Результат интеллектуальной деятельности: Штамм микроскопического гриба Aspergillus sp. ВКМ F-4822D, являющийся активным агентом биоповреждений промышленных материалов

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к защите промышленных материалов от коррозии и может быть использовано для тестирования грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий в различных климатических условиях, а также для получения ряда биологически активных веществ.

Известно, что основным агентом биокоррозии материалов являются микроскопические грибы. В настоящее время для проверки грибостойкости материалов согласно ГОСТ 9.048-89 используются музейные культуры микроскопических грибов, хранящиеся в национальных коллекциях микроорганизмов. Эти культуры выделены много лет назад как обладающие высокой повреждающей способностью к ряду материалов. При длительном хранении грибов в коллекциях многие их свойства ослабевают. Кроме того, за прошедший период появилось множество новых синтетических материалов, устойчивых к данным коллекционным культурам. В то же время микроскопические грибы в природных условиях постоянно приспосабливаются как к появляющимся новым материалам, так и к новым средствам защиты материалов, и среди них постоянно появляются новые высокоагрессивные штаммы грибов. Поэтому постоянный поиск и выделение таких штаммов, изучение их свойств и использование новых агрессивных штаммов в тестировании материалов на грибоустойчивость является необходимой частью работы по защите материалов от коррозии. Кроме того, именно такие штаммы зачастую являются активными продуцентами многих метаболитов, таких как органические кислоты и ферменты, которые и обеспечивают высокую коррозионную агрессивность штаммов. Высокопродуктивные штаммы могут быть использованы в биотехнологической промышленности для получения ряда важных метаболитов (например, Aspergillus niger - продуцент лимонной, янтарной и ряда других органических кислот).

Aspergillus niger - этот вид хорошо известен и как агент биоповреждения, и как продуцент многих органических кислот; различные штаммы этого вида задепонированы и хранятся во многих коллекциях по всему миру, в основном, как продуценты органических кислот. В настоящее время этот вид считается составным, из него выделены и продолжают выделяться согласно новым молекулярным данным отдельные виды, составляющие совместно с другими темноокрашенными видами, так называемую группу «черных аспергиллов» (секция Nigri). Виды этой группы грибов широко распространены в тропических регионах, обладают очень широкими адаптивными способностями и быстро осваивают новые материалы, поэтому постоянно появляются новые агрессивные штаммы. Наиболее быстро процессы адаптации проходят в условиях высоких температур и влажности, поэтому наибольшее количество новых агрессивных форм и наибольший урон приходится на страны с тропическим климатом. Нами выделен и исследован штамм Aspergillus sp. ЛТТ 7 из секции Nigri, обладающий высокой коррозионной способностью по отношению к лакокрасочным материалам, полимерам, устойчивостью к ряду фунгицидов. Данный штамм задепонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ РАН) под номером ВКМ F-4822D 20.03.2019 (свидетельство прилагается).

Известен Штамм гриба Aspergillus flavus Link ВКМР-3190Д как тест-культура для определения грибостойкости сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов. Штамм гриба Aspergillus flavus Link BKMF-3190Д депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБМФ АН СССР (RU 1766073, 19.06.1995). Тест-система позволяет повысить достоверность результатов при испытании сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов, используемых в условиях тропиков, на грибостойкость. Недостатками этого штамма является ограниченное его использование только по отношению к сталям, оксидным алюминиевым и магниевым сплавам, экспортируемым в страны с тропическим климатом. Данный источник рассмотрен в качестве ближайшего аналога.

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая коррозионная способность микроскопического гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D по отношению к лакокрасочным материалам, полимерным материалам, устойчивость к ряду фунгицидов.

Технический результат достигается тем, что создан штамм микроскопического гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D, используемый как тест-культура для определения грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий в различных климатических условиях, в том числе в тропических регионах, где повышенные температура и влажность создают оптимальные условия для развития плесневых грибов, вызывающих биоповреждения различных материалов.

Штамм Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D, выделен из биоповреждения полимерного покрытия электрорадиоизделия (ЭРИ) (вилка СНП-268-15 ВВ112-2-В) в тропической климатической зоне (Дам Бай, Нячанг, Вьетнам). Получение данного штамма осуществляли путем соскоба с биоповрежденного участка ЭРИ и высева его на агаризованной среде Чапека с добавлением антибиотика стрептомицина 100 мг/л среды

для подавления роста бактерий. Затем пересевали отдельные колонии на агаризованную среду Чапека для выделения чистой культуры штамма Aspergillus sp. ЛТТ 7.

