Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЗВООБРАЗОВАНИЯ НА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ЖЕЛУДКА

Анализ изобретательского уровня

Поиск и изучение новых высокоэффективных лекарственных средств для лечения и профилактики заболеваний органов желудочно-кишечного тракта, в том числе в виде современных лекарственных форм является одной из актуальных проблем современной гастроэнтерологии.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области разработки синтетических противоязвенных средств, природные вещества продолжают оставаться одним из перспективных источников получения новых лекарственных препаратов, и наряду с высокой эффективностью выгодно отличаются от многих синтетических соединений высоким профилем безопасности. Среди природных сырьевых источников, содержащих биологически активные вещества противоязвенного действия, следует выделить хитозан.

Известные противоязвенные средства представлены 7 классами: это ингибиторы протонной помпы (омепразол [1] и др.), блокаторы Н2-гистаминовых рецепторов (ранитидин) [2], фамотидин и др.), синтетические простагландины (энпростил, мизопростол [3]), стимуляторы выработки слизи (карбеноксолон [4]), М-холиноблокаторы (пирензепин [5]), блокаторы гастриновых рецепторов (проглумид), а также гастропротекторы вяжущего действия, такие как сукралфат [6] и висмута трикалия дицитрат [7]. Все перечисленные лекарственные препараты, кроме последней группы, влияют на секреторную функцию клеток слизистой оболочки желудка, не оказывая при этом противовоспалительного действия.

В этой связи, необходим поиск и разработка новых эффективных терапевтических средств и подходов к рациональной терапии язвенных повреждений слизистой оболочки желудка, которые предполагали бы как регулирование баланса факторов, влияющих на состояние слизистой оболочки желудка.

Перспективным компонентом для разработки новых противоязвенных лекарственных препаратов может являться хитозан, который проявляет важные фармакологические эффекты, позволяющие предположить его противоязвенное действие.

Ранозаживляющее действие [8]

Ранозаживляющее действие играет важную роль для лечения язв на коже при известном наружном применении хитозана, предположительно этот эффект является важным для лечения кислото-зависимых заболеваний, особенно язвы желудка, однако данный эффект при приеме внутрь практически не изучен.

Противовоспалительная активность [9]

Поскольку при формировании язвы любого типа практически всегда важным компонентом патогенеза является развитие воспаления слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), противовоспалительное действие хитозана может играть важную роль в лечении и профилактике кислото-зависимых заболеваний ЖКТ.

Кровоостанавливающее действие [10]

В связи с тем, что язвенное кровотечение является одним из достаточно частых и при этом тяжелых осложнений кислото-зависимых заболеваний ЖКТ, известное использование хитозана в качестве гемостатического средства [9, 7] может являться важным преимуществом хитозана и расширить показания к его применению в том числе для остановки язвенного кровотечения.

Антибактериальный эффект [11]

Принимая во внимание известное антибактериальное действие хитозана, особенно в отношении грамотрицательных бактерий, вероятно, однако практически не изучено наличие антихеликобактерного действия, что так же может являться важным компонентом механизмов фармакотерапевтической эффективности хитозана при лечении язв, ассоциированных с Helicobacter pylori.

Противоязвенная активность хитозана и его фармакологические свойства

По данным отдельных исследований известна противоязвенная активность хитозана, однако до настоящего времени в России и других странах мира не зарегистрирован лекарственный препарат, содержащий хитозан для лечения язв слизистой оболочки желудка, кроме этого применение хитозана в лекарственной форме гель для приема внутрь так же является новым, ранее не известным, что характеризует научную новизну предлагаемого изобретения.

В отдельных экспериментальных и клинических исследованиях доказано, что хитозан и его производные проявляют противоязвенную активность, но в данных исследованиях не указаны определенные лекарственные формы, и при этом упоминается об использовании хитозана у крыс в определенных дозах, которые при перерасчете для человека являются очень большими и не возможны для клинического применения.

Так, в исследовании авторов Ito и др. [12] сравнивали эффекты хитозана с низкой молекулярной массой (LMW) (MW: 25000-50000), хитозана с высокой молекулярной массой (HMW) (MW: 500000-1000000) и хитина на вызванное этанолом повреждение слизистой оболочки желудка и заживление язв желудка у крыс с использованием в качестве препарата сравнения сукральфата и циметидина, суспендировали эти соединения в 1% гуммиарабике. Сукралфат в пероральных дозах 250 и 500 мг/кг предотвратил язвы на 93% и 99% соответственно. Циметидин в пероральной дозе 100 мг/кг предотвращал повреждение слизистой оболочки на 61%. LMW хитозан в пероральных дозах 250, 500 и 1000 мг/кг предотвратил повреждение слизистой оболочки желудка на 87%, 95% и 99% соответственно. HMW хитозан в пероральных дозах 250 и 500 мг/кг предотвращал повреждение слизистой оболочки на 64% и 83%) соответственно (перорально).

