Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОМ-ИНДУЦИРОВАННОЙ КОАГУЛОПАТИИ У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для изучения механизмов нарушения системы гемостаза у экспериментальных животных при хроническом отравлении соединениями хрома, а также для экспериментальной разработки средств и методов профилактики и лечения нарушений свертывающей системы крови.

Данные литературы свидетельствуют о прямом влиянии экопатогенных факторов на здоровье человека (Микроэлементозы человека /А.П. Авцын, А.А. Жаворонков, М. А. Риш - М.: Медицина, 1991. - 496 с). Хром, как микроэлемент более полувека относили к эссенциальным нутриентам, которым свойственно влияние на углеводный, жировой и, по некоторым данным, белковый обмен (Vincent J.B. 2017. https://doi.org/10.3945/jn. 117.255901). Вместе с тем, в зависимости от степени окисления, при поступлении Cr⁶⁺ в организм могут развиваться полиорганные структурно-функциональные нарушения. Соединения хрома могут оказывать аллергенное, мутагенное, канцерогенное, гонадотропное воздействия. Известна корреляция зависимости гематологических показателей у работников тяжелой промышленности от стажа работы (Junaid М, Hashmi M.Z., Malik, R.N. 2016; https://doi.org/10.1007/s11356-016-7463-x). Одним из механизмов токсического действия хрома на организм является активация процессов перекисного окисления липидов и подавление механизмов антиоксидантной защиты клетки. Вместе с тем, показано, что оксидативный стресс при любой патологии сопровождается изменением процессов свертывания крови ( A.Sh., Galian S.L., Ral'chenko I.V. 2006). Имеются указания о том, что тяжелые металлы обладают прокоагулянтной активностью в последовательности Ni²⁺ > Cu²⁺ > Со²⁺ > Zn²⁺ (Mutch NJ1, Waters EK, Morrissey JH. 2012 Oct; 10(10):2108-15.

https://doi. org/10.1111/j.1538- 7836.2012.04890.x.). что было обусловлено активацией внутреннего пути свертывания крови через фактор контакта.

Mitrov D. и соавторы (Mitrov D., Hadzi-Petrushev N., Stojkovski V., Gjorgievska E., Gagov H., Mladenov M. Influence of chronic chromium exposition on the processes of lipid peroxidation inflammation and platelet activation in rats. J Biol Regul Homeost Agents. 2014;28(3):531-535.) выявили в эксперименте тромбоцитопению и увеличение агрегационной активности тромбоцитов у крыс, на фоне выраженной активации процессов перекисного окисления липидов при действии хрома.

Роль соединений хрома в профессиональной патологии изучена достаточно подробно, но действие их на систему гемостаза не исследовано, отдельные наблюдения противоречивы и носят преимущественно экспериментальный характер и отражают сугубо токсикологические аспекты (Mary Мото С.М., Ferdinand N., Omer Bebe N.K. 2019; https://doi. org/10.3390/vetsci6010030; Des Marais T.L., Costa M. 2019; https://doi. org/10.1016/j.cotox.2019.05.003). Актуальной является проблема создания удобной модели хронической коагулопатии, для разработки эффективных способов профилактики и лечения хронической интоксикации соединениями хрома.

Известен способ (Патент на изобретение RU 2 706 386 С1), при котором для моделирования токсической хронической коагулопатии белым крысам ежедневно вводили раствор ацетата свинца через зонд в желудок в течение двух месяцев в дозе 5 мг/кг массы тела животного. При моделировании свинцовой интоксикации у экспериментальных животных происходят нарушения в системе клеточного и плазменного гемостаза. Недостатком способа является то, что с его помощью невозможно получить модель хромовой коагулопатии, так как в прототипе не рассматривалось влияние бихромата калия на процессы свертывания крови. Показано, что разные металлы и их соединения оказывают различные биологические эффекты, имеют преимущественные системы и органы «мишени» повреждающего воздействия.