Морфо-физиологические и биохимические свойства штамма изучали на жидкой и агаризованной среде Чапека при 25°C.

Видовая идентификация штамма проводилась по культурально-морфологическим признакам посредством определителя: Klich М.А., Pitt J.I. A laboratory guide to common Aspergillus species and their teleomorphs. Commonwealth scientific and industrial research organization, Division of food processing. North Ryde, N.S.W: 1992. Штамм Aspergillus sp. ЛТТ 7 имеет нетипичное строение, в спороношении присутствуют одновременно одноярусные и двухярусные головки конидиеносцев, что не позволяет определить штамм до вида. Проведено молекулярное определение путем секвенирования ДНК с помощью набора реактивов BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», USA) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе Applied Biosystems 3130x1 Genetic Analyzer в Научно-производственной компании «Синтол» (Москва). Полученные нуклеотидные последовательности редактировали с помощью программы Chromas Lite 2.01 (http://www.technelysium.com.au). Стандартное определение видовой принадлежности штамма молекулярным методом по анализу участка ITS рДНК не дало результата.

Макроскопические признаки (см. фиг. 1а, б): широкорастущие колонии, диаметром 4.5-5.5 см; мицелий бесцветный до бледно-желтоватого, войлочно-пушистый; высота колоний 3 мм, в центре спороношение приподнятое коричневато-черное до угольно-черного (см. фиг. 1 а); оборот бесцветный; без запаха и пигмента (см. фиг. 1б).

Микроскопические признаки:

Конидиеносцы длиной (200)400 - 2000 (и >) мкм, гиалиновые до светло-желтоватых, округлые; конидиальные головки круглые или мохнатые «помпоны», диаметром до 300 мкм; опорная клетка - скошенная вбок под углом; апикальное вздутие шаровидное диаметром 20-60 мкм; головки 1-ярусные и 2-ярусные, фиалиды по всей поверхности апикального вздутия; конидии с утолщенной клеточной стенкой, меланизированные, шиповатые, диаметром 3-4 мкм (см. фиг. 2 а, б).

Физиологические свойства штамма:

Растет в аэробных и микроаэрофильных условиях, термотолерантен (отмечен рост при +55°C).

Методы исследования. Определение биомассы грибов.

Культивирование Aspergillus sp. ЛТТ 7 для биохимических исследований осуществлялось на жидкой питательной среде следующего состав (г/л): NaNO3 - 2,0; KH2PO4; K2HPO4 - 3; KCL - 0,5; MgSO4⋅7P2O; FeSO4 - 0,01, сахароза - 30,0 при температуре (27±2)°C на перемешивающих устройствах марки ПЭ - 0034 «Электроприбор Россия», которые обеспечивали встряхивание колб со скоростью 180 об/мин.

Накопление биомассы определялось следующим образом:

Споры тест-культуры Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D со скошенной агаризованной питательной среды, путем смыва стерильной дистиллированной водой, переносились в стерильные колбы с жидкой питательной средой. После культивирования в течение 7 суток, мицелий Aspergillus sp. ЛТТ 7 отфильтровывался, и равные по массе образцы мицелия вносились в колбы со свежей питательной средой, содержащей исследуемые соединения в различных концентрациях. Культивирование проводилось аналогичным, описанному выше, способом, в течение 7 суток. По истечении срока культивирования, мицелий Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D был отфильтрован и высушен до постоянной массы.

Определение органических кислот.

Были проведены эксперименты по использованию штамма гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D в качестве культуральной жидкости (к.ж.). Пробу подготавливали предварительным разбавлением культуры штамма Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D. бидистиллированной водой в 50 раз и центрифугированием в течение 3 мин при скорости 5000 об/мин. Анализ проводили в соответствии с методикой анализа М 04-47-2012. Ввод пробы осуществлялся автоматически при 30 мбар, длина волны детектора 254 нм, напряжение - 20 кВ, температура 20°C.

Определение органических кислот осуществлялось методом капиллярного электрофореза (КЭ), который основан на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под воздействием электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером - электролитом. После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 3-кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и массы (точнее - от величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества является параметр удерживания (время миграции), а количественной - высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества. Были получены следующие органические кислоты (см. таблица 1). Как видно из таблицы 1, данный штамм продуцирует в больших количествах глюконовую и молочные кислоты.

