцелл

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к разработке питательных сред, которые создают оптимальные условия для выращивания биомассы бруцелл.

Известна питательная среда для выращивания бруцеллезного микроба - мясопептонный агар, основой которой является, г/л: мясная вода - 1000,0 мл, 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого натрия хлористого и 25 г агар-агара, промытого водопроводной водой, рН среды устанавливают 7,8. Затем среду варят до полного расплавления агара и разливают в необходимую посуду (по 1-2 л). Далее среду автоклавируют при температуре 115°С в течение 20 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой, и вновь устанавливают рН - 7,1-7,2. Среду расфасовывают и стерилизуют при 115°С в течение 20 минут (Профилактика инфекционных болезней: инфекции, общие для человека и животных. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. Методические указания МУ 3.1.7.1189-03. С. 53).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность, длительный рост и малое количество выращенной биомассы бруцелл.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда-заменитель среды Альбими, содержащая 20 г пепетона Дифко, 20 см³ дрожжевой воды, 5 г натрия хлористого, 0,1 натрия бисульфита, дистиллированной воды - до 1 л (Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов И.Б. Определитель зоонозных микроорганизмов. - М.: Колос, 1995, с. 183). Смесь кипятят, устанавливают рН 7,3±0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют 20 мин при температуре 120°С.

Недостатком данной среды является низкая питательная ценность для бруцеллезных микроорганизмов.

Целью изобретения является получение универсальной питательной среды плотной для выращивания биомассы бруцелл, обеспечивающей достаточное количество биомассы в максимально ранние сроки - через 48 ч.

Технический результат заключается в том, что добавление в питательную среду «Сыворотки крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкой» максимально ускоряет процесс накопления биомассы бруцелл - до 48 ч.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется гидролитзат говяжьего мяса, мясная вода двойной концентрации, причем в качестве добавок вносятся пептон, дрожжевой эжкстракт, натрий фосфонокислый двузамещенный, натрий хлористый, глицерин, глюкоза, «Сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая», натрия метабисульфит, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

В качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется гидролизат говяжьего мяса, его основные характеристики: рН 7,2, общий азот 902 мг %, аминный азот 600 мг %, процент расщепления 74%, натрия хлорида 0,086%, пептона 1,2, Са 4 мг %, Mg 5,16 мг %, фосфор общий 96,8 мг %, фосфор неорганический 56,4 мг %. Сухой остаток 10±1,5%, редуцирующие вещества 364 мг %.

Также используют мясную воду двойной концентрации, являющуюся основой для многих питательных сред, обычно для приготовления мясной воды служит говядина или конина. Конина отличается большим содержанием углеводов (гликоген). Мясную воду лучшего качества (питательные свойства, прозрачность) обычно получают из мяса молодых, хорошо упитанных животных (телят). Азотистые вещества от 12,7 до 21,71%, жиры от 1,4 до 15,5%. Минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа, общее количество их достигает 1%. Мясо свежее содержит также витамины, экстрактивные вещества в большем количестве, чем в замороженном. (Ю.А. Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз - 1950 г. С. 46-48). Для увеличения концентрации мясной воды соотношение мясного фарша и воды можно увеличивать до 1:1 (двойная концентрация), при последующем изготовлении среды ее соответственно разводят. В мясной воде содержится, (%, масс): общего азота - 0,3; аминного азота - 0,07; сухих веществ - 2,4-2,8; белка - 0,45. Для требовательных микроорганизмов в питательную среду обязательно вводят пептон ферментативный, сыворотку и т.д. (Ю.А. Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз - 1950 г. С. 46-48). Включение в состав среды натрия фосфорнокислого 2-замещенного 12-водного обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов - М., 1989). (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 37-38).

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей, ГОСТ 13805-76. Пептон сухой ферментативный или панкреатический перевар получают за счет ферментов поджелудочной железы. Пептон выпускают, главным образом, в сухом состоянии, в виде желто-бежевого порошка. Пептон характеризуется высокой питательной ценностью для микроорганизмов. (Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии М.С. Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич. Санкт-Петербург. Элби-СПб. 2008. С. 27-31).

Сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая. В расплавленный и охлажденный до 45-56°С агар вносят 10-15% лошадиной сыворотки. Бруцеллы очень требовательны к факторам роста. Добавление сыворотки лошади в питательные среды значительно повышает их питательную ценность и ускоряет процесс накопления биомассы бруцелл за счет одновременного обогащения источником углерода и источником азота. (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Биргер М.О. Москва. «Медицина» 1982. С. 69).

Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке. Все питательные среды, как правило, содержат 0,5% натрия хлористого, что соответствует изоосмотическим условиям среды, оптимальным для жизнедеятельности микробов. Ионы натрия (Na⁺) участвуют в транспорте веществ через клеточные мембраны, в регуляции синтеза белка. (Справочник по микробиологическим питательным средам М.М. Меджидов. Москва «Медицина», 2003. С. 18).

Глюкоза кристаллическая, чда. Является наилучшим источником углерода (энергии). Внесение в питательную среду глюкозы в концентрации 1% улучшает ее ростовые свойства и способствует лучшему усвоению бруцеллами питательных веществ. Для выделения культуры возбудителя бруцеллеза во время лечения антибиотиками в питательные среды добавляют 1% глюкозы и 2% химически чистого глицерина. (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Биргер М.О. Москва. «Медицина», 1982. С. 276-279).

Глицерин, ГОСТ 6259-75. С внесением в питательную среду глицерина в концентрации 2% улучшаются ее ростовые свойства.

Натрия метабисульфит, ГОСТ 11683-76. В средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO₂), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.

Агар микробиологический - порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, без постороннего запаха, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85% не ниже 80°С, температура застудневания - 30-37°С, прочность студня - не менее 350±40 г. Главная особенность агара - его желирующая способность.

Дистиллированная вода соответствует всем санитарно-гигиеническим требованиям.

Приготовление мясной воды двойной концентрации

1 кг мясного фарша заливают 1 л дистиллированной воды и ставят на один сутки при температуре 6-8°С. Через сутки смесь фарша с водой кипятят в течение часа. Небольшие количества - до 5 литров можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса. После кипячения мясную воду двойной концентрации отжимают от фарша, доливают до первоначального объема дистиллированной водой, фильтруют и стерилизуют 30 минут при температуре 120°С. Хранят мясную воду двойной концентрации в стерильном виде в холодовой камере при температуре 5±2°С.

Приготовление универсальной питательной среды плотной

Питательную среду для культивирования бруцелл на основе ферментативного гидролизата говяжьего мяса и мясной воды двойной концентрации готовят следующим способом: ферментативный гидролизат говяжьего мяса, разведенный дистиллированной водой до содержания в нем 120 мг % аминного азота - 170,0 мл соединяют с мясной водой двойной концентрации - 500,0 мл; добавляют пептон ферментативный - 20,0 г; дрожжевой экстракт - 20,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 4,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; агар микробиологический - 18,0 г. Среду кипятят до полного растворения ингредиентов, устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, добавляют глюкозу - 5,0 г; глицерина - 4,0 мл; натрия метабисульфит - 0,3 г; дистиллированную воду - остальное, тщательно перемешивают, разливают по 263,3 мл в 3 градуированные флакона объемом 500 мл, перекрывают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт, фиксируют резиновыми кольцами, стерилизуют при 1 атм. в течение 20 мин. После стерилизации охлаждают до 56°С, стерильно над факелом добавляют в каждый флакон по 40 мл «Сыворотки крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкой» (таким образом в каждом из них получается по 333,3 мл среды). Укладывают на скашиватели, после охлаждения помещают в термостат на 2 суток при температуре 37°С (проверка на стерильность).

Сочетанное применение вышеописанных ингредиентов обеспечивает существенное усиление ростовых качеств при культивировании возбудителя бруцеллеза и значительное сокращение сроков выращивания - до 48 ч. Готовую питательную среду плотную используют для выращивания возбудителя бруцеллеза Brucella abortus 544, Brucella abortus 19 BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16 M.

