Результат интеллектуальной деятельности: Способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале

Изобретение относится к способам количественного определения стойких хлорорганических соединений - хлорорганических пестицидов (α-, β-, γ-, δ- гексахлорциклогексана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилтрихлорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилдихдорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилэтилена, дильдрина, эндрина) и полихлорированных бифенилов - газохроматографическим и хроматомасс-спектрометрическим методами в органах и тканях многоклеточных животных, включая человека, что может быть использовано в биологии, экологии, медицине.

Известен способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов в крови, включающий экстракцию пестицидов из крови n-гексаном, очистку от соэкстративных веществ концентрированной серной кислотой, концентрирование n-гексанового экстракта (см. RU №2414711, МПК G01N 33/50, G01N 33/48, 2011).

Недостатком этого решения является ограниченная область применения из-за невозможности исследования внутренних органов и тканей человека.

Известен также способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений (ХОС) в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение и последующую экстракцию хлорорганических соединений n-гексаном, после чего полученный материал очищают от соэкстративных веществ концентрированной серной кислотой и получают концентрат n-гексанового экстракта хлорорганических соединений (см. патент РФ №2543360, G01N 33/483, 2015).

Недостатком этого способа является низкая эффективность и точность исследования из-за многократности этапов экстракции и очистки экстракта серной кислотой и, кроме того, сравнительно невысокий «выход» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение «выхода» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в повышении «выхода» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта за счет повышения полноты его извлечения из материала проб и исключения многоэтапности процесса очистки концентрированной серной кислотой.

Для решения поставленной задачи способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение, последующую экстракцию хлорорганических соединений n-гексаном, и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой отличается тем, что пробу отбирают из внутренних органов и тканей многоклеточного животного, гомогенизируют и полученный гомогенизированный образец помещают в ацетон и после интенсивного встряхивания добавляют n-гексан при соотношении навеска образца в г : ацетон в см³ : n-гексан в см³ равном 2:4:3, закрывают посуду парафиновой пленкой и оставляют экстрагироваться на лабораторном шейкере со скоростью не более 1 Гц на 25 минут, после чего жидкую фазу декантируют в делительную воронку, содержимое которой двукратно промывают порциями n-гексана по 2-3 см³, после чего в нее вносят 50 см³ 1% раствор KCl или NaCl, встряхивают и отстаивают до разделения фаз, после чего водно-ацетоновый слой удаляют, затем осуществляют полное выпаривание n-гексана, для очистки полученного липофильного экстракта от соэкстративных веществ в содержащую его посуду вносят 20-25 см³ n-гексана, тщательно перемешивают и вносят 10 см³ H₂SO_4конц., повторно перемешивают содержимое и оставляют на 24 часа, затем отделяют кислоту, а n-гексановый слой переносят в делительную воронку, далее промывают липофильный экстракт в n-гексане порцией 20 см³ 1% бикарбоната натрия, а затем порциями бидистиллированной воды объемом 20-30 см³ до нейтральной реакции универсального бумажного индикатора, полученный раствор фильтруют через безводный сульфат натрия и осуществляют полное выпаривание n-гексана.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Совокупность признаков формулы изобретения обеспечивает возможность повышения «выхода» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта за счет повышения полноты его извлечения из материала проб и исключения многоэтапности процесса очистки концентрированной серной кислотой от соэкстрактивных веществ в ходе реакции с ней липофильного экстракта.

При этом признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.

Признак «пробу отбирают из внутренних органов и тканей многоклеточного животного» описывает вид биоматерила.

Признак, указывающий, что полученный гомогенизированный образец «помещают в ацетон» обеспечивает далее полноту «выхода» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта из фосфолипидных комплексов.

Признак, указывающий, что «после интенсивного встряхивания (гомогенизированного образца в ацетоне) добавляют n-гексан» задает последовательность использования ацетона и n-гексана для получения концентрата n-гексанового экстракта.

Признак указывающий, что n-гексан к образцу в ацетоне добавляют «при соотношении навеска образца в г : ацетон в см³ : n-гексан в см³ равном 2:4:3» задает эффективные пропорции упомянутых веществ.

Признаки, указывающие, что «закрывают посуду (с реакционной массой) парафиновой пленкой и оставляют экстрагироваться на лабораторном шейкере со скоростью не более 1 Гц на 25 минут» обеспечивают процесс экстрагирования стойких хлорорганических соединений.