В другом исследовании [13] изучали эндоскопическое применение гидрогеля хитозана, содержащего эпидермальный фактор роста (гель EGF-CS), для лечения язвенной болезни желудка. Гель EGF-CS непосредственно вводили в область язвы через эндоскоп на моделях язвенной болезни желудка, вызванных уксусной кислотой (AAU), и язвенной болезни желудка, вызванных резекцией слизистой оболочки (MRU) на кроликах и свиньях. Эффективность заживления оценивали микроскопически в гистологических исследованиях. На модели AAU нормализованный размер язвы в группе, получавшей гель, был в 2,3 раза меньше, чем в группе без лечения на 3-й день после изъязвления (Р<0,01). В модели MRU нормализованный размер язв в группе, получавшей гель, был в 5,4 раза меньше по сравнению с таковым в контрольной группе, не получавшей лечение, на 1-й день после изъязвления (Р<0,05), результаты гистологических исследований так же подтвердили эффективность геля EGF-CS.

Другое исследование касается разработки фармацевтической формы, которая максимально прилипает к слизистой оболочке и увеличивает присутствие ранитидина в пораженном участке. Предложен гидрогель ранитидина, содержащий полимерную смесь хитозана и гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ) 9:1 (F1) или смесь карбоксиметилцеллюлозы натрия и ГПМЦ 9:1 (F2). 336 мг ранитидина НСl добавляли к каждой формуле через 0,5, 1, 2, 3 и 4 часа в разных группах. Установлено, что оставшееся количество ранитидина через 4 часа после введения мукоадгезивных гидрогелевых формул F1 и F2 составляло 55,8±6,5%, 45,4±3,5% соответственно по сравнению с 5,6±2,1% после приема порошка ранитидина. Настоящее исследование показало, что F1 проявил большую терапевтическую активность, чем F2, так как F1 снизил индекс язвы до (0,10±0,10), обеспечив профилактику на 96,43%. F2 снижает язвенный индекс до (1,1±0,24), обеспечивая 60,71% профилактики. По мнению авторов, это указывает на то, что F1 один из лучших составов, который прилипает к стенке желудка, сохраняет достаточное количество препарата и увеличивает его биодоступность [14]. Кроме того, биохимические маркеры ALT, AST и общая антиоксидантная способность были значительно снижены по сравнению с контрольной группой в обоих экспериментах. Таким образом, авторы делают вывод, что предложенные формулы мукоадгезивного гидрогеля содержащего хитозан могут быть использованы в качестве пероральной желудочно-кишечной системы контролируемой доставки лекарственного средства, обеспечивающей улучшение его пероральной биодоступности.

Так же известно исследование для оценки противоязвенного эффекта хитозана, мизопростола и их комбинации при язве желудка, вызванной индометацином у крыс [15]. Индометацин для индукции ульцерогенеза суспендировали в соотношении одна капсула препарата на 1 мл дистиллированной воды. Мизопростол 200 мкг суспендировали в 10 мл дистиллированной воды и вводили в дозе 20 мкг на одно животное. Хитозан с низкой молекулярной массой суспендировали в 1 мл дистиллированной воды и вводили в дозе 400 мг на одно животное. Лечение мизопростолом (20 мкг/животное) ежедневно в течение 7 дней до введения индометацина (25 мг/животное) ежедневно в течение 3 дней значительно снизило средний язвенный индекс (до 28±6,7 мм²) по сравнению со средним значением язвенного индекса индометацина (Р<0,05). Для крыс, получавших LMW хитозан, у четырех животных не было язв вообще, и у двух небольших областях были замечены изъязвления. Средний индекс язвы у крыс, получавших LMW хитозан, составил 3,6±5,7 мм², что значительно ниже, чем у мизопростола (Р<0,05) и индометацина (Р<0,05). Язвы, некроза или гиперемии не наблюдалось у всех животных (n=6), которых лечили комбинацией LMW хитозан плюс мизопростол (LMW хитозан 400 мг/животное + мизопростол 20 мкг/животное ежедневно в течение 7 дней). Авторы делают вывод, что мизопростол, хитозан и их комбинация защищали слизистую оболочку желудка, так как значительно снижали язвенный индекс и уровни малонового диальдегида в крови и тканях, а также повышенную выработку муцина. Более того, наблюдаемый противоязвенный эффект был более выраженным при комбинации по сравнению с монотерапией мизопростолом или хитозаном в отдельности.