Известен способ включающий введение в организм экспериментальных животных соли ртути с питьевой водой в течение 28 дней в дозе превышающей ПДК в 1000 раз (Arbi S, Oberholzer HM, Van Rooy MJ, Venter С, Bester MJ. Effects of chronic exposure to mercury and cadmium alone and in combination on the coagulation system of Sprague-Dawley rats //Ultrastruct Pathol. 2017 Jun 15:1-9.

https://doi.org/10.1080/01913123.2017.1327909). Показано, что соли ртути способны активировать прокоагулянтные свойства тромбоцитов. Недостатком способа является сложность определения количества металла поступающего в организм с питьевой водой на единицу массы тела животного и отсутствие сведений о состоянии плазменного звена системы гемостаза при воздействии тяжелых металлов на организм экспериментального животного.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ (Кухарчук О.Л., Руденко С.С., Бойчук Т.М., Подолян С.К., Довганюк Л.I, Магаляс В.М., Заболотна Л.В., Оленович О.А. Стан загального коагуляцiйного потенцiалу кровi i тканинного фiбринолiзу у бiлих щурiв в нормi та при // Вiсник проблем биологии и медицины. 1999; 6: 130-136.), при котором с целью моделирования токсической коагулопатии у экспериментальных животных, крысам вводят через зонд в желудок раствор хлорида кадмия (CdCl2) в дозе 0,05 мг/кг массы тела, ежедневно в течение 2-х недель. При кадмиевой интоксикации у животных в течение двух недель развивается синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. Нарушения в системе регуляции агрегатного состояния крови начинаются с токсического влияния на мембраны тромбоцитов, что вызывает увеличение их адгезивной и агрегационной активности, освобождение индукторов агрегации и вторичную активацию коагуляционного гемостаза и снижение активности противосвертывающей системы крови.

Недостатком данного способа является:

- невозможность получения модели хромовой коагулопатии, так как в прототипе не рассматривалось влияние бихромата калия на свертывающую систему крови. Различные химические соединения металлов оказывая политропный эффект на организм, все же имеют преимущественные системы и органы «мишени» воздействия на живой организм. Кадмий является токсическим веществом первого класса опасности. Соли хрома, в зависимости от степени окисления, могут с одной стороны оказывать влияние на обмен веществ, чувствительность клеток к инсулину и применялись ранее в составе биологически активных добавок в рацион человека (Feng W, Zhao Т, Мао G, et al. 2015. https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0125952; Piotrowska A., Pilch W., Tota , Nowak G. 2018. https://doi.org/10.13075/mp.5893.00625), с другой стороны, способны вызывать нефро и гепатотоксические эффекты ( W.R., Z.L., R., C.C., Tapia E., Pedraza-Chaverri J. 2015. https://doi.org/10.1007/sl2011-015-0283-x) и карциногенез при введении бихромата калия (Chen QY, Murphy A, Sun Н, Costa М. 2019. https://doi.org/10.1016/i.taap.2019.114636).

- влияние хлорида кадмия на организм в течение двух недель недостаточно для получения модели хронической коагулопатии. Длительный эксперимент - в течение двух месяцев является более приближенным к натуральным условиям (моделируя поступление металла в организм с пищей и водой в условиях техногенного загрязнения окружающей среды), является более информативным, позволяя в разные сроки подробно в динамике изучить формирование нарушений звеньев системы гемостаза (через один и два месяца) в условиях токсического воздействия, что особенно важно в коагулологии.

- Такая разрозненность, противоречивость сведений и определили цель настоящего исследования.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в создании способа моделирования хронической токсической хромовой коагулопатии у экспериментальных животных.

Решение этой задачи позволяет более полно в динамике изучить патофизиологические механизмы развития коагулопатии при хроническом воздействии хрома, создать способ моделирования хронической хромовой коагулопатии у экспериментальных животных, повышающий воспроизводимость, удобный для проведения эксперимента на животных и экономически выгодный.

Для достижения этого технического результата в заявляемом способе экспериментальным животным ежедневно 1 раз в сутки в течение 60 дней вводят в желудок токсическое вещество, в качестве которого используют раствор бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг в пересчете на металл, где в единице раствора, равной 0,3 мл, содержится 0,05 мг хрома Cr(VI).

Данный способ отличается от прототипа использованием в качестве токсического вещества - бихромата калия, длительностью и дозировкой введения металла.

Между отличительными признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: длительное введение бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг приводит к развитию хронической токсической коагулоратии у экспериментальных животных, что является удобной и приближенной к натуральным условиям моделью.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа моделирования хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных. В научно-медицинской литературе нами не выявлено описание использования бихромата калия для моделирования хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных. Следовательно, изобретение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в точном и легко воспроизводимом способе развития хронической хромовой коагулопатии у экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом. Для получения токсического вещества бихромат калия растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что в единице раствора, равной 0,3 мл, содержится 0,05 мг хрома (Cr(VI) в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы вводят 0,3 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор бихромата калия вводят через атравматичный зонд в желудок в дозе 0,5 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 60 дней одной группе животных (30 крыс).

