Результат интеллектуальной деятельности: НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ТЕТРАЦИКЛИНАМ ИЗ ГРУППЫ tet У БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ "РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ"

Изобретение относится к области ветеринарии, биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой набор олигонуклеотидов для идентификации и детекции участков генов tetA, tetM, tetO, обеспечивающих устойчивость к тетрациклинам у бактерий, выявленных в результате ветеринарного мониторинга, с помощью детектирующего амплификатора.

Тетрациклины, представляют собой семейство антибиотиков, широкого спектра действия, проявляющими активность в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных бактерий. Применяются для лечения инфекций домашней птицы, крупного рогатого скота, овец и свиней. В некоторых случаях, например, для терапевтического лечения большого количества домашней птицы, выращиваемой на коммерческих фермах, антибиотики добавляют непосредственно в корм или воду или могут вводиться в виде аэрозолей. Тетрациклины используются в аквакультуре для борьбы с инфекциями у лосося, сома и омаров [1,2]. Их также распыляют на фруктовые деревья и другие растения для лечения заражения Erwinia amylovara, вводят в пальмы для лечения микоплазменных инфекций и используют для борьбы с заражением семян Xanthomonas campestis (черная гниль). Они также находят применение в лечении насекомых, имеющих коммерческую ценность; например, окситетрациклин используется для лечения гнильца медоносных пчел, который вызывается либо личинками Bacillus, либо Streptococcus pluton.

Устойчивость к тетрациклинам часто связана с приобретением новых генов, которые кодируют энергозависимый отток тетрациклинов или белок, защищающий бактериальные рибосомы от действия тетрациклинов. Большинство генов tet у бактерий связаны с мобильными плазмидами, транспозонами, конъюгативными транспозонами и интегронами (генными кассетами). Эти мобильные единицы позволили генам tet перемещаться от вида к виду и в широкий диапазон родов путем конъюгации. Гены грамотрицательных tet, впервые описанные у Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae, теперь обнаруживают также у Neisseria, Haemophilus, Mannheimia, Treponema и Vibrio [3]

Существуют различные методы идентификации и детекции генетических детерминант резистентности, основанные на использовании технологии ДНК-чипов (RU 2685188 C2, RU 2415932 C1, RU 2415937 C1) и нескольких разновидностей ПЦР: метод одноцепочечного конформационного полиморфизма (PCR-SSCP), анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP) (RU 2646107 C1). Также возможно использование лигазной цепной реакции (ЛЦР). Метод секвенирования является «золотым стандартом» для идентификации неизвестных продуктов амплификации, что позволяет определять новые варианты ферментов [4].

Молекулярно-генетические методы направлены на выявление генов, ассоциированных с резистентностью, и характеризуются: высокой чувствительностью, скоростью получения результатов, стандартизованностью и технологичностью исследования. Важной особенностью является отсутствие манипуляций с живыми бактериальными культурами, что способствует предотвращению распространения и циркуляции микроорганизмов внутри лечебно-диагностических и лабораторных учреждений.

ПЦР в реальном времени (PCR-RT) метод является наиболее практичным методом идентификации, который используется для выявления генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, включая гены устойчивости к тетрациклинам.

Целью настоящего изобретения является разработка набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени, используемой с целью выявления фрагментов генов устойчивости к тетрациклинам tetA, tetM и tetO из образцов продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилка и др.), без этапа выделения бактериальных изолятов, а также из чистых бактериальных культур.

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность выбранных олигонуклеотидов специфичных к последовательностям генов tetA, tetM и tetO, по которым осуществляется определение устойчивости анализируемого образца к тетрациклинам.

Преимуществом данного изобретения является экспресс-выявление генов резистентности, к антибиотикам, наиболее часто применяемых в ветеринарной практике и являющихся критически важным для клинической медицины.

Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что при проведении полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени», используют специальный оригинальный набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления фрагментов генов устойчивости к тетрациклинам tetA, tetM и tetO, имеющий следующий нуклеотидный состав:

1) гена устойчивости к тетрациклинам tetA:

tetA-F CGGTCTTCTTCATCATGCAACT

tetA-R GAGTGAATGCAGAATGCCAAATG

tetA-Z ROX-TTTCGGCGAGGATCGCTTTCACT-BHQ2

2) гена устойчивости к тетрациклинам tetM:

tetM - F GGTACAACGAGGACGGATAATAC

tetM - R CCTGGCGTGTCTATGATGTT

tetM - Z ROX-ACGTCAGAGAGGAATTACAATTCAGACAG-BHQ2

3) гена устойчивости к тетрациклинам tetO:

tetO - F GAGCGTAGATGAAGGCACAA

tetO - R ATGGCCTGGCGTATCTATAATG

tetO - Z FAM-TCACTGCTGTCTGGATAGTGATTCCC-BHQ1

Согласно предлагаемому способу осуществляется идентификация трех генетических детерминант резистентности, чаще всего встречающихся в образцах продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилка и др.).

