Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КАЧЕСТВЕННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГОВЯДИНЫ ПО АДДИТИВНОМУ ДЕЙСТВИЮ НЕКОТОРЫХ SNP-МАРКЕРОВ

Изобретение относится к области разведения, селекции и генетики сельскохозяйственных животных и может быть использовано в племенном и товарном скотоводстве при создании, по генетическим предпосылкам, родительских пар для получения телят с высокими качественными показателями говядины при последующем убое, раннего прогнозирования этих качеств у незрелых животных, а также при создании новых селекционных достижений путем включения данного способа в современные оценочные программы по селекции крупного рогатого скота, что может способствовать значительному ускорению селекционного процесса.

Используемые Министерством с/х РФ оценочные селекционные программы, в том числе и «Порядок и условия проведения бонитировки племенного крупного рогатого скота мясного направления продуктивности» основанная на традиционных методах селекции требует значительной модернизации в связи с прорывными открытиями в генетике связанных, прежде всего с расшифровкой генома млекопитающих. Появилась возможность использования ДНК технологии при селекции новых форм с/х животных.

Известны: «Способ оценки мясных коров по молочности» [1], «Способ определения и прогнозирования продуктивных качеств молодняка мясных пород КРС по мясной продуктивности» [2]. Однако, они не имеют в основе использование генетических методов.

К одним из современных способов оценки животных генетическими методами относится способ определения генетического потенциала КРС по качеству молока [3], а также способ генетического отбора молочных коз [4]. Однако эти способы не способствуют улучшению качественных показателей мясной продуктивности в скотоводстве.

Наиболее близкими к предлагаемому методу являются:

1. Патент США US 2005181373 A1 - способ выявления нежности мяса по однонуклеотидному полиморфизму гена CAPN1 у крупного рогатого скота [5]. Недостатком данного метода является некоторая ограниченность достоверного результата из-за использования как маркера лишь одного гена CAPN1.

2. Статья Nattrass G.S. и др. «Посттранскрипционный механизм регуляции экспрессии кальпастатина в скелетных мышцах крупного рогатого скота» [6]. В ней указывается на ассоциацию некоторых аллелей гена CAPN1 и CAST с нежностью говядины, что «является следствием изменений в уровнях их м-РНК, которые в конечном итоге могут влиять на активность белков этих генов, тем самым изменяя скорость и (или) степень посмертного протеолиза в скелетных мышцах», при этом о взаимном влиянии этих генов на нежность говядины, речь не идет. Кроме того, известные методы не учитывают такие характеристики как сочность и вкус мяса.

Целью предполагаемого изобретения является использование аддитивных свойств взаимодействия отдельных генов маркеров: CAPN1 в положении 316 (CAPNI₃₁₆) и CAST в положении 2857 (CAST₂₈₅₇), ответственных за активность и степень послеубойного созревания мяса подтверждающих его нежность и влияющих на сочность и вкус (вкус и запах) мяса. При отборе особей животных, имеющих желательный генотип по искомым генам, достигается значительный селекционный эффект по изучаемым признакам.

Суть заявленного изобретения состоит в следующем.

В группе племенного или товарного молодняка крупного рогатого скота (в зависимости от целей) в результате рандомной выборки извлекаются животные, телки или бычки, у которых берут кровь в специализированные стерильные вакуумные пробирки с ЭДТА - К3. Из полученных образцов сразу же выделяют ДНК. В нашем случае ДНК выделяется с помощью набора реагентов, например, Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). Далее образец ДНК анализируют методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) на амплификаторе или секвенаторе, в нашем случае, Applied Biosystems 3130 с использованием стандартного протокола с прямого и обратного праймеров.

Следует оговориться о выборе генов-маркеров CAPN1 и CAST, который мы почерпнули из открытых источников [7, 8] согласно которым ген CAPN1 ответственен за экспрессию кальпаина (кальций зависимой протеазы), модифицирующий мышечную ткань во время послеубойного созревания мяса, а ген CAST имеет отношение к экспрессии кальпастатина являющегося ингибитором кальпаина. В кодирующей части гена CAPN1 нас заинтересовала несинонимическая замена в положении 316 C/G, как наиболее изученная и эффективная в плане проявления ассоциации связанных с нежностью мяса. В гене CAST такой заменой явилась С/Т в положении 2857.

Для генотипирования использовался программируемый амплификатор АНК-32 («Синтол», Россия). Для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР) по тиражированию участков генома использовались коды праймеров найденные в открытой печати (GenBank accession №. AF248054; GenBank accession №AF159246) и синтезированные в фирме «Синтол» (табл. 1). Условия проводимой реакции по температуре и времени первоначальной денатурации, денатурации, отжигу, синтезу и завершающему синтезу, а также объему и составу используемой реакционной смеси, осуществлялись согласно инструкции производителя. Для оценки соответствия равновесию Харди - Вайнберга и для сравнения частот генотипов и аллелей использовались стандартные формулы.