Признаки, указывающие, что «жидкую фазу декантируют в делительную воронку, содержимое которой двукратно промывают порциями n-гексана по 2-3 см³, после чего в нее вносят 50 см³ 1% раствор KCl или NaCl, встряхивают и отстаивают до разделения фаз, после чего водно-ацетоновый слой удаляют, затем осуществляют полное выпаривание n-гексана» обеспечивают более полный выход целевых веществ на этапе выпаривания за счет использования водного раствора поверхностно-инактивных веществ для быстрого и полного отделения ацетона от липофильного эктракта.

Признаки «для очистки полученного липофильного экстракта от соэкстративных веществ в содержащую его посуду вносят 20-25 см³ n-гексана, тщательно перемешивают и вносят 10 см³ H₂SO_4конц., повторно перемешивают содержимое и оставляют на 24 часа, затем отделяют кислоту, а n-гексановый слой переносят в делительную воронку, далее промывают липофильный экстракт в n-гексане порцией 20 см³ 1% бикарбоната натрия, а затем порциями бидистиллированной воды объемом 20-30 см³ до нейтральной реакции универсального бумажного индикатора, полученный раствор фильтруют через безводный сульфат натрия и осуществляют полное выпаривание n-гексана» задают перечень и режимы последующих операций по подготовке концентрата n-гексанового экстракта к газохроматографическому определению хлорорганических соединений в биоматериале.

На фиг. показана сводная хроматограмма определения хлорорганических соединений в биоматериале, где синим цветом обозначены пики, соответствующие полихлорированным бифенилам, а розовым и черным цветами обозначены хлорорганические пестициды.

Объем пробы определяется исходя из концентраций анализируемых веществ в образце, чувствительности аналитического метода и воспроизводимости результатов при повторе количественного анализа.

Предел обнаружения определялся из расчета три стандартных отклонения на восемь - десять анализируемых на ХОС образцов. Для анализа следовых концентраций ХОС обычно используют образцы от 1 до 10 г. Однако для более эффективного определения ХОС с высоким коэффициентом «октанол-вода» необходимо учитывать не только компонентное соотношение, но и различную степень химического экранирования липидов пептидными и полисахаридными комплексами в органах и тканях человека, поскольку такой подход позволяет повысить экстракционный выход.

Установлено, что наиболее эффективная очистка концентрированной серной кислотой исследуемых соединений от соэкстрактивных происходит в ходе реакции липофильного экстракта и концентрированной серной кислоты, если фосфолипидные комплексы пробы подверглись последовательному воздействию ацетона и гексана. Наиболее отчетливо процесс наблюдается при экстракции ХОС из проб цельной крови и проб поперечно-полосатой мускулатуры - в цельной крови начинается интенсивный гемолиз и распад фосфолипидных комплексов, сопровождающийся высвобождением молекул ХОС и частичным окрашиванием липофильного экстракта железосодержащими комплексными соединениями, в пробах поперечно-полосатой и гладкой мускулатуры не происходит рост коагулировавшего сгустка, препятствовавшего выходу ХОС.

Различные органические соединения имеют разные площади пиков на хроматограмме при одинаковой концентрации, что свидетельствует о разных лимитах детектирования ХОС (фиг.) и различной чувствительности масс-спектрометрического детектора к одинаковым концентрациям различных хлорорганических соединений.

При ацетоновогексановой экстракции применяют лабораторную посуду из боросиликатного стекла и керамический одноразовый инструмент во избежание контаминации анализируемыми веществами.

Пример реализации способа.

Пробу отбирают из биоматериала в виде внутренних органов и тканей человека. Все пробы помещают в стеклянные контейнеры достаточного объема и замораживают до температуры -20°С или ниже. Пустая пробирка необходима для контроля чистоты тары.

Отобранные пробы измельчают на ультрагомогенизаторе механически. В плоскодонную коническую колбу без шлифа вместимостью 100 см³ вносят ацетон, навеску полученного гомогенизированного образца и интенсивно встряхивают, после чего добавляют n-гексан (объемы растворителей рассчитываются из соотношения навеска образца в г : ацетон в см³ : n-гексан в см³, но не менее 8 см³ ацетона и, соответственно, 6 см³ n-гексана), закрывают плоскодонную коническую колбу парафиновой пленкой типа Parafilm и оставляют экстрагироваться на лабораторном шейкере со скоростью не более 1 Гц на 25 минут.