Определение активности каталазы.

Определение активности каталазы проводилось спектрофотометрически (Shimadzu UVmini-1240). В качестве субстрата использовался 30 мМ пероксид водорода (Li, Shellhorn, 2007). Измерения проводились при λ=240 нм.

В кювету спектрофотометра толщиной 1 см помещалась реакционная смесь, состоящая из 1 мл буферного раствора рН=7,8; 1 мл культуральной жидкости гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D; 1 мл 30 мМ Н₂О₂. Измерения проводили в течение одной минуты. В контрольной кювете Н₂О₂ заменяли водой.

Активность каталазы рассчитывалась по формуле:

где А - активность фермента каталазы,

D - убыль оптической плотности реакционной смеси гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7,

d - толщина слоя жидкости в кювете, см,

t - время, мин,

С - концентрация белка в к.ж., мг/мл

α×β×χ - факторы разведения.

Результаты измерений выражались в условных единицах (у.е.). За единицу активности принималась убыль оптической плотности в 1 мл реакционной смеси гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D за 1 минуту, в пересчете на 1 мг общего белка.

Определение активности полифенолоксидазы.

Определение активности полифенолоксидазы проводилось спектрофотометрически по модифицированному методу. В качестве субстрата использовали n-фенилендиамин (0,1 М). Измерения проводились при λ_max=535 нм.

В кювету спектрофотометра толщиной 1 см помещалась реакционная смесь, состоящая из: 2 мл буферного раствора рН = 7,2; 0,5 мл 0,1 М раствора n-фенилендиамина; 0,5 мл культуральной жидкости гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7. В контрольной кювете n-фенилендиамин заменяли водой.

Активность полифенолоксидазы рассчитывалась по формуле: А=D⋅α⋅β⋅γ/C⋅t⋅d, где А - активность фермента, D - приращение оптической плотности реакционной смеси гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7, d - толщина слоя жидкости в кювете, см.; t - время, мин.; α⋅β⋅γ - факторы разведения.

Результаты изменений выражались в условных единицах (у.е). За единицу активности принималось приращение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D за 1 минуту, в пересчете на 1 мг белка.

Определение активности протеиназ.

Определение протеолитической активности грибов проводили по методу Ансона (Билай В.И. Методы экспериментальной микологии изд-во «Наукова Думка», 1982. С 145-146). Метод основан на способности белков и продуктов их ферментативного расщепления поглощать свет в УФ-области спектра (при λ=275-280 нм). Поглощение света в этой части спектра обусловлено наличием ароматических аминокислот: тирозина, триптофана, фенилаланина.

Об активности протеиназ судили по количеству образовавшегося после протеолиза свободного тирозина и тирозина в составе коротких пептидов, не осаждающихся сильными кислотами, в частности трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Для идентификации щелочных протеиназ, в качестве субстрата использовали 2,0% раствор казеина (рН - 7,8). В качестве субстрата для определения кислых протеиназ использовали 2,0% раствор гемоглобина (рН - 3,8),

Для определения активности кислых протеиназ использовали фосфатно-цитратный буфер с рН 3,8. В пробирки приливали по 1 мл реакционной смеси: состоящей из буферного раствора и исследуемой культуральной жидкости гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D и инкубировали в термостате при температуре +37°C в течение 10 минут. Затем в опытные пробирки вносили по 1 мл субстрата 2,0% раствора гемоглобина (рН-3,8)) и перемешивали. Протеолиз проводили в течение 10 минут при температуре +37°C. По истечении этого времени, реакцию останавливали добавлением 3 мл 10% ТХУ. Контрольный раствор готовился аналогично, но ТХУ вносили до введения раствора субстрата в реакционную смесь гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7. После добавления ТХУ пробирки выдерживали на холоде в течение 20 минут и фильтровали.

Количество тирозина определяли спектрофотометрически при λ=280 нм на спектрофотометре UV mini-1240 (Shimadzu) (полученные значения оптической плотности переводили в количество мкг тир/мл используя калибровочный график), выражали в микромолях/мл.

Протеолитическую активность в культуральной жидкости Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D определяли по формуле:

, где

Д_оп - мкг тирозина в опытном растворе;

Д_к - мкг тирозина в контрольном растворе;

181 - молекулярный вес тирозина;

10 - продолжительность протеолиза в мин;

1/6 - разведение культуральной жидкости Aspergillus sp. ЛТТ 7.