Нами были проведены несколько опытов с положительным результатом. В последнем эксперименте на 84 головах бычков брединского мясного типа подготовленных для убоя, перед убоем в возрасте 15 мес. у животных была взята кровь, в т.ч. и на генетические исследования. Генотипирование по гену CAPN1₃₁₆ (табл. 2) показало высокую степень проявления гомозиготного генотипа СС. Среди 84 голов бычков у которых были взяты биосубстраты в виде крови - 60 голов, что составляет 71,4% от всего поголовья оказались носителями гена нежности, 20 голов или 23,8% бычков имели гетерозиготу по этому гену и лишь 4 головы (4,8%) были гомозиготными по генотипу GG. По частотам встречаемости аллелей этого гена, аллель G составляла 0,153, а аллель С - 0,847. Высокая степень наличия аллеля С и в целом генотипа СС по гену CAPN1 предполагают, по данным многих авторов, высокую возможность степени нежности говядины.

Генотипирование по другому гену - CAST₂₈₅₇, который, также (но не столь однозначно) связывают с нежностью говядины, ассоциируемой с гомозиготным состоянием аллеля Т показало, что желательный генотип гена CAST₂₈₅₇ в микропопуляции полученного кросса, обозначенный символом ТТ проявился, в отличии от его предшественника, незначительно (табл. 3). Лишь 7,1% от их общего количества имели данный генотип, тогда как особей с гетерозиготной составляющей 15,5% было в два раза больше. Больше всего оказалось носителей нейтральной гомозиготы СС, связанной с экспрессией активного кальпастатина, а именно 65 голов бычков, что составляет 77,4% от всей выборки.

Убой бычков проводился в возрасте 15 мес. при котором из правой полутуши каждого бычка, после 24-часовой выдержки, в области 9-11 ребра вырезалась проба длиннейшей мышцы спины (1 кг) longissimus thoracis (LT) и в вакуумной упаковке помещалась в холодильную камеру на хранение при температуре 4°С. На 8 день пробы извлекались и проводилась оценка на качественные показатели мяса, а именно: нежность (сопротивление усилию на разрез прибором Уорнера - Братцлера в модификации Максакова + органолептическая оценка варенного и жаренного мяса на нежность), сочность (p/h с использованием прокалывающего электрода LoT406-M6-DXK-S7/25 + влагоудерживающая способность, методом измерении процента потери влаги образца после выдержки и после варки + органолептическая оценка варенного и жаренного мяса на сочность) и вкус (дегустационная оценка варенного и жаренного мяса на вкус и запах). Все показатели были унифицированы под баллы по 10-бальной системе [9].

При изучении таких фенотипических признаков качества мяса как p/h и влагоудерживающая способность мяса достоверных результатов с результатами генотипирования не получено (данные не представлены), также не представлены результаты статистической обработки материала генотипов, имеющих в выборке менее 3 животных, хотя, для обозначения тенденции, показаны абсолютные результаты. Подкрепление полученных результатов методами измерений - сенсорными способами (органолептическими), неотъемлемая часть современных методов изучения вкусовых достоинств мяса.

В таблице 4 представлены результаты объединенной бальной оценки нежности, сочности и вкуса говядины в зависимости от сочетания генотипов по генам CAST₂₈₅₇ и CAPN1₃₁₆. Следует отметить, что в наших исследованиях желательный гомозиготный генотип ТТ* гена CAST₂₈₅₇, при рассмотрении его вне зависимости от генотипов CAPN1₃₁₆, не получил достоверного подтверждения по ассоциации с признаком нежности говядины, также не выявлены ассоциации с такими показателями как сочность и вкус выдержанного 8 дней мяса. В то же время, высокие показатели отмечены по всему спектру вкусовых достоинств мяса, вне зависимости от сочетаний генотипов по генам у животных имеющих генотип СС по гену CAPN1₃₁₆, что подтверждает исследования других авторов об ассоциации нежности говядины от животных с наличием желательных аллелей по этому гену, а также указывает на наличие новых ассоциации полиморфных состояний этого гена с сочностью и вкусом говядины. Однако, наибольшие значения баллов были характерны для животных сочетающих желательные генотипы обеих генов. Так, все показатели мяса бычков имеющих сочетание генотипов ТТ* по CAST₂₈₅₇ и СС* по CAPN1₃₁₆ имели превосходство над средними показателями общей выборки по 3 порогу достоверности (Р<0,001), а также, над имеющим наибольшее распространение в выборке группой животных (n=54), имеющих сочетание генотипов по CAST₂₈₅₇ (СС) и по CAPN1₃₁₆ (СС*) на 1,22 балла или 15,4% (Р<0,01) по нежности, на 1,44 балла или 18,2% (Р<0,05) по сочности, на 1,56 балла или 19,2% (Р<0,001) по вкусу и запаху. Отмечена высокая взаимозависимость всех элементов вкусовых достоинства мяса, таких как нежность, сочность, непосредственно вкус и запах и их сочетания. Так, наибольшая коррелятивная зависимость установлена между органолептической оценкой вкуса с общей суммой баллов за вкусовые достоинства (r=0,90), сочностью и общей суммой баллов (r=0,86), нежностью и общей суммой баллов (r=0,76), сочностью и вкусом (r=0,78). Несколько меньшая, но устойчивая корреляция (Р<0,01) установлена между нежностью и органолептической оценкой вкуса (r=0,48), нежностью и сочностью (r=0,40).