Приведенные данные свидетельствует о высокой перспективности природных полисахаридов, таких как хитозан, как комплексообразователей с высокой и разнонаправленной биологической активностью.

Таким образом, в доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено указания на то, что высокомолекулярный хитозан, применяемый внутрь в форме геля, обладает гастропротекторным действием и применяется в качестве монокомпонентного лекарственного препарата для лечения и профилактики язвообразования на слизистой оболочке желудка, в том числе при гастропатии вызванной нестероидными противовоспалительными средствами, такими как диклофенак натрия, что характеризует патентную новизну предлагаемого изобретения.

Приведенные результаты дали обоснование для подтверждения противоязвенных свойств хитозана и разработки оптимальной лекарственной формы.

Задача настоящего изобретения - расширение арсенала природных средств, обладающих гастропротекторным действием и способных предотвращать ульцерогенное воздействие на слизистую оболочку желудка путем создания на ее поверхности защитного слоя и/или создания условий для ее регенерации.

Технический результат настоящего изобретения состоит в разработке способа профилактики язвообразования на слизистой оболочке желудка, обеспечивающего при приеме содержащего хитозан геля в дозе 0,08-0,24 мл/100 г массы тела за час до введения ульцерогенного агента диклофенака натрия в дозе 50 мг/кг, снижение количества язв на 7-20,4%, площади язв на 25,0%-74,2%, и, проявляющий противоязвенную активность (отношение индекса Паулса контрольной группы к индексу Паулса опытной группы), равную 1,33-3,87 соответственно.

Технический результат достигается тем, что в способе профилактики язвообразования на слизистой оболочке желудка, включающем пероральное применение крысам гомогенного геля, содержащего хитозан, согласно изобретению, используют гель в дозах от 0,08 до 0,24 мл/100 г массы тела крыс однократно за 1 ч до воздействия ульцерогенного фактора диклофенака натрия в дозе 50 мг/кг, при этом 100 мл геля включает 1 г высокомолекулярного хитозана с молекулярной массой 500-1000 кДа, 0,25 мл ледяной уксусной кислоты, 99 мл воды.

При этом предлагаемый гель, содержащий хитозан является стабильным при хранении в стеклянной прозрачной таре при комнатной температуре в течении 1 года.

Пример 1. Состав геля, содержащего хитозан

Настоящее изобретение заключается в том, что разработан и предложен гель для приема внутрь, содержащий хитозан, уксусную кислоту и воду и имеющий оптимальное рН 5.5. Состав геля представлен на фигуре 1 (таблица 1). По внешнему виду гель являлся гомогенным, бесцветным, без примесей и инородных включений, полученный гель является стабильным при хранении в стеклянной прозрачной таре при комнатной температуре в течении 1 года.

На фиг. 1 представлена таблица 1 - состав геля для приема внутрь, содержащего хитозан.

На фиг. 2 приведена таблица 2 - результаты доклинических исследований по оценке противоязвенной активности геля, содержащего хитозан, где:+ - Р<0,05; ++ - Р<0,01; +++ - Ρ<0,001 - достоверность различий при сравнении с контролем.

На фиг. 3 приведены гистологические исследования слизистой оболочки желудка крыс: А) Интактная группа (здоровые животные) - нормальная слизистая на всем протяжении, фигура митоза и клетка в апоптозе на разных уровнях; Б) Контрольная группа (без профилактического воздействия) - на срезах множество протяженных язв, увеличено количество слизи, в деструкции кариопикноз, лимфоциты, нейтрофилы, митозы в зоне деструкции отсутствуют; В) Опытная группа (профилактическое применение геля содержащего хитозан) - на срезах малое число язв, в крае единичный митоз, в инфильтрате эозинофилы, лимфоциты, нейтрофилы, кариопикноз в некрозе.

Результаты доклинических исследований геля, содержащего хитозан

Исследования по оценке противоязвенной активности разработанного геля, содержащего хитозан проведены на 45 белых аутбредных крысах самцах массой тела 210-290 г, не мене чем по 7 голов в каждой из групп.

В качестве ульцерогенного агента для моделирования язв на слизистой оболочке желудка использовали диклофенак натрия в виде официального 2,5% раствора (25 мг/мл), диклофенак вводили однократного перорально в известной по литературным данным «ульцерогенной дозе» составляющей 50,0 мг/кг, что эквивалентно объему 0,2 мл/100 г массы тела животного.