Полученные данные приведены в таблице 2.

Таким образом, штамм Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D обладает каталазной, оксидоредуктазной и протеазной активностью, что делает этот вид потенциально опасным для таких полимерных материалов, как ПВХ, полиакрилаты, эпоксидные компаунды и т.д., в деструкции которых участвуют данные энзимы. Штамм представляет опасность как потенциальный деструктор полимерных материалов, содержащих амидную связь. Штамм Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D синтезирует в выделяет в окружающую среду многие органические кислоты: глюконовую, щавелевую, яблочную, лимонную, янтарную, молочную, что свидетельствует о его возможности участвовать в процессе биоповреждений изделий РЭО.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма (состав среды, температура, срок выращивания).

Для таксономических и морфо-физиологических исследований, хранения культуру гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 выращивают на агаризованных средах в чашках Петри или пробирках.

Среда Чапека:

вода питьевая - 1,0 литр

сахароза - 30,0 г

нитрат натрия (NaNO₃) - 2,0 г

хлорид калия (KCl) - 0,5 г

сульфит магния (MgSO₄) - 0,5 г

фосфат калия двузамещенный (K₂HPO₄) - 1,0 г

агар-агар - 20,0 г

рН 7,4-7,6

Стерилизация при 1 атм. (121°C) - 20 мин.

Мальт-экстракт-агар (солодовый агар);

вода питьевая - 1,0 литр

солодовый экстракт 30,0 г

пептон из соевой муки 3,0 г

агар-агар 15,0 г

рН 5,6±0,2 при 25°C.

Стерилизация при 1 атм. (121°C) - 10 мин.

Культивирование в термостате 7-10 суток при +25°C.

Для наращивания биомассы и биохимических исследований экзометаболитов Aspergillus sp. ЛТТ 7 культивируют на жидкой среде Чапека (без добавления агар-агара) в колбах на качалке (120-180 оборотов/мин.) при температуре +25-+27°C.

Описание режима хранения штамма (среды, условия, предельный срок)

1) В пробирке на закошенной питательной среде Чапека под минеральным маслом;

в холодильнике при температуре 0-+4°C. Срок хранения без пересева - 2 года.

2) Лиофилизированные споры гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 в запаянной ампуле для длительного хранения.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ФБГУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина (ВКМ ИБФМ РАН) под номером ВКМ F-4822D.

Результаты.

Реализация использования штамма гриба Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D в качестве тест-культуры для определения биокоррозионной способности (агрессивности) проверяли методом нанесения его споровой суспензии в концентрации 10*5 мл на поверхность лакокрасочных материалов, полимеров, резин и герметиков. Контролем служили образцы тех же материалов, обработанные споровой суспензией грибов Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D согласно ГОСТ 9.048-89. Обработанные суспензией образцы помещали в эксикаторы с 90% влажностью и устанавливали в термостаты с температурой +28°C на 28 суток (ГОСТ 9.048-89). Повторность всех образцов трехкратная.

В опытах использовали следующие материалы:

1. Краска МЛ-12;

2. Краска ЭП-525;

3. Краска ЭП-140;

4. Краска акриловая бактерицидная с частицами наносеребра PREMIA (Ярославль);

5. Герметик 1 акриловый (Soudal, Бельгия);

6. Герметик 2 силиконовый бесцветный с кислотным отвердением с добавлением биоцида 2-octyl-2H-isothiazol-3-on (Soudal, Бельгия);

7. Герметик 3 силиконовый белый с кислотным отвердением с добавлением биоцида 4.5-dichloro-2n-octyl-4-isothiazol-3-one (Soudal, Бельгия);

8. Герметик 4 однокомпонентный герметик ВГО-1 кремнийорганический белый (ТУ 38.303-04-04-90);

9. Резина фторсиликоновая ФС-608;

10. Резина ИРП-1354.

Результаты исследования отражены в таблице 3.

По результатам экспериментов, деструктивная активность штамма Aspergillus sp. ЛТТ 7 ВКМ F-4822D превышает активность музейных культур, рекомендованных ГОСТ 9.048-89 и штамм может быть рекомендован для дополнительных испытаний на грибостойкость лакокрасочных и полимерных материалов.