Олигонуклеотиды, входящие в набор, отличаются от известных из уровня техники тем, что имеют оригинальные олигонуклеотидные последовательности и позволяют специфическим образом детектировать и выявлять гены tetA, tetM и tetO, по которым осуществляется определение устойчивости анализируемого образца к тетрациклинам т.е. набор олигонуклеотидов является видоспецифичным.

Для выбора и анализа ДНК последовательностей генов резистентности были использованы базы данных ResFinder, Arg-ANNOT, CARD и NCBI BARRGD, а также последовательности геномов различных грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые были ранее получены в ФГБУ «ВГНКИ» методом полногеномного секвенирования.

Для выбора генов-мишеней при разработке методики выявления генов устойчивости к тетрациклинам были проанализированы литературные данные о встречаемости генов группы tet в бактериях ветеринарного и медицинского происхождения. Кроме того, учитывались данные ветеринарного мониторинга антибиотикорезистености в РФ, распространенность генов tet среди возбудителей, данные полногеномного секвенирования изолятов из различных регионов РФ.

Ген tetA кодирует белок, осуществляющий выведение (эффлюкс) тетрациклинов из бактериальной клетки путем активного транспорта. Данный механизм резистентности к тетрациклинам широко распространен среди энтеробактерий, выделяемых от животных, птиц и из пищевых продуктов. Гены tetM и tetO кодируют белки, взаимодействующие с 23S рибосомальной РНК и препятствующие связыванию тетрациклинов с рибосомой. Данный механизм резистентности к тетрациклинам («защита мишени») распространен как среди грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, выявляемых при ветеринарном мониторинге антибиотикорезистентности. Локализация tetM и tetА на мобильных генетических элементах способствует их горизонтальному переносу между микроорганизмами, в том числе таксономически и экологически отдаленными.

Подбор праймеров производили на онлайн-ресурсе «PrimerQuest Tool» (IDT). Для анализа множественного выравнивания последовательностей использовали программу «Ugene» и алгоритм Clustal omega. Для выбора оптимальных параметров структурных характеристик наборов праймеров использовали программы PCR Primer Stats и Oligo Analysis Tool, оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования димеров и «шпилек». Специфичность праймеров оценивали при помощи онлайн-ресурса «Primer-Blast», расположенном на сайте NCBI.

Последовательности и характеристики выбранных праймеров и зонда для детекции гена tetA и множественное выравнивание фрагментов гена из различных баз данных представлены в таблице 1 и на рисунке 1 (Множественное выравнивание последовательностей гена tetА. Последовательность праймера tetA-R1 дана в виде «reverse-complement»).

Последовательности и характеристики выбранных праймеров и зонда для детекции гена tetM и множественное выравнивание фрагментов гена из различных баз данных представлены в таблице 2 и на рисунке 2 (Множественное выравнивание последовательностей гена tetM. Последовательность праймера tetM-R1 дана в виде «reverse-complement»).

Последовательности и характеристики выбранных праймеров и зонда для детекции гена tetO и множественное выравнивание фрагментов гена из различных баз данных представлены в таблице 3 и на рисунке 3 (Множественное выравнивание последовательностей гена tetO).

Последовательности праймера tetO-R2 и зонда tetO-Z2 даны в виде «reverse-complement».

Выбранные комплекты праймеров и зондов не предназначены для выявления других генов устойчивости к терациклинам, например tet(B), (K), (L), (S), tet(38) и др.

Выделение ДНК из образца, осуществляют с помощью набора реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИЭ) или «PureLink Genomic DNA» (Invitrogen), или «QIAamp DNA Mini Kit» (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве отрицательного контроля выделения (Kв) используют 100 мм³ воды деионизованной. Срок хранения выделенной ДНК составляет при комнатной температуре не более 16 ч, при температуре (2-8) С - не более семи дней, при температуре не выше минус 16°С - не более шести месяцев.