Материалом для исследования является плазма крови, богатая и бедная тромбоцитами, а также цельная кровь. Забор крови, ее стабилизация и получение образцов плазмы осуществляются с учетом международных стандартов по клинической лабораторной диагностике для исследований в области гемостаза (Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики. - СПб.: ФормаТ, 2006. - 208 с).

В пробах крови и плазмы определяются следующие показатели: количество тромбоцитов; АДФ - индуцированная агрегация тромбоцитов по Born A.G. (1962); активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) по Caen et al. (1968); протромбиновое время (ПВ) свертывания по Quick (1935); содержание фибриногена в плазме по Clauss (1961); активность антитромбина III в плазме крови по В.А. Макарову и соавт.(2002); количество растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) (Елыкомов В.А., Момот А.П. Авторское свидетельство 1371219, 1987. СССР / Способ определения количества растворимого комплекса фибрин-мономера в плазме крови); XIIa-калликреин-зависимый фибринолиз (XIIa-ЗЛ) - для оценки фибринолитической системы (Баркаган, З.С.Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза / З.С.Баркаган, А.П. Момот.М.: Ньюдиамед-АО, 2008. - 292 с.)

Все коагулологические исследования были выполнены с использованием наборов реагентов для исследования системы гемостаза НПО «Ренам» и ООО фирмы «Технология-Стандарт», Россия на турбидиметрическом коагулометре CGL-2110 и агрегометре АР-2110 «Solar» (Беларусь). Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных (1986) и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №708 от 23.08.2010).

Полученные результаты обрабатывались статистически с учетом распределения признаков в группах с использованием критерия Шапиро-Уилка. Использовали пакет программ Microsoft Excel 2016 и "STATISTICA 10.0" (StatSoft). Данные представлены в виде медианы (Me) и [25-75] процентилей выборки. Оценку статистической значимости различий в группах животных проводили с использованием непараметрического U-критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при вероятности ошибки р<0,05.

Пример. Крысам-самцам линии Вистар весом 200-300 гр в течение 2 месяцев ежедневно 1 раз в сутки через зонд в желудок вводили раствор бихромата калия в дозе 0,5 мг/кг веса животного. Контролем служили интактные животные (10 крыс) содержащиеся в стандартных условиях вивария.

С целью изучения состояния системы гемостаза через 2 недели, 1 и 2 месяца определяли количество тромбоцитов и их агрегационную активность (индуктор АДФ - 10,0 мкг/мл), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ), относительное время полимеризации фибрин-мономеров (ВПФМ), концентрацию фибриногена, активность антитромбина АТ(III), время спонтанного эуглобулинового лизиса (СЭЛ), концентрацию растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) («Технология стандарт», Россия).

Проведенные исследования показали, что при внутрижелудочном введении раствора хрома в течении двух месяцев, у экспериментальных животных развиваются нарушения в системе клеточного и плазменного гемостаза (Таблица).

Как следует из представленных данных выявлялось значительное увеличение концентрации фибриногена в плазме крови и повышение степени АДФ-агрегации тромбоцитов через две недели. С увеличением времени эксперимента через один месяц выявлялась гиперкоагуляционная направленность процессов свертывания крови. Сохранялась высокая концентрация фибриногена. Выявлялось укорочение АЧТВ и ПВ, тромбиновое время достоверно не менялось. Напряжение в системе гемостаза подтверждалось укорочением времени полимеризации фибрин мономерных комплексов (ВПФМ). Регистрировалось уменьшение количества тромбоцитов, при увеличении их функциональной активности. Смещение гемостатического потенциала в сторону гиперкоагуляции компенсировалось активацией антикоагулянтной и фибринолитической систем. Выявлялось достоверное увеличение активности AT III и укорочение времени спонтанного эуглобулинового лизиса.

Через два месяца интоксикации гиперкоагуляционные изменения системы гемостаза прогрессировали, АЧТВ и ПВ укорачивалось, концентрация фибриногена была выше контроля. Регистрировалось состояние тромботической готовности, характеризовавшееся сохранением высокой агрегационной способности тромбоцитов и резко возросшей концентрацией маркеров тромбинемии - растворимых фибрин мономерных комплексов, на фоне укорочения времени их полимеризации. Зафиксированная гиперкоагуляция усугублялась выраженным снижением активности антитромбина на фоне угнетения фибринолитической активности плазмы крови в 2 раза.

Полученные результаты отражены в Таблице.

Предлагаемый способ моделирования хронической хромовой коагулопатии у экспериментальных животных является эффективным, позволяет подробно изучить патофизиологические механизмы развития токсического влияния хрома на состояние системы гемостаза и может способствовать разработке и поиску средств для лечения и профилактики токсической коагулопатии.