Опытным группам животных вводили изучаемые препараты: гель, содержащий хитозан или препарат сравнения - сукральфат. Гель, содержащий хитозан вводили в дозах 0,08, 0,16 и 0,24 мл/100 г массы тела животного однократно перорально за 1 ч до воздействия ульцерогенного фактора. Сукральфат вводили в виде суспензии в воде в дозе 0,014 г/кг (эквивалентной средней терапевтической дозе для человека), однократно перорально через желудочный зонд за 1 ч до введения ульцерогенного агента. Через 3 ч после введения диклофенака натрия всех животных контрольной, интактной и опытных групп умерщвляли передозировкой хлороформного наркоза и производили патологоанатомические исследования, обязательным элементом которых являлось извлечение желудков для осмотра состояния слизистой оболочки и проведения измерений. Степень язвообразования на слизистой оболочке желудка оценивали путем подсчета количества язв и планиметрического определения площади язвенных дефектов, определяли индекс Паулса исходя из площади язв по формуле

где IP_S - Индекс Паулса по критерию площадь язв, S - суммарная площадь язв в среднем из расчета на одно животное, мм², F - процентное количество животных с язвами в группе, %.

На основании полученных значений Индекса Паулса в контрольной и опытной группах определяли Противоязвенную активность по формуле

где AU - Противоязвенная активность изучаемого препарата, IР_k - Индекс Паулса в контрольной группе, IР_е - Индекс Паулса в опытной группе.

Установлено, что препарат сравнения сукральфат в дозе 0,014 г/кг уменьшал количество язв на 29,2% и уменьшал площадь язв на 18,8%, расчетное значение противоязвенной активности 1,23, что являлось сопоставимым с противоязвенной активностью геля хитозана в минимальной исследуемой дозе 0,08 мл на 100 г массы тела животного.

Выявлено, что введение животным геля, содержащего хитозан в дозах 0,08-0,24 мл/100 г за 1 час до введения ульцерогенного агента в значительной степени сокращает язвообразование по сравнению с группой негативного контроля. Результаты исследования по оценке противоязвенной активности представлены в таблице 2.

Наблюдается прямая пропорциональная зависимость между увеличением дозы хитозана и повышением противоязвенной активности. Для дозы 0,08 мл/100 г массы тела противоязвенная активность равна 1,33, уменьшение площади язв по сравнению с контролем составило 25,0%, количества язв на 20,4%, что характеризует наличие умеренной противоязвенной активности. Для дозы 0,16 мл/100 г массы тела животного противоязвенная активность равна 2,28, выявлено уменьшение количества язв на 7% и значительное достоверное уменьшение площади язв 56,1%, что свидетельствует о высокой противоязвенной активности. Для дозы 0,24 мл на 100 г массы тела животного противоязвенная активность составила 3,87, выявлено уменьшение количества язв на 20,3%, значительное достоверное уменьшение площади язв 74,2%, то есть для данной дозы выявлена наибольшая величина противоязвенной активности, что превышало эффективность препарата сравнения сукральфата.

Таким образом, в доклинических исследованиях на лабораторных животных доказано, что пероральное введение геля, содержащего хитозан в дозах от 0,08 до 0,24 мл/100 г массы тела животного однократно за 1 ч до воздействия ульцерогенного фактора, в качестве которого использован диклофенак натрия (в дозе 50 мг/кг) оказывает выраженное достоверное дозозависимое противоязвенное действие, значительно превышающее эффективность препарата сравнения сукральфата. Результаты гистологических исследований.

Для подтверждения результатов доклинических исследований проведены гистологические исследования слизистой оболочки желудка крыс интактной группы (здоровые животные), контрольной и опытных групп. Биоматериал для исследований фиксировали формалином, срезы заливали в парафин и окрашивали гематоксилин-эозином по общепринятой методике. Микрофотографии представлены на Фиг. 3.

На гистологических срезах слизистой оболочки желудка здоровых животных интактной группы нормальная слизистая на всем протяжении, единичные фигуры митоза и единичные клетки в апоптозе на разных уровнях, у одного животного данной группы единичная поверхностная микроэрозия, вероятно связанная с предшествующей пищевой депривацией. Микрофотографии представлены на Фиг. 3А.

У всех животных контрольной группы на протяжении гистологических срезов множественные протяженные язвы, от 3 до 8 штук, увеличенное количество слизи на поверхности слизистой оболочки, единичные митозы в неповрежденной слизистой, митозы в зоне деструкции отсутствуют, кариопикноз или некроз с лизисом в зоне деструкции, в инфильтрате выявлены лимфоциты, эозинофилы, нейтрофилы, что в целом свидетельствует о гисто-морфологических признаках язвообразования и воспалительного процесса на слизистой оболочке желудка. Микрофотографии представлены на Фиг. 3Б.