Для приготовления соответствующих мастермиксов «ПЦР-смесь-1» в отдельных пробирках смешивают из расчета на одну реакцию (с учетом контролей выделения и ПЦР) следующие реагенты: растворы прямых и обратных ПЦР-праймеров и зондов в необходимой концентрации, 0,2 мм³ смеси дНТФ (25 ммоль/дм³) и воды деионизованной до 5 мм³. Смесь с полимеразой для выявления целевых генов готовили в отдельной пробирке (из расчета на каждую реакцию с учетом контролей выделения и ПЦР), вносят по 10 мм³ «ПЦР-смеси-1», 0,5 мм³ ДНК-полимеразы, 5 мм³ ПЦР-буфера с магнием. Затем вносят по 15 мм³ приготовленной смеси с полимеразой в тонкостенные пробирки и по 10 мм³ исследуемых или контрольных проб. Запускают на амплификаторе RotorGene соответствующие программы термоциклирования (табл. 4-5).

При идентификации генов устойчивости к тетрациклинам tetA, tetO, tetM результаты интерпретируются в качественном формате на основании значения Ct. Учет результатов амплификации фрагментов генов начинают с оценки результатов амплификации положительных и отрицательных контролей в соответствии с таблицей 6. Результаты ПЦР исследования считаются достоверными, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей ПЦР и отрицательного контроля выделения ДНК.

В образце обнаружен ген устойчивости к тетрациклинам tetA, если в таблице результатов по каналу Orange определено среднее значение порогового цикла Ct ≤ 32, а результаты контрольных реакций соответствуют таблице 4.

В образце обнаружен ген устойчивости к тетрациклинам tetM, если в таблице результатов по каналу Orange определено среднее значение порогового цикла Ct ≤ 32, а результаты контрольных реакций соответствуют таблице 4.

В образце обнаружен ген устойчивости к тетрациклинам tetO, если в таблице результатов по каналу Green определено среднее значение порогового цикла Ct ≤ 35, а результаты контрольных реакций соответствуют таблице 6.

Изобретение имеет преимущество от известных из уровня техники методов возможностью экспресс-идентификации и высокой специфичностью. Для подтверждения специфичности изобретения готовили панель, содержащую ДНК, выделенную из различных чистых бактериальных культур коллекции ФГБУ «ВГНКИ». В качестве контрольных использовали изоляты, которые охарактеризованы полногеномно, с указанием на присутствие или отсутствие каких-либо из таргетных генов: tetA, tetO, tetM, а также отсутствие или присутствие других генов из группы tet (таблица 7).

В рамках предложенной панели системы идентификации и детекции генов резистентности показали 100% специфичность: наблюдается амплификация только фрагментов генов tetA, tetO, tetM.

Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.

Изобретение может быть использовано при выборе лекарственного препарата, режима лечения и с целью осуществления эпизоотического мониторинга.

Литературные источники

1. DePaola A, Hill W E, Harrell F M. Oligonucleotide probe determination of tetracycline-resistant bacteria isolated from catfish ponds. Mol Cell Probes. 1993;7:345-348.

2. Institute of Medicine, Division of Health Promotion and Disease Prevention. Report of a study. Human health risks with the subtherapeutic use of penicillin or tetracyclines in animal feed. Washington, D.C.: National Academy Press; 1998. [Google Scholar]

3. Morse S A, Johnson S J, Biddle J W, Roberts M C. High-level tetracycline resistance in Neisseria gonorrhoeae due to the acquisition of the tetM determinant. Antimicrob Agents Chemother. 1986;30:664-670.

4. Chroma M., Kolar M. Genetic methods for detection of antibiotic resistance: focus on extended-spectrum β-lactamases. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 2010, 154(4): 289-296.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="НАБОР

ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ТЕТРАЦИКЛИНАМ ИЗ

ГРУППЫ tet У БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО

ВРЕМЕНИ».xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-10-12">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022118597</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-07-07</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>02-10</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и

стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ

«ВГНКИ») (Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe uchrezhdenie

«Vserossiiskii gosudarstvennyi Tsentr kachestva i standartizatsii

lekarstvennykh sredstv dlia zhivotnykh i kormov» (FGBU «VGNKI»))

123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе д.5. (Rossiya, Moskva,

Zvenigorodskoye shosse d.5.)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBU VGNKI</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ

ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ТЕТРАЦИКЛИНАМ ИЗ ГРУППЫ tet У БАКТЕРИЙ

МЕТОДОМ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cggtcttcttcatcatgcaact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagtgaatgcagaatgccaaatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tttcggcgaggatcgctttcact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtacaacgaggacggataatac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctggcgtgtctatgatgtt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acgtcagagaggaattacaattcagacag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagcgtagatgaaggcacaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggcctggcgtatctataatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcactgctgtctggatagtgattccc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---