Таким образом, наши исследования подтвердили влияние полиморфного состояния гомозиготы СС гена CAPN1₃₁₆ на нежность говядины само по себе, взаимного влияния генов CAST₂₈₅₇ и CAPN1₃₁₆ на этот же показатель, а также выявили новые ассоциации в той ее части, когда сочетание генотипов ТТ в гене CAST₂₈₅₇ и СС в гене CAPN1₃₁₆ дает положительный эффект не только по нежности говядины, но и сочности и вкуса приготовленных образцов, вероятно связанный с активизацией протеолитической деятельности μ-кальпаина, в связи с ослаблением влияния нефункционального кальпастатина, продуцируемого экспрессией ТТ генотипа гена CAST₂₈₅₇ под действием которого утрачивается функция кальпастатина как ингибитора на μ-кальпаин, в результате чего ферментативное действие на миофибриллярные белки приобретает иную интенсивность, а возможно и иное проявление, что может служить причиной иной сенсорной чувствительности по вкусу и запаху, нежности и сочности мяса. Поэтому считаем, что отбор животных, имеющих желательные аллели вышеуказанных генов может проводиться в раннем возрасте и служить эффективным инструментом раннего прогнозирования качественных показателей мясной продуктивности крупного рогатого скота. В виду наследования вышеупомянутых аллелей генов у животных, отбор молодых индивидуумов разного пола типа брединский мясной и другим мясным породам по данным маркерам и использование данного способа отбора в оценочных селекционных программах может способствовать значительной интенсификации селекционного процесса качественного улучшения вкусовых достоинств мяса при создании новых селекционных достижений в области мясного скотоводства.

Источники информации:

1. Патент на изобретение RU №2545397. Способ оценки мясных коров по молочности / Ш.А. Макаев, С.А. Мирошников, К.М. Джуламанов, Ф.Г. Каюмов, И.В. Щукина, Б.Г. Рогачев, Л.Н. Павлов : опубликовано 27.03.2015, бюл. №9.

2. Патент на изобретение RU №2583305. Способ определения и прогнозирования продуктивных качеств молодняка мясных пород крупного рогатого скота по мясной продуктивности / К.М. Джуламанов, Е.Б. Джуламанов, Ю.И. Левахин, Г.Н. Урынбаева : опубликовано 10.05.2016, бюл. №13.

3. Патент на изобретение RU №2317704. Способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота по качеству молока / Г.Е. Сулимова, И.В. Лазебная, О.Е. Лазебный : опубликовано 27.02.2008, бюл. №6.

4. Патент на изобретение RU №2620977. Способ генетического отбора молочных коз / О.А. Кравцова, С.В. Спиридонова, Т.Х. Фаизов : опубликовано 30.05.2017, бюл. №16.

5. Патент США: US 2005181373 A1 Single nucleotide polymorphism markers in the bovine CAPN1 gene to identify meat tenderness / Inventor: Timothy Smith, Eduardo Casas. 2005-08-18 Publication of US 20050181373 A1.

6. Nattrass G.S. A post-transcriptional mechanism regulates calpastatin expression in bovine skeletal muscle / G.S. Nattrass, B.L. MIntyre, G.E. Gardner, P. McGilchrist, D.L. Robinson, P.L. Greenwood // Journal of Animal Science. - 2014, 92(2), 443-455.

7. Page B.T. Evaluation of single-nucleotide polimorphisms in CAPN1 for association with meat tenderness in cattle / B.T. Page, E. Casas, M.P. Heaton, N.G. Cullen, D.L. Hyndman, C.A. Morris et al. // J. Anim. Sci. - 2002, 80:3077-85.

8. Riley D.G. Effect of sire on mu-and m-calpain activity and rate of tenderization as indicated by myofibril fragmentation indices of steaks from Brahman cattle / D.G. Riley, C.C. Jr. Chase, T.D. Pringle, R.L. West, D.D. Johnson, T.A. Olson et al. // J. Anim. Sci. - 2003, 81:2440-7.

9. O'Sullivan M G Use of sensory science as a practical commercial tool in the development of consumer-led processed meat products / M.G. O'Sullivan, J.P. Kerry, D.V. Byrne//ProcessedMeats. - 2011, 10(1533) 156-182.