У животных опытной группы при профилактическом применении геля, содержащего хитозан, на протяжении гистологических срезов выявлено от 3 до 10 язв и глубоких эрозий, количество слизи увеличено не у всех животных (60%), в крае деструкции единичные митозы, кариопикноз в некрозе, в инфильтрате эозинофилы, лимфоциты, нейтрофилы. Слизистая с отеком, покровно-ямочный эпителий с гидропической дистрофией, подслизистый слой с очаговой умеренной эозинофильной инфильтрацией. Язвы на срезах выявлены не у всех животных (80%), у одного животного на протяжении срезов язв нет вообще. Микрофотографии представлены на Фиг. 3В.

В целом, гистологические исследования свидетельствуют, что при применении геля, содержащего хитозан, выявлено снижение язвообразования, признаки умеренного снижения интенсивности воспаления и тенденция к активизации процессов регенерации, что подтверждает данные проведенных доклинических исследований.

Список литературы

1. Analogue-based Drag Discovery / edited by Janos Fischer; C. Robin Ganellin. - Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2006. - P. 445.

2. Aminoalkylfuranderivate, process for their production and these compounds containing drug: pat. DE2734070A1 German: C07D275/03 / Barry John Price, John Watson Clitherow, John Bradshaw; Application by Allen and Hanburys Ltd.-Application №DEI9772734070; Priority 04.08.1976; Filed 28.07.1977; Published 09.02.1978.

3. Vaginal tablets comprising misoprostol and methods of making and using the same: pat. 20070071814 [US]: A61K9/0034 / Inventors: Salah Ahmed, Raj Mahajan; Application filed by Teva Women s Health Inc. - №US 11/526,240; Priority 23.09.2005; Publication 29.03.2007; Bull. №29, 2007.

4. Pharmacological compounds: pat. 3070623A [US] C07C35/44 / Inventors: Gottfried Siegfried, Baxendale Lily; Application filed by Biorex Laboratories Ltd.-№US744668A. Publication 25.12.1962.

5. Холинолитическое средство: пат. 2014074 C1 Рос. Федерация: МПК А61K 31/13 / Гмиро В.Е. [и др.]; патентообладатель Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН. - №4353304/14; заявл. 30.12.1987; опубл. 15.06.1994.

6. Method for preparing high potency sucralfate: pat. US4990610A [US] C07H23/00 / Inventors; Nick V. Lazaridis, Moo K. Park, Yousry Sayed. Application filed by AAIPharma Services Corp. - №US07/285,028; Publication 05.02.1991; bull. 3.

7. Машковский Μ.Д. Лекарственные средства / Μ.Д. Машковский. - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая волна, 2012. - Т. 1. - 1216 с.

8. Кровоостанавливающее и ранозаживляющее средство: пат.WO 2016155749A1 WIPO (РСТ) A61L26/0023 / заявитель: ООО "Тектум".- № РСТ/ЕА2016/000001; заявл. 2015; опубл. 06.10.2016.

9. Friedman A.J. Antimicrobial and anti-inflammatory activity of chitosan-alginate nanoparticles: a targeted therapy for cutaneous pathogens/ A. J. Friedman [et. al.] // The Journal of Investigative Dermatology. - 2013. - 133. - P. 1231-1239.

10. Pogorielov M.V. Chitosan as a Hemostatic Agent: Current state/ M.V. Pogorielov, V.Z. Sikora // European Journal of Medicine. Series B. - 2015. - 2. - P.24-33.

11. Sudarshan N.R. Antibacterial action of chitosan/N.R. Sudarshan, D.G. Hoover, D. Knorr // Food Biotechnol.-2009. - 6(3). - P.257-272.

12. Ito M. Anti-ulcer effects of chitin and chitosan, healthy Foods, in Rats / Ito M., Ban Α., Ishihara M. // Jpn J. pharmacol. - 2000. - V. 82. - P. 218-225.

13. Endoscopic application of EGF-chitosan hydrogel for precipitated / J. H. Maeng [et al.] // J Mater Sci: Mater Med. - 2014. - V. 25. - P. 573-582.

14. Zaki N. Evaluation of Newly Formulated Antiulcer Drug on Experimental Ulcer Model /N. Zaki, L. Hassanin, A. Khattab // J. Drug Res.-2014. - №1. - P.81-92.

15. J. Al-Ahmed. Evaluation of the gastroprotective effect of misoprostol, chitosan and their combination on indomethacin induced gastric ulcer in rats / A1-Ahmed J., Ahmed J., Al-Masoodi E.A. // The mediical journal of basrah uniiversiity. - MJBU. - 2011. - Vol 29. - №1 & 2.