Жидкую фазу в виде раствора липофильного экстракта в n-гексан-ацетоновой смеси декантируют через простой фильтр (Белая лента), смоченный n-гексаном, в делительную воронку ВД-3-250-29/32 с PTFE краном. Содержимое делительной воронки двукратно промывают порциями n-гексана по 2-3 см³, после чего в нее вносят 50 см³ 1% раствор KCl (предпочтительно) или NaCl, встряхивают и отстаивают до разделения фаз. После разделения фаз водно-ацетоновый слой удаляют.

На аналитических весах (4 класс точности) взвешивают круглодонную колбу К-1-100-29/32, предварительно просушенную в сушильном шкафу в течение 30-40 минут до стабилизации веса, охлажденную до комнатной температуры в эксикаторе с индикаторным силикагелем. Данные вносят в лабораторный журнал.

Оставшийся в делительной воронке слой фильтруют через безводный сульфат натрия, смоченный в n-гексане, в круглодонную колбу К-1-100-29/32 и ставят на роторный испаритель (водяная баня - 35°С + вакуум) до полного выпаривания n-гексана. Далее круглодонную колбу помещают в сушильный шкаф с температурой 102°С до стабилизации веса.

После стабилизации веса липофильного экстракта круглодонную колбу взвешивают повторно. Данные вносят в лабораторный журнал и рассчитывают массу навески и процентное содержание общих жиров, полученных во время экстракции, для последующего пересчета концентраций органических загрязняющих веществ как нг/г липидов (общепринятые измерения концентрации органических загрязняющих веществ в живых организмах).

Для очистки полученного липофильного экстракта от соэкстративных веществ в вытяжном шкафу в круглодонную колбу с липофильным экстрактом вносят 20-25 см³ n-гексана, тщательно перемешивают и вносят 10 см³ H₂SO_4конц. Содержимое повторно перемешивают и оставляют на 24 часа. Отделяют часть кислоты автоматическим кислотостойким дозатором с одноразовым полипропиленовым наконечником и n-гексановый слой переносят в делительную воронку ВД-3-250-29/32 с PTFE краном. Промывают раствор экстрагированных исследуемых соединений в n-гексане порцией 20 см³ 1% бикарбоната натрия, и далее порциями бидистиллированной воды объемом 20-30 см³ до нейтральной реакции универсального бумажного индикатора.

Раствор исследуемых соединений в n-гексане фильтруют через безводный сульфат натрия в коническую колбу KO-30-14/23; КО-30-29/32 и ставят на роторный испаритель (водяная баня - 35°С) до полного выпаривания n-гексана.

Определение концентраций хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в образцах проводят на газовом хроматографе с масс-селективным детектором и на газовом хроматографе с детектором электронного захвата.

Используют капиллярные колонки 5ms (в токе защитной смеси газов гелия и азота при стабильном потоке 1 см³/мин) и 5ms (в токе защитного газа гелия при стабильном потоке 1 см³/мин). Температуры колонки, инжектора и детектора газового хроматографа с детектором электронного захвата составляют 210°С, 250°С и 280°С соответственно, газового хроматографа с масс-селективным детектором - 100-310°С (подъем температуры составляет 7°С в минуту до предела в 310°С), 250°С, 200°С, соответственно. Масс-спектрометр работает в режиме электронной ионизации (EI). Программное обеспечение работает в режиме «поиска и определения». Одно- и двухзарядные ионы учитываются раздельно.

Пробу растворяют в 0,5 см³ n-гексана и «закалывают» аликвоту в объеме 2 мм³.

Время удержания, массы и объем подтвержденных ионов целевых веществ являются идентификационными критериями. Хроматограммы с бифенилами и пестицидами представлены на фиг.

Таким образом, показанный способ подготовки пробы для газохроматографического и хроматомасс-спектрометрического определения хлорорганических соединений (ХОС) в органах и тканях человека позволяет уменьшить объем пробы при сравнимом выходе липофильного экстракта, что в итоге сокращает расходы n-гексана и бидистиллированной воды, сокращает время на производство одной пробы на 48-72 часа и повышает чувствительность метода при количественном обнаружении ХОС.