Эффективность полученной среды оценивают в соответствии с методическими указаниями МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., с использованием штаммов: вакцинного Brucella abortus 19 ВА, вирулентных Brucella abortus 544, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16 M.

Испытуемые культуры выращивают в бактериологических пробирках на поверхности скошенного агара, рН 7,2±0,1, при температуре 37°С в течение 48 ч. Двухсуточные культуры смывают с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ НЦЭСМП МЗ России, эквивалентную 1,7×10⁹ бруцелл в 1 мл. Полученные микробные взвеси культур разводят сначала до концентрации 1×10⁹ м.к./мл, затем после разведения их 1:1, культуры каждого штамма: Brucella abortus 544, Brucella abortus 19 BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16 M высевают на 3 флакона по 500 млн м.к., содержащихся в 1 мл, равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности плотной среды. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С.

Оценку эффективности универсальной питательной среды плотной для выращивания биомассы бруцелл проводят путем подсчета количества собранной бактериальной массы штаммов Brucella abortus 544, Brucella abortus 19 BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16 M через 48 ч культивирования.

Пример 1. Культуры Brucella abortus 544, Brucella abortus 19 BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16 M выращивали на скошенной поверхности универсальной питательной среды плотной для выращивания биомассы бруцелл, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса - 150,0; мясную воду двойной концентрации - 300,0 мл; пептон сухой ферментативный - 18,0; дрожжевой экстракт - 20,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 3,0 г; натрий хлористый - 4,0 г; сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую - 80,0 мл; глюкозу - 4,0; глицерин - 3,0; натрия метабисульфит - 0,1; агар микробиологический - 15,0, дистиллированная вода - остальное.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде сбор биомассы составил для Brucella abortus 544 - 65 млрд м.к., для Brucella abortus 19 BA - 71 млрд м.к., для Brucella suis 1330 - 55 млрд м.к., для Brucella melitensis 16 М - 78 млрд м.к.

Питательная среда темно-коричневого цвета, в микроскоп не просматривается морфология колоний.

Пример 2. Культуры Brucella abortus 544, Brucella abortus 19 BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16 M выращивали на скошенной поверхности универсальной питательной среды плотной для выращивания биомассы бруцелл, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса - 170,0; мясную воду двойной концентрации - 500,0 мл; пептон сухой ферментативный - 20,0; дрожжевой экстракт - 20,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 4,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую - 120,0 мл; глюкозу - 5,0; глицерин - 4,0; натрия метабисульфит - 0,3; агар микробиологический - 18,0, дистиллированная вода - остальное.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде сбор биомассы составил для Brucella abortus 544 - 79 млрд м.к., для Brucella abortus 19 BA - 82 млрд м.к., для Brucella suis 1330 - 64 млрд м.к., для Brucella melitensis 16 М - 81 млрд м.к.

Пример 3. Культуры Brucella abortus 544, Brucella abortus 19 BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16 M выращивали на скошенной поверхности универсальной питательной среды плотной для выращивания биомассы бруцелл, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат говяжьего мяса - 190,0; мясную воду двойной концентрации - 600,0 мл; пептон сухой ферментативный - 22,0; дрожжевой экстракт - 20,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 5,0 г; натрий хлористый - 6,0 г; сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую - 140,0 мл; глюкозу - 5,0; глицерин - 5,0; натрия метабисульфит - 0,5; агар микробиологический - 21,0, дистиллированная вода - остальное.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде сбор биомассы составил для Brucella abortus 544 - 69 млрд м.к., для Brucella abortus 19 BA - 74 млрд м.к., для Brucella suis 1330 - 60 млрд м.к., для Brucella melitensis 16 М - 79 млрд м.к.

Таким образом, заявленная универсальная питательная среда плотная для выращивания биомассы бруцелл (пример №2) является оптимальной по количеству подобранных ингредиентов, и обеспечивает достаточное количество биомассы в максимально ранние сроки - через 48 ч культивирования.